AT261111B

AT261111B - Verfahren zur Herstellung von neuen aliphatischen und araliphatischen Mercapto phenoxymethyl penicillinen

Info

Publication number: AT261111B
Application number: AT596264A
Authority: AT
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1963-07-13
Filing date: 1964-07-10
Publication date: 1968-04-10

Description

Verfahren zur Herstellung von neuen aliphatischen und araliphatischen Mercapto-phenoxymethyl-penici11inen
Seit festgestellt wurde, dass die Zugabe von Phenylessigsäure als sogenannte Precursor-Substanz zu einer Kulturlösung mit Penicillium chrysogenum die Bildung eines bestimmten Penicillins, des Penicillin G, besonders fördert, wurden verschiedentlich Versuche unternommen, Penicilline mit andern als den bekannten Eigenschaften durch Zugabe von verschiedenartigen Precursor-Substanzen herzustellen.

Zunächst haben Behrens und Mitarb. (J. Biol. Chem. 175, 751,765, 771,793 [1948] ; J. Am. Chem.

Soc. 70,2837, 2843,2849 [1948]) verschiedene Precursorsgeprüft ; die Salze einiger neuer Penicilline (z. B. Phenoxymethyl-penicilIIn, Phenyl-mercapto-methyl-penicillin, Ttüenyl-penicillinu. a.) sind Gegenstand der USA-Patentschriften Nr. 2,479, 295, Nr. 2,479, 296, Nr. 2,479, 297, Nr. 2,562, 408, Nr. 2,562, 410, Nr. 2,623, 876 und Nr. 2,562, 411 sowie der brit. Patentschrift Nr. 643,514.

Über die Befunde von Behrens und Mitarb. hinaus machten Brandl und Margreiter (Österr. Chemiker-Zeitung Band 55 [1954] 11) die Feststellung, dass sich das Phenoxy-methyl-penicillin (von ihnen Penicillin V genannt) als freie Säure kristallisieren lässt und eine weitgehende Säurestabilität aufweist. Es eignet sich daher gut für orale Applikationen (vgl. Wiener Med. Wochenschrift 33/34,602 und österr.

Patentschriften Nr. 178692 und Nr. 181689).

Ein anderes, weitgehend säurestabiles Penicillin, das p-Kresoxymethylpenicillin, kann man durch Zugabe von p-Kresoxyessigsäure gewinnen (USA-Patentschrift Nr. 2,756, 226).

Nach der brit. Patentschrift Nr. 916,488 wird mit 4-Fluor-phenylmercapto-essigsäure als Precursor ein 4-Fluorphenylmercaptomethylpenicillin erhalten, das besonders gegenüber gram-negativen Mikroorganismen wirksam ist.

Es wurde nun gefunden, dass bei Verwendung der bisher nicht bekannten Alkyl- oder Aryl-mercaptophenoxyessigsäuren oder ihrer Salze, der entsprechenden Alkohole bzw. der funktionellen Derivate dieser Verbindungen als Precursors neue Penicilline der Formel
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worin R ein gegebenenfalls durch einen Phenylrest substituiertes Alkyl oder Alkenyl bedeutet, gebildet werden. Als Alkylgruppen kommen vorzugsweise gerad-oder verzweigtkettige Reste mit 1-8 C-Ato- men, z. B. Methyl, Äthyl, n-Propyl, t-Butyl und n-Octyl in Frage.

Die Alkylgruppe kann auch gegebenenfalls zusätzlich zu den oben genannten Substituenten Doppelbindungen enthalten ; als Beispiele seien Vinyl, Allyl und Cinnamyl erwähnt.

Die Alkyl-bzw. Alkenylgruppen können als Substituenten Phenylgruppen tragen.

Weiterhin wurde gefunden, dass die neuen Precursoren gegenüber dem Pilz nur eine geringe Toxizität aufweisen, so dass die Zugabe zu Beginn der Fermentation, oder portionsweise oder kontinuierlich während der Fermentation erfolgen kann. Die Zugabe kann dabei so reguliert werden, dass der PHWert der Kulturlösung im Laufe der Fermentation zwischen 5,5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,4 und 6,8, gehalten wird. Die Isolierung des betreffenden Penicillins erfolgt in an sich bekannter Weise nach Abbruch der Fermentation durch Extraktion aus der filtrierten Kulturlösung. Das Kulturfiltratwird nach Ansäuern auf PH 2-3 mit Butylacetat extrahiert ; aus diesem wird das Penicillin in eine Pufferlösung, vorzugsweise Phosphatpuffer, bei PH 7, 0 übergeführt und aus diesem wieder nach Ansäuern mit Butylacetat extrahiert.

Die endgültige Fällung erfolgt mit Alkalimetall-, Erdalkalimetall-oder Ammoniumverbindungen oder mit organischen Basen bzw. deren Salzen, die in gelöster Form oder als Suspension zugegeben werden. Unter" Verbindungen" werden vornehmlich Salze, Hydroxyde und Alkoholate verstanden. Besonders bewährt haben sich die Salze organischer Säuren, namentlich aliphatischer und cycloaliphatischer Carbonsäuren wie Essigsäure und Äthylhexancarbonsäuren, und unter diesen wieder in erster Linie die Na-und K-Salze. Auch organische Basen oder deren Salze lassen sich verwenden, da die entstehenden Penicillinsalze in vielen Fällen den Vorteil der schwereren Löslichkeit besitzen. Unter organischen Basen werden dabei solche verstanden, die ausreichend basischen Stickstoff enthalten, z. B.

Procain,
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lendiamin, Tetracyclin und andere Amine, welche zur Salzbildung mit Penicillin G und V verwendet werden können. Ausserdem kann man die Salze der erfindungsgemäss hergestellten Penicilline auch dadurch erhalten, dass man ein durch Ausfällung erhaltenes Salz durch doppelte Umsetzung mit einer der oben genannten Verbindungen in das gewünschte Verfahrenserzeugnis überführt.

Die Fällung kann auf einmal oder fraktioniert erfolgen. Die Abtrennung des nicht verbrauchten Precursors ist dabei einfacher als die Abscheidung der Phenoxyessigsäure bei der Herstellung von Penicillin V. Wenn notwendig, kann aus Aceton-Wasser umkristallisiert werden.

Die Verbindungen können auch als freie Säuren in Substanz gewonnen werden, u. zw. entweder durch Ansäuern wässeriger Lösungen der Salze oder durch Einengen aus organischen Lösungsmitteln.

Die hergestellten Penicilline weisen eine weitgehende Säurestabilität auf. Ihr mikrobielles Wirkungsspektrum unterscheidet sich von dem der bisher bekannten Penicilline : Die hergestellten Penicilline sind besonders wirksam gegen Strepto- und Staphylococcen und haben nahezu keine Wirkung auf gram-negative Bakterien, schonen also bei oraler Anwendung die Darmflora. Die neuen Penicilline sind in Form der freien Säuren oder deren Salze anwendbar.

Beispiel l : Von einer sterilen Nährlösung der Zusammensetzung
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<tb>
<tb> 20 <SEP> g <SEP> Rohrzucker
<tb> 10 <SEP> g <SEP> Ca-Carbonat
<tb> 76 <SEP> g <SEP> Cornsteep-Liquor
<tb>
mit Wasser auf 1000 miaufgefüllt, wurden 80 ml in einen 300 er Erlenmeyer-Kolben gegeben, mit Sporen von Penicillium chrysogenum beimpft und 48 h bei 250 C geschüttelt. Von dieser als Vorstufe bezeichneten Kultur wurden 3 ml auf 50 ml einer sterilen Hauptstufenlösung (Zusammensetzung : 55 g Lactose, 50 g Cornsteep-Liquor, 7 g prim. Kaliumphosphat, 10 g Calciumcarbonat, 3 g Magnesiumsulfat, mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt) übergeimpft und bei 250 C geschüttelt. Nach 24 h wurden 125 mg K - Salz der 4-Methylmercapto-phenoxyessigsäure als Precursor zugegeben.

Nach weiterem 96 stündigem Schütteln wurden 1080 E säurestabiles Penicillin pro ml Lösung gefunden.

Beispiel 2 : Eine sterile Vorstufenlösung (Zusammensetzung : 2, 0 g Rohrzucker, 7, Og Cornsteep- Liquor, 1, 0 g fette Öle, 1, 0 g Calciumcarbonat in 100 ml HO) wurde mit Sporen von Penicillium chrysogenum beimpft und 26 h bei 250 C geschüttelt. Mit dieser Kulturlösung wurde ein Vorfermenter (sterile Nährlösung : 7,4 kg Rohrzucker, 28 kg Cornsteep-Liquor, 3,7 kg Ca-Carbonat, 3,7 l fette Öle, 370 l Wasser) beimpft und unter intensivem Rühren und Belüften 36 h bei 250 C fermentiert. Darauf
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Cornsteep-Liquor, 12,75 kg Ca-Carbonat, 17,7 kg prim.

K-Phosphat, 4,94 kg Mg-Sulfat, 6,25 l fette Öle mit Wasser auf 2500 l aufgefüllt), die bei 250 C unter intensivem Rühren und Belüftung fermentiert wurde. Nach der 24., 36., 48., 60., 72., 84., 96., 108., 120. und 132. Stunde wurden je500gK-Salze der 4-Methylmercaptophenoxyessigsäure, gelöst in 81 Wasser, als Recursor zugegeben. Nach 160 h Fer-
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de das 4-Methylmercapto-phenoxymethylpenicillin mit 500 l Butylacetat bei PH 2 extrahiert, aus der organischen Phase in 48 1 einer K-Na-phosphat-Pufferlösung vom pH 9 übergeführt und diese wieder mit 251 Butylacetat bei pH 2 extrahiert.

Aus der Butylacetat-Phase wurde, nach Trocknen mit 3,5kg wasserfreiem Natriumsulfat, durch Zugabe von insgesamt 6100 ml einer 20%igen Lösung von wasserfreiem Kaliumacetat in Methanol 3112 Millionen Einheiten 4-Methylmercapto-phenoxymethylpenicillin als K-Salz isoliert.

Aussehen : farblose, kurze Nadeln, die oft fächerförmig verwachsen sind und bei zirka 243-245 C unter Aufschäumen schmelzen.

Elementaranalyse : C17H19O5N2S2K (Mol.-Gewicht 434,59)
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IR-Spektrum : Eine kennzeichnende schmale, kräftige Bande bei 1765 K, die dem ss-Lactamring zugeordnet wird, gemessen im KBr-Pressling. Stärkere Banden, die im IR-Spektrum der Kaliumsalze von Penicillin G und Penicillin V fehlen und das neue Penicillin von diesen unterscheiden : 1883, 1509,1275, 1006,967, 965,840 K.

UV-Spektrum : flache Bande bei 245 - 260 mou (Maximum bei zirka 253 mali), gemessen in Wasser (20 mcg/ml).
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cus aureus ATCC 6538 P) : 1369 E/mg.

Säurestabilität (1 h bei PH 2 in HCI-Glycocoll-Puffer) : 1310 E/mg.

Löslichkeit : Leicht löslich in Wasser, mässig löslich in Methanol, schwer löslich in höheren Alkoholen, Äther, Aceton, Äthyl- und Butylacetat, Benzol, Alkanen und chlorierten Kohlenwasserstoffen.

Beispiel 3 : Nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhält man bei Zugabe von 125 mg 4-Methylmercapto-phenoxy-äthanol als Precursor 249 Einheiten säurestabiles Penicillin/ml.

Beispiel 4 : Nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhält man bei Zugabe von 125 mg 4-Allylmercapto-phenoxyessigsäure als Precursor 370 Einheiten säurestabiles Penicillin/ml.

Beispiel 5 : Nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhält man bei Zugabe von 125 mg 4-Hexylmercapto-phenoxyessigsäure als Precursor 143 Einheiten säurestabiles Pnicillin/ml.

Beispiel 6 : Nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhält man bei Zugabe von 125 mg 4-(3'-Phenyl)-allylmercapto-phenoxyessigsäure als Precursor 140 Einheiten säurestabiles Penicillin/ml.

Beispiel 7 : Nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhält man bei Zugabe von 50 mg 4-Methylmercapto-penoxyessigsäure-äthylester als Precursor 640 Einheiten säurestabiles Penicillin pro ml.

Beispiel 8 : Nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhält man bei Zugabe von 125 mg K-Salz der 3-Methylmercapto-phenoxyessigsäure als Precursor 176 Einheiten säurestabiles Penicillin pro ml.

Beispiel 9 : Nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhält man bei Zugabe von 50 mg 3-Methylmercapto-phenoxyessigsäurechlorid als Precursor 194 Einheiten säurestabiles Penicillin/ml.

Beispiel 10 : In einem Vergleichsversuch wurde zu einer nach Beispiel 1 hergestellten Kulturlösung kein Precursor zugegeben. Es wurde kein säurestabiles Penicillin gebildet.

Beispiel 11 : 4,35 g Kaliumsalz des 4-Methylmercapto-phenoxymethyl-penicillins werden in 20 ml Wasser gelöst und mit einer Lösung von 1, 80 g N, N'-Dibenzyl-äthylendiamin-diacetat in 50 ml Wasser versetzt. Es erfolgt eine schneeweisse Fällung des N, N'-Dibenzyl-äthylendiaminsalzes, das kurze Zeit gerührt, dann abgesaugt und mit 50 ml Wasser gewaschen wird. Man trocknet imVakuum bei Raumtemperatur über CaCl und erhält 5,30 g eines weissen Salzes, das bei zirka 1180 C schmilzt.

Biologischer Test : 1015 E/mg
Das IR-Spektrum zeigt unverändert die starke Bande bei 1765 K, die dem I3-Lactamring zugeord-

net wird.

B eispiel 12 : 4, 35 g Kaliumsalz des 4-Methylmercapto-phenoxymethyl-penicillins werden in
20 ml Wasser gelöst und unter Rühren mit einer Lösung von 2, 46 g 3, 3-Diphenyl-propep- (2) -amin-hydro- chlorid in 90 ml Wasser versetzt. Der entstehende weisse Kristallbrei wird mit 50 ml Wasser versetzt, abgesaugt und dieFällung mit 100 ml Wasser gewaschen. Man erhält das3, 3-Diphenylpropen- (2 -ammo- niumsalz des 4-Methylmercapto-phenoxymethyl-penicillins in Form farbloser Nadelbüschel. Nach
Trocknen im Vakuum bei Raumtemperatur über CaCl2 beträgt die Ausbeute 6, 67g ; die Substanz schmilzt unter Zersetzung bei zirka 1300 C.

Biologischer Test : 960 E/mg
Das IR-Spektrum weist die typische ss-Lactam-Bande bei 1765 K auf.

Beispiel 13 : In der unter den Beispielen 11 und 12 angegebenen Weise werden äquimolare Mengen von4-Methylmercapto-phenoxymethyl-penicillin-kaliumsalz und 4- Methylaminoaceto- brenzcatechinhy- drochlorid in wässeriger Lösung zusammengegeben. Man erhält das in Wasser schwerlösliche4-Methylammonium-acetobrenzcatechinsalz des 4-Methylmercapto-phenoxymethyl-penicillins als schneeweisse, feinkristalline Substanz, die bei zirka 1350 C zu sintern beginnt und sich allmählich zersetzt.

Biologischer Test : 908 Efmg
Im IR-Spektrum ist deutlich die ss-Lactam-Bande bei 1765 K zu erkennen.

Beispiel 14 : 5, 0 g Kaliumsalz des 4-Methylmercapto-phenoxymethyl-penicillins werden in 80 ml Wasser gelöst und unter Kühlung 2 n Salzsäure zugetropft, bis ein pH-Wert von 2,5 erreicht ist. Dabei fällt die freie Säure des Penicillins in Form feiner Öltröpfchen aus, die nachkurzem Anreiben in eine weisse kristalline Fällung übergehen. Nach Absaugen, Nachwaschen mit 200 ml Wasser und Trocknen erhält man 4,3 g 4-Methylmercapto-phenoxymethyl-penicillin mit einer biologischen Aktivität von 1414 E/mg. Das IR-Spektrum zeigt die ss-Lactam-Bande leicht verschoben bei 1690 K, daneben die C = 0-Bande der freien Carboxylgruppe bei 1640 K.

Die Herstellung der erfindungsgemäss als Precursor in Betracht kommenden Verbindung kannz. B. durch Umsetzung von Alkyl- oder Arylmercapto-phenolen mit Halogenessigsäuren oder deren funktionellen Derivaten, beispielsweise von Estern oder Salzen bzw. mit Halogenacetaldehyden, vorzugsweise in acetalisierter Form bzw. mit ss-Halogenäthanolen in Gegenwart von Basen vorgenommen werden.

Claims

PATENTANSPRUCH : 1. Verfahren zur Herstellung von neuen aliphatischen undaraliphatischenMercapto-phenoxymethyl- penicillinen der allgemeinen Formel EMI4.1 und deren Salzen, worin R für eine Alkyl oder Alkenylgruppe steht, die auch durch einen Phenylrest EMI4.2 beimpften Kulturlösung zu Beginn der Fermentation oder im Laufe der Fermentation portionsweise oder kontinuierlich entsprechende Mercapto-phenoxy-essigsäuren bzw. deren Salze oder funktionelle Säurederivate, wie Säurechloride oder Ester, sowie entsprechende Alkohole als Precursor zugesetzt werden und aus den Fermentationslösungen die entsprechenden neuen Penicilline isoliert werden.