DE2128377A1

DE2128377A1 - Hydrolysierbare Teilester von Heparin

Info

Publication number: DE2128377A1
Application number: DE19712128377
Authority: DE
Inventors: Jean; Fournier Pierre Dr.; Paris Mardiguian
Original assignee: Societe dEtude et dExploitation de Marques Mar-Pha, Paris
Priority date: 1970-04-14
Filing date: 1971-06-08
Publication date: 1971-12-16
Also published as: DE2117980A1; US3759439A; CA959460A; GB1355036A

Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT, DIPLOMCHEMIKER

5 KDLN-LINDENTHAL PETER-KINTGEN-STHASSE 2 Λ

Köln, den 6.6.71

Eg/Ax

SOCIETB D'ETUDE ET D'EXPLOITATION DE MARQUES MAR-PHA 7, Rue Biscornet, Paris 12e, Frankreich

Hydrolysierbare Teilester von Heparin

Heparin ist ein Polysaccharid, das aus Einheiten von a-D-Gluo urons ä ure und 2-Amino-2-desoxy-a-D-glucose "besteht, die durch 1,4-Bindungen verbunden sind, und Schwefelsäureestergruppen enthält« Diese aus verschiedenen Geweben von Säugetieren extrahierte natürliche Substanz ist ein Medikament, das seit etwa 30 Jahren wegen seiner Wirkung^ auf ^ine„.grp.ße.Jlahl,..y.P.n..e.nz.ymatischen Mechanismen des Organismus, hauptsächlich diejenigen der Blutgerinnung und des Lipidstoffwechsels, verwendet wird₀ Es hat jedoch den Nachteil einer sehr schnellen Ausscheidung aus dem Organismus und erfordert daher zur Sicherstellung einer konstanten konzentration im Blut eine Verabreichung durch stetige intravenöse Perfusion öder auf intramuskulärem oder subkutanen Wege, und in diesem Pail ruft seine große gerinnungshemmende Wirkung häufig die Bildung starker Hämatome hervor.

Gegenstand der Erfindung sind Teilester von Heparin und ungiftigen, physiologisch unbedenklichen organischen Säuren, die entweder inaktiv sind oder selbst eine eigene therapeutische Wirkung unabhängig von der gerinnungshemmenden Wirkung haben können«, Diese neuen Produkte haben eine sehr geringe gerinnungshemmende Wirkung im Vergleich zu derjenigen des Heparins, jedoch kann diese

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in zunehmendem Maße und völlig durch eine klinische oder enzymatische Hydrolyse wieder hergestellt werden· Ferner ist es durch Wahl gewisser langkettiger Fettsäuren zur Veresterung des Heparins möglich, die Bedingungen der Absorption des Heparins durch den menschlichen Organismus zu modifizieren.

Die Erfindung ist insbesondere auf Monoester von Heparin und organischen ungiftigen, physiologisch unbedenklichen Säuren gerichtet, die vorzugsweise aus den folgenden Gruppen gewählt werden:

a) Säuren, die selbst eine Wirkung auf den Stoffwechsel der Lipide haben, ζ .B₀ 4-Chlorphenoxyisobuttersäure, 4-Chlorphenoxyessigsäure, Cholinsäure, Nicotinsäure, N-Oxynicotinsäure, Pyridylessigsäure und N-Oxypyridylessigsäure.

b) Fettsäuren mit wenigstens 16 C-Atomen, die in Lipiden lösliche, oral verabreichbare Heparlüester zu bilden vermögen, z.B„ Linolsäure und a-Suifopalmitinsäure_o

c) Aminosäuren, die- labile, leicht hydrolysierbare Heparinester zu bilden vermögeη₀

Das Heparin kann in diesen Monoestern in Form von Alkali-, Magnesium-, Calcium^, Aminosalzen oder quaternären ™ Ammoniumsalzen vorliegen.

Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung der oben genannten Teilester von Heparin durch direkte Veresterung eines quaternären Ammoniumsalzes von Heparin bei einer Temperatur von 0⁰C oder darunter in Gegenwart eines dehydratisierenden Mittels aus der Gruppe der Carbodiimide, insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid oder Di-p-nitrophenylcarbodiimid, in einem organischen wasserfreien Lösungsmittel, das keine Hydroxylgruppen enthält, insbesondere Methylenchlorid, Chloroform, Aceton, Äther, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und Dioxan sowie in

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Gegenwart eines großen Überschusses einer der oben genannten organischen Säuren«

Die Veresterung verläuft glatt und kann an einer oder mehreren Hydroxylgruppen der Cetrasaccharidkomponente des Heparins erfolgen:

COO

H OSO

.worin.η einen Wert von 10 bis 15 hat, ohne eine Depolymerisation oder Des ulf at at ion am Stickstoff iia Eeparinmolekül hervorzurufen«

Die gerinnungshemniende' Wirkung der erhaltenen Ester hängt ferner vom Veresterungsgrad ab. Durch Einstellung des Veresterungsgrades ist es somit möglich, einen Eeparinester herzustellen, dessen gerinnungshemmende .Wirkung in vitro mehr 'oder veniger aufgehoben ist. Ss ist interessant, daß diese gerinnungshemmende Wirkung im menschlichen Organismus durch Hydrolyse allmählich wieder hergestellt wird, vie die in den folgenden Beispielen beschriebenen gezielten Verseifungsversuohe zeigen· Auf Grund dieser Tatsache können die Heparinester gemäß der Erfindung u_oa_o als Antikoagulantien mit Retardeffekt,' Mittel gegen Hyperlipämie oder Plypercholesterinämie verwendet werden·. Sie haben etwa die gleiche !oxizität und die gleiche gerinnungshemmende Wirkung wie Heparin, jedoch darüber hinaus einen Retardeffekt·

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BAD ORIGINAL

Beispiel 1 Ester von Heparin und 4-OhlorphenoxyiBobuttersäure

Zu einer mit einem Eisbad gekühlten Lösung von 5,16 g des Heparinsalzes von Hyamin 1622 (Benzäthoniumchlorid, Hersteller Rohm and Haas) in 50 ml wasserfreiem Methylenchlorid wird eine Lösung von 12,5 g Dicyclohexylcarbodiimid als dehydratisierendes Mittel in 50 ml wasserfreiem Methylenchlorid gegebene Zu der erhaltenen, in einem Eisbad gekühlten Lösung, durch die Stickstoff geleitet wird, wird langsam eine Lösung von 13g p-Chlorphenoxyisobuttersäure in 80 ml wasserfreiem Methylenchlorid gegebene Die Zugabe dauert etwa 45 Minuten, wobei das Reaktionsgemisch bei O⁰O gehalten wird. Das Gemisch wird 48 Stunden im Kühlschrank gehalten«

Nach Filtration zur Entfernung des ausgefällten Harnstoffs wird unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingedampfte Der erhaltene Rückstand wird in Äther aufgenommen. Man filtriert, wäscht den unlöslicKen"Besfändteil mit Äther und trocknet dann unter vermindertem Druck, wobei man den 4-Chlorphenoxyisobuttersäureester des Heparinsalzes von Hyamin erhält.

Zur Herstellung des wasserlöslichen Salzes werden 10 g des erhaltenen Produkts in 84 ml 95$igem Alkohol gelöst« Zur Lösung- werden 20 ml einer 16,75?6igen Natriumacetatlösung gegeben. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit 95#igem Alkohol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Hierbei werden 1,03 g des 4-Chlorphenoxyisobuttersäureesters von Natriumheparinat erhalten»

Elementaranalyse : 1,73$ Stickstoff

12?δ Schwefel 3,1# Chlor

Für die vollständige Veresterung einer einzigen Hydroxylgruppe der letrasacchari^komponente des Heparins werden die folgenden entsprechenden Werte berechnet:

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Sticks-toff, 11,18$ Schwefel, 2,5# Chlor«,

Die Verbindung zeigt das charakteristische TJltraviolettspektrum mit 3 Maxima bei 270, 273 und 277' mu (siehe O

^{! 10}»^{16 bei 277} 7¹ (ⁱⁿ

Das Infrarotspektrum zeigt die für die Estergruppe charakteristische Bande bei 5»8 ax (siehe Fig_e2).

Gerinnungshemmende Wirkung: 16,5 IU/mg (gegenüber 130 IU/ mg für Heparin in Form des Natriumsalzes„

Verseifung

In einem Eisbad werden bei O⁰O unter Rühren und unter Stickstoff allmählich 0,484 g des in der oben beschriebenen Weise hergestellten Esters in 20 ml 1n-Natriumhydroxyd gelbst. Nach einer Reaktionszeit von 2 Stunden wird das Heparinsalz von Hyamin durch Zugabe von 10 ml einer 10bigen wässrigen Hyaminlösung ausgefällte Die Fällung wird durch Dekantieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in 27»5 ml 95$igem Alkohol gelöst. Zur Ausfällung des Natriumsalzes von Heparin werden langsam 6,7 ml 15$iges Natriumacetat zugesetzt. Das Natriumsalz wird unter Phosphorsäure-Vakuum getrocknete Hierbei werden 0,285 g eines Produkts erhalten, das 75 IU/mg (gegenüber 16,5 IU/mg für den Ausgangsester) aufweist«

Die charakteristische gerinnungshemmende Wirkung des Heparins wird somit durch Hydrolyse des Esters wiederhergestellte

Beispiel 2 Ester von Heparin mit' Linolsäure

Zu einer mit einem Eis- und Salzbad gekühlten Lösung von 2,13 g des Heparinsalzes von Hyamin 1622 in 30 ml wasserfreiem Methylenchlorid wird eine Lösung von 5,15 g

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Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid gegeben. Zur erhaltenen lösung, die auf -10⁰C gekühlt und von Stickstoff durchströmt wird, wird tropfenweise eine Lösung von 7 g Linolsäure in 15 ml wasserfreiem Methylenchlorid gegeben» Die Zugabe dauert 2 Stunden und 20 Minuteno Anschließend wird eine weitere Stunde gerührt, worauf der ständig unter Stickstoff gehaltene Kolben 48 Stunden in einem Kühlschrank gehalten wird»

Die gebildete Fällung wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingedampft» Der pastenförmige Rückstand wird in Äthyläther aufgenommen. Man filtriert, wäscht den unlöslichen Bestandteil mit

Äther und trocknet dann unter vermindertem Druck, wobei man 2,32 g des Linolsäureester3 des Heparinsalzes von Hyamin erhält.

Das wasserlösliche Natriumsalz wird wie folgt erhalten: Zu einer Lösung von 1 g des in der oben beschriebenen Weise hergestellten Esters in 25 ml 95$igem Alkohol werden 6 ml einer 16,6$igen Natriumacetatlösung gegeben. Man läßt 3 Stunden ausfällen, filtriert die Fällung ab, wäscht mit 20 ml 95$igem Alkohol und trocknet unter Phosphorsäure-Vakuum. Hierbei werden 0,330 g des Linolsäureesters von Natriumheparinat erhaltene

Ψ Analyse:

Schwefelgehalt: 10,65$

Stickstoffgehalt: 1,82$

S/N-Atomverhältnis: 2,55

UV-Spektrum: Maximum bei 260 nm

(siehe Fig»3) '

Infrarotspektrum: Esterbande bei 5,8 ja (siehe Fig.4)

Gerinnungshemmende Wirkung: 15 IU/mg (gegenüber

130 IU/mg bei

Heparin in Form des Natriumsalzes)·

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Verseifung

In einem Bad werden "bei O⁰C unter Stickstoff allmählich Ο#4·24 g des in der oben beschriebenen Weise hergestellten Esters unter Rühren in 18 ml 1n-Natriumhydroxyd gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 2 Stunden wird das Heparinsalz von Hyamin durch Zugabe von 8,75 ml einer wässrigen 10bigen Hyaminlösung ausgefällt. Die Fällung wird durch Dekantieren isoliert, mit Wasser gewaschen und dann in 50 ml 95$igem Alkohol gelöst. Durch langsame Zugabe von 4- ml 25#igem Natriumacetat wird das Natriumsalz von Heparin ausgefällt. Das Salz wird unter Phosphorsäure-Vakuum getrocknet. Hierbei werden 0,4-03 g eines Produkts · mit 115 IU/mg erhalten (gegenüber 15 IU/mg für den Ausgangsester),

Die charakteristische gerinnungshemmende Wirkung des Heparins wird somit durch Hydrolyse des Esters wiederhergestellt.

Die pharmakologischen Eigenschaften der Heparinester gemäß der Erfindung werden durch'Messung der Koagulierungszeit bei einem Kaninchen von 3,5 kg nach Verabreichung der Ester festgestellt.

Intravenöse Verabreichung

Ester von Heparin und 4-Chlorphenoxyisobuttersäure (Beispiel 1)

Dosis: 200 Iü/kg

Die maximale Wirkung wird nach einer Stunde festgestellt und hält über 4· Stunden hinaus an (Kurve von Pig,5, die die Koagulierungszeit in Minuten (als Ordinate) in Abhängigkeit von der Zeit nach der Injektion in Stunden (als Abszisse) darstellt).

Intramuskuläre Verabreichung

Ester von Heparin und Linolsäure (Beispiel 2) Dosis: 800 IU/kg

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Die maximale Wirkung wird nach 2 Stunden festgestellt und hält über 7 Stunden hinaus an (Kurve von Pig.6).

Subkutane Verabreichung

Produkt von Beispiel 2: 400 IU/kg
in Kombination mit Natriumheparinat: 400 ITJ/kg Die maximale Wirkung tritt nach 4 Stunden ein„ Die Wirkung ist nach 7 Stunden noch stark (Kurve von Fig„7)o

In allen Fällen haben die Heparinester eine längere Wirkungsdauer als Heparin und rufen kein Hämatom hervor» Sie können allein oder in Kombination mit Heparin verabreicht werden«

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von hydrolysierbaren Teil-

tern von Heparin mit einer ungiftigen, physiologisch unbedenklichen organischen Säure, dadurch gekennzeichnet, daß man ein quaternäres Ammoniumsalz von Heparin mit einem großen Überschuss einer organischen Säure bei einer Temperatur von O⁰C oder darunter in Gegenwart eines dehydratisierenden Mittels aus der Gruppe der Carbodiimide in einem organischen wasserfreien, keine Hydroxylgruppen enthaltenden Lösungsmittel in Berührung bringt«

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine der folgenden Säuren verwendet:

a) Säuren, die selbst eine Wirkung auf den Stoffwechsel der Lipide ausüben, nämlich 4-Chlorphenoxyisobuttersäure, 4-Chlorphenoxyessigsäure, Cholinsäure, Nicotinsäure, N-Oxynicotinsäure, Pyridylessigsäure und N-Oxypyridylessigsäure;

b) wenigstens 16 C-Atome enthaltende Fettsäuren, die in Lipiden lösliche Heparinester zu bilden vermögen und oral verabreicht werden können, z.B. Linolsäure und a-Sulfopalmitinsäure, und

c) leicht hydrolysierbare Aminosäuren, die labile Heparinester zu bilden vermögen.

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Dehydiatisierungsmittel Dicyclohexylcarbodiimid oder Di-p-nitrophenylcarbodiimid verwendet₀

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Methylenchlorid, Chloroform, Aceton, Äther, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Dioxan verwendet»

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