DE1467903A1 - Penicilline und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Penicilline und Verfahren zu ihrer Herstellung

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DE1467903A1
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penicillin
acid
fermentation
penicillins
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Oeppinger Dr Heinz
Hoffmann Dr Hinrich
Schorr Dr Manfred
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Hoechst AG
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Description

H67903
PARBWIRKE HOECHST AG. vorm«le Meister Luciu· & Brtining
-■%
Aktenseichen: P 14 67 903. 9 Datum« 30.August 1968
Penicillin· und Verfahren bu ihrer Herstellung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Thienyloxymethylpenicilline und Verfahren eu deren Herstellung.
Seit festgestellt wurde» dass die Zugabe von Phenylessigsäure als sogenannte Precursor-Substans. aeu einer Kulturlösung mit Penicillium chrysogenum, die die Bildung eines bestimmten Penicillin· G, besonders fördert, wurden verschiedentlich Versuche unternommen« Penicilline mit anderen als den bekannton Eigenschaften durch Zugabe von.verschiedenartigen Precursor-Substansen herzustellen.
ZunHehst haben Behrens und Mitarbeiter (J. Biol. Chem. 175. 751« 765, 771, 793 (19*8)» J. Amor. Chem. Soc. 70, 2837· 28*3. 28*9 (1946) verschiedene Precursor-Substansen geprüft: die Salse einiger neuer Penicilline U.B. Phenoxymethyl-penicillin, Phenyl-mercapto.methyl-penicillin u.a.) sind Gegenstand der US-Patent· 2Λ79 295, i %79 296, 2 Λ79 297, 2 562 4o8, 2 562 fclO, 2 623 876 und 2 562 kll sowie, des britischen Patentes 6*3
O Übcx dl« Befunde von Behrens und Mitarbeiter hinaus machten
*· Brand! und Margreiter (Osterr.Chemiker-Zeitung Band 551
O die Feststellung, dass sieh das Phenoxy-methyl-penicillin (v.ihnen
BAD ORIGINAL Neu* Unterlagen {Art 711 Abe. 2 nm s«u a <t« Χη<«·Γ«ηβ·ο·«. ν. 4. ϊ. taen
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Penicillin V genannt) als freie Säure kristallisieren lässt und eine weitgehende Säurestabilität aufweist. Es eignet sich daher gut für orale Applikationen (vgl. Wiener Med. Wochenschrift to?, (1955), S. 602 und österr. Patentschriften I78 692 und I8I 689).
Ein anderes, weitgehend säurestabiles Penicillin, das p-Kresoxymethylpenicillih, kann man durch Zugabe von p-Kresoxyessigsäure gewinnen (US-Patent 2 756 226).
Nach EP 9I6 488 wird mit 4-Fluor-phenylmercapto-esslgsäure als Precursor ein 4-Fluorphenyljnercaptomethylpenicillin erhalten, das besonders gegenüber gram-negativen Mikroorganismen wirksam ist.
Alkyl-Nsch DAS ^l 207 O46 sowie BeIg. Pat. 650 488 kann man,nereaptophenoxymethylpenicililne durch Fermentation herstellen.
Es wurde nun gefunden, daß man Thienyloxymethyl-penieilline der allgemeinen Formel I
H pnnW
r·
/ \
ί CO
\ /
CH CO - CH2
,Jn -
CH,
J 3
J η
in der R^ und R2 Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeuten, und deren Salze dadurch herstellen kann, da8 man einer mit einem penic 11,1 inbildenden Pilz beimpften Kulturlöeung zu Beginn der Fermentation oder portionsweise oder kontinuierlich nie Preeursur. bisher nicht bekannte Thienyloxyeseigs.Muren der allgemeinen Formel TI
· : ■■ :ι · ■■■■ ■ ■·· · ■ ·
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O - CH2 - COOH II,
in der R- und R2 die oben angegebene Bedeutung besitzen, oder deren Salze, die entsprechenden Aldehyde oder Alkohole bzw. die funktionellen Derivate dieser Verbindungen zusetzt und aus der Feraentatlonslösung die entsprechenden Penicilline isoliert.
Als erfindungsgemäS einsetzbare Precursor kommen beispielsweise die folgenden Thienyloxyessigsäuren in Betracht:
2-Thienyloxyessigsäure, 3-Thienyloxyessigsäure, 5-Methyl-2-thienyloxyesslgsäure, 3»5-Dimethyl-2-thienyloxyesslgsSure, 2-Methyl-3-thlenyloxyessigeäure, 3-Methyl-Juthienyloxyessigsäure, 2-Methyl-4-thienyloxyessigsäure, 2,5-Dimethyl-3-thienyloxyessigsäure, 2,3-Dimethyl-4-thienyloxyessigsäure.
Die Thienyloxyessigeäuren lassen sich nach bekannten Verfahren, z.B. durch Timsetzung von Hydroxythiophenen mit entsprechenden oc-Halogenfettsäureestern und anschließende Verseifung gewinnen.
Die Zugabe des Precursors ist dabei vorteilhafterweise so zu regulieren, daß der pH-Wert der Kulturlösung im Laufe der Fermentation zwischen 5#5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,0 und 6,6 gehalten wird.
Die Isolierung des betreffenden Penicillins erfolgt in an sich bekannter Weise nach Abbruch d#r Fermentation durch Extraktion au» der filtrierten Kulturlösung. Das Kulturfiltrat wird nach Ansäuern auf einen pH-Wert von etwa 1,5 bis etwa 2,5 mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie bei-
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spieleweise Äthylaoetat, Chloroform, vorzugsweise Butylacetat extrahiert. Aus diesem wird dann das Penicillin in eine annBhernd neutrale oder schwach alkalische Pufferlösung, vorzugsweise Phosphatpuffer, bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 8,5# vorzugsweise einem pH-Wert von 7*0 bis 7*5 übergeführt, und aus diesem wiederum nach insäuern mit einem organischen, «it Wasser nioht mischbaren Lösungsmittel, wie, z.B. Äthylaoetat, Chloroform, vorzugsweise Butylacetat bei einem pH-Wert von etwa 1,5 bis etwa 2,5 extrahiert.
Es wurde weiterhin gefunden, daß sich'im Gegensatz zu der Isolierung von beispielsweise Penicillin V die Penicilline der Allgemeinen Formel T überraschenderweise von den durch die Extraktion mitgeeohieppten, nioht verbrauchten Precursor-Substanzen in einfacher und wirtschaftlicher Welse dadurch abtrennen lassen, daß die Ausfällung der Penicilline aus den organischen Lösungsmittel, vorzugsweise aus Butylaoetat, durch fraktionierte Fällung mit einem in fester oder., vorzugsweise in gelöster Form vorliegenden Salz einer aliphatischen Carbonsäure mit 1-20 Kohlenstoffatomen erfolgt. Ale aliphatisohe Carbon« säuren kommen vorzugsweise Fettsäuren mit 1-9 Kohlenstoffatomen, jedoch auch höhere Fettsäuren wie z.B. Pälmitinsäure, Ölsäure, Stearinsäure oder auch Dicarbonsäuren, wie beispielsweise Oxalsäure oder Malonsäure in Betracht, als Lösungsmittel für das Salz der Carbonsäure seien insbesondere niedere aliphatisohe Alkohole oder Ketone mit 1-5 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methanol oder Aceton genannt. Als Salze der aliphatischen Carbonsäuren können Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze oder Suit« mit stickstoffhaltigen Basen, vorzugsweise Jedoch Alkaliealtt, insbesondere die KaliuBsalze, wie beispielsweise Kaliueaoetat, das Kalluasalz der Äthylhexenoβrboneäure otter das Kallumealz der Diäthyl essigsäure Verwendung finden.
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überraschenderweise erfolgt bei portionsweiser Zugabe des Carbonsäuresalzes als Fällungsmittel in den ersten Fraktionen die Ausfällung des Precursors. Tn den weiteren Fraktionen wird das Penicillin ausgefällt. Die Grenze ist sehr scharf.
Es war nicht zu erwarten, daß sich das Penicillin und der Precursor auf diese Weise trennen lassen wurden, denn wie die Ausführungsbeispiele 10 und 11 zeigen, lässt sich Penicillin V von der als Precursor üblichen Phenoxyessigsäure mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens nicht abtrennen. Wie beispielsweise im DDR-Patent Nr. 26 023 ausgeführt wird, ist es daher bei Penicillin V notwendig, selbst bei den wirtschaftlich am besten brauchbaren Ver-„ fahren die Trennung unter Verwendung organischer Lösungsmittel durchzuführen. Andere, ebenfalls dort angegebene Verfahren sind noch aufwendiger oder verlustreicher. Demgegenüber lassen sich in einfacher Welse nach dem erfindungsgemäß vorteilhaft anwendbaren Verfahren reine Salze, vorzugsweise die Kaliumsalze der Thienyloxywethyl-penicilline erhalten, aus denen durch einfaches Lösen in Wasser und Ausfällen der kristallin zu erhaltenden freien Säure so in äußerst wirtschaftlicher Weise hochgereinigte Penicilline gewonnen werden.
Die er,findungsgemäa erhaltenen Penicilline sind in Form ihrer Salz· oder als freie Säuren feste, zumeist gut kristallisierende Produkt·. Di· freien Säuren sind in Wasser schwer, in den meisten organischen Lösungsmitteln dagegen leicht löslich. Die Salze besitzen Je nach der verwendeten Base sehr unterschiedliche Lösllchkeiten In Wasser; die schwer löslichen eignen sich gut zur Herstellung von Depotpräparaten »it verlängerter Wirksamkeit. Die SäurestabilItMt der erfindungsgemäS herstellbaren Penicilline •rlaubt such ihre orale therapeutische Verwendung. Sie besitzen •In· aasettelohnst· «ntlbakterlelle Wirksamkeit, die gegen grampositive Keine besonders gut ausgeprägt ist. Die in den Beispielen
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beschriebenen Verbindungen besitzen alle eine bei etwa I76O -I785 K liegende starke C=O-Bande, die dem ß-Lactamring zugeordnet wird (vgl. L.J. Bellamy, JR-Spectra of Complex Molecules, London u. New York I962, S. 214).
ν Beispiel 1
Eine sterile Vorstufen-Lösung (Zusammensetzung: 2,0 g Rohrzucker, 7,0 g Oomsteep-Liauor, 1,0 g fette öle und 1,0 g Calclumcarbonat in 100 ml Wasser) wurde mit Sporen von *Penicillium chrysogenum beimpft und 26 Stunden bei 250C geschüttelt. Mit 1 1 dieser Kulturlösung wurde die Hauptfermentationsstufe (sterile Nährlösung: 6,45 kg Cornsteep-Liquor, 2,28 kg Lactose, 0,75 kg CaCO-, 0,45 kg prim. K-phosphat, 40 g MgSO^ und 340 ml fette öle in 60 1 Wasser) beimpft, die bei 250C unter intensivem Rühren und Einleiten steriler Luft fermentiert wurde. Von der 38. Stunde ab wurden In Abständen von 6 Stunden in l6 Einzelgaben je 22,5 g K-SaIz der 3-Thienyl-oxy-essigsaure, gelöst in 300 ml Wasser, als Precursor zugegeben.
Nach 164 Stunden Fermentationsdauer werden 3980 E Penicillin pro ml gefunden, Das Volumen beträgt dann 58 1 Kulturlösung, die durch Filtration vom Mycel befreit wird. Das Kyoel wird mit 44 1 Wasser nachgewasehen. Aus dem Piltrat wird das 3-Thienyloxymethyl-penicillin bei pH 2 mit 20 1 Butylacetat extrahiert und aus der organischen Phase in eine Na-K-phosphat-bicarbonat-Pufferlösung von pH 9,0 überfuhrt, wobei sich ein pH-Wert von 7,0 einstellt. Aus dieser wird das Penicillin erneut durch Zugabe von 2,5 l Butylacetat bei pH 2 extrahiert und die abgetrennte Butylacetat-Lösung mit 250 g wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Dl· Trennung des Penicillins von dem gleichzeitig in der Butylaoetatlösung vorhandenen Precursor erfolgt durehfrraktieniert· ■· Fällung der Kaliumsais·, die bei Zusatz einer 20*igen Lösung ▼on wasserfreiem Kaliumaoetat in Methanol auakristallisieren.
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Die Isolierung erfolgt durch Absaugen, Nachwaschen mit wenig Aceton und lO-stUndiges Trocknen Im Vakuum (2 -J5 ram Hg) bei Raumtemperatur. Das Kaliumsalz des 3-Thlenyioxymethyl-penlelllins enthält unter diesen Bedingungen nooh Kristallwasser.
Fraktion Nr. V
zugesetzte 		Ausbeute Gehalt
K-acetat-Lösung
1 125 ml 69,0 g <20 E/mg
2 125 ml 48,0 g < 20 E/mg
3 - 150 ml 51,3 g <20 E/mg
4 150 ml 91,2 g 1260 E 'mg
5 150 ml 22,1 g 1250 E'mg
6 170 ml keine Fällung ___
Es werden so allein über die Fraktionen 4 und 5 insgesamt 143,6 Millionen Einheiten oder 61,7 % des in der Kulturlösung nachgewiesenen Penicillins isoliert. Aus der Mutterlauge lassen sich weitere 9,7 Millionen Einheiten (e 4,2 %) in gleicher Weise unter Verwendung kleinerer Volumina abtrennen, so daß die Gesamtausbeute 65,9 # beträgt.
Die Fraktionen 1-3 enthalten praktisch reinen Precursor (3-Thienyl-oxy-esslgsäur·) als Kaliumsalz in einer Gesamtausbeute von 168,3 g oder 37#7 % des für die Fermentation eingesetzten Precursors, die ohne weitere Reinigung wieder für die nächste Fermentation eingesetzt werden können.
Das Kaliumealz des 3-Thlenyl-oxy-methyl-penicillins kristallisiert ■aus Butylacetat in farblosen, oft zu Büscheln verwachsenen Nadeln, die bei etwa 208 - 212°C unter Aufschäumen und Zersetzung schmelzen.
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IR-Spektrum: Eine schmale, sehr kräftige Bande bei I783 k, gemessen im KBr-Presslinge, wird dem ß-Lacteraring zugeordnet. Stärkere Banden, die im IR»Spektrum der Kalium-Salze von Penicillin V und Penicillin O fehlen und das neu gewonnene Penicillin von diesen unterscheiden, liegen ,bei 15*2, 1443, 1399» 1263, H58, I138, 861 und 838 K.
UV-Spektrum: flache Bande mittlerer Intensität bei etwa 237 m/U und flaches Minimum bei etwa 245 m/U.
Aktivitätsbestimmungen: Als Einheit wird diejenige Menge des neuen Penicillins bezeichnet, die 0,6%mcg Penicillin G-Natrium chemisch äquivalent ist. Der biologische Test (gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538P) ergibt bei kristallwaeserhaltlgem Kaliumsalz des 3-Thienyl-oxy-raethyl-penioillins oa. "1260 E/mg; das' reine, wasserfreie K-SaIz enthält dagegen 1515 E/mg. SäurestabiHtätt .Nach 1 Stunde bei pH 2 in HCl-Gljueokoll-Puffer und 200C beträgt die nooh vorhandene biologische Aktivität etwa 96 £ der des eingesetzten Kaliumsalzes.
Löslichkeit: leicht löslich in Wasser; massig'löslieh in Methanol: schwer löslich in Alkoholen mit 2 und mehr C-Atomen, Äther, Aceton, Äthyl- und Butylacetat, Benzol, Alkanen und chlorierten Kohlenwasserstoffen.
Beispiel 2
Die Fermentation erfolgte in gleicher Welse wie in Beispiel 1 angegeben. Jedoch wurden ab der 41. Stunde alle 6 Stunden in 16 Einzelzugaben Je 11,25 g K-SaIs der 3-ThienyloxyeeeigeKure, in 300 ml Wasser gelöst, als Precursor nachgegeben. Naoh 143 Stunden Fermentationsdauer wurden 3050 E/ml gefunden, das Volumen der Kulturlösung betrug 64 l.
Naoh Filtration und Naohwasohen alt 46 I Wasser wurde entsprechend den Beispiel 1 eine Mit wasserfreiem Natriumsulfat getr00knete Butylaoetat-Löaung erhalten. Die fraktioniert· *41- ■ lung nit methanollecher Kaiiumacetatlösung führte na eh Absaugen ■
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und Vaeehen »it «twaa Aceton zu kristallisierten Produkten, die 5 Stunden bei 4o°C im Vakuum (2 - 5 nun Hg) getrocknet wurden.
Fraktion Nr. zugesetzte Ausbeute Gehalt
K-aoetat-Löaung
1 50 »1 31,3 g - ^20 E/rag
2 50 ml 18,3 g <20 E/rag
3 100 ml 39,3 g <20 E/mg
4 100 »1 80,0 g 1394 E/mg
5 100 ml keine Fällung
Die Praktion 4 enthält damit 111,5 Millionen Einheiten oder 57,2 % des Penlollllna in der ausfermantierten Kulturlösung. Weiteres Penoillin konnte in geringer Menge aus der Butylacetat-Mutterlauge isoliert werden.
Die Fraktionen 1-3 enthalten Precursor in einer Ausbeute von 43,2 %, der direkt zur weiteren Fermentation verwendet wer den konnte.
Beispiel 3
Eine sterile Vorstufen-Lösung (Zusammensetzung* 2,0 g Hohrxucker, 7,0 β Cornsteep-Liquor, 1,0 g fette öle, 1,0 g Caloiumoarbonat in 100 el H3O) wurde alt Sporen von Periioillium ohrysogenura beimpft und 26 Stunden bei 250C geschüttelt. Mit dieser Kulturlösung wurde ein Vorfermenter (sterile NXhrlösung: 7,4 kg Bohrtueker, 28 kg Cornsteep-Liquor, 3,7 g Ca-Carbonat, Ifl 1 fette Öle, JTO 1 Vaster) beimpft und unter intensivem kühren und Belüftung 36 Stunden bei 250C fermentiert· Darauf wurde die Lösung in die Rauptfermentatlcneetufe übergeführt, (aterile HKhrlösungi 170 kg Laetose, 1O6#5 kg Trooken-Comsteep,
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12,75 leg Ca-Carbonat, 17,7 kg prim, K-Phosphat, b,9h kg Mg-Sulfat, 6,25 1 fette öle rait Wasser auf 2500 1 aufgefüllt), die bei 250C unter intensivem Rühren und Belüftung fermentiert wurde. Von der 71. Stunde an wurden in 20 Einzelzugaben alle 3 Stunden je 192,5 g K-SaIz der 3-Thienyloxyessigsä'ure, gelöst, in 5 1 Wasser, als Precursor zugegeben.
Nach 147 Stunden Fermentationsdauer wurden 2200 E/ml gefunden. Das Volumen betrug dann 2200 1, nach Filtration und Nachwaschen 2950 1.
Die weitere Aufarbeitung erfolte entsprechend Beispiel 1 und führte zu 35 1 einer angereicherten und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrockneten Butylacetatlösung.
Die Trennung von Penicillin und Precursor erfolgte durch fraktionierte Fällung mit raethanolleoher Kaliumacetat-Lösung:
Fraktion Nr. zugesetzte Au., -e'jte Gehalt
K-acetat-Lösung
1 2000 ml *50 E/mg
2 1000 ml 350 >:■■ β <50 K/mg
3 2000 ml 10*5,5 β 14b? I ψ
4 2000 ml 676,5 g 1225 E/mg
5 3000 ml keine Füllung
Die Fraktionen 3 und 4 enthalten 'enach 2380 Millionen Birgiten oder ^9,2 % des In der Kulturlösung vorhandenen Per <Uillins. Der wiedergewonnene Preourscr naehtr 3^,5 % des eingesetzten au»; er 1st zum Einsatz für dl· nächst« Fermentation ausreichend rein.
1· ■;..;. BAD
9098 0° ' * 117
U679Q3
- te. -
Beispiel 4
Vergleichsweiser Versuch zur Trennung von Penicillin V und PhenrT.y -ess igs äure. ·
Als AuBganga-Lösung diente ein Fenicillin-Fermentations-Kultur« filtrat, das in einem Volumen von 53 1 44,6 g Penicillin V sowie 46,5 g Phenoxyessigsäure (beide berechnet als freie Säuren) enthält. Die Isolierung des Penicillin V erfolgte entsprechend dem Beispiel 1:
Nach überschichten mit Butylacetat wurde nu.f pH 1,95 angesäuert, die organische Phase abgetrennt und die wässrige Schicht nochmals mit dem gleichen Lösungsmittel extrahiert. Nach überfuhren der Säuren aus dem Butylacetat in eine wässrige Pufferlösung bei pH T wurde die wässrige Schicht erneut unter Butylacetat auf pH 1,95 angesäuert und die organische Phase nach Abtrennen mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Endvolumen betrug nach Filtration und Nachwaschen 4,55 3. Entsprechend den Beispielen 1-3 folgte dann die fraktionierte F&i... r^g durch Zusatz einer 20 proz. Lösung von wasserfreiem Kaliumacetat in Methanol:
Fraktion Nr. zugesetzte ml Ausbeute g Aktivität "'
K-acetat-Lösung ml g
1 50 ml 12,0 g 58 E/mg
2 50 ml 23,0 g 650 E/mg
3 50 ml 20,8 g 840 E/mg
4 50 ml 22,0 g 825 E/mg
5 #l00 16,8 950 E/mg
6 100 16,0 <20 E/mg (K-aoetat)
+) Biologisch bestimmt gegenüber Penicillin V (USP Reference Standard rait I672 E/mg).
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Als Feetsubstanzen waren zwar damit In Fraktion 1-5 92,5 % der Summe aus Penicillin V 4- Precursor wiedergewonnen, die 68,9 der biologiechen Aktivität dee zn Anfang nachgewiesenen Peniolllin V enthielten, aber keine Fraktion enthielt neben Precursor ■ehr eis 950 I/ag oder oa. 62 % Penicillin V (des reihe salz dee Penicillin V enthält" 1529 E'"β).
Beispiel 5
▼ergleiehswetseT Vewuoh star Trennung von Pe*UUl In V und oaqreeeigslure, die eloh In «t«s frmiieelarer Menge in LuMM finden.
Altf AuegangtlOtuB« dient« ein PenUlllin-PereenUtiiMie-Kultttr. f iltret, das In eine· Volueen von 55 1 146,10 g, entepreelwnd 0,*i7 Hol Penicillin V und 68,46 g Phenojqreeeigilure, enttpre« ehend 0,*5 Hol» enthielt. Die Isolierung erfolgte nie unter Beispiel 4 angegeben.
fies KndvoltÄSft der getrockneten ButrlaeetatlOaung betrug 3,74 Ergebnis der fraktionierten Pillung alt fO prot, wasserfreie» Kalluaaeetat in Methanolj
Fraktion Mr. sugeeetste Auebeuti
IC-acetat-Lösung
1 8p ml 45#5 ι
2 8o Hl 5UT 1
5 80 al 42,5 ι
4 80 ml 39*5 1
5 * 80 »1 55#t 1
6 ao aa 9,H
. · ■ ■ τ 80 al 0,8 ι
ι Aktivität T>
B Ι2βρ S/pg
I 8?O Ε/μι
I 975 B/Hg
I 1095 B/t»g
[ 890 κΛ«
ι i5io κ fm
+) Biologisch beetlnmt gegenüber Penicillin V (üSP Reference Standard mit 1672 E/mg).
Auch hier erfolgte wie in Beispiel 4 keine Trennung von Penicillin V und Precursor.
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Beispiel 6
Von einer sterilen Nährlösung der Zusammensetzung 20 g BohrzuckerP 10 g Ca-Karbonat und 76 g Corneteep-Liquor, mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt, wurden 80 ml in einen 300 nrl-Erlenmeyer-Kolben gegeben, mit Sporen von Penicillium chrysogenum beimpft und 48 Stunden bei 25°C geschüttelt. Von dieser als Vorstufe bezeichneten Kultur wurden 3 ml *uf 50 «1 einer sterilen Hauptstufenlösung (Zusammensetzung 55 g Lactose,, 50 g Corns tee p-Liquor, 7 g prim. Kaliumphosphat, 10 g Calcluicoarbonat, 3 g Magnesiumsulfat, mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt) übergeinpft* und bei 25°C geschüttelt, Naoh 24 Stunden wurden 125 ag 3-Thienylaxyeeeigeäure als Precursor zugegeben. Nach weiterem 96-stUndigem SohUttelu wurden 14O9 E säurestabiles Penicillin pro ml Lösung 9»fanden. Die Aufarbeitung wurde wie in Beispiel 1 angegeben durchgeführt und zeigte die gleichen Ergebnisse.
Beispiel 7
Nach de» gleichen Verfahren wie in Beispiel 6 erhalt man bei Zugabe von 125 Bg S-Thlenyloxyessigsaure-nmid als P^cursor 1576 E sKuresteblles Penicillin pro ml Lösung,beI Zugabe von 125 mg Na-Salz der ^-ThieftyloxyesslgsNure als Precursor 2020 E säurestabiles Penfctllin pro nl Lösung,, bei Zugabe von ?=?5 mg 2-Methyl-4-thlenyloxyeislgelSure als Precursor I885 E säureetabiles Penicillin pro ml Lösung bei Zugabe von I25 mg 2-Methyl-5-Thienyloxyesslgaäure als Preoursor 1482 E slurestabiles Penicillin pro ml Lösung.
In einem Vergleichsversuoh wurde tu der Kulturlösung kein Precursor zugegeben. Es wurde kein säureetabiles Penicillin gebildet.
Beispiel θ
656,6 g Kallumsalz des ^-Thienyloxy-methyl-penicillins, das im biologischen Test eine Aktivität von 1515 E/mg besaß, wurden in 3,0 1 entsal*tem Wasser1 gelöst, mit I5 g Kohlepulver abgesaugt und das Filter mit 100 ml entsalztem Wasser naohgewaschen. Zum
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Piltrat wurde unter gutem Rühren langsam In Salzsäure zugetropft. Nach Auftreten der ersten Trübung wurde mit 2 g der reinen, kristallisierten freien Säure dea 3-Thienyloxy-methylpenioilllns angeirapft und durch weitere Säure zugabe ein pH-Wert von 2,0 eingestellt. Nach einatündigem Nachrühren wurde die Fällung abgesaugt, mit 200 ml entsalztem Wasser nachgewaschen ' und bei ? - 5 mm Hg zunächst 2h Stunden bei Raumtemperatur, dann 5 Stunden bei 500C getrocknet. Die Ausbeute betrug 571,3 g oder 91,7 % der biologische^ Aktivität des eingesetzten Kaliumsalzes. DLe biologische Aktivität wurde zu 1620 E/mg gefunden.
Die freie Säure des 3-Thienyloxy-methyl-penicillins kristallisiert in farblosen Nadeln, die nach vorherigem Sintern bei ca. 1200C unter Aufschäumen und Zersetzung (Braunfärbung) schmelzen.
TR-Spektrum: Eine für den ß-Lactam-Ring kennzeichnende starke Bande (C^O-Schwirgmg) bei V Ό K ν·./■--■··.-■ ^ das Vorhandensein del*
Penicilli :«nrundstruki,ir4 v?
AktivitHtsbestimung: Der biologische .<eet (gegen St^jph.aureue ATCC 6538 P) ergibt I65O E/mg.
Die Säurestabilität entspricht der de« ν „.^-,i^es, wenn die freie Säure vor der Prüfung durch Alkajχ-Zusatz (Puffer) in wässrige Lösung gebracht wurde.
Löslichkeit: Sehr schwer löslieh in Wasser, rat'abig bis leicht löslich in den üblichen organischen Lösungsmitteln.
Beispiel 9
^50,0 g des Kaliumsalzes von 3-Thienyloxy-methyl-penicillir mit einem Gehalt von 990 E'mg sowie 27,5 g mit 1110 E/mg wurden in 6,0 1 entsalztem Wasser gelöst und mic 15 g Kohlepulver abgesaugt. Dann wurden 18 1 Ε-Wasser hinzugefügt und die Lösung unter Rühren mit In Salzsäure langsam auf pH 2,0 ger --TIt; Maob
ßAD
9 0 9 S 0 3 /' 1 1 7
.'Mt-
Eintreten der ersten Trübung bei oa. pH 3J5 wurde mit 2,0 g der reinen freien Sture des Penicilline angeimpft. Nach βinetundlgea Rühren wurde abgesaugt* alt etwas Wasser" gewaschen und der Filtarruokatand sei 3 - 5 aa Hg sunäohst 10 Stunden bei Rauateapsretur* dann 4 Stunden bei 4o°C getrocknet. Die Ausbeut· in freier flfcurf das 3-Thienyloxy-«e thy 1-panic ill in betrug i» die telologlwhe ftktlvlttt 1650 E/s«.
Beispiel 10
30 g 4es taUua*als*S «on 3-ThUn/lo*y-sethn-penicillin •Umr biolegitehen AktWItIt "von 139* B/o« wurden in 250 al entsalste« Wasser gelOlt. Darm wurde langsaa eine Lösung von 3*»* $ H,M«*Dlb«Wl**thnen-dia«in-dlaeetat in 250 «1 entsslstea Wasser svtttreftft« «seh Auftreten der ersten Trübung wurde alt einer kleinen Ne&ge des kristallisierten Saltes engeiepft, das Eintropfen fertgesetst und 1,0 1 entsalztes wasser naehgeasb·«. iaob 30*«lnutlgea Maehrüiü·«^ wurde abgesaugt« alt 100 «I Wasser naeng%waeol>Bn und 12 atunden bei Hauateaperatur und 2 * 5 a« Hg getrooknet. Ausbeute an Salt 33,0 g. , Das Sal« kristallislart In farblosen Hldelchen, die bei os. 135 - 1*O°C unter Xereeteung seheeUen. IR-Spektruet eine fa> denβ-Lactae-fi ing kennet lohnende starke Bande bei 1775 K beweist die Penio111in~Grundetruktur. Aktivität? der biolog lache Test ergibt eine Aktivität von 1274 Β/»β, ■
Die Xiösllohkelt des Salzes in Wasser bei Raumtemperatur betragt oft· 0,5 g pro Llteiw
Beispiel Il
10,0 g 3-Thienyl-oxy-»ethyl-penioillin als freie Säure wurden in 400 ml n-Butylaoetet gelöst und 4,11 g N-Kthyl-piperidin hinzugefügt. Sech Animpfen kristallisierte das N-Xthyl-piperldln des 3-Thienyloxy-methyl-penicillins aus. Nach kurzen Rühren
909803/1117
wurde abgesaugt, mit 30 ml reinem Butyläcetat nachgewaschen und 12 Stunden bei Raumtemper*ur sowie h Stunden bei 50°C bei 1 - 5 mm Hg getrocknet.
Die Ausbeute betrug 12,0 g eines farblosen, kristallinen SaIz zes, das bei 126 - 128°C unter Zersetzung schmilzt. Es löst sich sehr gut in Wasser.
Die biologische Testung ergab Il8o E/mg.
Das IR-Spektrum zeigt die ß-Lactam-Bande bei ce. I770 - 1775
Beispiel 12
10 g Kaliurasalz des 3-Thienyl-oxy-methyl-penleillins wurden in 100 ml Wasser gelöst und 8,96 g Procain-hydrochlorirfln 25 ml Wasser hinzugefügt. Mach Aninipfen kristallisierte das Procainsalz des 3-Thienylo:xy-methyl-penicillins in farblosen, prisma tischen Nadeln aus, die dft zu größeren Büscheln verwachsen waren.' Nach. Absaugen wurde mit etwas Wasser nachgewaechen und bei 1 - 5 mm Hg zunächst 15 Stunden bei Raumtemperatur, dann 4 Stunden bei 500C getrocknet.
Die Ausbeute betrug 13,5 g» das Salz schmilzt unter Zersetzung bei ca. 97 - 1000C. Es ist in Wasser, schwer, dagegen In Äthanol gut löslich.
Die biologische Testung ergab 995 E/mg. Das IR-Spektrum zeigt die starke , ß-Lactam-Bande bei c«. 1775 K·
Beispiel I3
10 g Kaliumsalz des 3-Thienyloxy-raethyl-penicilline In 100 nl· Wasser wurden mit 8,08 g 3#3t-Dlphenyl-propen (2)-iiraln»hyd;roohlorid in 300 ml Wasser versetzt.
Nach Verreiben mit Wasser wurde das ausgefallene, zunttohst schmierig^ Salz kristallin. Es wurde abgesaugt und J6 Stunden
9 0 9 8 0 3/1117
1*
bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute betrug 12,85 g> die bei etwa 128°C unter Zersetzung
schmelzen. Das Salz 1st in Wasser nicht, dagegen in Methanol
gut löslich. j
Die biologische "Bstung ergab II70 E/mg. Da» IB-Spektrum zeigt eine starke C«=O-Bande (^-Lactam) bei I775 K.
Beispiel' 1* ;!
10 g freie Säure des 3-Thlenyl-methyl-penicillins wurden in 330 ml wassergesättigtem Butylacetat gelöst, 40 g wasserfreies Natriumsulfat zugesetzt, abgesaugt und mit 20 ml η-Butylacetat nachgewasehen, pann wurden 7*17 g Dibenzylamin unter Rühren eingetropft. Das auskristallisierte Salz wurde nach 30 min. Nachrühren abgesaugt, mit etwas Butylacetat gewaschen und in Vakuum bei Rauntemperatur getrocknet.
Die Ausbeute betrug 14,5 g eines farblosen, kristallisierten Salzes, das*bei oa. 86 - 870C unter Zersetzung schmilzt. Es
ist in Wasser schwer, in Methanol gut löslieh.
Die biologische Testung ergab I080 E/mg.
Das IR-Spektrum zeigt eine starke GO-Bande (ß-Lnctam) bei ca.
1775 K.
Beispiel
10 g freie Säure des ^-Thlenyloxy-methyl-penicillins wurden entsprechend Beispiel 14 in n-Butylacetat gelöst und mit 2,14 g n-Propylamin-(l) versetzt. Die zunächst trübe, ölige Fällung kristallisierte nach Animpfen und Rühren. Nach 30 Minuten wurde abgesaugt, mit wenig Butylaoetat naohgewasohen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Pie Ausbeute an farblosem Sale betrug 10,8 g, die bei oa. 82 -850C unter Zersetzung schmelzen. Bs löst aioh gut in Wasser.
Dl· biologisch· testung ergab 1240 E/mg.
Dft« IR*8p*ktrum weist «ine starke C=O-Bande (Q-Laetam) bei I780 K
909d03/tt17

Claims (3)

Patentansprüche
1) Verfahren zur Herstellung von Thienyloxymethyl penicillinen und deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass einer mit einem penicillinbildenden Pils beimpften Kulturlösung zu Beginn der Fermentation oder im Laufe der Fermentation portionsweise oder kontinuierlich als Precursor Thienyloxyessigsäuren der allgemeinen Formel
0 - CH2 -COOH
worin R. und R2 Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeuten, bzw. deren Salze, entsprechende Alkohole oder Aldehyde oder funktionelle Derivate dieser Verbindungen zusetzt und aus der Fermentationslösung die entsprechenden Penicilline isoliert.
2) Verfahren genäse Anspruch ., dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung durch fraktionierte Fällung mit einem Salz einer aliphatischen Carbonsäure mit 1-20 Kohlenstoffatomen aus dem Extraktionsmittel erfolgt, wobei die Sa" in fester Form oder vorzugsweise gelöst in einem niederen aliphatischen Alkohol oder Keton eingesetzt werden können.
3) Thienyloxymethyl-penicilline der allgemeinen Formel
/\ /CH3 0 - CHn - CO - NH - CH - CH
: ' A- c-co
cooH
und deren physiologisch verträgliche Salze, worin B^ und für Wasserstoff oder eine Methylgruppe stehen.
BAD ORIGINAL
Art.'7§iAbs,2 Nr. 1 Sat*3desXnderungsge3.v.4.9.19e3iii
09803/1117
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