PT85908B

PT85908B - Processo para a preparacao de esteres do acido hialuronico total ou parcialmente recticulados

Info

Publication number: PT85908B
Application number: PT85908A
Authority: PT
Inventors: Francesco Della Valle; Aurelio Romeo
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1986-10-13
Filing date: 1987-10-13
Publication date: 1990-08-31
Also published as: IL84032A; PT85908A; IE872618L; FI874504A; NO175374B; CN87106919A; FI874504A0; FI96610B; US4957744A; CN1025035C; IT1198449B; IN170801B; EP0265116A3; PH26025A; DE3752176D1; KR880005155A; AU610087B2; HUT45734A; EP0265116B1; NZ221994A

Description

Memória descritiva referente â patente de invenção de FIDIA S. p.A., italiana, industrial e co mercial, com sede em Via Ponte Delia Fabbrica 12, 35031 Abano Terme (Padova), Itália (invento res: Francesco delia Valle e Au relio Romeo, residentes na Itália) , para "PROCESSO PARA A PRE PARAÇÃO DE ÉSTERES DO ÃCIDO HIALURÓNICO TOTAL OU PARCIALMENTE RECTICULADOS".

MEMÓRIA DESCRITIVA

ANTECEDENTES E ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se aos esteres de álcoois poli-hídricos de ácido hialurónico resultantes da esterificação de tais alcoóis com dois ou vários grupos carboxi dos ésteres poli-sacaridos do ácido hialurónico os quais devido â presença de ligações em ponte entre as funções carboxi anteriores de moléculas iguais ou diferentes de ácido hialurónico, se podem descrever com o termo "ligações reticulares". Estes ésteres de ligações reticulares podem ser totais ou parciais e, no ultimo caso, podem esterificar-se outras funções carboxi com alcoóis mono-hídricos ou poli-hídricos, sem a formação de ligações reticulares (grupos éster que serão também designados adian te pelo termo "simples"). Em ambos os tipos de ésteres parciais

de ligações reticulares, as funções carboxi não esterifiçadas po dem ser livres ou salifiçadas com metais ou bases orgânicas. A invenção também se refere â utili. zação de novos ésteres hialurõnicos de ligações reticulares no campo dos materiais plásticos biodegradáveis para a'preparação de artigos cirúrgicos e sanitários, e nos campos farmacêutico e cosmético pelo que engloba os diversos artigos com eles preparados em tais campos. A utilização específica dos novos ésteres pode ser vista em relação ao grau de esterificação de li gação reticular, isto é, o número de grupos de ligação reticular de funções carboxi esterifiçadas com os alcoõis poli-hídricos an teriores, o número de grupos esterifiçados simples e finalmente, também o número de grupos salifiçados, estando o próprio grau de esterificação ou de salificação relacionado a solubilidade do produto e com as suas propriedades visco-elásticas. Deste modo, por exemplo, os ésteres de ligações reticulares totais são virtualmente insolúveis em líquidos aquosos e são muito adequados, devido à sua estrutura molecular, para utilização na preparação de resinas e materiais plásticos e como aditivos para esses mate riais. Os ésteres com um grau de esterificação baixo ou médio e os seus sais com bases inorgânicas ou orgânicas são mais ou menos solúveis em condições aquosas e são adequados para a prepara ção de geles que podem possuir diversas utilizações, quer em cojs mêticos quer em farmacologia e de um modo geral no campo médico--sanitãrio. 0 pedido de patente europeia N9. 0 161887 de 3.5.85, publicado em 21.11.85, contém uma descrição de diversos derivados de ligações reticulares de ácido hialurõni co obtidos por reacção de compostos epoxi, designados como "poli -funcionais". No anterior pedido de patente, o termo "compostos epoxi poli-funcionais" significa hidrocarbonetos com pelo menos uma função epoxi e possuindo possivelmente também funções conver tíveis em funções epoxi, ocorrendo a reacção de ligação reticular entre os grupos epoxi. De entre estas funções apenas se refe • rem os halogêneos na patente. De entre estes compostos epoxi po-. li-funcionais apenas alguns exemplos são referidos no pedido de

patente anterior, nomeadamente: epicloridrina, epibromidrina, me til-epicloridrina, metil-epibromidrina, 1,2-bis-(2,3-epoxi-propo xi)-etano, 1,4-bis-(2,3-epoxi-propoxi)-butano, 1,6-bis-(2,3-epo-xi-propoxi)-butano, 1,6-bis-(2,3-epoxi-propoxi)-hexano e um êter glicidílico de bisfenol A e bisfenol F. 0 método de preparação utilizado nesse pedido de patente, o qual nas reivindicações se limita à utilização de halo-metiloxirano ou de um composto bis--epoxi, do mesmo modo que fica limitado nas suas aplicações possíveis, proporciona ésteres de ácido hialurõnico de ligações reticulares com um baixo grau de esterificação: de facto, conforme pode concluir-se a partir dos exemplos ilustrativos do pedido de patente, atinge-se um máximo de 4¾ de esterificação no caso da reacção com epicloridrina (Exemplo 4) para se obter um produto com um baixo grau de solubilidade. A presente invenção torna disponível uma ampla variedade de ésteres de ligações reticulares, incluindo os ésteres particulares em que os grupos éster são constituídos por radicais que são insubstituídos por um grupo hidro-xilo (como no caso dos produtos resultantes da reacção dos epoxi dos anteriores em ácido hialurõnico ou seus sais). De forma nota vel a invenção proporciona ésteres mistos constituídos por uma mistura de grupos éster que são de ligações reticulares e alguns grupos éster que não são de ligações reticulares, em que a percentagem de grupos de ligação reticular pode exceder em 10% a to talidade de unidades bi-sacarido de ácido hialurõnico. 0 pedido de patente britânica N9. 2 151 244 A de 13.8.1984 publicada em 17.7.1985 e o pedido de pa tente alemã N9. 34 34 082 Al de 17.9.1984 publicada em 11.7.1985 contêm descrições de alguns derivados de ligações reticulares de ácido hialurõnico obtidos pela acção sobre o mesmo de formaldeí-do, dimetil-ol-ureia, dimetil-ol-etilenureia, uma poliaziridina, um poli-isocianato e uma divinil-sulfona. Tais derivados são insolúveis e devido â sua biocompatíbilidade foram propostos para aplicações in vivo na forma de diversos artigos prostêticos, tais como as válvulas cardíacas, grampos vasculares, etc., ou podem . adicionar-se a diversos materiais poliméricos utilizados para [ preparar tais artigos. As mesmas patentes proporcionam a utiliza - 3 -

ção do óxido de etilo como agente'para conseguir a "ligação reti cular", mas o procedimento não estã ilustrado nem também o tipo de produto obtido. A estrutura de outros derivados de ligações reticulares não estã especificada e não se faz qualquer referência ao tipo de ligações que formam as ligações reticulares. No caso do formaldeído e das ureias substituídas anteriores, isto pode significar derivados que envolvam os grupos carboxi de acido hialurónico com uma estrutura semi-acetãlica, ao passo que noutros casos pode significar produtos alquilados de hidróxilos.

Deste modo ê possível definir o ob-jectivo principal da presente invenção como sendo os ésteres de ácido hialurónico de ligações reticulares totais e parciais com alcoôis poli-hidricos das séries alifáticas. Nos ésteres de liga ções reticulares parciais podem existir grupos carboxi esterifi-cados com álcoois mono-hídricos ou poli-hidricos das séries ali-fática, alicíclica, aralifãtica ou heterocíclica, e nos ésteres parciais podem existir grupos carboxi não esterifiçados, salifi-cados com bases inorgânicas ou orgânicas, com excepção dos ésteres de ligações reticulares obtidos por acção de halo-metiloxira no ou de um composto bis-epoxi sobre o ácido hialurónico.

Descrição Pormenorizada da Invenção 0 termo "ácido hialurónico" ê utili zado na literatura para significar poli-sacaridos ácidos com diferentes pesos moleculares constituídos por radicais de ácido D--glucurõnico e de ácido da N-acetil-D-glucosamina, o qual ocorre naturalmente nas superfícies das células, nas substâncias extra celulares básicas do tecido conjuntivo dos vertebrados, no fluido sinovial das articulações, no fluído endobulbar do olho, no tecido do cordão umbilical humano e na cristã dos galos. 0 ácido hialurónico desempenha um papel importante num organismo biolõgi co, como suporte mecânico para as células de muitos tecidos, tais como a pele, tendões, músculos e cartilagens pelo que constitui a componente principal da matriz intercelular, mas também desempenha outras funções importantes no processo biológico, tais co-. mo a humidificação dos tecidos, lubrificação, migração das célu-l_ las, diferenciação e funções das células. (Ver por exemplo A. Ba

A

lazs e outros em "Cosmetics & Toiletries", edição italiana N9. 5/84, páginas 8-17). 0 ácido hialurõnico pode extrair-se dos tecidos naturais anteriores, por exemplo a partir das cristãs dos galos ou ainda a partir de algumas bactérias. Nos dias correntes ê possível preparar ácido hialurõnico por métodos mi-crobiolõgicos. 0 peso molecular do ácido hialurõnico integral ob tido por extracção ê de 8-13 milhões aproximadamente. Contudo, a cadeia molecular deste poli-sacarido degrada-se bastante facilmente por meio de diversos factores físicos e químicos, por exem pio por meios mecânicos ou sob a influência de radiação ou de a-gentes hidrolizantes, oxidantes ou enzimãticos. Por esta razão, mesmo utilizando os procedimentos de purificação normais de ex-tractos originais, as fracções degradadas obtidas possuem um peso molecular inferior (Ver Balazs e outros, anteriormente referi dos) . 0 ácido hialurõnico, as suas fracções moleculares e os respectivos sais têm sido utilizados como medicamentos e têm sido propostos para utilização como cosméticos (Ver por exemplo o artigo anterior de Balazs e outros e a pa tente francesa N9. 2478468). Como agente terapêutico tem-se utilizado o ácido hialurõnico e os seus sais especialmente na terapia de artropatias, por exemplo no campo da veterinárias para o tratamento de artrite em cavalos /Ãcta Vet. Scand. 167, 379 (1976)J. Como agente terapêutico substituto e auxiliar para os tecidos e orgãos naturais tem-se utilizado o ácido hialurõnico e as suas fracções moleculares e respectivos sais em cirurgia of talmica (Ver por exemplo Balazs e outros em "Modern Problems in Ophthalmology", Vol. 10, 1970, p. 3 - E.B. Strieff, S. Karger eds., Basel, ou "Viscosurgery and the Use of Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation", Paper documento apresenta do no Congress and First Film Festival on Intraocular Implanta-tion, Cannes, 1979, e a patente dos Estados Unidos N9. 4 328 803 com um sumário da literatura sobre a utilização de HY em oftalmo logia, e também a patente dos Estados Unidos N9. 4 141 973). No • pedido da patente europeia N9. 0138572A3 de 24 de Abril de 1985 . encontra-se uma descrição de uma fracçao molecular do ácido hia-

lurónico que se pode utilizar, por exemplo como sal de sódio, pa ra injecções intra-oculares e intra-articulares adequadas como substitutos para os fluidos endobulbares no olho e adequadas para a terapia de artropatia, respectivamente. O ácido hialurónico também pode ser usado como aditivo para diversos materiais poliméricos utilizados em artigos cirúrgicos e sanitários, tais como os polímeros acrílicos, poli-uretanos, poliesteres, poli-olefinas, poliamidas poli-siloxanos, vinilo, e fibras de carbono com o efeito de tornar estes materiais biocompatíveis. Neste caso a adição de HY ou dos seus sais efectua-se por exemplo por revestimento da superfí cie de tais materiais ou fazendo a dispersão nos mesmos ou utili. zando ambos os procedimentos. Tais materiais podem utilizar-se para diversos artigos sanitários e médicos, tais como as válvulas cardíacas, as lentes intra-oculares, os grampos vasculares, aparelhos marca-passo e artigos semelhantes (Ver a patente dos Estados Unidos N9. 4 500 676). O termo "ácido hialurónico" tem sido utilizado incorrectamente significando, como acabámos de ver, uma série global de poli-sacaridos com radicais alternantes de ácido D-glucurónico e de ácido da N-acetil-D-glucosamina com pesos moleculares variáveis ou ainda as fracções degradadas do mejs mo, pelo que parece mais correcto utilizar o termo plural de "ã-cidos hialurónicos". Contudo, utilizar-se-ã o termo singular com a mesma significação nesta descrição, e do mesmo modo no caso das fracções moleculares, e ainda em adição a abreviatura "HY" será utilizada frequentemente em vez deste termo colectivo. Descobriu-se que os ésteres de ácido hialurónico com álcoois alifã-ticos, aralifáticos, ciclo-alifáticos ou heterocíclicos também possuem propriedades idênticas ou mesmo superiores ãs do próprio poli-sacarido ácido e que são mesmo mais adequados para as utili zações anteriores. Estes ésteres e o processo para a sua prepara ção estão descritos no pedido de patente pendente dos Estados Unidos com ο N9. de série 881 454, depositado em 2 de Julho de 1986, indicando-se aqui como referência. Os ésteres com um eleva do grau de esterificação e especialmente os ésteres totais pos-* suem, ao contrário do ácido hialurónico, boa solubilidade em sol

ventes orgânicos, por exemplo em dimetil-sulfóxido. Deste modo, por exemplo, à temperatura ambiente o éster benzilico de HY dissolve-se em DMSO na proporção de 200 mg/ml. Esta solubilidade em alguns solventes orgânicos em conjunto com propriedades visco--elãsticas particulares e notáveis torna possível a obtenção de artigos sanitários, médicos e cirúrgicos que são insolúveis em solução salina e que possuam a forma particular desejada: primei ro prepara-se uma solução do éster de HY num solvente orgânico, depois molda-se a solução viscosa na forma pretendida para o artigo acabado, e finalmente extrai-se o solvente orgânico com outro solvente que seja miscível com o primeiro mas no qual o éster de HY seja insolúvel. Estas vantagens também se encontram, possivelmente num grau ainda mais elevado, nos compostos de liga ções reticulares da presente invenção.

Os ésteres de ligações reticulares da presente invenção podem derivar de qualquer álcool poli-hídri co de natureza alifãtica, sendo contudo preferível derivá-los de alcoóis poli-hídricos com um máximo de 8 funções álcool e especialmente 4 funções dessas e um máximo de 16 átomos de carbono. Em rigor, o termo "poli-hídrico" refere-se geralmente aos alcoóis que possuam 3 ou mais grupos hidrõxi, ao passo que os termos "djL -hídrico" ou "glicol" se referem geralmente aos alcoóis que possuam 2 grupos hidroxi. Contudo, tal como utilizado aqui, o termo "poli-hídrico" abrangerá os alcoóis que possuam 2 ou mais grupos hidroxi. Deste modo, os alcoóis "poli-hídricos" podem ser os álcoois di-hídricos, tri-hldricos, tetra-hídricos, penta- e hexa--hídricos. De entre estes far-se-á especial referência â gliceri na, aos três isômeros eritrite, penta-eritrite, aos quatro isôme ros xilitol e aos dez isômeros dulcitol.

Nos novos ésteres as "ligações reti culares" podem derivar de diversos dos alcoóis poli-hídricos anteriores, mas ê preferível preparar ésteres em que todas as "ligações reticulares" derivem do mesmo álcool poli-hídrico. A classe mais importante dos novos ésteres ê a que deriva dos alcoóis di-hídricos, isto ê, que deri • va dos glicois. Tais glicois possuem preferencialmente o máximo , anteriormente referido de 16 átomos de carbono, e acima de tudo •n

um máximo de 8 átomos de carbono e são especialmente o etileno--glicol, propileno-glicol, butileno-glicol, os glicois derivados de pentano, hexano, heptano, octano e dos seus isomeros posicionais. Contudo tais isomeros também podem possuir ligações duplas, por exemplo entre 1 e 3 ligações duplas.

Os grupos éster simples que podem estar presentes em conjunto com os grupos de ligações reticulares, podem derivar de alcoõis das séries alifática, aralifática, aliclclica ou heterocíclica e podem ser substituídos ou insubsti tuídos, saturados ou insaturados. Os alcoõis das séries alifáticas são, por exemplo, os que possuem o máximo de 34 átomos de carbono, os quais podem ser saturados ou insaturados e que possam também ser substituídos por outros grupos funcionais livres ou modificados funcionalmente, tais como os grupos amino, hidro-xi, aldeído, ceto, mercapto, carboxi ou por grupos que derivem destes, tais como os grupos hidrocarbilo ou di-hidro-carbil-ami-no (o termo "hidrocarbilo" deverá ser considerado com a significação não sõ de radicais monovalentes de hidrocarbonetos, por exemplo, do tipo -cnH2n+l' mas tan*,®ln ^e radicais bivalentes ou trivalentes, tais como os "alquilenos" -cnH2n” ou "^ÇP^lídenos" CnH2n^' grupos éter ou éster, grupos acetal ou cetal, grupos tio -éter ou tio-éster e grupos carboxi esterificados ou grupos car-bamídicos e grupos carbamídicos substituídos por um ou dois grupos hidrocarbilo, por grupos nitrilo ou por halogeneos. De entre as alcoõis substituídos ê preferível escolher aqueles que possuam uma ou duas das funções atrás referidas.

De entre os grupos atrás referidos que contenham hidrocarbilos, são preferenciais os radicais alifâ ticos inferiores, por exemplo os alquilos com um máximo de 6 âto mos de carbono. Tais alcoõis podem ser interrompidos na cadeia dos átomos de carbono por heteroãtomos, tais como os átomos de oxigénio, azoto, enxofre. Os alcoõis do grupo anterior utilizáveis preferencialmente dentro dos limites da presente invenção são os que possuem um máximo de 12 e especialmente 6 átomos de carbono, e de entre os substituídos aqueles em que os radicais hidrocarbilo nos grupos anteriormente referidos amino, éter, éster, tio-éter, tio-éster, acetal, cetal representam grupos alqui 8

lo com um máximo de 4 átomos de carbono e em que nos grupos car-boxi esterifiçados, ou nos grupos carbamídicos substituídos, tam bem os grupos hidrocarbilo são alquilos com o mesmo numero de ã-tomos de carbono, e em que os grupos amino ou carbamídicos podem ser grupos alquileno-amina ou alquileno-carbamídicos com um mãxi mo de 8 átomos de carbono. De entre esses álcoois, primeiro e acima de tudo devem referir-se aqueles que são saturados e in-substituldos tais como por exemplo os alcoõis metílico, etílico, propllico, isopropllico, os alcoõis n-butílico, isobutílico, terc-butllico, alcoõis amílicos, alcoõis pentílico, hexílico, oc tallco, nonílico e dodecílico e sobretudo aqueles que possuam uma cadeia linear, tais como os alcoõis n-octílico e n-dodecíli-co.

De entre os alcoõis substituídos são preferíveis os já referidos glicois, também utilizados para a formação de "ligações reticulares", e bem assim os alcoõis po-li-hídricos tais como a glicerina, os alcoõis aldeído tais como o álcool tartrõnico, os alcoõis carboxi tais como os ácidos lácticos, por exemplo o ácido oC-oxi-propiõnico, o ácido glicõlico, o ácido málico, os ácidos tartãricos, o ácido cêtrico, os amino--alcoôis tais como o amino-etanol, amino-propanol, n-amino-buta-nol e os seus derivados dimetílicos e dietílicos na função amino, colina, pirrolidinil-etanol, piperidinil-etanol, piperazinil -etanol e derivados correspondentes de álcool n-propílico ou de álcool n-butílico, mono-tio-etileno-glicol ou os seus derivados alquilo, por exemplo o derivado etílico na função mercapto. De entre os alcoõis alifãticos superiores saturados são preferenciais por exemplo o álcool cetílico e o álcool miricílico, mas de especial importância para os objectivos da presente invenção são os alcoõis insaturados superiores com uma ou duas ligações duplas, especialmente os que estão contidos em diversos õleos essenciais e que possuem uma afinidade com os terpenos, tais como por exemplo o citronelol, geraniol, nerol, nerolidol, linalool, farnesol e fitol. De entre os alcoõis inferiores insaturados são uteis o álcool alílico e o álcool propargílico. , De entre os alcoõis aralifãticos me ' recem especial referência todos os que possuem apenas um radical

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benzeno e em que a cadeia alifãtica possui um máximo de 4 átomos de carbono e em que o radical benzeno pode ser substituído por um a tris grupos metilo ou hidroxi ou por átomos de halogeneo, especialmente por cloro, bromo ou lodo, e em que a cadeia alifá-tica pode ser substituída por uma ou várias funções escolhidas entre o grupo constituído por amino livre ou por grupos mono- ou dimetilo ou por grupos de pirrolidinilo ou piperidínicos. De entre todos estes alcoõis são preferíveis o álcool benzílico e o álcool fenetllico.

Os alcoõis das séries ciclo-alifáti cas (englobando também os alcoõis ciclo-alifãticos/alifáticos) podem derivar de hidrocarbonetos mono- ou poli-cíclicos e podem possuir preferencialmente um máximo de 34 átomos de carbono. No caso dos alcoõis substituídos, os substitutos podem ser os ante-riormente referidos para os alcoõis das séries alifáticas.

De entre os alcoõis derivados de hi drocarbonetos cíclicos mono-anelares deve fazer-se especial refe rência aos que possuem um máximo de 12 átomos de carbono, possuir i do os anéis preferencialmente entre 5 e 7 átomos de carbono, os quais podem ser substituídos, por exemplo, por um a três grupos alquilo inferior, tal como o grupo metilo, etilo, propilo ou iso propilo. Como alcoõis específicos deste grupo preferido indicam--se o ciclo-hexanol, ciclo-hexanodiol, 1,2,3-ciclo-hexanotriol e 1,3,5-ciclo-hexanotriol (floroglucitol), inositol. Os alcoõis he terociclicos podem considerar-se como derivados dos anteriores alcoõis ciclo-alifãticos ou alifãtico/ciclo-alifáticos se as suas cadeias lineares ou cíclicas foram interrompidas por um ou vários hetero-ãtomos, por exemplo entre 1 e 3 hetero-ãtomos esco lhidos entre o grupo formado por -0-, -S-, -N=e-NH-e neles existir uma ou várias ligações duplas, em particular entre 1 e 3, englobando deste modo também os compostos heterocíclicos com estruturas aromáticas. Estes podem ser alcoõis simples tais como o álcool furfurílico ou alcoõis com rima ou várias estruturas complexas, tal como sucede em muitos derivados alcaloides e em muitos medicamentos. • Conforme já especificado, os novos . derivados de ligações reticulares da presente invenção podem uti

άΐ lizar-se para todas as aplicações principais adequadas para o ácido hialurõnico ou para os seus sais ou para os ésteres ante-tiormente descritos no pedido de patente pendente dos Estados Unidos. Conforme já referido, os novos derivados são particularmente adequados para a preparação de: 1) medicamentos 2) veículos farmacêuticos para medicamentos 3) cosméticos e veículos para cosméticos 4) artigos plásticos para utilização sanitária, médica e cirurgi ca englobando a presente invenção estas utilizações particulares. 0 tipo de éster de ligação reticular escolhe-se evidentemente de acordo com a utilização que se lhe pretenda dar. Normalmente, um grau elevado de esterificação até ao ponto de esterificação total do ácido hialurõnico aumenta o seu carácter lipofílico e por isso diminui a sua solubilidade, em água. Para utilizações terapêuticas ou de comêstica ê especialmente importante regular o grau de esterificação de tal forma que se assegure uma suficiente solubilidade em água, embora possua boas qualidades lipofílicas comparado com o ácido hialurõnico ou os seus sais. Naturalmente a dimensão molecular do próprio componente de esterificação deve ser conservada presente no espí rito, uma vez que normalmente influência a hidro-solubilidade de um modo inversamente proporcional. Tanto quanto pretenda utilizar-se como medicamento deverá tomar-se em consideração o maior ou menor grau de qualidades hidrofílicas ou lipofílicas em relação ao tipo de tecido que se pretenda tratar, por exemplo a pele no caso de medicamentos dermais.

Os novos derivados de ligações reti culares podem utilizar-se como agentes terapêuticos devido à pro priedade intrínseca do prõprio componente hialurõnico, por exemplo como fârmacos para o tratamento de artrite, quer na medicina humana quer em veterinária. Neste caso derivam de alcoõis alifá-ticos poli-hídricos sem propriedades farmacológicas ou com acti-vidade desprezível, especialmente de alcoõis di-hídricos com dois • a oito átomos de carbono, e os outros grupos éster simples pre- «1 1 sentes, derivam também possivelmente de álcoois sem acção farmacológica, por exemplo de álcoois alifâticos mono-hídricos com um número máximo de 8 ãtomos de carbono. A administração efectua-se por via parenteral e mais precisamente por via intra-articular.

Os outros derivados de ligações reticulares de acordo com a presente invenção também se podem deri var de alcoóis com um efeito farmacológico e isto ê especialmente verdadeiro para os alcoóis dos quais derivam os grupos éster simples. Esses possuem propriedades que são qualitativamente idênticas às do álcool, mas com um intervalo de acção mais diferenciado, garantindo uma acção farmacológica mais equilibrada, constante e regular e possuindo normalmente um notável efeito de "retardamento". Outros derivados de ligações reticulares ainda podem conter grupos éster simples de 2 ou vários tipos diferentes de alcoóis com ou sem a sua própria acção farmacológica. Do-seando adequadamente a proporção dos diferentes tipos de alcoóis como componentes de esterificação é possível obter ésteres com a actividade farmacológica dos alcoóis activos sem a actividade es peclfica do ácido hialurônico, possuindo as qualidades atrás de£ critas de biodisponibilidade e estabilidade superiores relativamente â actividade desejada e as caracterlsticas dos alcoóis far macologicamente activos.

Nos derivados aqui descritos, que derivem de alcoóis farmacologicamente activos, a molécula hialu-rônica de ligação reticular actua basicamente como um veiculo pa ra o componente farmacologicamente activo, podendo por isso englobar-se nos grupos 2) ou 3). Uma vez que os novos derivados de ligações reticulares actuam como os veículos actuais de acordo com as utilizações 2) e 3), são preferencialmente derivados dos anteriormente referidos alcoóis poli-hídricos terapeuticamente inactivos, e os possíveis grupos éster que derivem dos alcoóis mono-hídricos são também de preferência sem qualquer acção farma cológica. A substância activa mistura-se fisicamente com os novos derivados e os medicamentos resultantes podem conter também outros ingredientes e excipientes frequentemente utilizados em . preparações farmacêuticas convencionais. Em vez de uma substân-' cia activa ê possível ter uma associação de substâncias activas. - 17 -

São particularmente interessantes os medicamentos desta espécie em que os novos derivados hialurõnicos actuam como veículo e con têm topicamente substâncias activas.

Os alcoõis farmacologicamente acti-vos utilizáveis para a esterificação dos grupos carboxi que ainda não possuem ligações reticulares nos novos derivados podem ser, para alem dos jã anteriormente referidos, os alcoõis policí^ clicos alifãticos/ciclo-alifáticos, tais como por exemplo os es-teroides, tais como as hormonas sexuais e os seus análogos sinte ticos e particularmente os corticosteroides e respectivos deriva dos, tais como por exemplo o estradiol e os seus derivados de me tilo, derivados de etinilo ou de propinilo na posição 17, testos^ terona e seus derivados, tais como 17-oc-metil-testosterona, 17--cxT-etinil-testosterona, 1',1,2-desidro-testosterona, nor-ges-trel, 19-nor-testosterona, 19^nor-17-cxí'-metil-testosterona, anti -hormonas tais como ciproterona, cortisona, hidrocortisona, dexa metasona, betametasona, parametasona, flumetasona, fluocinolona, clobetasol, beclometasona, alfaxolona, bolasterona. Outros álcoois terapeuticamente activos são por exemplo as vitaminas tais como axeroftol, vitaminas D2 e D3, aneurina, lactoflavina, ácido ascõrbico, riboflavina, tiamina e ácido pantotenico. De entre os alcoõis heteroclclicos também referiremos a atropina, escopolami na, cinchonina, cinchonidina, quinina, morfina, codeina, nalorfjl na, brometo de N-butil-escopolamõnio, ajmalina; fenil-etilamina tal como efedrina, isoproterenol, epinefrina, fármacos de feno-tiazina tais como perfenazina, pipotiazina, carfenazina, homofe-nazina, acetofenazina, flufenazina, cloreto de N-hidroxi-etil--prometazina; fármacos de tio-xanteno tais como flupentixol e clopentixol; anti-convulsivos tais como meprofendiol; anti-psicõ ticos tais como opipramol; anti-eméticos tais como oxipendil; analgésicos tais como carbetidina e fenoperidina e metadol; hipnóticos tais como etodroxizina; anorêxicos tais como benzidrol e difemetoxidina; tranquilizadores secundários tais como hidroxi zina; relaxantes musculares tais como cinamedrina, difilina, me-fenesina, metocarbamol, clorfenesina, 2,2-dietil-l,3-propandiol, guaifenesina, hidrocilamida; vasodilatadores coronários tais como dipiridamol e oxifedrina; bloqueadores adrenêrgicos tais como i -¾ -

propanolol, timolol, pindolol, bupranolol, atenolol, metoprolol, practolol? anti-neoplãsticos tais como 6-azauridina, citarabina, floxuridina; antibióticos tais como cloranfenicol, tianfenicol, eritromicina, oleandomicina, lincomicina; antivirais tais como idoxuridina; vasodilatadores periféricos tais como o álcool iso--nicotinílico; inibidores de anidrase carbónica tais como sulo-carbilato; anti-asmáticos e anti-inflamatórios tais como tiarami da? sulfamidas tais como 2-p-sulfanil-anilino-etanol.

Os novos derivados de ligações reti culares agora descritos podem utilizar-se, como é evidente, nos mesmos casos dos alcoóis livres.

Um aspecto particularmente interessante da presente invenção ê a possibilidade de se prepararem fãrmacos mais estáveis do que aqueles até agora disponíveis. Por isso ê possível preparar derivados de ligações reticulares para utilização nas prescrições que sejam típicas do próprio ácido hialurónico, por exemplo para injecções intra-articulares em que o derivado de ligações reticulares actua como lubrificante: devi do à melhor estabilidade dos derivados quando se faz a comparação entre a hialuronidase e o ácido livre, ê possível obter-se uma acção extraordináriamente prolongada. Por outro lado ê possí vel obter-se fãrmacos com uma acção de "retardamento" para os de rivados anteriores que contenham também grupos éster que derivem de alcoóis terapeuticamente activos. Estes libertam o álcool far macologicamente activo muito lentamente no organismo por meio de esterases. Para utilização de acordo com o anterior ponto 4), preparam-se os derivados de ligações reticulares sobretudo com alcoóis farmacologicamente inertes, por exemplo, alcoóis alifãti cos saturados bivalentes, especialmente os que possuem entre 2 e 8 átomos de carbono, glicerina e alcoóis monovalentes, sobretu do alcoóis alifáticos, mas também se utilizam alguns das séries atrás referidas para a esterificação parcial dos grupos carboxi que não tenham ligações reticulares. Neste ultimo grupo são particularmente interessantes os alcoóis insaturados, por exemplo os que possuem uma ou várias ligações duplas tais como os alco-. ôis vinllico ou alllico e os seus derivados condensados, como su * cede especialmente com o álcool polivinllico e com a glicerina. -lá-

Neste caso também i possível utilizar esteres mistos, de acordo com o objectivo particular pretendido. Os alcoõis alieiclicos também são úteis, por exemplo os derivados de ciclo-pentano e ci clo-hexano e dos seus derivados substituídos por grupos alquilo inferior, por exemplo grupos alquilo possuindo entre 1 e 4 átomos de carbono, especialmente pelos grupos metilo.

Para utilização em cosmética ê preferível recorrer aos derivados de ligações reticulares com grupos esterificados substancialmente idênticos aos referidos ante-riormente para utilização em artigos sanitários, médicos e cirur gicos. Também são de referir os alcoõis de terpeno, tais como os anteriormente referidos, especialmente os alcoõis odoríferos para a preparação de perfumes e de cremes perfumados.

Em todos os derivados de ligações reticulares de acordo com a presente invenção, os grupos carboxi que não possuam "ligações reticulares" ou que não sejam esterifi cados podem ser livres ou salifiçados. Os sais podem ter bases inorgânicas, por exemplo metais alcalinos tais como o potássio e particularmente o sõdio e o amõnio, e metais alcalino-terrosos tais como os sais de cálcio, ou magnésio e alumínio, ou podem ter bases orgânicas, especialmente bases azotadas e por conseguinte aminas alifáticas, aralifáticas, ciclo-alifáticas ou hete rocíclicas. Estes sais podem derivar de aminas terapeuticamente aceitáveis mas inactivas, ou de aminas com uma acção terapêutica De entre as primeiras prestar-se-ã atenção especial às aminas alifáticas, por exemplo, mono-, di- e tri-alquilaminas com grupos alquilo com o máximo de 18 átomos de carbono ou aril-alquila minas com o mesmo número de átomos de carbono na parte alifática e em que arilo significa um grupo benzeno eventualmente substituído por um a três grupos metilo ou átomos de halogeneo ou grupos hidroxi. As bases biologicamente inactivas para a formação dos sais também podem ser cíclicas tais como as alquilenaminas monocíclicas com ciclos possuindo entre 4 e 6 átomos de carbono, sendo o ciclo eventualmente interrompido por heteroãtomos escolhidos entre o grupo formado por azoto, oxigénio e enxofre, tal . como a piperidina, piperazina ou morfolina, ou podendo ser substituído, por exemplo, por funções amino ou hidroxi, tal como ami κ ÍSWBSSbe

no-etanol, etileno-diamina/ efedrina ou colina.

Também é possível formar os sais de amõnio quaternários de esteres parciais, por exemplo, sais de te tra-alquil-amónio com o número anteriormente referido de átomos de carbono e de preferencia sais do mesmo tipo em que o quarto grupo alquilo possua entre 1 e 4 átomos de carbono, por exemplo, um grupo metilo.

Essas aminas biologicamente activas cuja acção terapêutica pode ser utilizada englobam os fãrmacos azotados e alcalinos tais como os abrangidos pelos grupos seguin tes ϊ alcaloides, peptidos, fenotiazina, benzodiazepina, tioxanteno, hormonas, vitaminas, anti-convulsivos, anti-psicõticos, anti-emê ticos, anestêticos, hipnóticos, anerêxicos, tranquilizantes, re-laxantes musculares, vasodilatadores coronários, anti-neoplãsti-cos, antibióticos, anti-bacterianos, antivirais, anti-malariais, inibidores de anidrase carbónica, anti-inflamatórios não esteroi. des, vasoconstrictores, agonistas colinêrgicos, antagonistas co-linêrgicos, agonistas adrenergicos, bloqueadores adrenérgicos, antagonistas narcóticos.

Todos estes fãrmacos com grupos azo tados alcalinos indicados na invenção podem ser referidos como exemplos relativos â utilização dos ésteres. A salificação dos grupos carboxi não esterificados com bases terapeuticamente actL vas pode substituir ou integrar a função veicular dos novos deri vados de ligações reticulares obtidos por esterificação com alco óis terapeuticamente activos pelo que representa outro caso particular de utilização dos novos compostos como veículos terapêuticos de acordo com o ponto 2): as bases activas são veiculadas igualmente pelos sais neutros que se obtêm por adição da quantidade estequiomêtrica alcalina, tanto a partir de sais alcalinos que se obtêm por adição de vim excesso de base como de sais ácidos que se obtêm por adição de uma base por defeito. Os novos de rivados hialurônicos de acordo com a presente invenção são parti cularmente úteis uma vez que constituem medicamentos para utili-, zação local ou tópica, especialmente em oftalmologia, onde apre-' sentam particular compatibilidade com o epitilio da cõrnea sendo - Ί £ _

por isso muito bem tolerados, sem efeitos de sensibilização. Alên disso, quando se administram os medicamentos na forma de soluções concentradas com caracteristicas visco-elásticas ou na forma sólida, ê possível obter-se sobre o epitélio da côrnea pelícu las estáveis e perfeitamente transparentes que são também perfei tamente adesivas, garantindo uma utilidade biológica prolongada do fármaco constituindo por isso preparações excelentes com um efeito de retardamento.

Estes medicamentos oftálmicos são de valor excepcional especialmente no campo da veterinária, tendo em consideração que no presente não existem especialidades de veterinária que contenham agentes químicos. Na realidade, utilizam-se nos animais os produtos utilizáveis nas pessoas, pelo que nem sempre é possível garantir um intervalo especifico de acção sendo por vezes inadequados para aplicação nas condições sob as quais têm que ser administrados. Por exemplo, ê esse o caso da terapia da conjuntivite da córnea infecciosa, do olho rosa ou IBK, que e uma infecção que normalmente afecta os bovinos, ovi-dios e caprinos. Presumivelmente existem factores etiolõgicos e£ peclficos para estas três espécies e mais particularmente: nos bovinos o micro-organismo principal envolvido parece ser a Mora-xella bovis (mesmo não sendo de excluir outros agentes virais, tais como o vírus Rhinotracheitis, nos ovidios temos o Micoplas-ma, Rickettsia e Chlamidia, nos caprinos temos Rickettsia). A do ença apresenta-se numa forma grave e tende a espalhar-se rapidamente: nos estádios iniciais a sintomatologia caracteriza-se pelo blefarosplasmo e lacrimação excessiva, seguindo-se a descarga purulenta, conjuntivite e ceratite, frequentemente associados com febre, uma redução do apetite e da produção de leite. São particularmente graves as lesões da córnea em que os estádios fi nais podem conduzir â perfuração da própria córnea. 0 processo clinico varia desde alguns dias até diversas semanas.

Utiliza-se uma ampla variedade de terapias envolvendo agentes químicos administrados quer pela via tópica (frequentemente em associação com agentes anti-inflamatõ-. rios esteroides) quer pela via sistémica, tais como: tetracícli-] na, tal como oxitetraclclina, penicilina, tal como cloxacilina e ι n

benzil-penicilina, sulfamidas, polimixina B (associada com mico-nazol e prednisolona), cloranfenicol, tilosina e cloromicetina. 0 tratamento tópico da doença, apesar da sua aparente simplicida de, constitui ainda um problema em aberto, uma vez que com as preparações oculares até agora utilizadas não tem sido possível, por uma razão ou por outra, obterem-se as concentrações de antibióticos ou de sulfamidas terapeuticamente activas na secreção lacrimal. Este facto ê facilmente compreensível no caso das solu ções tendo em consideração a posição predominantemente inclinada da cabeça dos animais atrás referidos, mas também ê verdade para os medicamentos semi-sólidos, visto que os excipientes normalmen te utilizados nos mesmos não possuem as qualidades necessárias para aderirem â superfície da cõrnea. Isto deve-se ao facto de usualmente não possuirem uma concentração suficientemente elevada de substância activa e de não se obter uma distribuição perfeita da mesma (presença de um gradiente de distribuição). Os obstáculos aos colírios convencionais para utilização oftálmica foram descritos, por exemplo, por Slatter e outros em "Austr. vet. J.", 1982, 59 (3), pp. 69-72. Com os esteres da presente in venção ê possível ultrapassar essas dificuldades. Na realidade, a presença do ester hialurõnico como veículo para os fârmacos of tâlmicos permite a formulação de excelentes preparações sem gradiente de concentração de substância activa sendo por isso perfe. tamente homogenea, transparente e adesiva ao epitilio da córnea, sem nenhum efeito de sensibilização e com a substância activa ac tuando como um veículo excelente, possivelmente também com um efeito de retardamento. Gs medicamentos que contêm os novos deri vados que se podem utilizar em tratamentos oftálmicos afectam principalmente os efeitos anti-microbiano/antibiótico, anti-in-flamatõrio, cura de ferimentos e miôtico. Alguns exemplos de subj. tâncias antibióticas são: antibióticos alcalinos e não alcalino^ por exemplo, aminoglucosídicos, macrolídicos, tetracíclina e pep tidos, tais como por exemplo gentamicina, neomicina, estreptomi-cina, di-hidro-estreptomicina, canamicina, amicacina, tobramici-na, espectinomicina, eritromicina, oleandomicina, carbomicina, • espiramicina, oxi-tetracíclina, rolitetracíclina, bacitracina, . polimixina B, gramicidina, colistina, cloramfenicol, lincomicina,

vancomicina/ novobiocina, ristocetina, clindamicina, amfoterici-na B, griseofulvina, nistatina e possivelmente os seus sais, tais como os sulfatos ou nitratos, ou associações dos mesmos quer entre eles próprios quer com outros princípios activos, tais como por exemplo os referidos anteriormente.

Outros fãrmacos oftálmicos que se podem utilizar com vantagem de acordo com a presente invenção são: outros anti-infecciosos tais como dietil-carbamazina, meben dazol, sulfamidas tais como sulfacetamida, sulfadiazina, sulfiso xazol; antivirais e anti-tumorais tais como iodo-desoxiuridina, adenina arabinosida, trifluoro-timidina, aciclovir, etil-desoxiu ridina, bromo-vinil-desoxiuridina, 5-iodo-5,-amino-2',5'-di-deso xiuridina; anti-inflamatôrios esteroides, tais como dexametasona, hidrocortisona, prednisolonafluoro-metolona, medrisona e possivelmente os seus ésteres, por exemplo os ésteres do ácido fosfórico; anti-inflamatôrios não esteroides tais como indometacina, oxifen-butazona, flurbiprofeno; cicatrizantes de ferimentos tais como o factor EGF; de crescimento da epiderme; anestésicos locais, tais como Benoxinato, proparacaina e possivelmente os seus sais; fãrmacos agonistas colinêrgicos tais como pilocarpina, me-tacolina, carbamil-colina, aceclidina, fisostigmina, neostigmina, demecario e possivelmente os seus sais; fãrmacos de bloqueio colinêrgicos tais como a atropina e os seus sais; fãrmacos agonistas adrenêrgicos tais como noradrenalina, adrenalina, nafazolina, metoxamina e possivelmente os seus sais; fãrmacos de bloqueio adrenêrgicos tais como propanolol, timolol, pindolol, bupranolol, atenolol, metoprolol, oxprenolol, practolol, butoxamina, sotalol, butadrina, labetalol e possivelmente os seus sais.

Os exemplos de substâncias activas que se utilizam por si próprias ou em associação entre elas ou com outros princípios activos em dermatologia são: os agentes te rapêuticos tais como os agentes anti-infecciosos, antibióticos, antimicrobianos, anti-inflamatôrios, citostãticos, citotoxicos, antivirais, anestésicos e agentes preventivos, tais como as pro-tecções solares, desodorizantes, anti-sêpticos e desinfectantes. . A partir dos exemplos conceituados [ para oftalmologia e dermatologia ê razoável admitir-se por analo 1 Λ

gia quais são os medicamentos de acordo com a presente invenção adequados para utilização nos diversos campos da medicina, tais como por exemplo otolaringologia, ginecologia, angiologia, neura logia ou qualquer outro tipo de patologia dos orgãos internos que possa ser tratada por aplicações tópicas locais, por exemplo por acção rectal. Evidentemente que ê possível preparar associações de substâncias terapeuticamente activas com os novos deriva dos de acordo com a presente invenção adequadas para administração parenteral. Neste último caso, para se obterem soluções aquo sas para injecção, devem escolher-se derivados hialurónicos com um baixo nível de ligações reticulares e/ou esterificação. Podem utilizar-se derivados que sejam ligeiramente solúveis ou totalmente insolúveis em água para preparar associações que contenham as substâncias activas para administração em soluções de substân cias orgânicas, por exemplo soluções oleosas.

Os medicamentos do tipo aqui descri to para utilização tópica podem apresentar-se na forma sólida, tais como os pós secos por congelamento que contêm apenas os dois componentes misturados ou separadamente. Tais medicamentos na for ma sólida em contacto com o epitilio que se pretende tratar formam soluções mais ou menos concentradas de acordo com a natureza do epitêlio particular, possuindo as mesmas características das soluções previamente preparadas in vitro e que representam outro aspecto particularmente interessante da presente invenção. Tais soluções preparam-se de preferência em água destilada ou numa so lução salina esterilizada e não contêm outros veículos farmacêuticos para alem do ester hialurónico ou de vim dos seus sais. As concentrações de tais soluções também podem variar dentro de amplos limites, por exemplo entre 0,01 e 75% para cada um dos componentes considerado separadamente, e para as suas misturas ou sais. Da-se preferência particular âs soluções com propriedades visco-elãsticas pronunciadas, por exemplo com vim teor entre 10% e 90% de medicamento ou de cada um dos seus componentes. São par ticularmente importantes os medicamentos deste tipo quer na forma anidra (pó seco por congelamento) ou em soluções concentradas . ou diluídas em agua ou em solução salina, possivelmente com acrês ' cimo de substâncias aditivas ou auxiliares, tal como no caso par • - ?n -

ticular das substâncias desinfectantes ou de sais minerais que actuam como veículo ou outras para utilização oftálmica.

De entre os medicamentos da invenção e preferível escolher conforme for o caso, aqueles que tenham um grau de acidez adequado para o ambiente ao qual vão ser aplicados, isto ê, um pH fisiologicamente tolerável. Por exemplo, nos sais anteriores dos ésteres de ácido hialurõnico com uma sub£ tância activa alcalina, pode ajustar-se o pH regulando adequadamente a quantidade de poli-sacarido, dos seus sais e da própria substância alcalina. Deste modo, por exemplo, se a acidez de um sal de ester hialurõnico com substâncias alcalinas for muito ele vada, neutralizam-se os grupos de ácido livre em excesso com as bases inorgânicas atrás referidas, por exemplo com hidrato de sõ dio ou de potássio ou de amónio.

Processos para a Preparação dos Esteres HY da Invenção

Os novos derivados de ligações reti culares da presente invenção podem preparar-se por métodos conhe eidos de per si para a esterificação de ácidos carboxi, por exem pio para o tratamento do ácido hialurõnico livre com os alcoõis poli-hídricos anteriores na presença de catalizadores, tais como os ácidos onorgânicos fortes ou os permutadores iõnicos de tipo ácido, ou com um agente de esterificação susceptível de introduzir o radical álcool desejado na presença de bases inorgânicas ou orgânicas. Como agentes de esterificação ê possível utilizar os indicados na literatura, especialmente os ésteres de diversos ácidos inorgânicos ou ácidos sulfônicos orgânicos, tais como os hidrogeno-ãcidos, isto ê, o halogeneto de alquilo, tal como o io deto de metilo ou outros grupos alquilo que estejam na base dos anteriores alcoõis bivalentes. A reacção pode efectuar-se num solvente adequado, por exemplo um álcool, de preferência aquele que corresponda ao grupo alquilo que se pretende introduzir no grupo carboxi, mas também pode efectuar-se em solventes não polares tais como as cetonas, éteres, tais como o dioxano ou solventes . aprõticos, tais como o dimetil-sulfóxido. Como base ê possível utilizar por exemplo um hidrato de um metal alcalino, de um me-

tal alcalino-terroso ou de magnésio ou óxido de prata ou um sal alcalino de um desses metais, tal como um carbonato, e de entre as bases orgânicas, uma base azotada terciária tal como a piridi na ou a colidina. Em vez de uma base pode utilizar-se um permuta dor de iões do tipo alcalino.

Outro método de esterificação impli ca sais de metal ou sais com bases azotadas orgânicas, por exemplo, sais de amónio ou de amónio substituído. De preferência devem utilizar-se os sais de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos, mas também se podem utilizar quaisquer outros sais de metais. Neste caso os agentes de esterificação são também os atras referidos e o mesmo ê verdadeiro para os solventes. De pre ferência devem utilizar-se solventes apróticos, por exemplo, di-metil-sulfóxido e dimetil-formamida. Estes métodos de esterifica ção podem, como ê evidente, utilizar-se também para a preparação dos ésteres simples atrãs descritos.

De acordo com um novo e original procedimento descrito no pedido de patente pendente dos Estados Unidos atrãs referido e relativo aos ésteres simples de acido hialurônico, ê possível prepara-los vantajosamente a partir de sais de amónio quaternário de acido hialurônico com um agente de esterificação num solvente aprôtico, tal como os dialquil-sulfô-xidos, dialquil-carboxil-amidas, em particular os dialquil-sulfõ xidos de alquilo inferior, sobretudo dimetil-sulfÓxido, e dial-quil-amidas de alquilo inferior de ácidos alifáticos inferiores, tais como dimetil- ou dietil-formamida ou dimetil- ou dietil-ace tamida. A reacção efectua-se de preferência a uma temperatura compreendida entre 09C e 1009C, e especialmente entre 259C e 759 C, por exemplo a 309C aproximadamente. A esterificação efectua--se preferencialmente por adição gradual do agente de esterifica ção ao sal do amónio anterior dissolvido num dos solventes referidos, por exemplo em dimetil-sulfóxido.

Pode utilizar-se o mesmo método para preparar os esteres de ligações reticulares típicos da presen te invenção, isto ê, as ligações em ponte entre os dois grupos • carboxi formam-se facilmente por esterificação de substâncias que . derivem dos anteriores alcoõis poli-hidricos em sais de amónio Λ Λ

quaternário de ácido hialurónico. Como sais de amónio quaternário de partida ê preferível utilizar um tetra-alquilato de amónio inferior/ possuindo os grupos alquilo entre 1 e 6 átomos de carbono de preferência. Numa primeira escolha deve utilizar-se hialuronato de tetra-butil-amõnio. Estes sais de amónio quaternã rio podem preparar-se fazendo reagir um sal metálico de ácido hialutônico, de preferência um dos referidos anteriormente, espe cialmente o sal de sódio ou de potássio/ numa solução aquosa com uma resina sulfõnica salifiçada com a base de amónia quaternária. 0 hialuronato de tetra-alquil-amõnio pode obter-se secando o e-luldo por congelamento.

Os hialuronatos de tetra-alquil-amô nio que derivem de alquilos inferiores, especialmente de alqui-los de 1 a 6 átomos de carbono são novos e constituem outro ob-jectivo da presente invenção. Inesperadamente verificou-se que tais sais são solúveis nos solventes aprôticos anteriores, sendo a esterificação do ácido hialurónico de acordo com o novo procedimento anterior particularmente fácil e proporcionando rendimen tos elevados. Por isso, é possível apenas com tal procedimento dosear exactamente o numero de grupos carboxi do ácido hialurõnjL co que são esterifiçados.

Uma variante do procedimento anteriormente referido consiste em fazer reagir o sal de potássio ou de sódio do ácido hialurónico, em suspensão num solvente adequado tal como o dimetil-sulfóxido, com um agente de esterificação adequado na presença de uma quantidade catalítica de sal de amónio quaternário, tal como o iodeto de tetra-butil-amõnio. Para a preparação dos novos ésteres de acordo com a presente invenção podem utilizar-se ácidos hialurõnicos de qualquer origem, por exemplo os ácidos extraídos dos materiais de partida naturais an teriores, por exemplo a partir de cristãs de galos. A preparação de tais ácidos hialurõnicos está descrita na literatura: de preferência devem utilizar-se ácidos hialurõnicos purificados. De acordo com a invenção ê preferível utilizar ácidos hialurõnicos constituídos pelas fracçóes moleculares dos ácidos integrais ob-• tidos directamente por extracção dos materiais orgânicos com pe-. sos moleculares que podem variar amplamente, por exemplo entre

O

90%-80% e 0,2% do peso molecular do acido integral, de preferência entre 5% e 0,2%. Estas fracções podem obter-se por diversos procedimentos descritos na literatura, ou seja, por hidrólise ou por oxidação ou por agentes enzimãticos ou por procedimentos físicos, por exemplo procedimentos mecânicos ou por irradiação, e por isso formam-se com frequência extractos fundamentais durante esses mesmos procedimentos de purificação (ver por exemplo o artigo atras referido de Balazs e outros em "Cosmetics & Toiletri-es"). A separação e a purificação de fracções moleculares obtidas efectua-se, por exemplo, segundo técnicas conhecidas, por exemplo por filtração molecular.

Uma fracção de HY purificada adequa da para utilização de acordo com a presente invenção ê, por exem pio, a que se designa por "hialuronato de sódio não inflamatório NIF-NaHA" cuja descrição foi feita por Balazs no artigo "Healon" - Um guia para a sua utilização em Cirurgia Oftálmica - D. Mille:: e R. Stegmann, edições John Wiley & Sons N.Y. 81983: p.5. Particularmente importantes como materiais de partida para os ésteres da presente invenção são as duas fracções purificadas que se obtêm a partir do acido hialurônico, por exemplo o tipo extraído das cristãs dos galos, conhecidos pelos nomes de "Hyalastine" e "Hyalectin". A fracção "Hyalastine" possui um peso molecular médio compreendido entre 50 000 e 100 000 ao passo que a fracção "Hyalectin" possui um peso molecular médio compreendido entre 500 ooo e 730 000. Também se isolou e caracterizou uma fracção combinada com estas duas fracções, possuindo um peso molecular médio compreendido entre 250 000 e 350 000. Esta fracção combina da pode obter-se proporcionando um rendimento de ácido hialurõni. co total igual a 80% da quantidade disponível no material de par tida particular, ao passo que a fracção "Hyalectin" pode obter--se com um rendimento de 30% e a fracção "Hyalastine" com um ren dimento de 50% do HY de partida. A preparação destas fracções es tá descrita nos Exemplos 38 e 40.

Nos novos derivados de ligações reticulares de ácido hialurônico, os grupos carboxi não esterifica . dos podem ser livres ou salificados ou parcialmente salificados [ obtendo-se por isso diversos tipos diferentes de produtos de li-

gações reticulares. Isto é, aqueles em que os grupos carboxi remanescentes são livres ou salifiçados, aqueles em que os grupos carboxi remanescentes são total ou parcialmente esterifiçados e entre os últimos os grupos remanescentes podem por sua vez ser li vres ou salifiçados. Deste modo fica disponível uma ampla variedade de produtos, variando as suas propriedades físicas e especialmente o seu grau de acidez e propriedades visco-elásticas e a sua capacidade para a formação de gel. 0 número de grupos ácidos que se mantêm livres pode ser importante para a preparação de medicamentos com um pH particular. A preparação dos sais dos novos derivados pode efectuar-se por um processo conhecido, por exemplo fazendo reagir no derivado hialurónico a quantidade básica calcu lada de hidratos alcalinos ou de sais básicos de metais alcalinos, tais como os carbonatos ou bicarbonatos. Por exemplo, i po£ sível preparar primeiro soluções aquosas do derivado hialurónico e da base, libertando-se tais substâncias das soluções aquosas dos seus sais com permutadores iónicos adequados, combinando as duas soluções a uma temperatura baixa, por exemplo entre 09C e 209C; se o sal assim obtido for facilmente solúvel em água seca--se por congelamento, ao passo que os sais menos solúveis se separam por centrifugação ou filtração ou decantação e possívelmen te secam-se depois. No caso das bases orgânicas que vierem a ser veiculadas com os novos derivados de ligações reticulares, os me dicamentos obtidos como sais de tais bases com os novos derivados podem ser neutros, ácidos ou alcalinos conforme se adicionem quantidades estequiomêtricas ou conforme exista um defeito ou ex cesso de base.

De acordo com um aspecto particular da invenção i possível preparar medicamentos do tipo anterior co meçando com os sais isolados previamente e talvez purificados, num estado anidro, tal como os põs amorfos, os quais em contacto com o tecido que se pretende tratar constituem uma solução aquosa concentrada de carácter gelatinoso, consistência viscosa e com propriedades elásticas. Estas qualidades mantêm-se também para • diluições mais fortes e podem utilizar-se em vez dos sais anidros . anteriores, soluções em água ou numa solução salina mais ou me-

nos concentradas, possivelmente com a adição de outros excipien-tes ou aditivos, tais como outros sais minerais para regular o pH e a pressão osmõtica. Ê evidente gue também é possível utilizar os sais para preparar geles, pomadas, cremes ou unguentos, incluindo outros excipientes ou ingredientes utilizados nas formulações tradicionais destas preparações farmacêuticas.

De entre os novos produtos da presente invenção merecem particular evidencia os ésteres anterior-mente descritos, os seus sais e também os gue se destacam nos se guintes exemplos ilustrativos. A presente invenção também engloba modificações dos processos de preparação dos novos ésteres e res pectivos sais, podendo um procedimento ser interrompido em qual-guer estádio ou podendo um procedimento iniciar-se com um composs to intermediário e efectuando-se os passos restantes, ou podendo os produtos de partida formar-se in situ. A invenção ilustra-se com os exemplos seguintes, sem limitações de generalidade, e em gue DMSO significa dimetil-sulfoxido. Os produtos descritos nos exemplos são constituídos por ésteres de ligações reticulares de acordo com a presente invenção, possuindo uma percentagem de grupos car boxilo de ácido hialurõnico esterifiçados com um álcool poli-hí-drico e possuindo os restantes grupos carboxilo salificados e/ou esterifiçados com um álcool mono-hídrico. A tabela 1 apresenta diversos produtos de acordo com os exemplos 1-37, descrevendo o numero de grupos carboxilo esterificados com o álcool poli-hldri. co especificado, e o numero de grupos carboxilo salificados com sõdio e/ou esterificados com o álcool mono-hídrico especificado. EXEMPLO 1

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-3 propandiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259C em cor . dições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azoto l_ e longe da luz. Adiciona-se 0,078 g de iodeto de etilo (0,5 mM) r\ y-

e agita-se a solução durante 15 horas a 309C. Adiciona-se 0,074 g de 1-3 di-iodo-propano (0,25 mM, correspondente a 0,5 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amónio em sal de sódio adiciona-se à solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de E^O destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/H20 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 4,01 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros (Anal. Biochem. 33, 1028, 1961) e apresenta um teor de 0,56% p/p em etanol (teoricamente: 0,574) . A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titu lação com HC1 0,1 N utilizando fenol-ftaleína como indicador. Des te modo e possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,24 mEq/g (teoricamente: 0,25). EXEMPLO 2

Preparação de ácido hialurônico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-3 propandiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amônio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,078 g de iodeto de etilo (0,5 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309C. Adiciona-se 0,148 g de 1-3 di-iodo-propano (0,5 mM, correspondente a 1 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi

do radical tetra-butil-amónio em sal de sódio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 3,99 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 0,56% p/p em etanol (teoricamente: 0,574). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleína como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,36 mEq/g (teoricamente 0,374 . EXEMPLO 3

Preparação de ácido hialurónico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-3 propandiol

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,078 g de iodeto de etilo (0,5 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309C. Adiciona-se 0,296 g de 1-3 di-iodo-propano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amónio em sal de sódio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo. • Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa . ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de

I

acetona/I^O 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 3,98 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 0,56% p/p em etanol (teoricamente: 0,574). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleína como indicador. Deste modo e possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,61 mEq/g (teoricamente 0,621. EXEMPLO 4

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,156 g de iodeto de etilo (1 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309C. Adiciona-se 0,296 g de 1-3 di-iodo-propano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se ã solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com vim banho de í^O/gelo.

Obtem-se 4,00 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor o n

de 1,08% p/p em etanol (teoricamente: 1,15). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. 0 excesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fe nol-ftaleína como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,735 mEq/g (teoricamente: 0,747) . EXEMPLO 5

Preparação de ácido hialurónico ΉΥ) parcialmente esterifiçado com etanol e parcialmente reticulado com 1-3 propandiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,312 g de iodeto de etilo (2 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,296 g de 1-3 di-iodo-propano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amônio em sal de sódio adiciona-se à solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de í^O destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/H^O 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 4,01 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 2,18% p/p em etanol (teoricamente: 2,29). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. ] 0 excesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fe * nol-ftaleína como indicador. Deste modo ê possível determinar um Λ Λ»

teor em grupos ester total igual a 0,98 mEq/g (teoricamente: 0,995). EXEMPLO 6

Preparação de ácido hialurõnico \EY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-3 propandiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,624 g de iodeto de etilo (4 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,296 g de 1-3 di-iodo-propano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se à solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 4,00 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 4,5% p/p em etanol (teoricamente: 4,57). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. 0 excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe nol-ftalelna como indicador. Deste modo e possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,43 mEq/g (teoricamente 1,49) EXEMPLO 7

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado

com etanol e parcialmente reticulado com 1-3 propandiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,934 g de iodeto de etilo (6 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,296 g de 1-3 di-iodo-propano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se à solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H^O/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/H20 5sl e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 4,03 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 6,74% p/p em etanol (teoricamente: 6,83). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. 0 excesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fe nol-ftaleína como indicador. Deste modo i possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,96 mEq/g (teoricamente 1,98). EXEMPLO 8

Preparação de ácido hialurónico (HY) parcialmente esterifiçado com etanol e parcialmente reticulado com 1-3 propandiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amônio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo • to e longe da luz. Adiciona-se 1,170 g de iodeto de etilo (7,5 ) mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se

vrxmsssmsrsr -. 0,296 g de 1-3 di-iodo-propano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sõdio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de ^O/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/ELjO 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vãcuo.

Obtem-se 4,02 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 8,46% p/p em etanol (teoricamente: 8,52). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. 0 excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe nol-ftaleína como indicador. Deste modo e possível determinar um teor em grupos ester total igual a 2,28 mEq/g (teoricamente 2,34). EXEMPLO 9

Preparação de ácido hialurÓnico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-3 propandiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,624 g de iodeto de etilo (4 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,592 g de 1-3 di-iodo-propano (2 mM, correspondente a 4 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sõdio adiciona-se â solu ] ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 desti-• lada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de

H20/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/H20 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vãcuo.

Obtem-se 3,99 g do composto designa do em epígrafe.

I A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 4,42% p/p em etanol (teoricamente: 4,57). A analise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleína como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,96 mEq/g (teoricamente 1,99). EXEMPLO 10

Preparação de acido hialurônico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-4 butanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amônio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,312 g de iodeto de etilo (2 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,310 g de 1-3 di-iodo-butano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs ho mogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amónio em sal de sódio adiciona-se à solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/H20 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se • ca-se no vãcuo.

Obtem-se 4,02 g do composto designa

do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 2,3% p/p em etanol (teoricamente: 2,28). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacçio de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe nol-ftaleína como indicador. Deste modo i possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,97 mEq/g (teoricamente 0,99). EXEMPLO 11

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-4 butanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-aménio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,624 g de iodeto de etilo (4 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,310 g de 1-4 di-iodo-butano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após ho mogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas. >

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de ^0 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de ^O/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/^O 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 3,95 g do composto designa do em epígrafe.

A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 2,25% p/p em etanol (teoricamente: 2,28). A análise dos gru-. pos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma * quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O H'r

excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftalelna como indicador. Deste modo é possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,41 mEq/g (teoricamente 1,48). EXEMPLO 12

Preparação de acido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-4 butanodiol. »

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amônio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,936 g de iodeto de etilo (6 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,310 g de 1-4 di-iodo-butano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apôs ho mogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amônio em sal de sõdio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de ^O/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/^O 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vãcuo.

Obtem-se 3,98 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 6,69% p/p em etanol (teoricamente: 6,81). A analise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fe-nol-ftalelna como indicador. Deste modo é possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,91 mEq/g (teoricamente 1,97). o r

EXEMPLO 13

Preparação de acido hialurõnico (HY) parcialmente esterifiçado com etanol e parcialmente reticulado com 1-6 hexano-diol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,312 g de iodeto de etilo (2 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,244 g de 1-6 di-bromo-hexano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amónio em sal de sódio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 4,05 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 2,18% p/p em etanol (teoricamente: 2,27). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleína como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,96 mEq/g (teoricamente 0,985». EXEMPLO 14

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-6 hexanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal \ tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0/624 g de iodeto de etilo (4 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0/244 g de 1-6 di-bromo-hexano (1 mM/ correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se à solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H^O destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de HLO/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona/ sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/E^O 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 4,02 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 4,46% p/p em etanol (teoricamente: 4,52). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleína como indicador. Deste modo é possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,43 mEq/g (teoricamente 1,47), EXEMPLO 15 ~

Preparação de ácido hialurónico (HY) parcialmente esterifiçado com etanol e parcialmente reticulado com 1-6 hexanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,934 g de iodeto de etilo (6 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,244 g de 1-6 di-bromo-hexano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas. . Para conversão dos grupos carboxi * do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se ã solu

ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de í^O/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/I^O 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 4,00 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 6,68% p/p em etanol (teoricamente: 6,76). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftalelna como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,91 mEq/g (teoricamente 1,96). EXEMPLO 16

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterifiçado com etanol e parcialmente reticulado com 1-8 octanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,078 g de iodeto de etilo (0,5 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,068 g de 1-8 di-bromo-octano (0,25 mM, correspondente a 0,5 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amónio em sal de sódio adiciona-se ã solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de ^0 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de ^O/gelo. • Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa • . ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de Λ Λ

acetona/H20 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 3,99 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 0,54% p/p em etanol (teoricamente: 0,571). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleína como indicador. Deste modo é possível determinar vim teor em grupos ester total igual a 0,23 mEq/g (teoricamente 0,25). EXEMPLO 17

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-8 octanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,078 g de iodeto de etilo (0,5 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,136 g de 1-8 di-bromo-octano (0,5 mM, correspondente a 1 mEq) e apos homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amônio em sal de sõdio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 3,97 g do composto designa • do em epígrafe. . A determinação etoxilo efectua-se

de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 0,55% p/p em etanol (teoricamente: 0,569). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleína como indicador. Deste modo é possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,35 mEq/g (teoricamente 0,37). EXEMPLO 18

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,078 g de iodeto de etilo (0,5 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,272 g de 1-8 di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 c durante 24 horas

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se à solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 4,05 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 0,55% p/p em etanol (teoricamente: 0,564). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos, c • excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fenoj. . -ftaleina como indicador. Deste modo ê possível determinar um

teor em grupos ester total igual a 0,60 mEq/g (teoricamente 0/61). EXEMPLO 19

Preparação de acido hialurõnico (HY) parcialmente esterifiçado com etanol e parcialmente reticulado com 1-8 octanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,156 g de iodeto de etilo (1 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,272 g de 1-8 di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amonio em sal de sódio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 4,01 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 1,09% p/p em etanol (teoricamente: 1,13). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleina como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,70 mEq/g (teoricamente 0,73). EXEMPLO 20 | Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado • com etanol e parcialmente reticulado com 1-8 octanodiol. λ r\

Paz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,312 g de iodeto de etilo (2 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,272 g de 1-8 di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amônio em sal de sõdio adiciona-se ã solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 4,05 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 2,05% p/p em etanol (teoricamente: 2,25). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. 0 excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftalelna como indicador. Deste modo i possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,96 mEq/g (teoricamente 0,98). EXEMPLO 21

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,624 g de iodeto de etilo (4 mM) • e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,272 • g de 1-8 di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após

homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 3,99 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 4,39% p/p em etanol (teoricamente: 4,49). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe-nol-ftalelna como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,43 mEq/g (teoricamente 1,46) EXEMPLO 22

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,934 g de iodeto de etilo (6 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309C. Adiciona-se 0,272 g de 1-8 di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 desti-• lada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de \ H20/gelo.

Obtem-se 4,10 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 6,66% p/p em etanol (teoricamente: 6,72). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fe-nol-ftalelna como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,89 mEq/g (teoricamente 1,94). EXEMPLO 23

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 1,170 g de iodeto de etilo (7,5 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,272 g de 1-8 di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309C durante 24 horas.

Obtem-se 4,03 g do composto designa do em epígrafe. a r·

A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 8,27% p/p em etanol (teoricamente: 8,38). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fe-nol-ftaleina como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 2,05 mEq/g (teoricamente 2,3). EXEMPLO 24

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,624 g de iodeto de etilo (4 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,544 g de 1-8 di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sodio adiciona-se ã solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 4,15 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 4,36% p/p em etanol (teoricamente: 4,42). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quan • tidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509C durante 30 minutos. 0 ex-. cesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fenol- 1 1 WSS&SSSfasss^;i

s·* -ftaleina como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,90 mEq/g (teoricamente 1,92). EXEMPLO 25

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-10 decanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,312 g de iodeto de etilo (2 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,300 g de 1-10 di-bromo-decano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apôs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sódio adiciona-se a solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de 0/gelo.

Obtem-se 4,12 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 2,12% p/p em etanol (teoricamente: 2,24). A análise dos grupos ester totais e£ectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe nol-ftaleína como indicador. Deste modo e possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,94 mEq/g (teoricamente 0,97). EXEMPLO 26

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado

com etanol e parcialmente reticulado com 1-10 decanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,624 g de iodeto de etilo (4 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,300 g de 1-10 di-bromo-decano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apôs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas. >

Obtem-se 4,10 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 4,36% p/p em etanol (teoricamente: 4,46). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fe nol-ftaleína como indicador. Deste modo i possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,43 mEq/g (teoricamente 1,45). EXEMPLO 27

Preparação de ácido hialurônico (HY) parcialmente esterificado com etanol e parcialmente reticulado com 1-10 decanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo • to e longe da luz. Adiciona-se 0,934 g de iodeto de etilo (6 mM) ! e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,300 a n g de 1-10 di-bromo-decano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amónio em sal de sódio adiciona-se a solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

I

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/E^O 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 4,12 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 6,5% p/p em etanol (teoricamente: 6,67). A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fe nol-ftalelna como indicador. Deste modo e possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,87 mEq/g (teoricamente 1,93). EXEMPLO 28

Preparação de ácido hialurónico (HY) parcialmente esterificado » com etanol e parcialmente reticulado com oc -paraxilenodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,624 g de iodeto de etilo (4 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,264 g de oc , oc-dibromo-p-xileno (1 mM, correspondente a 3 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas,

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amónio em sal de sódio adiciona-se ã solu * ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 desti- • lada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de A Λ

H20/gelo.

Obtem-se 4,04 g do composto designa do em epígrafe. A determinação etoxilo efectua-se de acordo com o método de Cundiff e outros e apresenta um teor de 4,4% p/p em etanol (teoricamente: 4,5). A análise dos grupos éster totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em excesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fe nol-ftalelna como indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,36 mEq/g (teoricamente 1,47). EXEMPLO 29

Preparação de ácido hialuronico (HY) parcialmente esterifiçado com álcool benzílico e parcialmente reticulado com 1-8 octanodi-ol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,342 g de brometo de benzilo (2 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,272 g de di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de . acetona/H20 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ] ca-se no vãcuo. 1

Obtem-se 4f15 g do composto designa do em epígrafe. A analise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. 0 excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co mo indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,93 mEq/g (teoricamente; 0,95). EXEMPLO 30

Preparação de acido hialurõnico (HY) parcialmente esterificado com ãlcool benzílico e parcialmente reticulado com oc, oc'-paraxi lenodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amônio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,342 g de brometo de benzilo (2 mM) e agita-se a solução durante 15 horas a 309 C. Adiciona-se 0,246 g de oC, oc1-dibromo-p-xileno (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Obtem-se 4,11 g do composto designa do em epígrafe. A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex • cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso deter- • mina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co

mo indicador. Deste modo i possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,92 mEq/g (teoricamente: 0,95) . EXEMPLO 31

Preparação de ácido hialurônico (HY) parcialmente reticulado com 1-3 propanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,296 g de 1-3 di-iodo-propano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sodio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de ^0 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de ^O/gelo.

Obtem-se 3,98 g do composto designa do em epígrafe. A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co mo indicador. Deste modo é possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,47 mEq/g (teoricamente: 0,499). EXEMPLO 32

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal r o

tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,740 g de 1-3 di-iodo-propano (2,5 mM, correspondente a 5 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sõdio adiciona-se à solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de í^O/gelo.

Obtem-se 3,89 g do composto designa do em epígrafe. A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co mo indicador. Deste modo é possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,21 mEq/g (teoricamente: 1,25). EXEMPLO 33

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente reticulado com 1-3 propanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amõnio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 1,184 g de 1-3 di-iodo-propano (4 mM, correspondente a 8 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sõdio adiciona-se à solu * ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 desti-. lada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de

H20/gelo.

Adiciona-se 500 ml de acetona, sepa ra-se o precipitado por filtração, lava-se 3 vezes com 100 ml de acetona/ILjO 5:1 e 3 vezes com 100 ml de acetona pura e depois se ca-se no vácuo.

Obtem-se 3,87 g do composto designa do em epígrafe A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso determina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co mo indicador. Deste modo i possível determinar um teor em grupos ester total igual a 1,97 mEq/g (teoricamente: 2,00). EXEMPLO 34

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente reticulado com 1-4 butanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amônio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,310 g de 1-4 di-iodo-butano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apõs homogeneização mantem-se a so lução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amônio em sal de sódio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de ^0 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 4,00 g do composto designa do em epígrafe. . A análise dos grupos ester totais * efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex

C A

cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso deter-mina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co mo indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,492 mEq/g (teoricamente: 0,497) . EXEMPLO 35

Preparação de acido hialurõnico (HY) parcialmente reticulado com 1-6 hexanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amônio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,370 g de iodeto de tetra-butil--amônio (1 mM) e agita-se a solução durante 1 hora a 209 C. Adiciona-se 0,244 g de 1-6 di-bromo-hexano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apos homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amõnio em sal de sõdio adiciona-se â solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H20/gelo.

Obtem-se 4,01 g do composto designa do em epígrafe. A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso deter-mina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co mo indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,486 mEq/g (teoricamente: 0,494).

EXEMPLO 36

Preparação de ácido hialtirõnico (HY) parcialmente reticulado com 1-8 octanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo to e longe da luz. Adiciona-se 0,370 g de iodeto de tetra-butil--amõnio (1 mM) e agita-se a solução durante 1 hora a 209 C. Adi-ciona-se 0,272 g de 1-8 di-bromo-octano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e após homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amonio em sal de sõdio adiciona-se ã solu ção resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H20 destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de H2o/gelo.

Obtem-se 4,02 g do composto designa do em epígrafe. A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso deter-mina-se por titulação com HCl 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co mo indicador. Deste modo ê possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,478 mEq/g (teoricamente 0,490). EXEMPLO 37

Preparação de ácido hialurõnico (HY) parcialmente reticulado com 1-10 decanodiol.

Faz-se uma solução de 6,21 g de sal tetra-butil-amónio de HY (10 mEq) em 248 ml de DMSO a 259 C em • condições rigorosas de ausência de humidade, em atmosfera de azo . to e longe da luz. Adiciona-se 0,369 g de iodeto de tetra-butil-

-amónio (1 mM) e agita-se a solução durante 1 hora a 209 c. Adiciona-se 0,300 g de 1-10 di-bromo-decano (1 mM, correspondente a 2 mEq) e apôs homogeneização mantem-se a solução a 309 C durante 24 horas.

Para conversão dos grupos carboxi do radical tetra-butil-amônio em sal de sódio adiciona-se â solu çio resultante 2,5 g de NaCl dissolvidos em 100 ml de H^O destilada enquanto se arrefece a partir do exterior com um banho de I^O/gelo.

Obtem-se 3,99 g do composto designa do em epígrafe. A análise dos grupos ester totais efectua-se por reacção de saponificação com uma quantidade em ex cesso de NaOH 0,1 N a 509 C durante 30 minutos. O excesso deter-mina-se por titulação com HC1 0,1 N utilizando fenol-ftaleína co mo indicador. Deste modo é possível determinar um teor em grupos ester total igual a 0,476 mEq/g (teoricamente 0,487).

EXEMPLO 37A

Preparação do (parcial e misturado) octandiol e ester de cortiso na do ácido hialurônico (HY) - 40% de grupos carboxilicos esteri ficados com octandiol - 20% de ácidos carboxílicos esterificados com cortisona (C2]_)~40% de grupos carboxílicos salifiçados (Na) 6,2 g de sal de tetrabutilamõnio de HY com um peso molecular de 125 ooo correspondendo a 10 m.Eq. de uma unidade monomêrica são solubilizados em 310 ml de dimetilsu-fõxido a 259, adicionam-se 1,09 g (4 m.Eq.) de 1,8-di-bromo-octa no e conserva-se a solução durante 24 horas a 309. Adicionam-se 0,85 q (2 m.Eq.) de 21-bromo-4-pregneno-17 -1-3,11,20-triona e conserva-se a solução durante 24 horas a 309. • Depois adiciona-se uma solução que . contem 100 ml de água e 5 g de cloreto de sódio e verte-se vaga- cn

rosamente a mistura resultante em 2 000 ml de acetona sob agitação constante. Forma-se um precipitado que se filtra e lava por três vezes com 100 ml de acetona/ãgua 5:1 e três vezes com 100 ml de acetona e seca-se finalmente sob vácuo durante oito horas a 309 C.

Obtem-se 4,5 g do composto referido na epígrafe. Efectua-se a determinação quantitativa de cortisona, após hidrólise alcalina suave com solução hidro-alcoolica de Na2 COj e extracção com clorofórmio, de acordo com a British Pharma-copea, 1980, p. 224. C O _

TABELA 1

COMPOSIÇÃO PERCENTUAL DOS DIVERSOS PRODUTOS RETICULADOS N9 de grupos carbo-xilo sali-f içados com sódio por 100 N9 de N9 de grupos car- N9 de grupos car-exemplos boxilo esterifica boxilo reticular dos por 100 com... dos por 100 com.. 1 5 / ch3-ch2- 5 / -<ch2)3- 90 2 5 / ch3-ch2- 10 / -(ch2)3- 85 3 5 / ch3-ch2- 20 / -(ch2)3- 75 4 10 / ch3-ch2- 20 / -<ch2)3- 70 5 20 / ch3-ch2- 20 / -<ch2)3- 60 6 40 / ch3-ch2- 20 / -(ch2)3- 40 7 60 / ch3-ch2- 20 / -<ch2)3- 20 8 75 / ch3-ch9- 20 / -(ch2)3- 5 9 40 / ch3-ch9- 40 / -(CH2)3- 20 10 20 / ch3-ch9- 20 / -<CH2>3~ 60 11 40 / ch3-ch2- 20 / -<ch2)4- 40 12 60 / ch3-ch9- 20 / -(ch2)4- 20 13 20 / ch3-ch9- 20 / ' -(ch2)6- 60 14 40 / CH3-CH2- 20 / ' -(ch2)6- 40 15 60 / CH3-CH2- 20 / ' -<CH2>6- 20 16 5 / ch3-ch2- 5 / -<CH2>8- 90 17 5 / CH3-CH2- 10 / -<CH2>8- 85 18 5 / CH3-CH2- 20 / ' -(Ch2)8~ 75 19 10 / CH3-CH2- 20 / ' -(ch2)8- 70 20 20 / ch3-ch9- 20 / -ích2)8- 60 21 40 / ch3-ch9- 20 / -<ch2)8- 40 22 60 / ch3-ch2- 20 / -(CH2>8- 20 23 75 / ch3-ch9- 20 / -(ch2)8- 5 24 40 / CH3"CH2- 40 / -(ch2)8- 20 25 20 / ch3-ch2- 20 / -(CH2)10- 60 26 40 / ch3-ch2- 20 / -<CH2>10- 40 27 60 / ch3-ch2- 20 / -<CH2>10' 20 28 40 / ch3-ch2- 20 / - (CH2-0-CH2) - 40 29 20 / 0-ch2- 20 / -<ch2>8- 60

30 20 / 0-CH2- 20 / -(CH2-0-CH2)- 60 31 - 20 / -(CH2>3~ 80 32 - 50 / -<CH2>3- 50 33 - 80 / -<CH2>3- 20 34 - 20 / -<ch2)4- 80 35 - 20 / ' -(ch2> 6- 80 36 - 20 / · -<CH2> 8" 80 37 - 20 / ' -<ch2>io- 80 EXEMPLO 38 Método para a obtenção de uma mistu ra de fracções de Hyalastina e de Hialectina sem actividade inflamatória.

Trituram-se cristais de galos (3000 g) congelados ou frescas num triturador e depois homogenizam-se cuidadosamente num homogeneizador mecânico. Coloca-se a pasta a£ sim obtida num recipiente de aço inoxidável AISI 316 ou de vidro e trata-se com 10 volumes de acetona anidra. Agita-se tudo duran te 6 horas a uma velocidade de 50 rpm. Permite-se a separação du rante 12 horas e depois elimina-se a acetona com um sifão. Repete-se a extracção da acetona até que a acetona eliminada atinja o grau de humidade correcto (método Karl-Fischer). Depois faz-se a centrifugação e seca-se no vácuo a uma temperatura adequada du rante 5-8 horas. Deste modo obtem-se aproximadamente 500-600 g de cristais de galo em pó seco.

Faz-se a exposição de 300 g de pó seco a digestão enzimãtica com papaína (0,2 g) em meio aquoso tamponado com um tampão de fosfato na presença de uma quantidade adequada de cloridrato de cisteína. Agita-se durante 24 horas a 60 rpm a uma temperatura constante de 60-659 C. Depois arrefece--se para 259 C e adiciona-se Celite ® (60 g), mantendo-se a agitação durante mais 1 hora. Filtra-se a mistura obtida para proporcionar um líquido límpido. O líquido límpido expõe-se a ultra • -filtração molecular sobre membranas com um limite de exclusão * molecular de 30 000 de modo a reter na membrana as moléculas com

um peso molecular superior a 30 000.

Faz-se a ultra-filtração de 5 a 6 volumes originais adicionando continuamente água destilada ao produto que se está a ultra-filtrar. Suspende-se a adição de ã-gua e mantem-se a ultra-filtração atê o volume ficar reduzido a um terço do riginal. Ajusta-se o resíduo líquido para 0,1 N com adição de cloreto de sõdio e ajusta-se a temperatura para 509 C. Adiciona-se 45 g de cloreto de cetil-piridinio sob agitação a 60 rpm. Mantem-se a agitação durante 60 minutos e depois adiciona--se 50 g de Celite ®. Sob agitação ajusta-se a temperatura do conjunto para 259 C e recolhe-se o precipitado formado por centrifugação. Com o precipitado obtido faz-se uma suspensão numa solução 0,01M em cloreto de sõdio (5 litros) contendo 0,5% de cloreto de cetil-piridinio. Agita-se durante 60 minutos a 509 C; ajusta-se depois a temperatura para 259 C e centrifuga-se o precipitado. Repete-se a lavagem 3 vezes e finalmente reune-se o precipitado num recipiente contendo 3 litros de uma solução 0,05 M de cloreto de sõdio contendo 0,5% de cloreto de cetil-piridinio.

Agita-se a 60 rpm durante 60 minutos e mantem-se a temperatura constante a 259 C durante 2 horas. Elimina-se o sobrenadante por centrifugação. Repete-se o procedi mento diversas vezes com soluções de cloreto de sõdio 0,1M contendo 0,05% de cloreto de cetil-piridinio. Centrifuga-se a mistu ra e elimina-se o sobrenadante. Faz-se a dispersão do precipitado numa solução de cloreto de sõdio 0,30M contendo 0,5% de clore to de cetil-piridinio (3 litros). agita-se a mistura e recolhe--se o precipitado e o líquido límpido. Repete-se a extracção do precipitado mais 3 vezes, utilizando de cada vez 0,5 litros da mesma solução aquosa.

Finalmente elimina-se o precipitado residual e reunem-se os líquidos límpidos num unico recipiente. Ajusta-se a temperatura do liquido para 509 C enquanto se mantém a agitação. Depois ajusta-se o líquido para 0,23M com cloreto de sõdio. Adiciona-se 1 g de cloreto de cetil-piridinio e mantem-se . a agitação durante 12 horas. | Arrefece-se a mistura para 259 C e r i

depois filtra-se primeiro sobre Celite ^ e depois através de vim filtro. Seguidamente expõe-se de novo a ultra-filtração molecular sobre uma membrana com um limite de exclusão molecular de 30 000 fazendo-se a ultra-filtração de 3 volumes iniciais com a adição de uma solução de cloreto de sódio 0,33M. Interrompe-se a adição de solução de cloreto de sódio e reduz-se o volume para um quarto do volume inicial. A solução assim concentrada precipi ta-se sobre agitação (60 rpm) a 259 C com 3 volumes de etanol (95%). Recolhe-se o precipitado por centrifugação e elimina-se o sobrenadante. Dissolve-se o precipitado em 1 litro de uma solução 0,1M em cloreto de sódio e repete-se a precipitação com 3 vo lumes de etanol a 95%. Recolhe-se o precipitado e lava-se primei ro com etanol a 75% 3 vezes, depois com etanol absoluto (3 vezes] e finalmente com acetona absoluta (3 vezes). O produto assim obtido (fracções HIALASTINA + HIALECTINA) possui um peso molecular médio compreen dido entre 250 000 e 350 000. O rendimento em HY ê igual a 0,6% do tecido fresco original. EXEMPLO 39

Processo para a obtenção da fracção Hialastina a partir da mistura obtida através do método descrito no Exemplo 38.

Dissolve-se a mistura obtida pelo processo descrito no Exemplo 38 em agua destilada apirogênica nu ma proporção de 10 mg do produto por 1 ml de ãgua. Expóe-se a so lução obtida a filtração molecular através de membranas filtrantes com um limite de exclusão molecular de 200 000, utilizando uma técnica de concentração sem adição de ãgua na parte superior da membrana. Durante o processo de ultra-filtração através das membranas com um limite de exclusão molecular de 200 000, as moléculas com um peso molecular de 200 000 não podem passar, ao passo que as moléculas menores passam através da membrana em con " junto com a ãgua. Durante o procedimento de filtração não se adi • ciona nenhuma ãgua sobre a parte superior da membrana pelo que o r o f

volume diminui e consequentemente a concentração de moléculas com um peso molecular superior a 200 000 aumenta; Mantem-se a ul tra-filtração até que o volume na parte superior da membrana fi~ que reduzido a 10% do volume inicial. Adiciona-se 2 volumes de água destilada apirogenica e faz-se de novo a ultra-filtração ate que o volume fique reduzido a um terço do original. Repete--se a operação mais 2 vezes. Ajusta-se para 0,1M com cloreto de sódio a solução que passou através da membrana e depois precipita-se com 4 volumes de etanol a 95%. Lava-se o precipitado 3 vezes com etanol a 75% e depois seca-se no vácuo. O produto assim obtido (fracção Hi-alastina) possui um peso molecular médio compreendido entre 50 000 e 100 000. 0 rendimento de HY é igual a 0,4% do tecido fresco original de partida. EXEMPLO 40

Processo para a obtenção da fracção

Hialectina. ►

Dilui-se a solução concentrada reco lhida no recipiente da parte superior da membrana de ultra-filtração com um limite de exclusão molecular de 200 000, conforme Exemplo 39, com água até se obter uma solução contendo 5 mg/ml de ácido hialurónico, conforme determinado por análise quantitativa baseada na dosagem de ácido glucurónico.

Ajusta-se a solução para 0,1M em cloreto de sódio e depois precipita-se com 4 volumes de etanol a 95%. Lava-se o precipitado 3 vezes com etanol a 75% e depois seca- se no vácuo. O produto assim obtido (fracção HIA LECTINA) possui um peso molecular compreendido entre 500 000 e 730 000. Isto corresponde a uma fracção de ácido hialurónico específica com uma cadeia molecular medindo entre 2 500 e 3 500 unidades sacarido e com um elevado grau de pureza. 0 rendimento de HY é igual a 0,2% do tecido fresco original de partida. r "> «

“ EXEMPLO 41

Preparação de películas de derivados reticulados de ácido hialurônico (HY) e parcialmente esteri-fiçados com diversos alcoóis.

Após a adição de todos os ingredien tes e apõs a homogeneização obtida de acordo com os Exemplo 6-15, 19-30 e 37 fazem-se camadas de soluções em DMSO em pratos de vidro com a espessura desejada, numa atmosfera de azoto, em condições de secura absoluta e longe da luz durante 24 horas.

Primeiro faz-se a diãlise em NaCl a 1% das películas dos derivados hialurõnicos reticulados e esteri ficados assim obtidos e nos quais também estão presentes os grupos carboxi do radical tetra-butil-amônio, e depois em I^O desti lada a 49 C, mudando-se as soluções periodicamente. Depois colocam-se as películas que contêm os sais de sódio dos derivados re ticulados anteriores entre duas membranas de celofane e secam-se no vácuo a 379 C num secador de placas.

Produtos Médicos e Preparações Farmacêuticas

As preparações farmacêuticas que contêm como princípio activo os novos derivados reticulados da presente invenção e os seus sais, tanto no caso dos derivados re ticulados possivelmente ainda esterificados e/ou salificados com alcoóis terapeuticamente activos e pretendidos para as mesmas prescrições do próprio HY, como no caso dos ésteres com alcoóis terapeuticamente activos pretendidos para utilização nas prescri ções correspondentes a tais alcoóis, contêm excipientes comuns e podem destinar-se a utilização oral, rectal, parenteral, subcu tânea, local, intradermal ou tópica. Apresentam-se por isso na forma sólida ou semi-sôlida, por exemplo, pílulas, pastilhas, cápsulas gelatinosas, cápsulas, supositórios, cápsulas de gelati na macia. Para utilização parenteral e subcutânea ê possível uti lizar as formas necessárias para administração intramuscular ou intradermal, ou adequadas para infusão ou injecções intravenosas Por conseguinte ê possível apresentar os compostos activos como • soluções ou como pós secos por congelamento que são combinados . com um ou vários excipientes ou diluentes que sejam farmacêutica

V

mente aceitáveis e convenientes para as utilizações anteriores, e cora um tipo de osmolaridade adequada para os líquidos fisiológicos. Para utilização local devem considerar-se as preparações em forma de aspersões, por exemplo aspersões nasais, cremes ou unguentos para utilização tópica de emplastros adequadamente pre parados para administração intradermal.

As preparações da invenção podem destinar-se â administração nas pessoas ou nos animais. Contêm de preferência entre 0,01% e 10% de componente activo para as so luções, aspersões, unguentos e cremes e entre 1% e 100% e preferencialmente entre 5% e 50% de composto activo para preparações na forma sólida. A dosagem que se deve administrar depende da prescrição, do efeito desejado e da via de administração escolhi da. A dosagem diária de tais preparações pode deduzir-se da utilização de preparações conhecidas correspondentes com ácido hia-lurõnico nos fãrmacos correspondentes, por exemplo, para a cura de artrite, por exemplo no homem ou no cavalo, e com o álcool te rapeuticamente activo cuja acção se pretenda utilizar. Deste modo, por exemplo, a dosagem de um ester hialurónico com cortisona pode deduzir-se do seu teor nesse ester e da sua dosagem usual nas preparações farmacêuticas conhecidas.

Em produtos de cosmética mistura-se os novos derivados reticulados da presente invenção e os seus sais com os excipientes normalmente utilizados nesta especialida de e que são, por exemplo, as já referidas anteriormente para as preparações farmacêuticas. Utilizam-se sobretudo cremes, unguentos, loções para uso tópico em que os novos derivados reticulados da presente invenção possam constituir o princípio cosmético activo, possivelmente com a adição de outros princípios activos em cosmética, tais como os esteroides, por exemplo a pregnenolo-na, ou um dos princípios activos atrás referidos. Nestas prepara ções, os novos derivados reticulados da presente invenção são preferencialmente ésteres com um álcool sem qualquer acção cosme tica, tal como um álcool alifático inferior, por exemplo um dos já referidos. Nestas preparações o efeito ê devido ãs proprieda-• des cosméticas intrínsecas do componente poli-sacarido, como su-. cede no caso do ácido hialurónico livre ou dos seus sais.

I

Contudo, os produtos de cosmética podem basear-se em substâncias com acções especificas diferentes das do ácido hialurõnico, por exemplo, desinfectantes, protec-ções solares, substâncias ã prova de âgua ou de regeneração, ou substância anti-rugas ou odoríferas, especialmente perfumes. Nes te caso, os novos derivados reticulados da presente invenção podem ser eles próprios o ingrediente activo e derivarem de álcoois com estas propriedades, por exemplo, de alcoóis alifáticos superiores ou alcoóis de terpeno no caso dos perfumes, ou podem funcionar principalmente como veículos para substâncias com essas propriedades com as quais são associados. Todavia, são parti cularmente importantes as composições de cosmética semelhantes aos medicamentos anteriormente descritos em que o componente far maceuticamente activo é substituído por um factor de cosmêtolo-gia e respectivos sais. A utilização dos ésteres anteriores que derivam de alcoóis utilizados na indústria dos perfumes representa um passo importante no avanço da técnica, uma vez que proporciona uma libertação lenta, constante e prolongada dos princípios odoríferos.

Uma aplicação importante da presente invenção diz respeito aos produtos sanitários e cirúrgicos já anteriormente descritos, e aos processos para a sua preparação e utilização. Por conseguinte a invenção engloba todos os produtos semelhantes aos que já existem no mercado e que contêm ácido hia lurônico mas que contêm também os novos derivados reticulados da presente invenção em vez de ácido livre ou um dos seus sais, por exemplo enxertos ou lentes oftálmicas.

Produtos sanitários e cirúrgicos completamente novos de acordo com a presente invenção estão representados pelos novos derivados reticulados da presente invenção regenerados por soluções orgânicas apropriadas susceptíveis de serem preparados na forma de folhas ou de fios, obtendo-se pe llculas, folhas e fios para utilização em cirúrgia, como auxilia res e substituintes da pele em casos de danificação grave deste . orgão, por exemplo após queimaduras, ou como fios de sutura em • cirúrgia. Em particular a invenção engloba estas utilizações e

um processo de preparação destes artigos consiste em (a) formação de uma solução de um ester hialurõnico ou de um dos seus sais num solvente orgânico adequado, por exemplo uma cetona, um ester ou um solvente aprõtico tal como uma amida de um ácido carboxíli co, especialmente uma di-alquil-amida de um ácido alifático que possua entre 1 e 5 átomos de carbono e que derive de grupos alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, e antes de tudo de um sulfoxido orgânico, isto e, um di-alquil-sulfoxido com grupos alquilo com um máximo de 6 átomos de carbono, especialmente o dimetil--sulfòxido ou dietil-sulfõxido e novamente antes de tudo por um solvente fluorado com um baixo ponto de ebulição tal como hexa--fluoro-isopropanol especialmente, (b) preparação desta solução na forma de folhas ou de fios e (c) remoção do solvente orgânico por contacto com outro solvente orgânico ou aquoso que se possa misturar com o primeiro solvente e no qual o ester hialurõnico não seja solúvel, especialmente em álcool alifãtico inferior, por exemplo o álcool etílico (texturização húmida), ou no caso de se ter utilizado um solvente de ponto de ebulição não muito elevado para a preparação da solução do derivado hialurõnico, faz-se a remoção desse solvente com uma corrente de gás sendo especialmen te adequado o azoto aquecido (texturização a seco). Também ê po£ sível utilizar com grandes vantagens o sistema de texturização seco/húmido.

Os fios obtidos com os novos deriva dos reticulados da presente invenção podem utilizar-se para a preparação de tecidos para utilização na medicação de ferimentos e em cirurgia. A utilização de tais tecidos possui a vantagem ex cepcional da sua biodegradação no organismo, por efeito do enzimas que ele contem. Estes enzimas cindem o ester em ácido hialurõnico e no álcool correspondente e num composto já presente no organismo, ou ainda, num composto inõcuo tal como um álcool. Taií tecidos e também os fios anteriores podem deixar-se no interior do organismo apõs a intervenção cirúrgica visto que são depois absorvidos lentamente devido ao anterior processo de degradação.

Na preparação dos produtos sanitâ-. rios e cirúrgicos atrás referidos é conveniente adicionar materi * ais plasticizantes para melhorar as suas características mecâni- / -t

cas, como sucede no caso dos fios, para melhorar a sua resistência ao embaraço. Estes plasticizantes podem ser por exemplo sais alcalinos de ácidos gordos, por exemplo estearato de sõdio ou palmitato de sõdio, ésteres de ácidos orgânicos com muitos átomos de carbono, etc.

Outra aplicação dos novos derivados reticulados da presente invenção em que as suas qualidades de biodegradação são utilizadas pelas esterases presentes no organismo, ê representada pela preparação de cápsulas para implantação subcutânea de medicamentos ou de microcãpsulas para injecção por exemplo por via subcutânea e intramuscular. Para a aplicação subcutânea de medicamentos com libertação lenta e consequentemenj te com uma acção de "retardamento", tem-se utilizado até aos dias de hoje cápsulas feitas com material de silício, com a desvantagem de estas cápsulas terem tendência para migrar no interior do organismo e não ser possível recuperá-las. Evidentemente com os novos derivados reticulados da presente invenção este perigo dei xa de existir. Também ê da maior importância a preparação de microcãpsulas que contêm os novos derivados reticulados da presente invenção, evitando-se os problemas normalmente associados com a sua utilização, até agora bastante limitada pelas razões ante-riormente referidas. Esta preparação abre uma nova área de aplicações em que se obtem um efeito de "retardamento" por injecção.

Uma outra aplicação dos novos derivados reticulados da presente invenção no campo da medicina e da cirurgia é representada pela preparação de diversos enxertos sólidos tais como lâminas, discos, folhas, etc., em substituição das metálicas que contêm material plástico sintético de utilização corrente, nos casos que impliquem enxertos que se pretenda remover após um certo período de tempo. As preparações que contêm colagénio animal, sendo de natureza proteica, provocam frequentemente reacções desagradáveis tais como inflamação ou rejeição. No caso dos novos derivados reticulados da presente invenção, mesmo que derivem de ácido hialurõnico animal e não humano, este perigo deixa de existir, visto que não há incompatibilidade . entre os poli-sacaridos das diversas espécies animais. ] Outra utilização reside na correc- r\ r—-----

ção de defeitos e no acréscimo de tecidos macios. Desde há muito tempo que existe a necessidade de biomateriais eficazes e seguros com os quais se substituam os tecidos macios que tenham sido removidos ou danificados, têm-se utilizado muitos materiais alo-plâsticos incluindo a parafina, pasta de "teflon", silicio e co-lagénio bovino para substituir a perda de tecido macio. Contudo, estes materiais estavam associados a alterações permanentes e in desejãveis dos tecidos da pele, com migração in situ e com reac-çoes negativas. Por isso continua a existir a necessidade de bio materiais versáteis para utilização em medicina. Os novos deriva dos reticulados da presente invenção podem utilizar-se eficazmen te e com segurança para corrigir tais defeitos dos tecidos macicxs tais como as borbulhas do acne, irregularidades atróficas põs-ci rurgicas, quimiocirurgia de Mohs, ferimentos dos lábios lacerados e rugas causadas pela idade.

Também se englobam nas aplicações no campo da medicina e da cicurgia dos novos derivados reticulados da presente invenção as preparações feitas de material expan slvel, especialmente na forma de esponjas, para a medicação de ferimentos ou de lesões de natureza diversa.

Exemplos típicos de formulações pre paradas de acordo com a invenção são os seguintes:

Formulação 1 - Colírio que contem cortisona em que 100 ml contêm: - ester misturado e parcial de ácido hialu- rõnico com cortisona e octandiol (Ex 37A) 0,300 g - p. hidroxibenzoato de etilo 0,010 g - p. hidroxibenzoato de metilo 0,050 g - cloreto de sódio 0,900 g - água para preparação injectãvel/q.b.a. 100 ml de ácido hialu-100 g contêm: 0,2 g 10,000 g 5.000 g 2.000 g

Formulação 2 - Creme que contem um ester parcial rónico com 1,3-propandiol, em que - ester parcial de ácido hialurõnico com 1,3-propandiol (Ex 31) - mono-estearato de poli-etilen-glicol 400

- Cetiol V

- Lanette SX 4WNI «Sapas® iíiisi Λί ÍÍ . 4WNI «Sapas® iíiisi Λί ÍÍ . para-oxi-benzoato de metilo 0,075 g para-oxi-benzoato de propilo 0,050 g di-hidro-acetato de sõdio 0,100 g glicerina F.u. 1,500 g Sorbitol 70 1,500 g Creme de ensaio 0,050 g água para preparação injectãvel/q.b.a. 100,00 g

Claims

)

REIVINDICAÇÕES - lã - Processo para a preparação de ésteres de ácido hialurônico total ou parcialmente reticulados carac terizado por: se fazer reagir o ácido hialurõnico com um álcool poli-hi-drico na presença de um catalizador ou com um agente de eterifi-cação na presença de uma base inorgânica ou orgânica. - 2ã - Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o referido catalizador ser um ácido inoi gânico forte ou um permutador iônico do tipo ácido. ► Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por a referida base ser (a) um hidrato de um metal alcalino, de metal alcalino-terroso ou magnésio, (b) um óxido de prata, (c) um sal básico de um metal alcalino, de metal alcalino-terroso, magnésio ou prata, uma base azotada terciária ou (d) um permutador iónico do tipo alcalino. - 4§ - Processo de acordo com a reivindica *1 Ί I*

Processo de acordo com a reivindica ção 5, caracterizado por o referido sal do acido hialurõnico ser um sal de potássio ou de sódio e por a referida reacção se efec-tuar na presença de uma quantidade catalítica de um sal de amónio quaternário. a - 7 Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por o referido sal de amónio quaternário ser o iodeto de tetra-butil-amónio. - 8- - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5-7 caracterizado por o referido solvente apróti-

co ser um dialquil-sulfóxido, uma dialquil-carboxil-amida, uma dialquil-amida de alquilo inferior de ácidos alifãticos inferiores. - 9§ _ Processo de acordo com a reivindica ção 8, caracterizado por o referido solvente ser dimetilsulfoxido, dimetil- ou dietilformamida ou dimetil- ou dietilacetamida. - 10- - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5-9 caracterizado por a referida reacçio se efec-tuar a uma temperatura compreendida entre 0-1009 C. - 11- - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-10 caracterizado por o referido álcool poli-hi-drico ser um álcool poli-hidrico alifãtico e por o referido agen te de eterificação ser um halogeneto de alquilo de um álcool poli-hidrico alifãtico. - 12- - Processo de acordo com a reivindica ção 11, caracterizado por o referido álcool polivalente alifâti-• co ser um álcool bivalente. *7 O ΐ *

- 13- - Processo de acordo com a reivindica ção 11, caracterizado por o referido ãlcool polivalente alifático possuir entre 2 a 16 átomos de carbono. - 14- - Processo de acordo com a reivindica ção 12, caracterizado por o referido ãlcool bivalente ser um mem bro escolhido no grupo constituído por etileno-glicol, propileno -glicol, butileno-glicol, glicois derivados de pentano, hexano, heptano e octano, e respectivos isõmeros posicionais. - 15- - Processo de acordo com a reivindica ção 11, caracterizado por o referido ãlcool polivalente alifãti-co ser um membro escolhido no grupo constituído por glicerina, eritrite e penta-eritrite. - 16^ - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-15 caracterizado por o referido ácido hialurõni co ou o referido éster de ácido hialurõnico total ou parcialmente reticulados ser esterifiçado com um ãlcool alifático, aralifâ tico ou ciclo-alifãtico. _ Η Λ _

- 17- - Processo de acordo com a reivindica ção 16, caracterizado por o referido álcool alifático ser um álcool alifático que possui o máximo de 34 átomos de carbono e por o referido álcool alifático poder ser insubstituído ou substituí do por um ou dois grupos funcionais escolhidos entre o grupo cons tituldo pelos grupos amino, hidróxi, mercapto, aldeído, ceto, car boxi, hidrocarbilo e di-hidro-carbil-amino, pelos grupos éter, éster, tio-éter, tio-éster, acetal, cetal, carbalcoxi, carbamidi cos e carbamidicos substituídos por um ou dois grupos alquilo, possuindo os radicais hidrocarbilo nestes grupos modificados fun cionalmente um máximo de 6 átomos de carbono e em que tais álcoois alifãticos podem ser interrompidos na cadeia dos átomos de carbono por heteroãtomos escolhidos entre o grupo constituído por oxigénio, enxofre e azoto. Processo de acordo com a reivindica ção 17, caracterizado por o referido álcool alifático ser álcool etílico, propílico, isopropílico, n-butílico, isobutílico, terc--butílico, amílico, pentílico, hexílico ou octílico. - 19- - Processo de acordo com a reivindica ção 16, caracterizado por o referido álcool aralifático ser um álcool aralifãtico que possui apenas um radical de benzeno e em que a cadeia alifãtica possui um máximo de 4 átomos de carbono e em que o radical benzeno pode ser substituído por um a tris gru-• pos metilo ou hidroxi, por átomos de halogeno, e em que a cadeia

alifãtica pode ser substituída por um ou dois grupos funcionais escolhidos entre o grupo constituído por grupos amino livres ou grupos mono- ou di-etil-amino ou por grupos de pirrolidina ou de piperidina. - 20- - Processo de acordo com a reivindica ção 16, caracterizado por o referido álcool ciclo-alifático ser um álcool ciclo-alifático ou um álcool alifático-ciclo-alif-ãti-co ou um álcool heterociclico derivado de um carbo-hidrato mono ou poli-ciclico com um máximo de 34 átomos de carbono e que ê in substituído ou substituído por um ou vários grupos funcionais es colhidos entre o grupo constituído pelos grupos amino, hidroxi, mercapto, aldeído, ceto, carboxi, hidrocarbil- e di-hidrocarbil--amino, grupos éter, éster, tio-éter, tioêster, acetal, cetal, carbalcoxi, carbamidicos e carbamidicos substituídos por um ou dois grupos alquilo, possuindo os radicais hidrocarbilo nestes grupos modificados funcionalmente um máximo de 6 átomos de carbo no, e que pode ser interrompido na cadeia dos átomos de carbono por heteroátomos escolhidos no grupo constituído por oxigénio, azoto, e enxofre, e pode possuir uma ou várias ligações aromáticas. - 21- - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 16-20 caracterizado por o referido álcool esteri-ficado com os referidos grupos não reticulados ser um álcool far macologicamente activo. 22- - _ 7£ _

- 22- - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-21 caracterizado por o referido éster parcialmente reticulado possuindo pelo, menos um grupo carboxi livre ser salifiçado com um metal alcalino ou com um metal alcalino--terroso, magnésio ou amónio. - 23- - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-22, caracterizado por o referido ácido hialurô-nico ser uma fracção de ácido hialurônico possuindo um peso mole cular médio compreendido entre 50 000 e 730 000 e por ser substancialmente livre de ácido hialurônico que possua um peso molecular médio inferior a 30 000. - 24- - Processo de acordo com a reivindica çio 23, caracterizado por a referida fracção de ácido hialurônico possuir um peso molecular médio entre 50 000 e 100 000, entre 250 000 e 350 000 ou entre 500 000 e 730 000. A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na Itália em 13 de Outubro de 1986, sob ο n9 48546-A/86. Wf «~J H 'é Lisboa, 13 de Outubro de 1987

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