DE3752176T2

DE3752176T2 - Vernetzte Ester von Hyaluronsäure

Info

Publication number: DE3752176T2
Application number: DE3752176T
Authority: DE
Inventors: Valle Francesco Della; Aurelio Romeo
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 1986-10-13
Filing date: 1987-10-06
Publication date: 1998-10-29
Anticipated expiration: 2007-10-07
Also published as: DK536087A; DE3752176D1; CN87106919A; KR920002702B1; FI96610C; PT85908A; DK536087D0; JPS63105003A; IT8648546A0; ZA877559B; JP2648308B2; FI96610B; HUT45734A; KR880005155A; HU204858B; EP0265116A2; IT1198449B; AU7960087A; NO175374C; IE872618L

Description

Die Erfindung betrifft Ester mehrwertiger Alkohole von Hyaluronsäure, die sich aus der Veresterung dieser Alkohole mit zwei oder mehreren Carboxylgruppen der Hyaluronsäurepolysaccharide ergeben, wobei die Ester aufgrund der Gegenwart von Brückenbindungen zwischen den vorstehenden Carboxylfunktionen von gleichen oder von verschiedenen Hyaluronsäuremolekülen durch den Begriff "vernetzt" beschrieben werden können. Diese vernetzten Ester können vollständige oder partielle Ester sein, und in den letzteren können weitere Carboxylfunktionen mit einwertigen oder mehrwertigen Alkoholen ohne die Bildung von Vernetzungen verestert sein (Estergruppen, die nachstehend auch als "einfach" bezeichnet werden). In beiden Arten von vernetzten, partiellen Estern können nicht-veresterte Carboxylfunktionen frei sein oder mit Metallen oder organischen Basen ein Salz bilden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von neuen, vernetzten Hyaluronsäureestern im Bereich von biologisch abbaubaren Kunststoffmaterialien zur Herstellung von sanitären und chirurgischen Artikeln, in den pharmazeutischen und kosmetischen Bereichen und umfaßt daher verschiedene Artikel, die mit denselben in diesen Bereichen hergestellt werden.
Die spezielle Verwendung der neuen Ester kann in Beziehung zum Grade der Vernetzungsveresterung, das heißt der Zahl vernetzter Gruppen von Carboxylfunktionen, die mit den vorstehenden mehrwertigen Alkoholen verestert sind, der Zahl einfacher, veresterter Gruppen und zuletzt auch der Zahl von Gruppen, die ein Salz bilden, gesehen werden, wobei dieser Grad der Veresterung oder Salzbildung selbst auf die Löslichkeit des Produkts und seine viskoelastischen Eigenschaften bezogen ist. Somit sind zum Beispiel die vollständig vernetzten Ester in wäßrigen Flüssigkeiten eigentlich unlöslich und sind aufgrund ihrer Molekülstruktur zur Verwendung bei der Herstellung von Kunststoffmaterialien und -harzen und als Zusätze für diese Materialien sehr geeignet. Ester mit einem mittleren oder niedrigen Veresterungsgrad und ihre Salze mit anorganischen oder organischen Basen sind unter wäßrigen Bedingungen mehr oder weniger löslich und sind zur Herstellung von Gelen geeignet, die sowohl in der Kosmetik als auch in der Pharmakologie und im allgemeinen im medizinisch-sanitären Bereich viele Verwendungen finden können.
Die Anmeldung für das europaische Patent Nr. 0161887 vom 3. 5. 85, veröffentlicht am 21. 11. 85, enthält eine Beschreibung einiger vernetzter Derivate von Hyaluronsäure, die durch die Umsetzung von als "polyfunktionell" bezeichneten Epoxyverbindungen erhalten werden. In der vorstehenden Patentveröffentlichung bedeutet der Begriff "polyfunktionelle Epoxyverbindungen" Kohlenwasserstoffe mit wenigstens einer Epoxyfunktion und möglicherweise auch Funktionen, die in Epoxyfunktionen umwandelbar sind, wobei die Vernetzungsreaktion durch die Epoxygruppen stattfindet. Von diesen Funktionen sind in dem Patent nur die Halogenatome erwähnt. Von diesen polyfunktionellen Epoxyverbindungen sind in der vorstehenden Patentanmeldung nur wenige Beispiele erwähnt, nämlich: Epichlorhydrin, Epibromhydrin, Methylepichlorhydrin, Methylepibromhydrin, 1,2-Bis-(2,3-epoxypropoxy)ethan, 1,4-Bis-(2,3-epoxypropoxy)butan, 1,6-Bis-(2,3-epoxypropoxy)butan, 1,6-Bis-(2,3-epoxypropoxy)hexan und ein Glycidylether von Bisphenol A und Bisphenol F. Das in dieser Patentanmeldung verwendete Herstellungsverfahren, das in den Patentansprüchen auf die Verwendung eines Halomethyloxirans oder einer Bisepoxyverbindung sowie in seinen möglichen Anwendungen beschränkt ist, ergibt vernetzte Ester von Hyaluronsäure mit einem niedrigen Veresterungsgrad: tatsächlich wird, wie aus den veranschaulichenden Beispielen der Patentanmeldung erkannt werden kann, in dem Fall der Umsetzung mit Epichlorhydrin (Beispiel 4) maximal eine 4 %ige Veresterung erreicht, wobei ein Produkt mit einem niedrigen Löslichkeitsgrad erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung stellt eine breite Auswahl an vernetzten Estern zur Verfügung, umfassend spezielle Ester, wobei die Estergruppen Reste umfassen, die nicht mit einer Hydroxylgruppe substituiert sind (wie in dem Fall von Produkten, die sich aus der Umsetzung der vorstehenden Epoxide mit Hyaluronsäure oder ihren Salzen ergeben). Im wesentlichen stellt die Erfindung gemischte Ester, umfassend ein Gemisch aus Estergruppen, die vernetzt sind, und einigen Estergruppen, die nicht vernetzt sind, wobei der Prozentsatz von vernetzenden Gruppen 10 % aller Disaccharideinheiten von Hyaluronsäure übersteigen kann, bereit.
Die Anmeldung für das UK-Patent Nr. 2151244 A vom 13. 8. 1984, veröffentlicht am 17. 7. 1985, und die Anmeldung für die deutsche Offenlegungsschrift 3434082 A1 vom 17. 9. 1984, veröffentlicht am 11. 7. 1985, enthalten Beschreibungen einiger vernetzter Derivate von Hyaluronsäure, die durch die Wirkung von Formaldehyd, Dimethylolharnstoff, Dimethylolethylenharnstoff, eines Polyaziridins, eines Polyisocyanats und eines Divinylsulfons auf dieselbe erhältlich sind. Diese Derivate sind unlöslich und werden aufgrund ihrer biologischen Verträglichkeit für in vivo Anwendungen in Form von verschiedenen Prothesenartikeln, wie Herzklappen, Gefäßklemmen etc., vorgeschlagen oder können zu den verschiedenen Polymermaterialien gegeben werden, die zur Herstellung dieser Artikel verwendet werden. Dieselben Patente stellen die Verwendung von Ethyloxid als Mittel zur Durchführung der "Vernetzung" bereit, aber das Verfahren ist nicht veranschaulicht und auch nicht der erhaltene Produkttyp. Die Struktur weiterer vernetzter Derivate ist nicht angegeben, und die Bindungsart, die die Vernetzung bildet, ist nicht erwähnt. Im Fall von Formaldehyd und der vorstehenden substituierten Harnstoffe kann dies Derivate bedeuten, die die Carboxylgruppen von Hyaluronsäure mit einer Halbacetalstruktur umfassen, während es in anderen Fällen alkylierte Hydroxylprodukte bedeuten kann.
EP-A-0 193150 beschreibt einen geformten Artikel, der auf vernetzter, möglicherweise derivatisierter Hyaluronsäure oder einem Salz davon beruht, dadurch gekennzeichnet, daß er in einem weitgehend nicht gequollenen Zustand einen Trockenstoffgehalt von wenigstens 65 Gew.-% und eine Zugfestigkeit von wenigstens 2 N/cm² aufweist.
EP-A-0044228 beschreibt bestimmte Heparinester, von denen es heißt, daß sie bei der Herstellung von Arzneimitteln als Zwischenverbindungen verwendbar sind.
Die frühere Patentanmeldung EP-A-02 16453 der Anmelder beschreibt bestimmte Ester von Hyaluronsäure, in denen alle oder nur ein Teil der Carboxylgruppen der Säure verestert sind. Diese Verbindungen besitzen interessante pharmazeutische Eigenschaften und sind als Arzneimittel, Kosmetika und als medizinische und chirurgische Artikel verwendbar.
Die vorliegende Erfindung stellt vollständige oder partielle vernetzte, nicht-toxische Ester von Hyaluronsäure mit einem aliphatischen, mehrwertigen Alkohol mit 2 bis 16 Kohlenstoffatomen und Salze dieser partiellen Ester mit anorganischen oder organischen Basen bereit, wobei die vernetzenden Bindungen nur zwischen Carboxylgruppen der Hyaluronsäure bestehen, mit der Maßgabe, daß der vernetzte Ester nicht der vernetzte Ester von Hyaluronsäure mit einem Halogenmethyloxiran oder einer Bisepoxyverbindung ist.
In den partiellen vernetzten Estem können Carboxylgruppen mit einwertigen oder melirwertigen Alkoholen der aliphatischen, alicyclischen, araliphatischen oder heterocyclischen Reihe verestert sein, und in den partiellen Estem können nicht-veresterte Carboxylgruppen, die mit anorganischen oder organischen Basen Salze bilden, vorliegen.
Der Begriff "Hyaluronsäure" wird in der Literatur für saure Polysaccharide mit verschiedenen Molekulargewichten verwendet, die aus Resten von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosaminsäure gebildet werden, die von Natur aus in Zelloberflächen, in den basischen, extrazellulären Substanzen des Bindegewebes von Wirbeltieren, in der Synovialflüssigkeit der Gelenke, in der endobulbären Augenflüssigkeit, im menschlichen Nabelschnurgewebe und in Hahnenkämmen vorkommen. Hyaluronsäure spielt im biologischen Organismus als mechanischer Träger für die Zellen vieler Gewebe, wie der Haut, Sehnen, Muskeln und Knorpel, eine wichtige Rolle und daher ist sie die Hauptkomponente der interzellulären Matrix, aber sie spielt auch weitere wichtige Rollen in den biologischen Prozessen, wie dem Benetzen von Geweben, dem Gleifahigmachen, der Zellwanderung, den Zellfunktionen und der Zelldifferenzierung (siehe zum Beispiel A. Balazs et al. in "Cosmetics & Toiletries", italienische Ausgabe Nr. 5/84, Seiten 8-17).
Hyaluronsäure kann aus den vorstehenden natürlichen Geweben, zum Beispiel aus Hahnenkämmen oder auch aus einigen Bakterien, extrahiert werden. Gegenwärtig ist auch die Herstellung von Hyaluronsäure durch mikrobiologische Verfahren möglich. Das Molekulargewicht von durch Extraktion erhaltener, vollständiger Hyaluronsäure beträgt etwa 8-13 Millionen. Die Molekülkette dieser Polysaccharide wird jedoch durch verschiedene physikalische und chemische Faktoren, zum Beispiel durch mechanische Mittel oder unter dem Einfluß von Strahlung oder durch hydrolysierende, oxidierende oder enzymatische Mittel, ganz leicht abgebaut. Aus diesem Grund weisen die erhaltenen, abgebauten Fraktionen, sogar unter Verwendung der üblichen Reinigungsverfahren, ein niedrigeres Molekulargewicht auf (siehe Balazs et al., vorstehend zitiert).
Hyaluronsäure, ihre Molekülfraktionen und die jeweiligen Salze wurden als Arzneimittel verwendet und sie wurden zur Verwendung in Kosmetika vorgeschlagen (siehe zum Beispiel der vorstehende Artikel von Balazs et al. und das französische Patent Nr. 2478463). Als Arzneimittel wurden Hyaluronsäure und ihre Salze im besonderen bei der Therapie von Arthropathien, zum Beispiel im veterinären Bereich zur Behandlung von Arthritis bei Pferden, verwendet [Acta Vet. Scand 167, 379 (1976)]. Als therapeutisches Hilfs- und Ersatzmittel für natürliche Organe und Gewebe wurden Hyaluronsäure und ihre Molekülfraktionen und ihre Salze in der Augenchirurgie verwendet (siehe zum Beispiel Balazs et al. in "Modem Problems in Ophthalmology", Bd. 10, 1970, S. 3 - Hrsg. E. B. Strieff, S. Karger, Basel, oder "Viscosurgery and the Use of Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation", wobei die Abhandlung auf dem International Congress and First Film Festival on Intraocular Implantation, Cannes, 1979, vorgelegt wurde, und U.S.-Patent Nr. 4328803 mit einer Zusammenfassung der Literatur über Verwendungen von HY in der Augenheilkunde, und auch U.S.-Patent Nr. 4141973). In der EP-Veröffentlichung Nr. 0138572A3 vom 24. April 1985 gibt es eine Beschreibung einer Molekülfraktion von Hyaluronsäure, die zum Beispiel als Natriumsalz für intraokulare beziehungsweise intraartikuläre Injektionen, die als Ersatz für die endobulbären Flüssigkeiten im Auge und bei der Therapie von Arthropathien geeignet sind, verwendet werden kann.
Hyaluronsäure kann auch als Zusatz für verschiedene Polymermaterialien, die für sanitäre und chirurgische Artikel verwendet werden, wie Polyurethane, Polyester, Polyolefine, Polyamide, Polysiloxane, Vinyl- und Acrylpolymere, Kohlenstoffasern, mit dem Effekt, daß diese Materialien biologisch verträglich gemacht werden, verwendet werden. In diesem Fall wird die Zugabe von HY oder ihren Salzen zum Beispiel durch Beschichten der Oberfläche dieser Materialien oder durch Dispersion in denselben oder durch diese beiden Verfahren durchgeführt. Diese Materialien können auch zur Herstellung verschiedener sanitärer und medizinischer Artikel, wie Herzklappen, intraokularer Linsen, Gefaßklemmen, Schrittmacher und ähnlicher Artikel, verwendet werden (siehe U.S.-Patent Nr. 4500676).
Der Begriff "Hyaluronsäure" wird tatsächlich in der Regel nicht korrekt verwendet, wobei er, wie erkannt wurde, eine ganze Reihe von Polysacchariden mit wechselnden Resten von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosaminsäure mit unterschiedlichen Molekulargewichten oder sogar die abgebauten Fraktionen derselben bedeutet, und es scheint daher korrekter, den Pluralbegriff "Hyaluronsäuren" zu verwenden. Der Singularbegriff wird jedoch trotzdem in dieser Beschreibung, auch im Fall der Molekülfraktionen, verwendet, und ferner wird die Abkürzung "HY" häufig anstelle dieses Sammelbegriffes verwendet.
Es hat sich gezeigt, daß auch die Ester von Hyaluronsäure mit aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Alkoholen ähnliche und sogar bessere Eigenschaften als die der sauren Polysaccharide selbst besitzen, und daß sie sogar für die vorstehenden Verwendungen noch geeigneter sind. Diese Ester und ein Verfahren für ihre Herstellung sind in der ebenfalls anhängigen EP-Anmeldung Nr. 86305233.8, Veröffentlichungsnr. 0216453, beschrieben, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Ester mit einem hohen Veresterungsgrad und im besonderen die vollständigen Ester weisen, anders als Hyaluronsäure, eine gute Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, zum Beispiel in Dimethylsulfoxid, auf Somit löst sich zum Beispiel der Benzylester von HY bei Raumtemperatur in einer Menge von 200 mg/ml in DMSO. Diese Löslichkeit in bestimmten organischen Lösungsmitteln zusammen mit speziellen und deutlichen viskoelastischen Eigenschaften ermöglichen die Herstellung sanitärer, medizinischer und chirurgischer Artikel, die in Salzlösung unlöslich sind und die die spezielle erwünschte Form aufweisen: zuerst wird eine Lösung des HY-Esters in einem organischen Lösungsmittel hergestellt, anschließend wird die sehr viskose Lösung in die für den fertigen Artikel gewünschte Form gebracht, und schließlich wird das organische Lösungsmittel mit einem weiteren Lösungsmittel, das sich mit dem ersten mischt, in dem jedoch der HY-Ester unlöslich ist, extrahiert. Diese Vorteile sollen auch, möglicherweise in einem noch größeren Maß, in den vernetzten Verbindungen der vorliegenden Erfindung gefunden werden.
Die vernetzten Ester der vorliegenden Erfindung können sich von einem beliebigen mehrwertigen Alkohol aliphatischer Natur mit 2 bis 16 Kohlenstoffatomen ableiten, sie leiten sich jedoch bevorzugt von mehrwertigen Alkoholen mit maximal 8 Alkoholfunktionen und im besonderen mit 4 dieser Funktionen ab. Der Begriff "mehrwertig" betrifft genaugenommen im allgemeinen Alkohole mit drei oder mehr Hydroxylgruppen, während sich die Begriffe "zweiwertig" oder "Glykol" im allgemeinen auf Alkohole mit zwei Hydroxylgruppen beziehen. Der hier verwendete Begriff "mehrwertig" soll jedoch Alkohole mit zwei oder mehr Hydroxylgruppen umfassen. Somit können die "mehrwertigen" Alkohole zweiwertige Alkohole, dreiwertige, vierwertige, fünf- und sechswertige Alkohole sein. Von diesen sollten Glycerin, die drei Erythritisomere, Pentaerythrit, die vier Xylitisomere und die 10 Dulcitisomere besonders erwähnt werden.
In den neuen Estern können sich die "Vernetzungen" von verschiedenen der vorstehenden mehrwertigen Alkohole ableiten, wobei jedoch die Herstellung von Estem bevorzugt ist, in denen sich alle "Vernetzungen" von demselben mehrwertigen Alkohol ableiten.
Die wichtigste Klasse der neuen Ester ist die, die sich von zweiwertigen Alkoholen, d.h. von Glykolen, ableitet. Diese Glykole weisen bevorzugt maximal 3 Kohlenstoffatome auf und sind im besonderen Ethylenglykol, Propylenglykol, Butylenglykol, die Glykole, die sich von Pentan, Hexan, Heptan, Octan ableiten, und ihre Stellungsisomere. Diese Glykole können jedoch auch Doppelbindungen, zum Beispiel eine bis drei Doppelbindungen, aufweisen.
Die einfachen Estergruppen, die zusätzlich zu den vernetzten Gruppen vorhanden sein können, können sich von Alkoholen der aliphatischen, araliphatischen, alicyclischen oder heterocyclischen Reihe ableiten und können substituiert oder nicht substituiert, gesättigt oder ungesättigt sein. Alkohole der aliphatischen Reihe sind zum Beispiel diejenigen mit maximal 34 Kohlenstoffatomen, die gesättigt oder ungesättigt sein können und die möglicherweise auch mit weiteren freien funktionellen oder funktionell modifizierten Gruppen, wie einer Amino-, Hydroxyl-, Aldehyd-, Keto-, Mercapto-, Carboxylgruppe oder von diesen abgeleiteten Gruppen, wie Kohlenwasserstoff- oder Dikohlenwasserstoffaminoresten (hier und nachstehend sollte der Begriff "Kohlenwasserstoffrest" nicht nur für einwertige Kohlenwasserstoffreste, z.B. vom Typ -CnH2n+1, sondern auch für zweiwertige oder dreiwertige Reste, wie "Alkylene" -CnH2n- oder "Alkylidene" > CnH2n stehen), einer Ether- oder Estergruppe, einer Acetal- oder Ketalgruppe, einer Thioether- oder Thioestergruppe und veresterten Carboxylgruppen oder Carbaminsäuregruppen und mit einem oder zwei Kohlenwasserstoffresten, Nitrilgruppen oder Halogenatomen substituierten Carbaminsäuregruppen substituiert sein können. Von den substituierten Alkoholen werden bevorzugt die mit einer oder zwei der vorstehend erwähnten Funktionen gewahlt.
Von den vorstehend erwähnten Resten, die Kohlenwasserstoffreste enthalten, sind niederaliphatische Reste, zum Beispiel Alkylreste mit maximal 6 Kohlenstoffatomen bevorzugt. Diese Alkohole können dann auch durch Heteroatome, wie Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatome, in der Kohlenstoffatomkette unterbrochen sein. Alkohole der vorstehenden Gruppe, die bevorzugt in den Grenzen der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, sind die mit maximal 12 und im besonderen 6 Kohlenstoffatomen und die der substituierten Alkohole, in denen die Kohlenwasserstotfreste in den vorstehend erwähnten Amino-, Ether-, Ester-, Thioether-, Thioester-, Acetal-, Ketalgruppen Alkylreste mit maximal 4 Kohlenstoffatomen darstellen, und in denen auch in den veresterten Carboxylgruppen oder substituierten Carbaminsäuregruppen die Kohlenwasserstoffreste Alkylreste mit derselben Zahl von Kohlenstoffatomen sind, und in denen die Amino- oder Carbaminsäuregruppen Alkylenamin oder Alkylencarbaminsäurereste mit maximal 8 Kohlenstoffatomen sein können. Von diesen Alkoholen sollten zu allererst die erwähnt werden, die gesättigt und nicht substituiert sind, wie zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropylalkohol, n-Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butylalkohol, Amylalkohol, Pentyl-, Hexyl-, Octyl-, Nonyl- und Dodecylalkohol und vor allem diejenigen mit einer linearen Kette, wie n-Octyl- und n-Dodecylalkohol.
Von den substituierten Alkoholen sind die bereits erwähnten Glykole, die sonst zur Bildung von "Vernetzungen" verwendet werden, aber auch mehrwertige Alkohole, wie Glycerin, die Aldehydalkohole, wie Tartronalkohol, Carboxyalkohole, wie Milchsäuren, zum Beispiel α-Oxypropionsäure, Glykolsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Aminoalkohole, wie Aminoethanol, Aminopropanol, n-Aminobutanol und ihre Dimethyl- und Diethylderivate der Aminofunktion, Cholin, Pyrrolidinylethanol, Piperidinylethanol, Piperazinylethanol und die entsprechenden Derivate von n-Propylalkohol oder n-Butylalkohol, Monothioethylenglykol oder seine Alkylderivate, zum Beispiel das Ethylderivat der Mercaptofunktion bevorzugt. Von den gesättigten, höheren, aliphatischen Alkoholen sind zum Beispiel Cetylalkohol und Myricylalkohol bevorzugt, aber von besonderer Bedeutung fur die Ziele der vorliegenden Erfindung sind die höheren, ungesättigten Alkohole mit einer oder zwei Doppelbindungen, wie im besonderen die, die in vielen etherischen Ölen enthalten sind und mit Terpenen chemisch verwandt sind, wie zum Beispiel Citronellol, Geraniol, Nerol, Nerolidol, Linabol, Farnesol und Phytol. Von den ungesättigten, niederen Alkoholen sind Allylalkohol und Propargylalkohol verwendbar.
Von den araliphatischen Alkoholen sollen vor allem alle diejenigen mit nur einer Benzolgruppe erwähnt werden, in denen die aliphatische Kette maximal 4 Kohlenstoffatome aufweist, in denen die Benzolgruppe mit 1 bis 3 Methyl- oder Hydroxylgruppen oder mit Halogenatomen, im besonderen mit Chlor-, Brom- oder Iodatomen, substituiert sein kann, und in denen die aliphatische Kette mit einer oder mehreren Funktionen, die aus einer freien Aminooder Mono- oder Dimethylgruppe oder einer Pyrrolidinyl- oder Piperidingruppe ausgewählt sind, substituiert sein kann. Von diesen Alkoholen sind vor allem Benzylalkohol und Phenethylalkohol bevorzugt.
Die Alkohole der cycloaliphatischen Reihe (umfassend auch cycloaliphatisch-aliphatische Alkohole) können sich von mono- oder polycyclischen Kohlenwasserstoffen ableiten und können bevorzugt maximal 34 Kohlenstoffatome aufweisen. Im Fall von substituierten Alkoholen können die Substituenten die bereits fur die Alkohole der aliphatischen Reihe erwähnten sein.
Von den Alkoholen, die sich von cyclischen Kohlenwasserstoffen mit einem Ring ableiten, sollten besonders die mit maximal 12 Kohlenstoffatomen, wobei die Ringe bevorzugt 5 bis 7 Kohlenstoffatome aufweisen, die zum Beispiel mit ein bis drei Niederalkylresten, wie einer Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Isopropylgruppe, substituiert sein können, erwähnt werden. Als spezielle Alkohole dieser Gruppe sind Cyclohexanol, Cyclohexandiol, 1,2,3-Cydohexantriol und 1,3,5-Cyclohexantriol (Methylentriol) und Inosit bevorzugt. Die heterocydischen Alkohole können als von den vorstehenden cycloaliphatischen oder aliphatisch-cycloaliphatischen Alkoholen abgeleitet angesehen werden, wenn in diesen die linearen oder cydischen Ketten durch ein oder mehrere Heteroatome, zum Beispiel 1 bis 3 Heteroatome, die aus -O-, -S-, -N= und -NH- ausgewählt sind, unterbrochen sind, und in ihnen eine oder mehrere Doppelbindungen, im besonderen 1 bis 3, vorliegen können, wobei somit auch heterocyclische Verbindungen mit aromatischen Strukturen eingeschlossen sind. Sie konnen einfache Alkohole, wie Furfürylalkohol, oder Alkohole mit einer komplizierteren Strukir sein, wie sie in vielen Alkabidderivaten und in vielen Arzneimitteln vorliegen.
Wie bereits angegeben, können die neuen, vernetzten Derivate der vorliegenden Erfindung für alle die Hauptanwendungen, die für Hyaluronsäure oder ihre Salze oder die vorstehenden Ester geeignet sind, die in der vorstehenden, ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung beschrieben sind, verwendet werden. Wie bereits erwähnt, sind daher die neuen Derivate besonders für die Herstellung von:
1) Arzneimitteln
2) pharmazeutischen Trägern für Arzneimittel
3) Kosmetika und Trägern für Kosmetika
4) Kunststoffartikeln für sanitäre, medizinische und chirurgische Verwendungen geeignet, und die vorliegende Erfindung umfaßt im besonderen alle diese Verwendungen.
Die Art des vernetzten Esters wird offensichtlich nach der Verwendung, für die er eingesetzt werden soll, ausgewählt. In der Regel erhöht ein hoher Veresterungsgrad bis zu dem Punkt der vollständigen Veresterung der Hyaluronsäure seinen lipophilen Charakter und verringert daher seine Löslichkeit in Wasser. Für therapeutische oder kosmetische Verwendungen ist es besonders wichtig, den Veresterungsgrad auf eine solche Art und Weise zu regulieren, daß eine ausreichende Löslichkeit in Wasser sichergestellt ist, obwohl er, verglichen mit Hyaluronsäure oder ihren Salzen, gute lipophile Eigenschaften aufweist. Natürlich sollte man an die Molekülgröße der verestemden Komponente selbst denken, da diese in der Regel die Wasserlöslichkeit auf umgekehrt proportionale Art und Weise beeinflußt. Soweit die Verwendung von Arzneimitteln betroffen ist, sollte der größere oder kleinere Grad hydrophiler oder lipophiler Eigenschaften im Hinblick auf die Art des zu behandelnden Gewebes, zum Beispiel die Haut im Fall von Arzneimitteln für die Haut, berücksichtigt werden.
Die neuen, vernetzten Derivate können aufgrund der der Hyaluronsäurekomponente selbst innewohnenden Eigenschaft sowohl in der Human- als auch in der Vetrinärmedizin als Arzneimittel, zum Beispiel als Arzneistoffe zur Behandlung von Artliritis, verwendet werden. In diesem Fall leiten sie sich von mehrwertigen, aliphatischen Alkoholen ohne pharmakologische Eigenschaften oder mit gerinfilgiger Wirksamkeit, im besonderen von zweiwertigen Alkoholen mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, ab, und die möglicherweise vorhandenen weiteren einfachen Estergruppen leiten sich ebenfalls von Alkoholen ohne pharmakologische Wirkung, zum Beispiel von einwertigen, aliphatischen Alkoholen mit einer maximalen Zahl von 8 Kohlenstoffatomen, ab. Die Verabreichung erfolgt auf parenteralem Weg und genauer auf intraartikulärem Weg.
Weitere erfindungsgemäße vernetzte Derivate können sich auch von Alkoholen mit einer pharmakologischen Wirkung ableiten, und dies trifft im besonderen für Alkohole zu, von denen einfache Estergruppen abgeleitet sind. Sie besitzen Eigenschaften, die denen des Alkohols qualitativ ähnlich sind, aber sie weisen einen differenzierteren Wirkungsbereich auf, wodurch eine ausgewogenere, konstantere und regelmäßigere pharmakologische Wirkung sichergestellt wird, und sie weisen in der Regel eine deutliche "Retard"wirkung auf Weitere vernetzte Derivate wiederum können einfache Estergruppen mit zwei oder mehreren verschiedenen Alkoholarten mit oder ohne ihre eigene pharmakologische Wirkung enthalten. Durch geeignetes Dosieren des Verhältnisses der verschiedenen Alkoholarten als veresternde Komponenten ist es möglich, Ester mit der pharmakologischen Wirksamkeit wirksamer Alkohole ohne die spezielle Wirksamkeit von Hyaluronsäure, die die vorstehend beschriebenen Eigenschaften einer größeren Stabilität und Bioverfügbarkeit hinsichtlich der erwünschten Wirksamkeit und der Eigenschaften der pharmakologisch wirksamen Alkohole aufweisen, zu erhalten.
In den hier beschriebenen Derivaten, die sich von pharmakologisch wirksamen Alkoholen ableiten, wirkt das vernetzte Hyaluronsäuremolekül im wesentlichen als Träger für die pharmakologisch wirksame Komponente, und sie können daher auch in den Gruppen 2) oder 3) eingeschlossen sein. Da die neuen, vernetzten Derivate als eigentliche Träger nach den Verwendungen 2) und 3) wirken, sind sie auch bevorzugt von den vorstehend genannten therapeutisch unwirksamen, mehrwertigen Alkoholen abgeleitet, und auch mögliche Estergruppen, die sich von einwertigen Alkoholen ableiten, weisen bevorzugt keine pharmakologische Wirkung auf Der Wirkstoff wird physikalisch mit den neuen Derivaten gemischt, und die entstandenen Arzneimittel können auch weitere Inhaltsstoffe und Excipientien enthalten, die im allgemeinen in herkömmlichen pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden. Anstelle eines Wirkstoffes ist eine Vereinigung von Wirkstoffen möglich. Im besonderen sind die Arzneimittel der Art von Interesse, in denen die neuen Hyaluronsäurederivate als Träger wirken und topische Wirkstoffe enthalten.
Die pharmakologisch wirksamen Alkohole, die zur Veresterung noch nicht vernetzter Carboxylgruppen in den neuen Derivaten verwendet werden sollen, können, abgesehen von den bereits aufgeführten, aliphatisch-cycloaliphatische, polycyclische Alkohole, wie zum Beispiel Steroide, wie Sexualhormone und ihre synthetischen Analoga, und besonders Corticosteroide und ihre Derivate, wie zum Beispiel Östradiol und seine Methylderivate, Ethinyl- oder Propinylderivate in Stellung 17, Testosteron und seine Derivate, wie 17-α-Methyltestosteron, 17-α-Ethinyltestosteron, 1'1,2-Dehydrotestosteron, Norgestrel, 19-Nortestosteron, 19- Nor-17-α-methyltestosteron, Antihormone, wie Cyproteron, Cortison, Hydrocortison, Dexamethason, Betamethason, Paramethason, Flumethason, Fluocinolon, Clobetasol, Beclomethason, Alfaxolon und Bolasteron, sein. Weitere therapeutisch wirksame Alkohole sind zum Beispiel Vitamine, wie Axerophthol, Vitamin D&sub2; und D&sub3;, Aneurin, Lactoflavin, Ascorbinsäure, Riboflavin, Thiamin und Pantothensäure. Von den heterocyclischen Alkoholen erwähnen wir auch Atropin, Scopolamin, Cinchonin, Cinchonidin, Chinin, Morphin, Codein, Nalorphin, N- Butylscopolammoniumbromid, Ajmalin; Phenylethylamin, wie Ephedrin, Isoproterenol, Epinephrin; Phenothiazinarzneistoffe, wie Perphenazin, Pipotiazin, Carphenazin, Homofenazin, Acetophenazin, Fluphenazin, N-Rydroxyethylpromethazinchlorid; Thioxanthenarzneistoffe, wie Flupentixol und Clopenthixol; Antikonvulsiva, wie Meprophendiol; Antipsychotika, wie Opipramol; Antiemetika, wie Oxypendyl; Analgetika, wie Carbetidin, Phenoperidin und Methadol; Hypnotika, wie Etodroxizin; Anorektica, wie Benzhydrol und Diphemethoxidin; schwächere Beruhigungsmittel, wie Hydroxizin; Muskelrelaxantien, wie Cinnamedrin, Diphyllin, Mephenesin, Methocarbamol, Chlorphenesin, 2,2-Diethyl-1,3-propandiol, Guaiphenesin, Hydrocilamid; koronare Vasodilatatoren, wie Dipyridamol und Oxyfedrin; adrenerge Blocker, wie Propanolol, Timolol, Pindolol, Bupranolol, Atenolol, Metoprolol, Practolol; Antineoplastika, wie 6-Azauridin, Cytarabin, Floxuridin; Antibiotika, wie Chloramphenicol, Thiamphenicol, Erythromycin, Oleandomycin, Lincomycin; antivirale Mittel, wie Idoxuridin; periphere Vasodilatatoren, wie Isonicotinylalkohol; Inhibitoren der Carboanhydrase, wie Subcarbilat; Antiasthmatika und entztlndungshemmende Mittel, wie Tiaramid; Sulfamide, wie 2- p-Sulfanylanilinoethanol.
Die hier beschriebenen neuen, vernetzten Derivate können natürlich in denselben Fällen wie die freien Alkohole verwendet werden.
Eine besonders interessante erfindungsgemäße Ausfuungsforrn ist die Möglichkeit der Herstellung stabilerer Arzneistoffe als der bis jetzt verfügbaren. Es ist daher einerseits möglich, vernetzte Derivate zur Verwendung bei den Indikationen herzustellen, die für Hyaluronsäure selbst typisch sind, zum Beispiel für intraartikuläre Injektionen, wobei das vernetzte Derivat als Gleitmittel wirkt: aufgrund der besseren Stabilität der Derivate, wenn die Hyaluronidase mit der freien Säure verglichen wird, ist es möglich, eine ziemlich deutlich längere Wirkung zu erhalten. Andererseits ist es möglich, Arzneistoffe mit einer "Retard"wirkung für die vorstehenden Derivate, die auch Estergruppen enthalten, die sich von therapeutisch wirksamen Alkoholen ableiten, zu erhalten. In diesen wird der pharmakologisch wirksame Alkohol sehr langsam durch Esterasen in den Organismus ausgeschüttet. Zur Verwendung nach dem vorstehenden Punkt 4) werden die neuen, vernetzten Derivate vor allem mit pharmakologisch inerten Alkoholen, zum Beispiel zweiwertigen, gesättigen, aliphatischen Alkoholen, im besonderen denen mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Glycerin und einwertigen Alkoholen vor allem aliphatischen Alkoholen, jedoch auch einigen anderen der vorstehend genannten Reihe zur partiellen Veresterung der Carboxylgruppen, die nicht vernetzt sind, hergestellt. Von dieser letzten Gruppe sind die ungesattigten Alkohole, zum Beispiel die mit einer oder mehr Doppelbindungen, wie Vinyl- oder Allylalkohole und ihre kondensierten Derivate, wie im besonderen Polyvinylalkohol und Glycerin, besonders interessant. Auch in diesem Fall ist es möglich, nach der speziell beabsichtigten Verwendung gemischte Ester zu verwenden. Alicydische Alkohole, die zum Beispiel von Cyclopentan und Cyclohexan und von ihren Derivaten abgeleitet sind, die mit Niederalkylresten, zum Beispiel Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, im besonderen mit Methylgruppen, substituiert sind, sind ebenfalls verwendbar.
Zur kosmetischen Anwendung ist die Verwendung vernetzter Derivate mit veresterten Gruppen, die zu denen für die Verwendung in sanitären, medizinischen und chirurgischen Artikeln vorstehend aufgeführten weitgehend identisch sind, bevorzugt. Terpenalkohole, wie die vorstehend erwähnten, im besonderen wohlriechende Alkohole für die Herstellung von Parfüms und parfümierten Cremes, sollen ebenfalls berücksichtigt werden.
In allen vernetzten Derivaten nach der vorliegenden Erfindung können die nicht "vernetzten" oder nicht veresterten Carboxylgruppen frei sein oder als Salz vorliegen. Die Salze können anorganische Basen, zum Beispiel Alkalimetalle, wie Kalium und im besonderen Natrium und Ammonium, und Erdalkalimetalle, wie Calcium, oder Magnesium- und Aluminiumsalze, oder organische Basen, im besonderen azotierte Basen und daher aliphatische, araliphatische, cycloaliphatische oder heterocyclische Amine, aufweisen. Diese Salze können sich von therapeutisch verträglichen, jedoch unwirksamen Ammen oder von Ammen mit einer therapeutischen Wirkung ableiten.
Von den ersteren sollten vor allem die aliphatischen Amine, zum Beispiel Mono-, Di- und Trialkylamine mit Alkylresten mit maximal 18 Kohlenstoffatomen, oder Arylalkylamine mit derselben Zahl von Kohlenstoffatomen in dem aliphatischen Teil, wobei der Arylrest eine Benzolgruppe bedeutet, die möglicherweise mit 1 bis 3 Methylgruppen oder Halogenatomen oder Hydroxylgruppen substituiert ist, berücksichtigt werden. Die biologisch unwirksamen Basen für die Bildung der Salze können auch cyclisch sein, wie monocyclische Alkylenamine mit Ringen aus 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, die durch Heteroatome, die aus einem Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatom ausgewählt sind, im Ring unterbrochen sein können, wie Piperidin, Piperazin oder Morpholin, oder können zum Beispiel mit Amino- oder Hydroxylfunktionen substituiert sein, wie Aminoethanol, Ethylendiamin, Ephedrin oder Cholin.
Die Bildung der quartären Ammoniumsalze von partiellen Estern, zum Beispiel Tetraalkylammoniumsalze mit der vorstehend genannten Zahl von Kohlenstoffatomen und bevorzugt Salze derselben Art, in denen der vierte Alkylrest 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist, zum Beispiel eine Methylgruppe, ist auch möglich.
Die biologisch wirksamen Amine, deren therapeutische Wirkung angewendet werden kann, umfassen azotierte und basische Arzneistoffe, wie die, die in den folgenden Gruppen enthalten sind:
Alkaloide, Peptide, Phenothiazin, Benzodiazepin, Thioxanten, Hormone, Vitamine, Antikonvulsiva, Antipsychotika, Antiemetika, Anästhetika, Hypnotika, Anorektika, Beruhigungsmittel, Muskelrelaxantien, koronare Vasodilatatoren, Antineoplastika, Antibiotika, antibakterielle Mittel, antivirale Mittel, Antimalariamittel, Inhibitoren der Carboanhydrase, nicht-steroide entzündungshemmende Mittel, Vasokonstriktoren, cholinerge Agonisten, cholinerge Antagonisten, adrenerge Agonisten, adrenerge Blocker, narkotische Antagonisten.
Alle die in der Erfindung aufgeführten Arzneistoffe mit den basischen, azotierten Gruppen können als Beispiele hinsichtlich der Verwendung der Ester erwähnt werden. Die Salzbildung der nicht-veresterten Carboxylgruppen mit therapeutisch wirksamen Basen kann die Trägerfunktion der neuen, vernetzten Derivate, die durch Veresterung mit therapeutisch wirksamen Alkoholen erhaltenen werden, ersetzen oder integrieren und stellt daher einen weiteren speziellen Fall der Verwendung der neuen Verbindungen als therapeutische Träger nach Punkt 2) dar: die wirksamen Basen werden nicht nur durch die neutralen Salze, die durch Zugabe der stöchiometrischen Menge der Base erhältlich sind, sondern auch durch die basischen Salze, die durch Zugabe eines Überschusses an Base oder von den Säuren erhältlich sind, die durch Zugabe eines Mangels an Base erhältlich sind, zu Trägern gemacht.
Die neuen Hyaluronsäurederivate nach der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich, da sie Arzneimittel zur lokalen oder topischen Verwendung, im besonderen in der Augenheilkunde, sind, wo sie eine spezielle Verträglichkeit mit dem Hornhautepithel zeigen und daher ohne Sensibilisierungswirkungen sehr gut vertragen werden. Ferner ist es bei einer Verabreichung der Arzneimittel in Form von konzentrierten Lösungen mit elastoviskosen Eigenschaften oder in fester Form auf das Hornhautepithel möglich, homogene, stabile und vollkommen durchsichtige Filme zu erhalten, die auch perfekt haften, wodurch eine längere Bioverfügbarkeit des Arzneistoffes sichergestellt wird, und die daher ausgezeichnete Zubereitungen mit einer Retardwirkung darstellen.
Diese Arzneimittel für die Augen sind im Veterinärbereich von außergewöhnlichem Wert, wenn man berücksichtigt, daß es gegenwärtig keine veterinären Spezialpräparate, die chemische Mittel enthalten, gibt. Tatsächlich werden Produkte, die zur Verwendung bei Menschen gedacht sind, bei Tieren verwendet, und diese können nicht immer einen speziellen Wirkungsbereich sicherstellen und sind manchmal für eine Anwendung unter den Bedingungen, unter denen sie verabreicht werden sollen, ungeeignet. Zum Beispiel ist dies der Fall bei der Therapie infektiöser Keratokonjunktivitis, Bindehautentzündung oder IBK, einer Infektion, die in der Regel Rinder, Schafe und Ziegen befällt. Vermutlich existieren für diese drei Arten spezielle ätiologische Faktoren und insbesondere: bei Rindern scheint der beteiligte Hauptmikroorganismus Moraxella bovis zu sein (wenn auch weitere Erreger viralen Ursprungs, wie das Rhinotracheitisvirus, in Schafen Mycoplasma, Rickettsia und Clamydia, in Ziegen Rickettsia nicht ausgeschlossen werden sollen). Die Erkrankung tritt in akuter Form auf und neigt zu schneller Ausbreitung: in den Anfangsstadien ist die Symptomatologie durch Lidkrämpfe und übermäßige Tränensekretion, gefolgt von eiterigem Ausfluß, Bindehautentzündung und Hornhautentzündung, häufig verbunden mit Fieber, einer Abnahme des Appetits und der Milchbildung, gekennzeichnet. Besonders ernst sind die Hornhautschäden, die im Endstadium sogar eine Perforation der Hornhaut selbst verursachen können. Der klinische Verlauf variiert von wenigen Tagen bis zu mehreren Wochen.
Einen weiten Therapiebereich umfassende chemische Mittel werden verwendet, die sowohl auf topischem Weg (oft in Verbindung mit entzündungshemmenden, steroiden Mitteln) als auch auf systemischem Weg verabreicht werden, wie: Tetracycline, wie Oxytetracydin, Penicilline, wie Cloxacillin und Benzylpenicillin, Sulfamide, Polymixin B (in Verbindung mit Miconazol und Prednisolon), Chloramphenicol, Tylosin und Chloromycetin. Eine topische Behandlung der Erkrankung ist trotz ihrer offensichtlichen Einfachheit noch ein offenes Problem, da es mit den bis jetzt verwendeten okularen Zubereitungen aus dem einen oder anderen Grund nicht möglich war, Konzentrationen von therapeutisch wirksamen Antibiotika oder Sulfamiden in der Tränenflüssigkeit zu erhalten. Diese Tatsache ist im Fall von Lösungen ziemlich verständlich, wenn man die überwiegend geneigte Stellung des Kopfes bei den vorstehend erwähnten Tieren berücksichtigt, aber es trifft auch für halbfeste Arzneimittel zu, da die in denselben im allgemeinen verwendeten Excipientien nicht die erforderlichen Qualitäten aufweisen, um auf der Oberfläche der Hornhaut zu haften. Dies ist der Fall, da sie in der Regel keine ausreichend hohe Wirkstoflkonzentration aufweisen und keine perfekte Verteilung desselben (Vorliegen eines Verteilungsgradienten) erreichen können. Diese Nachteile herkömmlicher Augenkollyria wurden zum Beispiel von Slatter et al. in "Austr. vet. J.", 1982, 59(3), S. 69-72, beschrieben. Mit den erfindungsgemaßen Estem können diese Schwierigkeiten überwunden werden. Tatsächlich ermöglicht die Gegenwart der Hyaluronsäureester als Träger in Arzneistoffen für die Augen die Formulierung ausgezeichneter Zubereitungen ohne Konzentrationsgradient des Wirkstoffes, wodurch sie vollkommen homogen, durchsichtig und auf dem Hornhautepithel haftend ohne Sensibilisierungswirkungen sind, und wobei der Wirkstoff als ausgezeichneter Träger, möglicherweise auch mit einer Retardwirkung, wirkt. Arzneimittel, die die neuen Derivate enthalten, die bei Augenbehandlungen verwendet werden können, betreffen hauptsächlich pupillenverengende, wundheilende, entzündungshemmende und antimikrobielle/antibiotische Wirkungen. Einige Beispiele antibiotischer Substanzen sind: basische und nicht-basische Antibiotika, zum Beispiel Aminoglucoside, Macrolide, Tetracyclin und Peptide, wie zum Beispiel Gentamycin, Neomycin, Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Kanamycin, Amikacin, Tobramycin, Spectinomycin, Erythromycin, Oleandomycin, Carbomycin, Spiramycin, Oxytetracyclin, Rolitetracyclin, Bacitracin, Polymyxin B, Gramicidin, Colistin, Chloramphenicol, Lincomycin, Vancomycin, Novobiocin, Ristocetin, Clindamycin, Amphotericin B, Griseofulvin, Nystatin und möglicherweise ihre Salze, wie Sulfate oder Nitrate, oder Vereinigungen derselben entweder untereinander oder mit weiteren Wirkstoffen, wie zum Beispiel den nachstehend erwähnten.
Weitere Arzneistoffe für die Augen, die vorteilhafterweise nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, sind: weitere antiinfektiöse Mittel, wie Diethylcarbamazin, Mebendazol; Sulfamide, wie Sulfacetamid, Sulfadiazin, Sulfisoxazol; antivirale und antitumorale Mittel, wie Ioddeoxyuridin, Adeninarabinosid, Trifluorthymidin, Acyclovir, Ethyldeoxyuridin, Bromvinyldeoxyuridin, 5-Iod-5'-amino-2',5'-dideoxyuridin; steroide, entzündungshemmende Mittel, wie Dexamethason, Hydrocortison, Prednisolon, Fluormetholon, Medryson und möglicherweise ihre Ester, zum Beispiel Phosphorsäureester; nicht-steroide, entzündungshemmende Mittel, wie Indomethacin, Oxyphenbutazon, Flurbiprofen; Wundheilungsmittel, wie der epidermale Wachtumsfaktor EGF; Lokalanästhetika, wie Benoxinat, Proparacain und möglicherweise ihre Salze; Arzneistoffe aus cholinergen Agonisten, wie Pilocarpin, Methacholin, Carbamylcholin, Aceclidin, Physostigmin, Neostigmin, Demecarium und möglicherweise ihre Salze; Arzneistoffe aus cholinergen Blockem, wie Atropin und seine Salze; Arzneistoffe aus adrenergen Agonisten, wie Noradrenalin, Adrenalin, Naphazolin, Methoxamin und möglicherweise ihre Salze; Arzneistoffe aus adrenergen Blockern, wie Propranolol, Timolol, Pindolol, Bupranolol, Atenolol, Metoprolol, Oxprenolol, Practolol, Butoxamin, Sotalol, Butadrin, Labetalol und möglicherweise ihre Salze.
Beispiele von Wirkstoffen, die selbst oder vereinigt mit weiteren Wirkstoffen in der Dermatologie verwendet werden sollen, sind: therapeutische Mittel, wie antiinfektiöse Mittel, Antibiotika, antimikrobielle Mittel, entzündungshemmende Mittel, Zytostatika, Zytotoxika, antivirale Mittel, Anästhetika und vorbeugende Mittel, wie Sonnenschutzmittel, Deodorantien, Antiseptika und Desinfektionsmittel.
Aus den für die Ophthalmologie und Dermatologie angeführten Beispielen ist es angemessen, analog annunehmen, welche die nach der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in den verschiedenen Bereichen der Medizin geeigneten Arzneimittel sind, wie zum Beispiel Otolaryngologie, Gynäkologie, Angiologie, Neurologie oder einer beliebigen weiteren Art der Pathologie der inneren Organe, die durch lokale, topische Anwendungen, zum Beispiel durch rektale Wirkung, behandelt werden können. Es ist naturlich möglich, Vereinigungen von therapeutischen Wirkstoffen mit den neuen Derivaten nach der vorliegenden Erfindung herzustellen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind. In dem letzteren Fall sollten zur Herstellung waßriger Lösungen zur Injektion Hyaluronsäurederivate mit einem niedrigen Vernetzungs- und/oder Veresterungsgrad gewählt werden. Derivate, die nur schwach oder überhaupt nicht in Wasser löslich sind, können zur Herstellung von Vereinigungen, die die Wirkstoffe zur Verabreichung in Lösungen organischer Substanzen, zum Beispiel öligen Lösungen, enthalten, verwendet werden.
Die Arzneimittel der hier beschriebenen Art zur topischen Verwendung können in fester Form vorliegen, wie gefriergetrocknete Pulver, die nur die zwei Komponenten als Gemisch oder getrennt enthalten. Diese Arzneimittel in fester Form bilden beim Kontakt mit dem zu behandelnden Epithel nach der Natur des speziellen Epithels mehr oder weniger konzentrierte Lösungen mit denselben Eigenschaften wie die Lösungen, die vorstehend in vitro hergestellt wurden, und die eine weitere besonders interessante erfindungsgemäße Ausführungsform darstellen. Diese Lösungen liegen bevorzugt in destilliertem Wasser oder steriler Salzlösung vor und enthalten bevorzugt neben dem Hyaluronsäureester oder einem seiner Salze keinen weiteren pharmazeutischen Träger. Die Konzentrationen dieser Lösungen können auch innerhalb weiter Grenzen variieren, zum Beispiel von 0,01 bis 75 % für jede der zwei getrennt genommenen Komponenten und für ihre Gemische oder Salze. Lösungen mit ausgeprägten elastoviskosen Eigenschaften, zum Beispiel mit einem Gehalt des Arzneimittels oder jeder seiner Komponenten von 10 % bis 90 %, sind besonders bevorzugt. Arzneimittel dieser Art sowohl in wasserfreier Form (gefriergetrocknetes Pulver) als auch als konzentrierte Lösungen oder in Wasser oder Salzlösung verdünnt, möglicherweise mit der Zugabe von Zusätzen oder Hilfsstoffen, wie in besonderen desinfizierenden Substanzen oder Mineralsalzen, die als Träger wirken, oder weiteren, zur Verwendung am Auge sind besonders wichtig.
Von den erfindungsgemäßen Arzneimitteln werden je nach Fall bevorzugt die mit einem Aciditätsgrad ausgewählt, der für die Umgebung, in der sie angewendet werden sollen, geeignet ist, das heißt mit einem physiologisch verträglichen pH-Wert. Der pH-Wert kann, zum Beispiel in den vorstehenden Salzen der Hyaluronsäureester mit einer wirksamen, basischen Substanz, durch geeignetes Regulieren der Menge an Polysaccharid, seiner Salze und der basischen Substanz selbst eingestellt werden. Somit wird zum Beispiel, der Überschuß an freien Säuregruppen mit den vorstehend genannten anorganischen Basen, zum Beispiel mit Natrium- oder Kalium- oder Ammoniumhydroxid, neutralisiert, wenn die Acidität eines Salzes eines Hyaluronsäureesters mit einer basischen Substanz zu hoch ist.

Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen HY-Estern

Die erfindungsgemaßen neuen, vernetzten Derivate können durch Verfahren hergestellt werden, die an sich für die Veresterung von Carbonsäuren, zum Beispiel für die Behandlung von freier Hyaluronsäure mit den vorstehenden, mehrwertigen Alkoholen in Gegenwart von Katalysatoren, wie starken, anorganischen Säuren oder Ionenaustauschem vom Säuretyp, oder mit einem Veresterungsmittel, das den erwünschten Alkoholrest in Gegenwart von anorganischen oder organischen Basen einführen kann, bekannt sind. Es ist möglich, als Veresterungsmittel die in der Literatur genannten, wie im besonderen die Ester verschiedener anorganischer Säuren oder organischer Sulfonsäuren, wie Wasserstoffsäuren, das heißt die Alkylhalogenide, wie Methyliodid, oder weitere Alkylreste, die der Grundbestandteil der vorstehenden zweiwertigen Alkohole sind, zu verwenden.
Die Umsetzung kann in einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel einem Alkohol, bevorzugt dem, der dem Alkylrest entspricht, der in die Carboxylgruppe eingeführt werden soll, durchgeführt werden, aber sie kann auch in nicht-polaren Lösungsmitteln, wie Ketonen, Ethern, wie Dioxan, oder aprotischen Lösungsmitteln, wie Dimethylsulfoxid, durchgeführt werden. Es ist möglich, zum Beispiel ein Hydroxid eines Alkalimetalls, Erdalkalimetalls oder von Magnesium oder ein Silberoxid oder ein basisches Salz eines dieser Metalle, wie Carbonat, und von den organischen Basen, eine tertiäre, azotierte Base, wie Pyridin oder Collidin, als Base zu verwenden. Anstelle der Base kann ein Ionenaustauscher vom basischen Typ verwendet werden.
Ein weiteres Veresterungsverfahren umfaßt Metallsalze oder Salze mit organischen, azotierten Basen, zum Beispiel Ammonium- oder Ammoniumersatzsalze. Bevorzugt sollten die Salze von Alkali- oder Erdalkalimetallen verwendet werden, aber ein beliebiges weiteres Metallsalz kann ebenfalls verwendet werden. Die Veresterungsmittel sind auch in diesem Fall die vorstehend erwähnten und dasselbe gilt für die Lösungsmittel. Bevorzugt sollten aprotische Lösungsmittel, zum Beispiel Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid, verwendet werden. Diese Veresterungsverfahren können natürlich auch zur Herstellung der vorstehend beschriebenen einfachen Ester verwendet werden.
Nach einem neuen und originalen Verfahren, das in der vorstehenden, ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung beschrieben ist und die einfachen Ester von Hyaluronsäure betrifft, können diese vorteilhafterweise ausgehend von den quartären Ammoniumsalzen von Hyaluronsäure mit einem Veresterungsmittel in einem aprotischen Lösungsmittel, wie Dialkylsulfoxiden, Dialkylcarboxylamiden, wie im besonderen Niederalkyldialkylsulfoxiden, vor allem Dimethylsulfoxid, und Niederalkyldialkylamiden niederaliphatischer Säuren, wie Dimethyl- oder Diethylformamid oder Dimethyl- oder Diethylacetamid, hergestellt werden. Die Umsetzung wird bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 100ºC, und im besonderen von etwa 25 bis 75ºC, zum Beispiel bei etwa 30ºC, durchgeführt. Die Veresterung wird bevorzugt durch allmähliche Zugabe des Veresterungsmittels zu dem vorstehenden Ammoniumsalz, das in einem der erwähnten Lösungsmittel, zum Beispiel in Dimethylsulfoxid, gelöst ist, durchgeführt.
Dasselbe Verfahren kann zur Herstellung der typischen, vernetzten erfindungsgemäßen Ester verwendet werden, das heißt, die Brückenbindungen zwischen zwei Carboxylgruppen werden durch veresternde Substanzen, die sich von den vorstehenden mehrwertigen Alkoholen ableiten, mit den quartären Ammoniumsalzen von Hyaluronsäure leicht gebildet. Als quartäre Ausgangsammoniumsalze werden bevorzugt Ammoniumtetraniederalkylate verwendet, wobei die Alkylreste bevorzugt 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen. Als erste Wahl sollte Tetrabutylammoniumhyaluronat verwendet werden. Diese quartären Ammoniumsalze können durch Umsetzen eines Metallsalzes von Hyaluronsäure, bevorzugt eines der vorstehend erwähnten, im besonderen des Natrium- oder Kaliumsalzes, in wäßriger Lösung mit einem Salz eines Sulfonsäureharzes mit der quarären Ammoniumbase hergestellt werden. Tetraalkylammoniumhyaluronat kann durch Gefriertrocknen des Eluats erhalten werden.
Die Tetraalkylammoniumhyaluronate, die sich von Niederalkylresten, im besonderen Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ableiten, sind neu und bilden eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung. Unerwarteterweise erwies es sich, daß diese Salze in den vorstehenden aprotischen Lösungsmitteln löslich sind, und die Veresterung von Hyaluronsäure nach dem vorstehenden neuen Verfahren ist daher besonders leicht und ergibt reiche Ausbeuten. Daher ist es nur durch dieses Verfahren möglich, die Zahl der zu veresternden Carboxylgruppen von Hyaluronsäure genau zu dosieren.
Eine Änderung des vorstehend angegebenen Verfahrens besteht im Umsetzen des Kalium- oder Natriumsalzes von Hyaluronsäure, das in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, suspendiert ist, mit einem geeigneten Veresterungsmittel in Gegenwart einer katalysierenden Menge eines quartären Ammoniumsalzes, wie Tetrabutylammoniumiodid. Zur Herstellung der neuen Ester nach der vorliegenden Erfindung können Hyaluronsäuren beliebigen Ursprungs, zum Beispiel die Säuren, die aus den vorstehenden natürlichen Ausgangsmaterialien, zum Beispiel aus Hahnenkämmen, extrahiert wurden, verwendet werden. Die Herstellung dieser Säuren ist in der Literatur beschrieben: bevorzugt sollten gereinigte Hyaluronsäuren verwendet werden. Nach der Erfindung ist die Verwendung von Hyaluronsäuren bevorzugt, die die Molekülfraktionen der vollständigen Säuren umfassen, die durch Extraktion der organischen Materialien mit Molekulargewichten, die breit variieren können, zum Beispiel von etwa 90 % - 80 % bis 0,2 %, bevorzugt von 5 % bis 0,2 %, des Molekulargewichts der vollständigen Säure, direkt erhalten werden. Diese Fraktionen können durch verschiedene, in der Literatur beschriebene Verfahren, nämlich durch Hydrolysieren oder Oxidieren oder enzymatische Mittel oder physikalische Verfahren, zum Beispiel mechanische Verfahren, oder durch Bestrahlung erhalten werden, und häufig werden daher primordiale Extrakte während dieser erwähnten Reinigungsverfahren gebildet (siehe zum Beispiel der vorstehend erwähnte Artikel von Balazs et al. in "Cosmetics & Toiletries"). Die Trennung und Reinigung der erhaltenen Molekülfraktionen wird zum Beispiel durch bekannte Verfahren, zum Beispiel durch Molekülfiltration, durchgeführt.
Eine gereinigte HY-Fraktion, die zur Verwendung nach der Erfindung geeignet ist, ist zum Beispiel die als "nicht-entzändliches Natriumhyaluronat-NIF-NaHA" bezeichnete, die durch Balazs in dem Merkblatt "Healon" - A guide to its use in Ophthalmic Surgery - D. Miller & R. Stegman, Hrsg. John Wiley & Sons N.Y. 81983: S. 5, beschrieben ist. Besonders wichtig als Ausgangsmaterialien für die Ester der vorliegenden Erfindung sind zwei gereinigte Fraktionen, die aus Hyaluronsäure, zum Beispiel der aus Hahnenkämmen extrahierten Art, erhältlich sind und die unter den Namen "Hyalastin" und Hyalectin" bekannt sind. Die Hyalastin-Fraktion weist ein Molekulargewichtsmittel von etwa 50000 bis 100000 auf, während die Hyalectin-Fraktion ein Molekulargewichtsmittel von etwa 500000 bis 730000 aufweist. Eine aus diesen zwei Fraktionen kombinierte Fraktion wurde ebenfalls isoliert und durch ein Molekulargewichtsmittel von etwa 250000 bis 350000 charakterisiert. Diese kombinierte Fraktion kann mit einer Ausbeute an vollständiger Hyaluronsäure, die 80 % der in dem speziellen Ausgangsmaterial verfügbaren Menge entspricht, erhalten werden, während die Hyalectin-Fraktion mit einer Ausbeute von 30 % und die Hyalastin-Fraktion mit einer Ausbeute von 50 % der Ausgangs-HY erhalten werden können. Die Herstellung dieser Fraktionen ist in den Beispielen 38 und 40 beschrieben.
In den neuen, vernetzten Derivaten von Hyaluronsäure können die nicht-veresterten Carboxylgruppen frei sein oder als Salz oder partielles Salz vorliegen, und daher werden vielfältige unterschiedliche Arten von vernetzten Produkten erhalten. Das heißt, die, in denen die übrigen Carboxylgruppen frei sind oder als Salz vorliegen, und die, in denen die übrigen Carboxylgruppen vollständig oder teilweise verestert sind, und in den letzteren können die übrigen Gruppen dann wieder frei sein oder als Salz vorliegen. Somit ist ein ganzer Bereich von Produkten verfügbar, die in ihren physikalischen Eigenschaften und im besonderen hinsichtlich ihres Aciditätsgrades, ihrer viskoelastischen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit zur Gelbildung variieren. Die Zahl der freizuhaltenden Säuregruppen kann für die Herstellung von Arzneimitteln mit einem speziellen pH-Wert wichtig sein.
Die Herstellung der Salze der neuen Derivate kann auf die bekannte Art und Weise, zum Beispiel durch Umsetzen des Hyaluronsäurederivats mit der berechneten Menge an zum Beispiel basischen Alkalihydroxiden oder basischen Salzen von Alkalimetallen, wie Carbonaten oder Hydrogencarbonaten, durchgeführt werden. Es ist zum Beispiel möglich, zuerst wäßrige Lösungen des Hyaluronsäurederivats und der Base herzustellen, diese Substanzen mit geeigneten Ionenaustauschem aus den wäßrigen Löungen ihrer Salze freizusetzen, und die zwei Lösungen bei einer niedrigen Temperatur, zum Beispiel 0 bis 20ºC, zu vereinigen; wenn das so erhaltene Salz in Wasser leicht löslich ist, wird es gefriergetrocknet, während die weniger löslichen Salze durch Zentrifligation oder Filtration oder Dekantieren abgetrennt und möglicherweise anschließend getrocknet werden können. Im Fall der organischen Basen, die mit den neuen, vernetzten Derivaten einen Träger bilden sollen, können die Arzneimittel, die als Salze dieser Basen mit den neuen Derivaten erhalten werden, je nachdem ob stöchiometrische Mengen zugegeben werden oder ob ein Mangel oder Überschuß an Basen vorliegt, neutral, sauer oder basisch sein.
Nach einer speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Herstellung von Arzneimitteln der vorstehenden Art, beginnend mit den vorstehend isolierten und möglicherweise gereinigten Salzen in einem wasserfreien Zustand, wie amorphen Pulvem, die beim Kontakt mit dem zu behandelnden Gewebe eine konzentrierte, wäßrige Losung mit einem gelatineartigen Charakter, viskoser Konsistenz und elastischen Eigenschaften bilden, möglich. Diese Qualitäten werden auch bei stärkeren Verdünnungen aufrechterhalten, und mehr oder weniger konzentrierte Losungen in Wasser oder Salzlösung, möglicherweise mit der Zugabe weiterer Excipientien oder Zusätze, wie weiterer Mineralsalze, zur Regulierung des pH-Werts und des osmotischen Drucks, können anstelle der vorstehenden, wasserfreien Salze verwendet werden. Die Verwendung der Salze zur Herstellung von Gelen, Einlagen, Cremes oder Salben, umfassend weitere Excipientien oder Bestandteile, die in üblichen Formulierungen dieser pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden, ist natürlich auch möglich.
Von den neuen erfindungsgemäßen Produkten sollten die vorstehend beschriebenen Ester und ihre Salze und die, die in den folgenden veranschaulichenden Beispielen gezeigt sind, als besonderer Beweis vorgelegt werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Modifikationen der Herstellungsverfahren der neuen Ester und ihrer Salze, in denen ein Verfahren in einer beliebigen Stufe unterbrochen wird oder in denen das Verfahren mit einer Zwischenverbindung beginnt und die übrigen Stufen anschließend durchgeführt werden, oder in denen die Ausgangsprodukte in situ gebildet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne daß sie ihren Umfang einschränken, wobei DMSO Dimethylsulfoxid bedeutet. Die in den Beispielen beschriebenen Produkte umfassen vernetzte erfindungsgemäße Ester, die einen Prozentsatz der mit einem mehrwertigen Alkohol veresterten Carboxylgruppen von Hyaluronsäure aufweisen, und deren übrige Carboxylgruppen ein Salz bilden und/oder mit einem einwertigen Alkohol verestert sind. Tabelle 1 führt die verschiedenen Produkte nach den Beispielen 1-37 auf, wobei die Zahl der mit dem bestimmten mehrwertigen Alkohol veresterten Carboxylgruppen und die Zahl der mit Natrium ein Salz bildenden und/oder mit dem bestimmten einwertigen Alkohol veresterten Carboxylgruppen beschrieben sind.

Beispiel 1 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Ryaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter streng feuchtigkeitsfreien Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,078 g (0,5 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,074 g (0,25 mmol, entsprechend 0,5 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,01 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. (Anal. Biochem. 33, 1028, 1961) durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 0,56 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 0,574). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Auf diese Art und Weise ist die Bestimmung des Gehalts der

Beispiel 2 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter streng feuchtigkeitsfreien Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,078 g (0,5 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,148 g (0,5 mmol, entsprechend 1 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,99 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 0,56 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 0,574). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Auf diese Art und Weise ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen, der 0,36 mÄq/g (theoretisch: 0,374) entspricht, möglich.

Beispiel 3 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter streng feuchtigkeitsfreien Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,078 g (0,5 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,296 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,98 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 0,56 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 0,574). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Auf diese Art und Weise ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen, der 0,61 mÄq/g (theoretisch: 0,623) entspricht, möglich.

Beispiel 4 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter streng feuchtigkeitsfreien Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,156 g (1 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,296 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,00 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 1,08 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 1,15). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,735 mÄq/g (theoretisch: 0,747) möglich.

Beispiel 5 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,312 g (2 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,296 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Futration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,01 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 2,18 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 2,29). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,98 mÄq/g (theoretisch: 0,995) möglich.

Beispiel 6 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter streng feuchtigkeitsfreien Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,624 g (4 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Losung wird 15 h bei 30ºC gerüüüt. 0,296 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Futration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,00 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 4,5 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 4,57). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,43 mÄq/g (theoretisch: 1,49) möglich.

Beispiel 7 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,934 g (6 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,296 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,03 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 6,74 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 6,83). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,96 mÄq/g (theoretisch: 1,98) möglich.

Beispiel 8 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 1,170 g (7,5 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,296 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,02 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 8,46 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 8,52). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 2,28 mÄq/g (theoretisch: 2,34) möglich.

Beispiel 9 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 tnaq) des Tetrabutylamrmoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,624 g (4 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,592 g (2 mmol, entsprechend 4 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,99 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 4,42 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 4,57). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,96 mÄq/g (theoretisch: 1,99) möglich.

Beispiel 10 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,4-Butandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,312 g (2 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,310 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,4-Diiodbutan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, wanrend sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,02 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 2,3 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 2,28). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,97 mÄq/g (theoretisch: 0,99) möglich.

Beispiel 11 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,4-Butandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,624 g (4 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,310 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,4-Diiodbutan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,95 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 2,25 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 2,28). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,41 mÄq/g (theoretisch: 1,48) möglich.

Beispiel 12 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,4-Butandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,936 g (6 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhi-t. 0,310 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,4-Diiodbutan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,98 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 6,69 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 6,81). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,91 mÄq/g (theoretisch: 1,97) möglich.

Beispiel 13 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,6-Hexandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,312 g (2 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,244 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,6-Dibromhexan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,05 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 2,18 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 2,27). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Uberschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,96 mÄq/g (theoretisch: 0,985) möglich.

Beispiel 14 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,6-Hexandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,624 g (4 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,244 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,6-Dibromhexan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,02 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 4,46 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 4,52). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,43 mÄq/g (theoretisch: 1,47) möglich.

Beispiel 15 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,6-Hexandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,934 g (6 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,244 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1 ,6-Dibromhexan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,00 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 6,68 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 6,76). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,91 mÄq/g (theoretisch: 1,96) möglich.

Beispiel 16 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,8-Octandiol vernetzter Ryaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,078 g (0,5 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,068 g (0,25 mmol, entsprechend 0,5 mÄq) 1 ,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,99 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 0,54 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 0,571). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,23 mÄq/g (theoretisch: 0,25) möglich.

Beispiel 17 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,8-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,078 g (0,5 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,136 g (0,5 mmol, entsprechend 1 mÄq) 1,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,97 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 0,55 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 0,569). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,35 mÄq/g (theoretisch: 0,37) möglich.

Beispiel 18 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,8-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,078 g (0,5 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,272 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem R&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,05 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 0,55 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 0,564). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Ijberschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,60 mÄq/g (theoretisch: 0,61) möglich.

Beispiel 19 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,8-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,156 g (1 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerulirt. 0,272 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekiiblt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,01 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 1,09 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 1,13). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgefülirt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,70 mÄq/g (theoretisch: 0,73) möglich.

Beispiel 20 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1 ,8-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,312 g (2 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerulut. 0,272 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1 ,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,05 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 2,05 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 2,25). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,96 mÄq/g (theoretisch: 0,98) möglich.

Beispiel 21 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,8-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,624 g (4 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,272 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1 ,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Futration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,99 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 4,39 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 4,49). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,43 mÄq/g (theoretisch: 1,46) möglich.

Beispiel 22 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1 ,8-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von RY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,934 g (6 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,272 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,10 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 6,66 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 6,72). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,89 mÄq/g (theoretisch: 1,94) möglich.

Beispiel 23 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,8-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 1,170 g (7,5 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,272 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,03 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 8,27 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 8,38). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 2,05 mÄq/g (theoretisch: 2,3) möglich.

Beispiel 24 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,8-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,624 g (4 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,544 g (2 mmol, entsprechend 4 mÄq) 1,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,15 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 4,36 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 4,42). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,90 mÄq/g (theoretisch: 1,92) möglich.

Beispiel 25 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,10-Decandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,312 g (2 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerrt. 0,300 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,10-Dibromdecan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,12 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 2,12 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 2,24). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgefülirt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,94 mÄq/g (theoretisch: 0,97) möglich.

Beispiel 26 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,10-Decandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,624 g (4 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,300 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) l,10-Dibromdecan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,10 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 4,36 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 4,46). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,43 mÄq/g (theoretisch: 1,45) möglich.

Beispiel 27 - Herstellung von partiell mit Ethanol veresterter und partiell mit 1,10-Decandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,934 g (6 mmol) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC geruhrt. 0,300 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,1 0-Dibromdecan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,12 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Ethoxybestimmung wird nach dem Verfahren von Cundiff et al. durchgeführt und zeigt einen Gehalt von 6,5 % Gew./Gew. als Ethanol (theoretisch: 6,67). Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,87 mÄq/g (theoretisch: 1,93) möglich.

Beispiel 28 - Herstellung von partiell mit Benzylalkohol veresterter und partiell mit 1,8- Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,342 g (2 mmol) Benzylbromid werden zugegeben, und die Lösung wird 15 h bei 30ºC gerührt. 0,272 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,15 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,93 mäq/ g (theoretisch: 0,95) möglich.

Beispiel 29 - Herstellung von partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,296 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,98 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifiingsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgefülirt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,47 mÄq/g (theoretisch: 0,499) möglich.

Beispiel 30 - Herstellung von partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Ryaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,740 g (2,5 mmol, entsprechend 5 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,89 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,21 mÄq/ g (theoretisch: 1,25) möglich.

Beispiel 31 - Herstellung von partiell mit 1,3-Propandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter streng feuchtigkeitsfreien Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 1,184 g (4 mmol, entsprechend 8 mÄq) 1,3-Diiodpropan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,87 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 1,97 mÄq/ g (theoretisch: 2,00) möglich.

Beispiel 32 - Herstellung von partiell mit 1,4-Butandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,310 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,4-Diiodbutan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,00 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,492 mÄq/g (theoretisch: 0,497) möglich.

Beispiel 33 - Herstellung von partiell mit 1,6-Hexandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,370 g (1 mmol) Tetrabutylammoniumiodid werden zugegeben, und die Lösung wird 1 Stunde bei 20ºC gerührt. 0,244 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,6-Dibromhexan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während die von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,01 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,486 mÄq/g (theoretisch: 0,494) möglich.

Beispiel 34 - Herstellung von partiell mit 1,3-Octandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,370 g (1 mmol) Tetrabutylammoniumiodid werden zugegeben, und die Lösung wird 1 Stunde bei 20ºC gerührt. 0,272 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,8-Dibromoctan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
4,02 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,478 mÄq/g (theoretisch: 0,490) möglich.

Beispiel 35 - Herstellung von partiell mit 1,10-Decandiol vernetzter Hyaluronsäure (HY)

6,21 g (10 mÄq) des Tetrabutylammoniumsalzes von HY werden bei 25ºC unter völlig trockenen Bedingungen in Stickstoffatmosphäre und lichtgeschützt in 248 ml DMSO gelöst. 0,369 g (1 mmol) Iodid werden zugegeben, und die Losung wird 1 Stunde bei 20ºC gerührt. 0,300 g (1 mmol, entsprechend 2 mÄq) 1,10-Dibromdecan werden zugegeben, und nach dem Homogenisieren wird die Lösung 24 h bei 30ºC gehalten.
Zur Umwandlung der übrigen Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen in das Natriumsalz werden 2,5 g NaCl, die in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst sind, zu der entstandenen Lösung gegeben, während sie von außen mit einem H&sub2;O/Eis-Bad gekühlt wird.
500 ml Aceton werden zugegeben, der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, dreimal mit 100 ml Aceton/H&sub2;O, 5:1, und dreimal mit 100 ml reinem Aceton gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
3,99 g der im Titel bezeichneten Verbindung werden erhalten.
Eine Analyse der gesamten Estergruppen wird durch eine Verseifungsreaktion mit einer überschüssigen Menge an 0,1 N NaOH 30 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der Überschuß wird durch Titration mit 0,1 N HCl unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Somit ist die Bestimmung des Gehalts der gesamten Estergruppen von 0,476 mÄq/g (theoretisch: 0,487) möglich. TABELLE 1 PROZENTUALE ZUSAMMENSETZUNG DER VERSCHIEDENEN, VERNETZTEN PRODUKTE

Beispiel 36 - Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus Hyalastin- und Hyalectinfraktionen ohne entzündliche Wirksamkeit

3000 g frische oder gefrorene Hahnenkämme werden in einem Fleischhacker zerkleinert und anschließend sorgfältig in einem mechanischen Homogenisator homogenisiert. Die so erhaltene Paste wird in einen AISI 316 Edelstahlbehälter oder in ein Glas gegeben und mit 10 Volumina wasserfreiem Aceton behandelt. Das Ganze wird 6 h mit einer Geschwindigkeit von 50 UpM bewegt. Man läßt es sich 12 h abscheiden, und anschließend wird das Aceton durch Absaugen verworfen. Die Acetonextraktion wird wiederholt, bis das verworfene Aceton den richtigen Feuchtigkeitsgrad (Karl-Fischer-Verfahren) erreicht. Das Ganze wird anschließend zentrifugiert und unter reduziertem Druck 5-8 h bei einer geeigneten Temperatur getrocknet. Etwa 500-600 g trockene, pulverisierte Hahnenkämme werden so erhalten.
300 g des trockenen Pulvers werden in einem wäßrigen, mit Phosphatpuffer gepuffertem Medium in Gegenwart einer geeigneten Menge an Cysteinhydrochlorid mit 0,2 g Papain enzymatisch verdaut. Es wird 24 h bei einer konstanten Temperatur von 60-65ºC mit 60 UpM bewegt. Das Ganze wird anschließend auf 25ºC abgekühlt, und 60 g Celite werden zugegeben, wobei eine weitere Stunde bewegt wird. Das erhaltene Gemisch wird filtriert, bis eine klare Flüssigkeit erhalten wird. Die klare Flüssigkeit wird auf Membranen mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 30000 einer molekularen Ultrafiltration unterzogen, um die Moleküle mit einem größeren Molekulargewicht als 30000 auf der Membran zurückzuhalten.
5 bis 6 Anfangsvolumina werden ultrafiltriert, wobei zu dem ultrafiltrierten Produkt kontinuierlich Wasser gegeben wird. Die Wasserzugabe wird eingestellt, und die Ultrafiltration wird fortgesetzt, bis das Volumen auf 1/3 des Anfangsvolumens verringert ist. Die übrige Flüssigkeit wird durch die Zugabe von Natriumchlorid auf 0,1 M eingestellt, und die Temperatur wird auf 50ºC eingestellt. Unter Bewegen mit 60 UpM werden 45 g Cetylpyridiniumchlorid zugegeben. Es wird 60 Minuten bewegt, und anschließend werden 50 g Celite zugegeben. Unter Bewegen wird die Temperatur des Ganzen auf 25ºC eingestellt, und der durch Zentrifügation gebildete Niederschlag wird gesammelt. Der erhaltene Niederschlag wird in 5 l einer 0,01 M Natriumchloridlösung, die 0,5 % Cetylpyridiniumchlorid enthält, suspendiert. Es wird 60 Minuten bei 50ºC bewegt; die Temperatur wird anschließend auf 25ºC eingestellt, und der Niederschlag wird zentrifugiert. Das Waschen wird dreimal wiederholt, und schließlich wird der Niederschlag in einem Vorfiuter, der 3 l einer 0,05 M Natriumchloridlösung mit 0,5 % Cetylpyridiniumchlorid enthält, gesammelt.
Es wird 60 Minuten mit 60 UpM bewegt, und die Temperatur wird 2 h konstant bei 25ºC gehalten. Der Überstand wird durch Zentrifligation entfernt. Das Verfahren wird mehrmals mit 0,1 M Natriumchloridlösungen, die 0,05 % Cetylpyridiniumchlorid enthalten, wiederholt. Das Gemisch wird zentrifugiert, und der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 3 l einer 0,30 M Natriumchloridlösung, die 0,5 % Cetylpyridiniumchlorid enthält, dispergiert. Das Gemisch wird bewegt, und sowohl der Niederschlag als auch die klare Flüssigkeit werden gesammelt. Die Extraktion des Niederschlages wird weitere dreimal wiederholt, wobei jedesmal 0,5 l derselben wäßrigen Lösung verwendet werden.
Schließlich wird der übrige Niederschlag entfernt, und die klaren Flüssigkeiten werden in einem Einzelbehälter gesammelt. Die Temperatur der Flüssigkeit wird auf 50ºC eingestellt, während weiter bewegt wird. Die Flüssigkeit wird anschließend mit Natriumchlorid auf 0,23 M eingestellt. 1 g Cetylpyridiniumchlorid wird zugegeben, und es wird 12 h weiter bewegt.
Das Gemisch wird auf 25ºC abgekühlt und anschließend zuerst auf Celite und dann durch ein Filter filtriert. Es wird anschließend erneut auf einer Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 30000 einer molekularen Ultrafiltration unterzogen, wobei drei Ausgangsvolumina unter Zugabe von 0,33 M Natriumchloridlösung ultrafiltriert wurden. Die Zugabe von Natriumchloridlösung wird eingestellt, und das Volumen wird auf 1/4 des Ausgangsvolumens verringert. Die so eingeengte Lösung wird unter Schütteln mit 60 UpM bei 25ºC mit 3 Volumina 95 %igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, und der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 11 Natriumchloridlösung (0,1 M) gelöst, und die Fällung wird mit 3 Volumina 95 %igem Ethanol wiederholt. Der Niederschlag wird gesammelt und zuerst dreimal mit 75 %igem Ethanol, anschließend dreimal mit absolutem Ethanol und schließlich dreimal mit absolutem Aceton gewaschen.
Das so erhaltene Produkt (HYALASTIN- + HYALECTIN-Fraktionen) weist ein Molekulargewichtsmittel von 250000 bis 350000 auf.
Die Ausbeute an HY entspricht 0,6 % des frischen Ausgangsgewebes.

Beispiel 37 - Verfahren zur Herstellung der Hyalastinfraktion aus dem durch das in Beispiel 36 beschriebene Verfahren erhaltenen Gemisch.

Das durch das in Beispiel 36 beschriebene Verfahren erhaltene Gemisch wird in einer Menge von 10 mg Produkt pro 1 ml Wasser in apyrogenem, destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird einer molekularen Filtration durch Filtermembranen mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 200000 unter Verwendung eines Konzentrationsverfahrens ohne die Zugabe von Wasser auf die Oberseite der Membran unterzogen. Während des Ultrafiltrationsverfahrens durch Membranen mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 200000 können die Moleküle mit einem größeren Molekulargewicht als 200000 nicht passieren, während die kleineren Moleküle zusammen mit Wasser durch die Membran passieren. Während des Filtrationsverfahrens wird kein Wasser auf die Oberseite der Membrane gegeben, so daß das Volumen abnimmt, und folglich die Konzentration von Molekülen mit einem größeren Molekulargewicht als 200000 zunimmt. Die Ultrafiltration wird fortgesetzt, bis das Volumen auf der Oberseite der Membran auf 10 % des Ausgangsvolumens verringert ist. Zwei Volumina apyrogenes, destilliertes Wasser werden zugegeben, und es wird erneut ultrafiltriert, bis das Volumen auf 1/3 des Ausgangsvolumens verringert ist. Der Vorgang wird weitere zweimal wiederholt. Die durch die Membran passierte Lösung wird mit Natriumchlorid auf 0,1 M eingestellt und wird anschließend mit 4 Volumina 95 %igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird dreimal mit 75 %igem Ethanol gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
Das so erhaltene Produkt (HYALASTIN-Fraktion) weist ein Molekulargewichtsmittel von 50000 bis 100000 auf.
Die Ausbeute an HY entspricht 0,4 % des ursprünglichen, frischen Ausgangsgewebes.

Beispiel 38 - Verfahren zur Herstellung der Hyalectinfraktion

Die eingeengte Lösung, die in dem Behälter auf der Oberseite der Ultrafiltrationsmembran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 200000 wie in Beispiel 37 gesammelt wurde, wird mit Wasser verdünnt, bis eine Lösung mit 5 mg/ml Hyaluronsäure erhalten wird, wie es durch quantitative Analyse bezogen auf die Dosierung von Glucuronsäure bestimmt wurde.
Die Lösung wird mit Natriumchlorid auf 0,1 M eingestellt und anschließend mit 4 Volumina 95 %igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird dreimal mit 75 %igem Ethanol gewaschen und anschließend unter reduziertem Druck getrocknet.
Das so erhaltene Produkt (HYALECTIN-Fraktion) weist ein Molekulargewicht von 500000 bis 730000 auf Dies entspricht einer speziellen Hyaluronsäurefraktion mit einer Molekülkette aus etwa 2500 bis 3500 Saccharideinheiten und mit einem hohen Reinheitsgrad. Die Ausbeute von HY entspricht 0,2 % des ursprünglichen, frischen Ausgangsgewebes.

Beispiel 39 - Herstellung von Folien vernetzter und partiell mit verschiedenen Alkoholen veresterter Derivate von Hyaluronsäure (HY)

Die DMSO-Lösungen, die nach der Zugabe aller Bestandteile und nach dem Homogenisieren wie in den Beispielen 6-15, 19-28 und 35 erhalten wurden, werden in Stickstoffatmosphäre unter völlig trockenen Bedingungen und lichtgeschützt 24 h in Glasschalen bis zu der erwünschten Dicke geschichtet. Die so erhaltenen Folien vernetzter und veresterter Hyaluronsäurederivate, in denen auch Tetrabutylammoniumcarboxylgruppen vorliegen, werden zuerst in 1 %igem NaCl und anschließend in destilliertem Wasser bei 4ºC dialysiert, wobei die Lösungen regelmäßig gewechselt werden. Die Folien, die die Natriumsalze der vorstehenden vernetzten Derivate enthalten, werden anschließend zwischen zwei Cellophanmembranen gegeben und in einem Plattentrockner unter reduziertem Druck bei 37ºC getrocknet.

Medizinische Produkte und pharmazeutische Zubereitungen

Die pharmazeutischen Zubereitungen, die die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate und ihre Salze als Wirkstoff enthalten, enthalten sowohl im Fall der vernetzten Derivate, die möglicherweise mit therapeutisch wirksamen Alkoholen weiter verestert sind und/ oder ein Salz bilden und für dieselben Indikationen wie Hyaluronsäure selbst beabsichtigt sind, als auch im Fall von Estern mit therapeutisch wirksamen Alkoholen, die zur Verwendung bei Indikationen, die diesen Alkoholen entsprechenden, beabsichtigt sind, die üblichen Bxcipientien und können zur oralen, rektalen, parenteralen, subkutanen, lokalen, intradermalen oder topischen Anwendung bestimmt sein. Sie liegen daher in fester oder halbfester Form, zum Beispiel als Pillen, Tabletten, gelatineartige Kapseln, Kapseln, Suppositorien oder weiche Gelatinekapseln, vor. Für parenterale und subkutane Verwendungen ist die Verwendung von Formen möglich, die zur intramuskulären oder intradermalen Verabreichung beabsichtigt sind oder die zur Infüsion oder für intravenöse Injektionen geeignet sind. Es ist daher möglich, Wirkstoffe als Lösungen oder als gefriergetrocknete Pulver der Wirkstoffe vorzulegen, die mit einem oder mehreren Excipientien oder Verdünnungsmitteln, die pharmazeutisch verträglich und für die vorstehenden Verwendungen geeignet sind, und die eine Art von Osmolarität aufweisen, die für physiologische Flüssigkeiten geeignet ist, vereinigt werden sollen. Für die lokale Verwendung sollten Zubereitungen in Sprayform, zum Beispiel Nasensprays, Cremes oder Salben für die topische Verwendung von Pflastern, die geeigneterweise für die intradermale Verabreichung hergestellt wurden, berücksichtigt werden.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können zur Verabreichung an Menschen oder Tiere bestimmt sein. Sie enthalten im Falle von Lösungen, Sprays, Salben und Cremes bevorzugt 0,01 % bis 10 % des Wirkstoffes und 1 % bis 100 %, und bevorzugt 5 % bis 50 %, des Wirkstoffes für Zubereitungen in fester Form. Die zu verabreichende Dosierung hängt von der Indikation, von der erwünschten Wirkung und von dem gewählten Verabreichungsweg ab. Die tägliche Dosierung dieser Zubereitungen kann von der abgeleitet werden, die für die entsprechenden, bekannten Zubereitungen sowohl von Hyaluronsäure für die entsprechenden Behandlungen, zum Beispiel für die Behandlung von Arthritis, beispielsweise bei Menschen oder bei Pferden, als auch des therapeutisch wirksamen Alkohols, dessen Wirkung ausgenutzt werden soll, verwendet wird. Somit kann zum Beispiel die Dosierung eines Hyaluronsäureesters mit Cortison von seinem Gehalt in diesem Ester und von seiner üblichen Dosierung in den bekannten pharmazeutischen Zubereitungen abgeleitet werden.
In kosmetischen Artikeln werden die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate und ihre Salze mit den Excipientien gemischt, die gewöhnlicherweise in diesem Gebiet verwendet werden und zum Beispiel die sind, die bereits vorstehend für pharmazeutische Zubereitungen aufgeführt sind. Vor allem werden Cremes, Salben, Lotionen für die topische Verwendung verwendet, in denen die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate den kosmetischen Wirkstoff, möglicherweise mit dem Zusatz weiterer kosmetischer Wirkstoffe, wie Steroide, zum Beispiel Pregnenolon, oder eines der vorstehend berichteten Grundbestandteile darstellen können. In diesen Zubereitungen sind die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate bevorzugt Ester mit einem Alkohol ohne kosmetische Wirkung, wie einem niederaliphatischen Alkohol, zum Beispiel einem der bereits erwähnten. In diesen Zubereitungen ist, wie im Fall der freien Hyaluronsäure oder ihrer Salze, die Wirkung den der Polysaccharidkomponente innewohnenden kosmetischen Eigenschaften zuzuschreiben.
Die kosmetischen Artikel können jedoch auf Substanzen mit speziellen Wirkungen, die sich von denen der Hyaluronsäure unterscheiden, zum Beispiel Desinfektionsmitteln, Sonnenschutzmitteln, imprägnierenden oder regenerierenden Substanzen oder Substanzen gegen Falten oder wohlriechenden Substanzen, im besonderen Parfüms, beruhen. In diesem Fall können die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate wieder selbst der Wirkstoff sein und sich von Alkoholen mit diesen Eigenschaften, zum Beispiel von höheraliphatischen Alkoholen oder Terpenalkoholen im Fall von Parfüms, ableiten, oder können vor allem als Träger für Substanzen mit diesen Eigenschaften, mit denen sie verbunden sind, wirken. Besonders wichtig sind daher kosmetische Zusammensetzungen, die den vorstehend beschriebenen Arzneimitteln entsprechen, in denen der pharmazeutische Wirkstoff und die jeweiligen Salze durch einen kosmetologischen Faktor ersetzt sind.
Die Verwendung der vorstehenden Ester, die sich von in der Parfümindustrie verwendeten Alkoholen ableiten, stellt einen wichtigen Vorwärtsschritt in dem Verfahren dar, da sie eine langsame, konstante und längere Freisetzung der duftenden Wirkstoffe ermöglicht.
Eine wichtige erfindungsgemäße Anwendung betrifft die bereits vorstehend beschriebenen, sanitären und chirurgischen Artikel, ihre Herstellungsverfahren und Verwendung. Die Erfindung umfaßt daher alle Artikel, die denen bereits auf dem Markt befindlichen ähnlich sind und die Hyaluronsäure, aber auch die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate anstelle der freien Säure oder eines ihrer Salze enthalten, zum Beispiel Einlagen oder Augenlinsen.
Völlig neue chirurgische und sanitäre Artikel nach der vorliegenden Erfindung werden durch die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate dargestellt, die als solche durch geeignete organische Lösungen wiedergewonnen werden und die in Blatt- oder Fadenform hergestellt werden können, wobei Folien, Blätter und Fäden zur Verwendung in der Chirurgie als Hilfsmittel und Ersatz für die Haut in Fällen ernsthafter Schädigung dieses Organs, zum Beispiel nach Verbrennungen, oder als Nahtfäden in der Chirurgie erhalten werden. Die Erfindung umfaßt im besonderen diese Verwendungen, und ein Herstellungsverfahren dieser Artikel besteht aus (a) der Bildung einer Lösung eines Hyaluronsäureesters oder eines seiner Salze in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, zum Beispiel einem Keton, einem Ester oder einem aprotischen Lösungsmittel, wie einem Carbonsäureamid, im besonderen einem Dialkylamid einer aliphatischen Säure, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome aufweist und sich von Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, zu allererst von einem organischen Sulfoxid, nämlich einem Dialkylsulfoxid mit Alkylresten mit maximal 6 Kohlenstoffatomen, wie im besonderen Dimethylsulfoxid oder Diethylsulfoxid, ableitet, und wieder zu allererst in einem fluorierten Lösungsmittel mit einem niedrigen Siedepunkt, wie im besonderen Hexafluorisopropanol, (b) der Herstellung von Blättern oder Fäden aus dieser Lösung und (c) der Entfernung des organischen Lösungsmittels durch Kontakt mit einem weiteren organischen oder wäßrigen Lösungsmittel, das mit dem ersten Lösungsmittel gemischt werden kann, und in dem der Hyaluronsäureester nicht löslich ist, im besonderen einem niederaliphatischen Alkohol, zum Beispiel Ethylalkohol (Naßspinnen), oder, wenn bei der Herstellung der Lösung des Hyaluronsäurederivats ein Lösungsmittel mit einem nicht zu hohen Siedepunkt verwendet wurde, der Entfernung dieses Losungsmittels mit einem Gasstrom und im besonderen geeigneterweise erhitztem Stickstoff (Trockenspinnen). Die Verwendung des Systems des Trocken/Naßspinnens ist vorteilhafterweise auch möglich.
Die mit den erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivaten erhaltenen Fäden können zur Herstellung von Scharpien zur Verwendung bei der medizinischen Behandlung von Wunden und in der Chirurgie verwendet werden. Die Verwendung dieser Scharpien weist den außergewöhnlichen Vorteil ihres biologischen Abbaus im Organismus, der durch die in ihm enthaltenen Enzyme bewirkt wird, auf. Diese Enzyme spalten den Ester in Hyaluronsäure und in den entsprechenden Alkohol und in eine bereits im Organismus vorhandene Verbindung oder eher eine unschädliche Verbindung, wie einen Alkohol. Diese Scharpien und auch die vorstehenden Fäden können daher auch nach der Operation im Organismus zurückgelassen werden, da diese aufgrund des vorstehenden Abbauprozesses nachfolgend langsam absorbiert werden.
Bei der Herstellung der vorstehend erwähnten, sanitären und chirurgischen Artikel werden geeigneterweise Weichmacher zugegeben, um ihre mechanischen Eigenschaften zu verbessern, wobei, wie im Fall von Fäden, ihre Beständigkeit gegenüber Verwickeln verbessert wird. Diese Weichmacher können zum Beispiel Alkalisalze von Fettsäuren, zum Beispiel Natriumstearat oder Natriumpalmitat, die Ester von organischen Säuren mit vielen Kohlenstoffatomen etc. sein.
Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate, wobei ihre Qualitäten der biologischen Abbaubarkeit durch die im Organismus vorhandenen Esterasen genutzt werden, stellt die Herstellung von Kapseln zur subkutanen Implantation von Arzneimitteln oder von Mikrokapseln zur Injektion, zum Beispiel auf subkutanem oder intramuskulärem Weg, dar. Für die Anwendung subkutaner Arzneimittel für eine langsame Freisetzung und folglich eine "Retard"wirkung wurden bis heute aus Siliconmaterial hergestellte Kapseln verwendet, mit dem Nachteil, daß diese Kapseln dazu neigen, im Organismus zu wandern, und es unmöglich ist, sie wiederzugewinnen. Offensichtlich besteht mit den erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivaten diese Gefahr nicht mehr. Von großer Bedeutung ist auch die Herstellung von Mikrokapseln, die die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate enthalten, wobei die Probleme vermieden werden, die in der Regel mit ihrer Verwendung verbunden sind, die aus den vorstehend erwähnten Gründen bis jetzt ziemlich eingeschränkt war. Diese Herstellung eröffnet ganz neue Anwendungsbereiche, in denen durch Injektion eine "Retard"wirkung erhalten werden soll.
Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate im Bereich der Medizin und Chirurgie wird durch die Herstellung verschiedener fester Einlagen, wie Platten, Scheiben, Blätter etc., dargestellt, die die metallischen, die synthetisches Kunststoffmaterial enthalten, das gegenwärtig in Fällen verwendet wird, die Einlagen umfassen, deren Entfernung nach einer bestimmten Zeitdauer beabsichtigt ist, ersetzen. Zubereitungen, die tierisches Kollagen proteinischer Natur enthalten, rufen häufig unangenehme Reaktionen, wie eine Entzündung oder Abstoßung, hervor. Im Fall der erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate kommt diese Gefahr nicht vor, auch wenn sie von tierischer und nicht menschlicher Hyaluronsäure abstammen, da es keine Unverträglichkeit zwischen den Polysacchariden verschiedener Tierarten gibt.
Eine weitere Verwendung besteht in der Korrektur von Defekten und der Vermehrung von Weichgeweben. Seit einiger Zeit bestand ein Bedarf nach sicheren und wirksamen biologischen Materialien mit denen entfernte oder defekte Weichgewebe ersetzt werden sollen. Viele Alloplastikmaterialien, umfassend Paraffin, Teflonpaste, Silicon und Rinderkollagen, wurden als Ersatz von verlorenem Weichgewebe verwendet. Diese Materialien waren jedoch mit unerwünschten und bleibenden Veränderungen in den Hautgeweben, mit einer Wanderung in situ und mit negativen Reaktionen verbunden. Daher bleibt der Bedarf nach einem vielseitigen biologischen Material zur Verwendung in der Medizin bestehen. Die erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate können sicher und wirksam zur Korrektur dieser Defekte der Weichgewebe, wie Aknepickel, postoperative atrophische Unregelmäßigkeiten, Chemochirurgie nach Mohs, eingerissene Lippenwunden und durch Alter verursachte Falten, verwendet werden.
In den Anwendungen der erfindungsgemäßen neuen, vernetzten Derivate im Bereich der Medizin und Chirurgie sind auch Zubereitungen, die aus dehnbarem Material, im besonderen in Form von Schwämmen, hergestellt sind, zur medizinischen Behandlung von Wunden oder Läsionen verschiedener Natur eingeschlossen.

Claims

1. Vollständige oder partielle vernetzte, nicht-toxische Ester von Hyaluronsäure mit einem aliphatischen, mehrwertigen Alkohol mit 2 bis 16 Kohlenstoffatomen und Salze dieser partiellen Ester mit anorganischen oder organischen Basen, wobei die vernetzenden Bindungen nur zwischen Carboxylgruppen der Hyaluronsäure bestehen, mit der Maßgabe, daß der vernetzte Ester nicht der vernetzte Ester von Hyaluronsäure mit einem Halogenmethyloxiran oder einer Bisepoxyverbindung ist.

2. Vernetzte Ester nach Anspruch 1, wobei der aliphatische, mehrwertige Alkohol ein zweiwertiger Alkohol ist.

3. Vernetzte Ester nach Anspruch 2, wobei der zweiwertige Alkohol ausgewählt ist aus Ethylenglykol, Propylenglykol, Butylenglykol, von Pentan, Hexan, Heptan und Octan abgeleiteten Glykolen und Stellungsisomeren davon.

4. Vernetzte Ester nach Anspruch 1, wobei der aliphatische, mehrwertige Alkohol ausgewählt ist aus Glycerin, Erythrit und Pentaerythrit.

5. Vernetzte Ester nach einem der Ansprüche 1-4, wobei wenigstens eine nicht-vernetzte Carboxylgruppe in der Hyaluronsäure mit einem aliphatischen Alkohol mit maximal 34 Kohlenstoffatomen verestert ist, wobei der aliphatische Alkohol nicht substituiert oder mit einer oder zwei funktionellen Gruppen substituiert sein kann, ausgewählt aus Amino-, Hydroxyl-, Mercapto-, Aldehyd-, Keto-, Carboxylgruppen, Kohlenwasserstoff- und Dikohlenwasserstoffaminoresten, Ether-, Ester-, Thioether-, Thioester-, Acetal-, Ketalgruppen, Carbalkoxyresten, Carbaminsäure- und mit einem oder zwei Alkylresten substituierten Carbaminsäuregruppen, wobei die Kohlenwasserstoffreste in diesen funktionell modifizierten Resten maximal 6 Kohlenstoffatome aufweisen, und wobei diese aliphatischen Alkohole in der Kette der Kohlenstoffatome durch Heteroatome, ausgewählt aus einem Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoffatom, unterbrochen sein können.

6. Vernetzte Ester nach Anspruch 5, wobei der aliphatische Alkohol Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butylalkohol, Amyl-, Pentyl-, Hexyl- oder Octylalkohol ist.

7. Vernetzte Ester nach einem der Ansprüche 1-4, wobei wenigstens eine nicht-vernetzte Carboxylgruppe in der Ryaluronsäure mit einem araliphatischen Alkohol mit nur einer Benzolgruppe verestert ist, wobei die aliphatische Kette maximal 4 Kohlenstoffatome aufweist, und wobei die Benzolgruppe mit 1 bis 3 Methyl- oder Hydroxylgruppen oder mit Halogenatomen substituiert sein kann, und wobei die aliphatische Kette mit einer oder zwei funktionellen Gruppen, ausgewählt aus freien Aminogruppen oder Mono- oder Diethylaminogruppen, Pyrrolidin- und Piperidingruppen, substituiert sein kann.

8. Vernetzte Ester nach einem der Ansprüche 1-4, wobei wenigstens eine nicht-vernetzte Carboxylgruppe in der Hyaluronsäure mit einem cycloaliphatischen Alkohol oder aliphatischen-cycloaliphatischen Alkohol oder heterocyclischen Alkohol verestert ist, der sich von einem mono- oder polycyclischen Kohlenhydrat mit maximal 34 Kohlenstoffatomen ableitet und nicht substituiert oder mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert ist, ausgewählt aus Amino-, Hydroxyl-, Mercapto-, Aldehyd-, Keto-, Carboxylgruppen, Kohlenwasserstoff- und Dikohlenwasserstoffaminoresten, Ether-, Ester-, Thioether-, Thioester-, Acetal-, Ketalgruppen, Carbalkoxyresten, Carbaminsäure- und mit einem oder zwei Alkylresten substituierten Carbaminsäuregruppen, wobei die Kohlenwasserstoffreste in diesen funktionell modifizierten Resten maximal 6 Kohlenstoffatome aufweisen, in der Kette der Kohlenstoffatome durch Heteroatome, ausgewählt aus einem Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatom, unterbrochen sein können und eine oder mehrere aromatische Bindungen aufweisen können.

9. Vernetzte Ester nach Anspruch 8, wobei wenigstens eine der nicht-vernetzten Carboxylgruppen mit einem Alkohol verestert ist, ausgewählt aus Cortison, Hydrocortison, Prednison, Prednisolon, Fluorcortison, Dexamethason, Betamethason, Corticosteron, Desoxysicorticosteron, Paramethason, Flumethason, Flucinolon und seinem Acetonid, Fluprednyliden, Clobetasol und Bedomethason.

10. Salze partieller Ester nach einem der Ansprüche 1-9, wobei das Salz ein Salz des vernetzten Esters mit einem Alkali- oder Erdalkalimetall, Magnesium oder Aluminium ist.

11. Natrium- oder Ammoniumsalz eines vernetzten Esters nach Anspruch 10.

12. Salze partieller Ester nach einem der Ansprüche 1-9, abgeleitet von einer Ammoniumgruppe, araliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Resten.

13. Arzneimittel, umfassend einen vernetzten Ester nach einem der Ansprüche 1 - 12 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Excipient oder Verdünnungsmittel

14. Arzneimittel, umfassend einen vernetzten Ester nach einem der Ansprüche 1-12 als Träger im Gemisch mit einem pharmakologischen Wirkstoff.

15. Arzneimittel, umfassend einen vernetzten Ester nach einem der Ansprüche 7-12, wobei der mit der nicht-vernetzten Carboxylgruppe veresterte Alkohol ein pharmakologisch wirksamer Alkohol ist.

16. Kosmetischer Artikel, umfassend als Wirkstoff einen vernetzten Ester oder ein Salz davon nach einem der Ansprüche 1-12.

17. Kosmetischer Artikel, umfassend als kosmetischen Träger einen vernetzten Ester oder ein Salz davon nach einem der Ansprüche 1-12.

18. Sanitärer, medizinischer oder chirurgischer Artikel, umfassend einen vernetzten Ester oder ein Salz davon nach einem der Ansprüche 1-12.

19. Sanitärer, medizinischer oder chirurgischer Artikel nach Anspruch 18, umfassend eine Folie eines vernetzten Esters, abgeleitet von einem therapeutisch inerten Alkohol.

20. Sanitärer, medizinischer oder chirurgischer Artikel nach Anspruch 18, umfassend Fäden eines vernetzten Esters, abgeleitet von einem therapeutisch inerten Alkohol.

21. Kapsel oder Mikrokapsel für Arzneimittel, umfassend einen vernetzten Ester oder ein Salz davon nach einem der Ansprüche 1 - 12.

22. Verwendung eines vernetzten Esters oder eines Salzes davon nach einem der Ansprüche 1 - 12 zur Herstellung einer Folie zur Verwendung in der Dermatologie als künstliche Haut.

23. Verwendung eines vernetzten Esters oder eines Salzes davon nach einem der Ansprüche 1 - 12 zur Herstellung von Nahtfäden zur Verwendung bei chirurgischen Operationen.

24. Verfahren zur Herstellung von vollständigen oder partiellen vernetzten Estern von Hyaluronsäure nach Anspruch 1, umfassend das Umsetzen eines Kalium- oder Natrium- oder quartären Ammoniumsalzes von Hyaluronsäure mit einem verethernden Mittel in einem aprotischen Lösungsmittel.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Salz von Hyaluronsäure ein Kalium- oder Natriumsalz ist, und die Umsetzung in Gegenwart einer katalysierenden Menge eines quartären Ammoniumsalzes durchgeführt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das quartäre Ammoniumsalz Tetrabutylammoniumiodid ist.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24-26, wobei das aprotische Lösungsmittel ein Dialkylsulfoxid, ein Dialkylcarboxylamid, ein Niederalkyldialkylamid niederaliphatischer Säuren ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24-27, wobei das verethernde Mittel ein Alkylhalogenid eines aliphatischen, mehrwertigen Alkohols ist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der aliphatische, mehrwertige Alkohol ein zweiwertiger Alkohol ist.

30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der aliphatische, mehrwertige Alkohol ausgewählt ist aus Ethylenglykol, Propylenglykol, Butylenglykol, von Pentan, Hexan, Heptan und Octan abgeleiteten Glykolen und Stellungsisomeren davon, Glycerin, Erythrit und Pentaerythrit.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 24-30, wobei die nicht-vernetzten Carboxylgruppen des partiellen vernetzten Esters von Hyaluronsäure mit einem aliphatischen, araliphatischen oder cycloaliphatischen Alkohol verestert sind.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der mit den nicht-vernetzten Carboxylgruppen veresterte Alkohol ein pharmakologisch wirksamer Alkohol ist.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 24-32, wobei der partiell vernetzte Ester mit wenigstens einer freien Carboxylgruppe mit einem Alkali- oder Erdalkalimetall, Magnesium oder Ammonium ein Salz bildet.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 24-33, wobei die Hyaluronsäure eine Hyaluronsäurefraktion mit einem Molekulargewichtsmittel von 50 000 bis 730 000 ist und weitgehend frei von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewichtsmittel von weniger als 30 000 ist.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Hyaluronsäurefraktion ein Molekulargewichtsmittel von 50 000 bis 100 000, 250 000 bis 350 000 oder 500 000 bis 730 000 aufweist.