DE972336C - Verfahren zur Gewinnung von stabilen, besonders fuer die Oraltherapie geeigneten Penicillinen - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von stabilen, besonders fuer die Oraltherapie geeigneten PenicillinenInfo
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- DE972336C DE972336C DEB23846A DEB0023846A DE972336C DE 972336 C DE972336 C DE 972336C DE B23846 A DEB23846 A DE B23846A DE B0023846 A DEB0023846 A DE B0023846A DE 972336 C DE972336 C DE 972336C
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Description
BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
AUSGEGEBEN AM 2. JULI 1959
DEUTSCHES PATENTAMT
PATENTSCHRIFT
KLASSE 30 h GRUPPE 2 30 INTERNAT. KLASSE A 61 k; C12d
B 23846IVaj30h
Dr. Ernst Brandl, Kundl,
und Dr. Hans Margreiter,
Radfeld, Post Rattenberg, Tirol (Österreich)
sind als Erfinder genannt worden
BIOCHEMIE Gesellschaft mit beschränkter Haftung, Innsbruck (Österreich)
Verfahren zur Gewinnung von stabilen, besonders für die Oraltherapie geeigneten Penicillinen
Patentiert im Gebiet der Bundesrepublik Deutschland vom 20. Januar 1953 an
Patentanmeldung bekanntgemacht am 21. April 1955
Patenterteilung bekanntgemadit am 18. Juni 1959
Die Priorität der Anmeldung in Österreich, vom 22. April und 29. April 1952
ist in Anspruch genommen
Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Penicillinen, die sich von den normalen, klinisch
untersuchten und angewendeten Penicillinen G, X, F und K durch die Art der Seitenkette unterscheiden,
sind bereits in großer Zahl durchgeführt worden. Die Einführung der gewünschten Radikale
in das Penicillinmolekül wird, wie z. B. in der britischen Patentschrift 643 514 beschrieben ist, durch
Zusatz chemischer Verbindungen (sogenannter Precursors) bei der Fermentation bewirkt. Das
Formelbild der so erhaltenen Penicilline kann durch die Formel
C8H10O3NS-NHCO-R,
wobei R die verschiedenen eingeführten Radikale bedeutet, dargestellt werden.
Es ist bekannt, Penicillin aus seinen wässerigen Lösungen mittels Säuren in Verbindung mit organischen
Lösungsmitteln zu extrahieren. Da die bisher hergestellten Penicilline, wie Penicillin G, X,
F und K, von Säuren in kurzer Zeit inaktiviert werden, war es notwendig, dieselben möglichst
schnell und unter Verwendung besonders konstruierter Extraktionsvorrichtungen in die organische
Phase überzuführen und sie daraus in Form ihrer Salze mit Aminen oder Alkalien zu gewinnen.
Es wurde nun gefunden, daß Penicilline, die der allgemeinen Formel
worin R1 einen zweiwertigen, gegebenenfalls substituierten
aliphatischen Rest, X Sauerstoff, Schwefel oder die NH-Gruppe, η eine ganze Zahl von ι
bis 5 und R2 einen aliphatischen, araliphatischen
und/oder aromatischen, gegebenenfalls substituierten Rest bedeutet, entsprechen, sich in ihren
Eigenschaften typisch von den normalen Penicillinen G, X, F und K unterscheiden. Im Gegensatz
ao zu den normalen Penicillinen weisen, wie festgestellt wurde, die Penicilline dieser Formel eine
völlig unerwartete und hohe Stabilität unter verschiedenen Bedingungen und vor allem gegen den
Einfluß von Säuren auf. Es wurde gefunden, daß
as Penicilline der oben angeführten Struktur in homogener
Lösung bei einem pH von ι bis 2 und bei
240 C eine wesentlich größere Stabilität besitzen als beispielsweise reines Penicillin G bei einem pH
von 2,i und bei 240 C, dessen Halbwertzeit nur 18 Minuten beträgt. Im Vergleich dazu besitzt
z. B. das Phenoxymethylpenicillin eine solche von 500 Minuten. Die freie kristallisierte Säure ist bei
Zimmertemperatur praktisch unbegrenzt haltbar.
Auf Grund dieser neuen Erkenntnisse besteht nun das Verfahren gemäß der Erfindung im wesentlichen
darin, daß man aus den bei der Fermentation erhaltenen Rohlösungen oder aus bei der
nachfolgenden Aufarbeitung der Rohlösungen erhaltenen wässerigen Lösungen, welche Penicilline
der allgemeinen Formel
C8H10O3NS-NHCO-(R1X)n-R2,
worin R1 einen zweiwertigen, gegebenenfalls substituierten
aliphatischen Rest, X Sauerstoff, Schwefel oder eine N Η-Gruppe, η eine ganze Zahl zwischen 1
und 5 und R2 einen aliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Rest, der gegebenenfalls substituiert
sein kann, bedeutet, enthalten, diese Penicilline als freie Säuren abscheidet, beispielsweise
indem man diese Penicilline aus den wässerigen Lösungen (Rohlösungen oder wässerige Extraktionsstufen)
durch Fällung mit Säuren gewinnt oder aus diesen Lösungen in Gegenwart von Säuren
in organische Lösungsmittel überführt und durch Abdunsten des Lösungsmittels isoliert. Der Isolierung
der oben bezeichneten Penicilline in Form ihrer freien Säuren kann eine weitere Reinigung
zum Zwecke der Entfernung begleitender Precursorsäuren, z. B. durch Waschen mit Wasser,
Umfällung usw., folgen. Es können aber auch Lösungen vor der Isolierung der freien Säuren der
Penicilline durch Entfernung von Verunreinigungen, insbesondere restliche Mengen von Precursorsäuren,
gereinigt werden. Gemäß dem Verfahren der Erfindung gelingt es erstmalig, Penicilline als
freie Säuren in definierter, kristallisierter Form zu gewinnen. Die isolierten Säuren weisen demgemäß
scharfe Schmelzpunkte auf; sie sind in Wasser nur wenig löslich, lösen sich aber unter
Bildung der Salze leicht in Pufferlösungen von z. B, pH 7,2.
Das Verfahren gemäß der Erfindung hat sich insbesondere zur Gewinnung von Phenoxymethylpenicillin
C8H10O3NS-NHCO-CH2OC8H5,
das unter Verwendung von /?-Phenoxyäthanol oder
Phenoxyessigsäure als Precursor bei der Fermentation gebildet wird, bewährt, wobei die nach dem
Verfahren gemäß der Erfindung isolierte freie Säure einen Schmelzpunkt von 120 bis 1280 C hat.
Ebenso kann man das mit Hilfe von p-Oxy-/?-Phenoxyäthanol
oder p-Oxyphenoxyessigsäure als Precursor erhältliche p-Oxy-Phenoxymethylpenicillin
in dieser Weise als kristallisierte Säure gewinnen.
Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung werden beispielsweise die unter Verwendung
von Precursors bei der Fermentation erhaltenen Penicilline der oben bezeichneten Struktur
aus den wässerigen Rohlösungen oder aus einer wässerigen Extraktionsstufe durch Ansäuerung mit
Mineralsäuren auf ein pg unter 2, z. B. zwischen Pj1 1,5 und i,8, in unlöslicher kristallisierter Form
abgeschieden und allenfalls durch Waschen mit Wasser gereinigt, wobei gleichzeitig begleitende
Precursorsäuren und deren Salze abgetrennt werden. Eine solche Säurefällung würde, auf Penicillin
G angewendet, zu einer völligen Zerstörung und Bildung von biologisch inaktiven Zersetzungsprodukten führen.
Bei Isolierung der freien Säuren der genannten Penicilline durch Extraktion mit organischen
Lösungsmitteln in Gegenwart von Säuren — eine Arbeitsweise, die auf Lösungen von Penicillin G
gleichfalls nicht anwendbar ist — werden als Extraktionsmittel zweckmäßig solche organische Lösungsmittel
gewählt, die die Precursorsäuren schwer, das Penicillin dagegen sehr leicht aufnehmen,
so daß man das Penicillin nach Verdunsten des organischen Lösungsmittels und allfälligem
Waschen mit Wasser in der Säureform in reinem Zustand erhält. Beispielsweise kann man, wenn als
Precursor /S-Phenoxyäthanol, das während der aeroben Fermentation zu Phenoxyessigsäure oxydiert
wird, oder Phenoxyessigsäure selbst verwendet wurde, mit Chloroform als Extraktionsmittel arbeiten, für welches Lösungsmittel größere
Unterschiede in den Verteilungsverhältnissen von Phenoxyessigsäure und dem gebildeten Phenoxymethylpenicillin
gegen die wässerige Phase bestehen. So besitzt z. B. die Phenoxyessigsäure bei pH2,i und 240 C einen Verteilungskoeffizienten von
0,48, sofern die Chloroform- und wässerige Phase im Verhältnis 1 :1 angewendet werden. (Beim Ver-
hältnis 6 Wasser: ι Chloroform erhöht sich dieser
Koeffizient auf 2,3.) Das Phenoxymethylpenicillin dagegen hat entsprechend seiner Unlöslichkeit in
Wasser bei pH 2,1 und seiner großen Chloroforralöslichkeit
einen so kleinen Koeffizienten, daß bei der Extraktion der wässerigen Phasen mit Chloroform
das Phenoxymethylpenicillin in das Chloroform übergeht, während die Phenoxyessigsäure
größtenteils in der wässerigen Phase verbleibt.
Führt man aber die Penicilline der genannten Art in Gegenwart von Säuren in organische Lösungsmittel
über, welche die freien Begleitsäuren aufnehmen, was beispielsweise bei der Anwendung von
Butanol zur Extraktion aus der wässerigen Phase der Fall ist, so werden zuerst durch azeotrope
Destillation das Butanol-Wasser-Gemisch und dann die immer wasserärmer werdenden Butanolgemische
(z. B. im Vakuum) abgetrieben, wobei die aktiven Penicilline als freie Säuren, jedoch mit den Precursorsäuren
verunreinigt, übrigbleiben, da Precursorsäuren, wie z. B. Phenoxyessigsäure (pK = 3,25), ähnliche pH-Werte aufweisen wie die
Penicilline selbst (pK = 3,12 bei Phenoxymethylpenicillin). Die durch Ausfällung oder Verdunsten
des Lösungsmittels erhaltenen Penicillinsäuren werden daher gewünschtenfalls durch wiederholtes
Extrahieren oder Waschen mit Wasser od. dgl. von den begleitenden Precursorsäuren, die vom Wasser
aufgenommen werden, während die Säuren der Penicilline praktisch ungelöst verbleiben, gereinigt.
Man kann ferner die Penicilline der bezeichneten Art in an sich bekannter Weise als Alkalipenicilline
aus den Rohlösungen gewinnen und die abgeschiedenen Alkalipenicilline, die durch die Alkalisalze
der Precursorsäuren verunreinigt sind, in der Weise reinigen und in Form der freien Säuren gewinnen,
daß man die Alkalisalze in Wasser löst und die Penicillinsäuren mit Säuren, wie Salzsäure,
ausfällt, wobei die Precursorsäuren bei Anwendung entsprechender Wassermengen in Lösung bleiben.
Man kann ferner Salze der Penicilline aus der
Rohlösung über mehrere Extraktionsstufen in Chloroform überführen, durch Waschung mit
Wasser begleitende Precursorsäuren entfernen und dann über eine wässerige Pufferlösung (pH 7,2) in
Gegenwart von Säuren bei etwa pH 1,8 z. B. in
Butylacetat oder Amylacetat überführen und die freien Säuren durch Verdunstung des Lösungsmittels
gewinnen.
Weiter können die Rohlösungen und wässerigen Extraktionsstufen durch Zusatz von Erdalkalisalzen,
z. B. Bariumsalzen, gereinigt werden, da die Bariumsalze der hier in Betracht kommenden Penicilline
wasserlöslich, die der Precursorsäure dagegen in Wasser schwer- bis unlöslich sind (beispielsweise
löst sich Bariumphenoxyacetat zu 1,4 g/ 100 cm3 Wasser bei 200C). Anschließend können
die Penicilline in organische Lösungsmittel, wie z. B. Butylacetat, übergeführt und aus dieser
Lösung als Alkalisalze, z. B. mittels wasserfreier alkoholischer Kaliumacetatlösung als Kalisalze,
ausgefällt werden; aus den wässerigen Lösungen der Kalisalze können dann mit Hilfe von Mineralsäuren,
wie Salzsäure, die freien Säuren dieser Penicilline ausgefällt werden. Diese Methode ist
auch ohne vorhergehende Ausfällung der Begleitsäuren mit Erdalkalisalzen allgemein für die Reinigung
der Lösungen der Penicillinsalze oder freien Säuren der Penicilline in organischen Lösungsmitteln
anwendbar.
Die als freie Säuren gewonnenen Penicilline können, wenn erwünscht, hernach auch in Alkalioder
Erdalkalisalze übergeführt werden, beispielsweise durch Lösen in einer äquivalenten Menge
Lauge und lyophile Trocknung oder Ausfällen der im organischen Lösungsmittel, z. B. Butylacetat,
gelösten Penicilline durch Alkalisalze organischer Säuren, z. B. durch Kaliumacetat bei Gegenwart
eines wasserfreien polaren Lösungsmittels, z. B. Äthanol. Die Alkalisalze lassen sich auch z. B.
durch Aluminiumsalze in wässeriger Lösung zu Aluminium-Penicillinen umsetzen.
Für die Fermentation wurde eine Stammnährlösung folgender Zusammensetzung verwendet:
FeSO4 ■ 7H2O 0,01%
H3PO4 0,4%
MnSO4-H2O 0,025% go
CaCl2 ο,οΐ %
Laktose 3,0 %
Glukose 1,0 %
Gearbeitet wurde in einem 5-l-Lüftungskolben,
der mit 2 1 Nährlösung beschickt wurde. Diese bestand aus der Stammnährlösung und den in den
einzelnen Beispielen variierenden Stickstoffquellen sowie den verschiedenen Precursors. Die Luftmenge
betrug etwa 1 1 Luft pro Minute und Liter Nährlösung.
Nährlösung 1
1700 cm3 Stammnährlösung
300 cm3 Preßhefeautolysat (mit 10 g N/l)
0,075 °/o /J-Phenoxyäthanol
Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 240 C; erreichter Penicillingehalt: 2200 O.E/cm3, biologisch getestet
(jodometrisch: 1466 O.E/cm3).
^x
Nährlösung 2
1850 cm3 Stammnährlösung
150 cm3 Corn Steep Liquor (mit 40 g Stickstoff/l)
150 cm3 Corn Steep Liquor (mit 40 g Stickstoff/l)
0,05% p-Oxy-/?-phenoxyäthanol X1j
Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 240 C; erreichter Penicillingehalt: 1660 O.E/cm3, biologisch getestet.
Nährlösung 3
1800 cm3 Stammnährlösung
200 cm3 Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/l)
0,2% Phenoxyessigsäure
Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 240 C; erreichter Penicillingehalt: 2150 O.E/cm3, biologisch getestet
(jodometrisch: 1432 O.E/cm3).
Nährlösung 4
1750 cm3 Stammnährlösung 280 cm3 Preßhefeautolysat
0,08% /?-Phenoxyäthanol
Gärzeit: 6 Tage; Gärtemperatur: 240 C; erreichter
Penicillingehalt: 2800 0.E/cm3, biologisch getestet (jodometrisch: 1854 O.E/cm3).
Nährlösung 5
1720 cm3 Stammnährlösung 300 cm3 Bierhefeautolysat
0,076% /?-Phenoxyäthanol Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 240 C; erreichter Penicillingehalt: 2500 O.E/cm3, biologisch getestet (jodometrisch: 1704 O.E/cm3).
0,076% /?-Phenoxyäthanol Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 240 C; erreichter Penicillingehalt: 2500 O.E/cm3, biologisch getestet (jodometrisch: 1704 O.E/cm3).
Nährlösung 6
1800 cm3 Stammnährlösung 200 cm3 Bierhefeautolysat
0,2% Phenoxyessigsäure Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 240 C; erreichter Penicillingehalt: 2150 O.E/cm3, biologisch getestet (jodometrisch: 1432 O.E/cm3).
0,2% Phenoxyessigsäure Gärzeit: 7 Tage; Gärtemperatur: 240 C; erreichter Penicillingehalt: 2150 O.E/cm3, biologisch getestet (jodometrisch: 1432 O.E/cm3).
Werden die gleichen Nährlösungen, aber unter Verwendung von Phenylessigsäure als Precursor
unter denselben Fermentationsbedingungen verwendet, werden nur Penicillingehalte von 400 bis
500 O.E/cm3 erzielt.
Großversuche in normalen Fermentern führten zu ähnlichen Ergebnissen, wobei die Fermentationszeiten
wesentlich kürzer und praktisch gleich denen bei der normalen Großpenicillinproduktion
(3 bis 4 Tage) waren. Aus den unter Verwendung der obigen oder ähnlichen Nährlösungen mit Hilfe
von Precursors vom Typ
bzw.
COOH-(R1X)n-R2
CH2OH-(R1X)n-R2,
(wobei R1, X, R2 und η die eingangs definierte Bedeutung
haben), wie z. B. Phenoxyessigsäure, Phenylmercaptoessigsäure (C6 H5 S C H2 COO H),
p-Oxyphenoxyessigsäure (OHC6H4OCH2COOH),
p-Nitrophenoxyessigsäure(NO2C6H4OCH2COOH)
bzw. Phenoxyäthanol usw. nach der Fermentation erhaltenen Rohlösungen können erfindungsgemäß
die freien Säuren wie folgt erhalten werden:
I. Fällung der freien Penicillinsäure aus wässeriger Lösung mit Mineralsäuren
600 cm3 wässeriger Penicillinphase mit 47 000 O.E/cm3 (jodometrischer Test) mit einem Säureverhältnis
ι : 0,9 wurden auf pH 1,5 angesäuert.
Das ausgeschiedene freie Penicillin wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 15,24 g Phenoxymethylpenicillin zu 1673 O.E/mg bzw. 14,78 g p-Oxyphenoxymethylpenicillin
zu 1600 O.E/mg (jodometrischer Test).
Eine Weiterverarbeitung zu den Penicillinsalzen
kann etwa wie folgt vorgenommen werden:
a) 7,62 g der erhaltenen Penicillinsäure mit 1673 O.E/mg wurden in 230 cm3 Butanol gelöst
und das Penicillin durch Zugabe von 42 cm3 o,7molarer Kaliumacetatlösung gefällt.
Ausbeute: 8,08 g Kalium-Phenoxymethylpenicillin mit 1500 O.E/mg (jodometrischer Test).
b) 7,62 g Penicillinsäure mit 1673 O.E/mg wurden mit 2n-Kalilauge neutralisiert; durch Zugabe
von 30 cm3 ιo°/oiger Al Cl3-OH2 O-Lösung wird das
Aluminium-Phenoxymethylpenicillin abgeschieden.
Ausbeute: 6,95 g mit 1660 O.E/mg (jodometrischer Test).
II. Extraktion des Kulturfiltrates mit Chloroform, wodurch die Penicillinbegleiter in der wässerigen
Phase verbleiben; anschließende Verdunstung des
Chloroforms
3 1 enteiweißtes und filtriertes Kulturfiltrat mit 1200 O.E/cm8 (jodometrischer Test) wurden durch
Ansäuern auf Pjj2,i in 500 cm3 Chloroform übergeführt.
Hieraus erfolgte die Extraktion mit Puffer, dann wieder mit Chloroform usf., wobei
schließlich 50 cm3 Chloroformphase mit 63 400 O.E/ cm3 erhalten wurden. Die Säurezahl betrug 1,21,
was einem Säureverhältnis von nur 1:0,15 entspricht.
Aus dieser Chloroformphase wurde dann das Penicillin, das in Säureform vorlag, durch Abdunsten
des Lösungsmittels gewonnen. Es wurden in dieser Weise 1,90 g Phenoxymethylpenicillin als
Säure mit 1500 O.E/mg erhalten. Eine weitere Reinigung wurde durch Aufschlämmen in 100 cm3
Wasser und Absaugen des so gereinigten Penicillins bewirkt.
Ausbeute: 1,75 g Penicillinsäure mit 1690 O.E/
mg (jodometrischer Test).
III. Extraktion und weitgehende Reinigung des Phenoxymethylpenicillins durch Ausfällung der
Phenoxyessigsäure als Bariumsalz
Das in 1450 1 enteiweißtem Kulturfiltrat enthaltene Penicillin (1053 O.E/cm3 jodometrischer Test)
wurde im Gegenstromverfahren unter Reduktion des Volumens (erste Stufe 1 :4, zweite Stufe 1 :3,
dritte Stufe 1:2) in Butylacetat bei pH2,i, dann
wieder in Pufferlösung bei pH 7,2 und dann wieder in Butylacetat bei pH 2,1 übergeführt. Man erhielt
60 1 Butylacetatphase mit 23 715 O.E/cm3 (jodo- xio
metrischer Test), Säurezahl: 2,57, was einem Säureverhältnis von 1 :5,6 entspricht. Aus der
Butylacetatphase wurde das Penicillin durch NaO H in die wässerige Phase übergeführt (pH 7,2); Endvolumen
20 1. Diese wässerige Lösung wurde mit 1,7 kg BaCl2—2H2O versetzt, wobei Bariumphenoxyacetat
ausfiel. Nach istündigem Stehen wurde der Niederschlag abgesaugt und mit 5 1
Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden mit 35 1 Butylacetat versetzt, mit Schwefelsäure
auf pji 2 gebracht und so das Penicillin in das organische
Lösungsmittel befördert. Die Butylacetatphase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert
und das Natriumsulfat mit etwas Butylacetat gewaschen. Säurezahl der Butylacetatphase 1,00;
jodometrischer Test 37 700 O.E/cm3; Endvolumen
37 I- Das Säureverhältnis betrug also ι : 0,58. Die
Reduktion des Säureverhältnisses von 1 :5,6 auf ι : 0,58 bedeutet eine so starke Entfernung der
Phenoxyessigsäure, daß aus der Butylacetatphase das Penicillin unmittelbar mit Kaliumacetatlösung
ausgefällt werden konnte. Man erhielt auf diese Weise 986 g Kalium-Penicillin mit 1310 O.E/mg.
Dieses Produkt wurde zur weiteren Reinigung in 25 1 Wasser gelöst und durch Ansäuern auf pH 1,5
die freie Säure abgeschieden.
Ausbeute :748 g Penicillinsäure mit 1685 O.E/mg.
Die durch das Verfahren gemäß der Erfindung
erstmalig als freie kristallisierte, sehr stabile Säuren von definierten Eigenschaften erhaltenen
Penicilline der bezeichneten Art weisen eine annähernd theoretische Aktivität auf. Beispielsweise
erwiesen sich das Phenoxymethylpenicillin und das p-Oxy-phenoxymethylpenicillin, die also in der
Seitenkette Atome mit einsamen Elektronenpaaren bzw. eine aktivierte Methylengruppe aufweisen, in
Form der freien Säuren im Vitro-Versuch biologisch aktiver als Penicillin G mit 1667 O.E/mg.
Dies wird dadurch bestätigt, daß die biologisch ermittelten Aktivitäten meist wesentlich höher waren
als die durch jodometrische Testung gefundenen Werte. So ist z. B. das Phenoxymethylpenicillin
gegen Staphylokokkus aureus um etwa 50 °/o aktiver, als seine jodometrische Aktivität anzeigt.
Die Säurestabilität und überhaupt die erhöhte Stabilität unter verschiedenen Verhältnissen, wozu
auch die lange praktisch unbegrenzte Haltbarkeit bei Zimmertemperatur in festem Zustand gehört,
läßt die erfindungsgemäß erhaltenen freien Penicillinsäuren als für die Oraltherapie und Depot-Penicillintherapie
besonders geeignet erscheinen. Sie sind ungiftig und weisen eine hohe antibakterielle
Wirksamkeit auf. Während die normalen Penicilline im Magen zum größten Teil zerstört
werden und nur durch Zugabe großer Puffermengen zu einer ohne merklichen Aktivitätsverlust verlaufenden
Passage durch den Magen befähigt sind, gelangen die freien Penicillinsäuren ohne jeden
Zusatz von Stabilisierungsmitteln mit praktisch unveränderter Aktivität durch den Magen in die
resorbierenden Darmpartien. Zahlreiche Tier- und Humanversuche haben die Eignung dieser Penicilline
insbesondere für die ovale Applikation erwiesen.
IV. Ausscheidung der freien Penicillinsäure ^0 aus einem Äther durch Kühlung
a) 5 g Roh-Kaliumsalz des Phenoxymethylpenicillins
mit 1030 E/mg (jodometrischer Test) werden in 100 cm3 Wasser gelöst; die Lösung wird
mit 100 cm3 Diisopropyläther versetzt und das Penicillin unter Ansäuerung der wäßrigen Lösung
auf pH 1,8 in Form der freien Säure in das organische
Lösungsmittel (Diisopropyläther) übergeführt. Nach Abtrennung von der wässerigen Phase
und Trocknung der Diisopropylätherlösung wird diese auf — io° C gekühlt, wobei sich nach mehrstündigem
Stehen das Phenoxymethylpenicillin in Säureform abscheidet.
Ausbeute: 2,13 g Phenoxymethylpenicillinsäure mit 1685 E/mg (jodometrischer Test) =69,7%.
Die noch in der Diisopropylätherphase verbleibende restliche Penicillinsäure wird wieder in
100 cm3 Pufferlösung von pH 7,2 übergeführt und
daraus mit 2n-HCl gefällt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird gut mit Wasser gewaschen und
getrocknet.
Ausbeute: 0,78 g Phenoxymethylpenicillinsäure mit 1680 E/mg=25,4%. Daraus ergeben sich als
Gesamtausbeute 95,1% Phenoxymethylpenicillinsäure.
b) 300 cm3 wässerige Lösung von Phenylmercaptomethylpenicillin
mit 20000 E/cm3 (jodometrischer Test) werden bei pH 1,8, somit in der
Form der freien Säure, mit 100 cm3 Isoamyläther
extrahiert. Die ätherische Phase wird abgetrennt, getrocknet und die Lösung auf — 200 C abgekühlt,
wobei sich bald ein Niederschlag von reinem Phenylmercaptomethylpenicillin (als Säure) auszuscheiden
beginnt. Nach I2stündigem Stehen wird der Niederschlag abgesaugt und getrocknet.
Ausbeute: 3,10 g Phenylmercaptomethylpenicillinsäure
mit 1600 E/mg (theoretisch 1621 E/mg)
= 82,7%.
V. Ausscheidung der freien Penicillinsäure
aus Butylacetat durch Zusatz eines apolaren
Lösungsmittels
50 cm3 Butylacetatphase aus einer Betriebsextraktionsstufe
mit 91200 E/cm3 Phenoxymethylpenicillinsäure
werden mit 250 cm3 Petroläther versetzt, wobei sich sehr rasch ein Niederschlag,
bestehend aus Phenoxymethylpenicillinsäure und Penicillinbegleitsäuren ausscheidet. Nach 3stündigem
Stehen wird dieser Niederschlag isoliert, getrocknet und dann zur Entfernung der Penicillinbegleitsäuren
in 50 cm3 Wasser auf geschlämmt, wobei diese in Lösung gehen. Nach 2stündigem
Stehen wird die ungelöste Penicillinsäure abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 2,41 g Phenoxymethylpenicillinsäure mit 1660 E/mg=87,7 °/o.
VI. Es wird ein Kulturmedium hergestellt, welches aus 4 g p-Cresoxyessigsäure, 300 ecm Bierhefeautolysat
mit einem Stickstoffgehalt von 20 g Stickstoff pro Liter und 2800 ecm einer Stammnährlösung
der folgenden Zusammensetzung besteht :
FeSO4-7 H2O o,oi«/o
H3PO4 0,40/0
MnSO4- H2O 0,0250/0
CaCl2 0,01%
Laktose 3,0 °/o
Glukose 1,0%
Die Flüssigkeit wird in einen 5-l-Kolben gebracht,
angeimpft, und durch das Medium wird Luft in einer Menge von 2 l/Min, geleitet. Die
Mischung wird bei 240 C unter sterilen Bedingungen 7 Tage lang fermentiert. Dabei werden 3 1 KuI-turmedium
erhalten, welches etwa 1500 E Penicillin
909 545/45
pro ecm Lösung enthält (jodometrischer Test). Das Kulturmedium wird filtriert, auf einen pH-Wert
von 1,2 angesäuert und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird mit Aktivkohle entfärbt
und mit einer Pufferlösung extrahiert. Die Pufferlösung wird angesäuert, auf pg 2,1 und mit
50 ecm Chloroform extrahiert, wobei eine Chloroformlösung erhalten wird, die 78 200 E Penicillin
pro ecm Lösung enthält. Das Chloroform wird zur Trockne verdampft, wobei 2,24 g feste p-Cresoxymethylpenicillinsäure
mit einer Aktivität von 1520 E je mg erhalten werden. Die Penicillinsäure
wird zur Reinigung in der Weise weiterbehandelt, daß sie in einer so großen Menge o,i%iger wässeriger
Natriumhydroxydlösung aufgenommen wird, daß eine neutrale Lösung entsteht. Diese Lösung
wird unter Salzsäurezusatz auf einen pH-Wert von 1,7 eingestellt, wodurch die freie Penicillinsäure
ausgefällt wird. Die Penicillinsäure wird abfiltriert und mit ungefähr 10 ecm kaltem Wasser gewaschen.
1,91 g p-Cresoxymethylpenicillinsäure mit
einer Aktivität von 1630 E in mg wurden erhalten. Smp. i2o° C.
Zur Herstellung der freien Säuren des p-Cresoxymethylpenicillins kann auch in folgender Weise
vorgegangen werden:
Die Pufferlösung wird auf einen pH-Wert von 2,1
angesäuert und mit 50 ecm Butylacetat extrahiert; dabei entsteht eine Butylacetatlösung der freien
Säure des p-Cresoxymethylpenicillins, welche eine
Aktivität von 78 200 E pro ecm Lösung aufweist. Aus dieser Butylacetatphase wird das p-Cresoxymethylpenicillin
durch Zusatz von 18 ecm einer o,5molaren Lösung von Kaliumacetat in Butanol
als Kaliumsalz gefällt. Die Ausbeute beträgt 2,60 g Kalium-p-cresoxymethylpenicillin mit einer Aktivität
von 1345 E/mg. Das p-Cresoxymethylpenicillin
wird weiter durch Aufnahme des Kaliumsalzes in 300 ecm destilliertem Wasser und An-Säuerung
der so erhaltenen Lösung mit Sn-SaIzsäure auf einen pH-Wert von ungefähr 1,5 gereinigt.
Die ausgefällte, kristallisierte freie Säure des p-Cresoxymethylpeniciilins wird abfiltriert,
mit destilliertem Wasser gewaschen und im Vakum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 1,94 g p-Cresoxymethy!penicillin
mit einer Aktivität von 1600 E/mg (jodometrischer Test).
Claims (5)
- PATENTANSPRÜCHE:i. Verfahren zur Gewinnung von stabilen, besonders für die Oraltherapie geeigneten Penicillinen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus den bei der Fermentation erhaltenen Rohlösungen oder aus bei der nachfolgenden Aufarbeitung der Rohlösungen erhaltenen wässerigen Lösungen, welche Penicilline der allgemeinen Formel3H10O3NS-NHCO-(R1X)n-R2, worin R1 einen zweiwertigen, gegebenenfalls substituierten aliphatischen Rest, X Sauerstoff, Schwefel oder eine NH-Gruppe, η eine ganze Zahl von 1 bis 5 und R2 einen aliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, bedeutet, enthalten, diese Penicilline als freie Säuren abscheidet.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus den Rohlösungen oder wässerigen Extraktionsstufen die Penicilline durch Ansäuerung auf tiefe, vorzugsweise unter 2 liegende pH-Werte in fester Form als Säuren abscheidet, woran sich eine weitere Reinigung der abgeschiedenen Penicilline durch Waschen mit Wasser anschließen kann.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicilline aus den Rohlösungen oder wässerigen Extraktionsstufen in Gegenwart von Säuren in solche organische Lösungsmittel überführt, die wie Chloroform begleitendePrecursorsäuren schwer, die Penicilline als freie Säuren dagegen leicht aufnehmen, und die Penicilline durch Verdunstung des Lösungsmittels als freie Säuren gewinnt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach einer unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln, wiez. B. Butylacetat, und von wässerigen Pufferlösungen üblicherweise vorgenommenen Extraktion die begleitenden Precursorsäuren aus einer Extraktionsstufe, z. B. durch Fällung mit Erdakalisalzen anorganischer Mineralsäuren, vorzugsweise Bariumchlorid, entfernt, die Penicilline in Form ihrer Säuren in ein organisches Lösungsmittel, beispielsweise Butylacetat, überführt und aus dem organischen Lösungsmittel als Alkalisalze, z. B. mit akoholischer Kaliumacetatlösung, in wasserfreiem Zustand ausfällt und die in wässerige Lösung übergeführte Alkalisalze durch Mineralsäuren bei einem pH-Wert unter 2 zerlegt, wobei die freien Säuren der Penicilline in gereinigter fester Form abgeschieden werden.
- 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Säureform erhaltenen Penicilline in an sich bekannter Weise in ihre Salze, insbesondere Alkalisalze, überführt.In Betracht gezogene Druckschriften: »The Chemistry of Penicillin«, 1949, S. 91und 672;französische Patentschrift Nr. 942 528; USA.-Patentschriften Nr. 2 493 625, 2 528 175; britische Patentschrift Nr. 630 462; J. am. ehem. Soc, 70 (1948), S. 2964/2965; Chemisches Zentralblatt, 1949, Bd. Ill, S. 1704;1951, Bd. II, S. 2224.& 909 545/45 6.59
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT972336X | 1952-04-22 |
Publications (1)
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---|---|
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DEB23846A Expired DE972336C (de) | 1952-04-22 | 1953-01-20 | Verfahren zur Gewinnung von stabilen, besonders fuer die Oraltherapie geeigneten Penicillinen |
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DE (1) | DE972336C (de) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR942528A (fr) * | 1946-03-08 | 1949-02-10 | Lilly Co Eli | Procédé perfectionné pour la production de la pénicilline et milieu de culture pour ce procédé |
GB630462A (en) * | 1947-07-07 | 1949-10-13 | Glaxo Lab Ltd | Improvements in or relating to the preparation of salts of penicillin |
US2493625A (en) * | 1947-02-26 | 1950-01-03 | Hoffmann La Roche | Production of penicillin |
US2528175A (en) * | 1948-07-01 | 1950-10-31 | Lilly Co Eli | Procaine salts of biosynthetic penicillins |
-
1953
- 1953-01-20 DE DEB23846A patent/DE972336C/de not_active Expired
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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