JPH05508184A - ヘパリン誘導体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ヘパリン誘導体およびその製造方法 技術分野 本発明は虚血性心臓病および関連の血管障害の治療用のヘパリン誘導体およびそ の製造方法に関する。 背景 ヘパリンは豚からの腸粘液または牛からの肺から大規模に純粋培養される硫酸塩 含有多糖類である。標準の牛のヘパリンに関する平均分子量は９，０００より多 くかつ豚の標準分子量は１２，０００より多い。伝統的に、ヘパリンの臨床使用 はその抗凝固およびアンチトロンビン特性と関連付けられていた（ジョーペス・ アール著、１９４６年、血栓症の治療におけるヘパリン、再版、オックスフォー ド・メディカル・パブリケーションズ）。 ヘパリンは犬の冠状側副発育を促進させること（フジタエム、ミクニャ　ニー、 タカハシ　エム、ガデイスアール、ハートレイ　ジェイ、マツクノウン　デー及 びフランクリン　デー著、１９８７年、ジャパニーズ・サーキュレーション・ジ ャーナル、第５１頁、第３９５頁乃至第４０２頁）及び運動アンギナを有する患 者の側副循環を改善すること（フジタ　エム、ササヤマ　ニス。 アサノイ　エッチ、ナカジマ　エッチ、サカイ　オー及びオヒノ　ニー、１９８ ８年、サーキュレーション、第７７頁、第１０２２頁乃至第１０２９頁）も見出 された。 Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、第４４頁、第２５０頁乃至第２５３頁においてエラ カー　イー　イー・及びグロスピー（１９２９年）により認められた「ヘパリン の抗補助体力」および実験的な傷に追随するヘパリン注入が滑らかな筋肉細胞の 増殖を抑制したネイチャー第２６５巻、６２５−６２６におけるクローウィズ　 ニー　ダブリュー及びカルノブスキー　エム　ジエイ（１９７７年）による発見 のごとき他の作用はそれぞれ補助活性および滑らかな筋肉細胞増殖と関連付けら れる炎症または動脈硬化に関連付けられる病気の治療のためのヘパリンの広範な 使用を導かなかった。出血の危険が非アンチトロンビン指示におけるヘパリンの 臨床使用の主たる制限であると見做された。 ヨーロッパ特許出願第２８７４７７号明細書は低分子量を有するヘパリン製品を 開示しかつこの発明は過沃素酸塩によるヘパリンの酸化およびこの方法において 得られた低分子量ヘパリンに関する従来技術の良好な観察を示す。本明細書にお いてこの発明を参照する。 ヨーロッパ特許出願第２８７４７７号明細書において、豚の腸粘膜から得られた ヘパリンがｐＨ１１以上で強力な塩との処理により解重合に追随されるｐＨ５で の過沃素酸塩との処理を受けかつ次いで還元剤により還元されるとき、４８００ 〜９０００Ｄａの間に分布されたその分子量およびＨＰＬＣにより決定されるよ うな５５００〜６０００Ｄａのピーク分子量を有する低分子量へバリンが得られ ることが示された。この低分子ヘパリンは生理組織の調整に使用する。 ヨーロッパ特許出願第２８７４７７号の発明に対応する低分子量ヘパリン（ヘパ リン破片）が冠状側副発育を顕著に促進しないことを見出した。しかしながら、 硫黄含量を高めた標準のヘパリンに等しいかまたはそれより大きい分子量の新規 なヘパリン誘導体が冠状側副発育の増加のごとき標準のヘパリンの価値ある生理 学的な特性を保持することを見出した。加えて、ヘパリン自体に関してより我々 の新規なヘパリン誘導体に関して出血時間についての非常に小さい作用を説明し た。更にまた出血時間が延長されない投与量においてその新規なヘパリン誘導体 の潜在アンチトロンビン活性を示した。かくしてその新規なヘパリン誘導体はヨ ーロッパ特許出願第２８７４７７号に要求された製品より優れかつ例えば、経皮 トランスルミナール血管形成術（ＰＴＣＡ）後のレステノシスを防止するために 、アンギナおよび関連の血管障害のごとき虚血性心臓病の治療用の有用な薬剤を 構成する。 虚血性心臓病を病んでいる患者は一般に心臓内の動脈の狭窄を示す。冠状動脈の 管腔の進行する狭窄はアンギナの症状かつ最後にしばしば心筋梗塞（Ｍ　Ｉ　） を引き起こす。滑らかな筋肉細胞（ＳＭＣ）の過度の非制御成長は冠状血管の進 行する狭窄に主要な貢献を構成する。心筋梗塞を促進する狭窄血管の最終閉鎖は 血栓の形成によす非常にしばしば発生される。血栓形成はそれらにより狭窄動脈 の硬化表面により活性化される凝固および補体組織の活性により誘発される。狭 窄血管により供給される心臓のこれらの部分への減少された血流かつしたがって 減少された酸素供給に対する自然の防衛機構として、新たな血液供給路が幾らか の患者にゆっくり発育するが、一方他の患者においては実際にはほとんどない。 心臓の酸素不足（虚血性）区域へのこれらの新たな血液供給路は側副と呼ばれか つ新たな血管の形成の方法は脈管形成と呼ばれる。新たな路は小さいかまたは大 きい血管にすることができる。ここではそれらは側副として一纏めにして言及さ れている。ヘパリンが冠状側副発育についての刺激作用および脈管形成の方法な らびにＳＭＣ増殖についての抑制的な作用および血栓形成についての防止作用を 有することが示されている。しかしながら、虚血性心臓病におけるヘパリンの一 般的な使用の主たる障害は標準のヘパリンを使用する治療に関連付けられる出血 の危険である。 発明の開示 本発明は冠状側副形成を高め、ＳＭＣ増殖を禁止しかう出血に関連して危険なし に血液中に抗凝固活性の低いレベルを維持しかくして虚血性心臓病、例えば狭心 性および関連の血管障害における治療に適する新規なヘパリン誘導体を記載する 。関連の血管障害の例はレステノシスを防止するために経皮トランスルーミナル 冠状血管形成術（ＰＴＣＡ）方法を有している患者の治療である。 図面の簡単な説明 第１図はＨＰＬＣによるゲル浸透クロマトグラフィであり、 １は牛の肺からのヘパリン、 ２は過沃素酸塩酸化後の牛の肺からのヘパリン、３は過沃素酸塩酸化、水酸化ナ トリウムによる解重合およびホウ化水素ナトリウムによる還元後の牛の肺からの ヘパリン、 ４は過沃素酸塩酸化、水酸化ナトリウムによる解重合、ホウ化水素ナトリウムに よる還元および分別（ヘパリン誘導体１）後の牛の肺からのヘパリンを示してい る。 第２図はＨＰＬＣによるゲル浸透クロマトグラフィであり、 ３は過沃素酸塩酸化、水酸化ナトリウムによる解重合およびホウ化水素ナトリウ ムによる還元後の牛の肺がらのヘパリン、 ５は過沃素酸塩酸化、水酸化ナトリウムによる解重合およびホウ化水素ナトリウ ムによる還元後の豚の腸粘膜からのヘパリンを示す。 第３図はＨＰＬＣによるケル浸透クロマトグラフィであり、 ６は豚腸粘膜からの標準ヘパリン、 ７は硫酸化、過沃素酸塩酸化、水酸化ナトリウムによる解重合およびホウ化水素 ナトリウムによる還元後の豚腸粘膜からの標準ヘパリン、 ８は硫酸化、過沃素酸塩酸化、水酸化ナトリウムによる解重合およびホウ化水素 ナトリウムによる還元および分別（例５）後の豚腸粘膜からの標準ヘパリンを示 す。 第４図はヘパリン誘導体１　（１０’ｍｇ／　ｋ　ｇ）の皮下投与後の犬の抗Ｆ Ｘａ活性を示す。抗ＦＸａ活性はベルグビスト等（１９８３）、Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｒｅｓ、３２゜３８１−３９１により決定された。 第５図はヘパリン誘導体１　（１０ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与後の犬のＡＰＴＴ活 性を示す。ＡＰＴＴ活性はティエン等（１９７５）、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、７ ，７７７−７７８により決定された。 第６図は標準ヘパリンによる冠状側副の発育を示し、ヘパリン誘導体１は分子量 ４８００の低分子量ヘパリン（ヘパリン部片）および非処理の制御を示す。ヘパ リン誘導体１またはヘパリンの存在においてのみ冠状側副発育の増加が実施され た閉鎖の数において統計的に顕著な（ｐ＞０．０５）増加として示すことができ る。 第７図は標準ヘパリン（３，６ｍｇ／ｋｇ）またはヘパリン誘導体１（１０ｍｇ ／ｋｇ）で皮下注射により治療された犬の血液中のりｍ−ホワイト凝塊時間の延 長を示す。ヘパリン誘導体１　（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与はヘパリンに関してよ り３倍大きかったけれども凝塊時間の延長はより少なく表明された。 発明の説明 本発明は、 標準ヘパリンに等しいかまたはそれより大きい分子量を有し、 開始ヘパリンの硫黄含量に等しいかまたはそれより大きいかまたは少なくとも１ ３％ｗ／ｗである硫黄含量を示し、 それが作られる標準ヘパリンの１０％以下の抗ＦＸａ分析評価において抗凝固活 性を有し、 ３〜３５の抗ＦＸａを超えるＡＰＴＴ活性の比を示し、ｉ、Ｖ、投与後ラット追 跡において測定されるようなヘパリンに比較される出血時間の減少された延長を 示し、そして ヘパリンに等しいかまたはそれより良好な冠状側副の発育率の増加を示すことを 特徴とする牛ヘパリンからの新規なヘパリン誘導体に関する。 本発明はさらに、以下の工程、すなわち、暗がりにおける０〜１０’ＣでｐＨ４ 〜５での過沃素酸塩による酸化と、 アルカリによる部分的な解重合と、 ホウ化水素ナトリウムによる還元と、 ゲル浸透クロマトグラフィ、限外濾過、疏水性相互作用クロマトグラフィ、親和 力クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィまたは有機溶媒好ましくはエ タノールの添加による水性溶液からの沈澱を使用することにより得られた生成物 の分別と、 出発材料として使用された標準ヘパリンの分子量より少なくない分子量を有する 生成物を収集する工程からなる新規な牛ヘパリン誘導体の製造方法に関する。　 分別の目的は標準ヘパリンに等しいかまたはそれより高い分子重量の生成物を得 かつまたヘパリンまたは中間生成物におけるより狭い分子量分布を得ることであ る。 本発明はまた、 穏やかな化学的硫酸化と、 暗がりにおけるＯないしｉｏ’ｃでｐＨ４〜５での過沃素酸塩による酸化と、 アルカリによる部分的な解重合と、 ホウ化水素ナトリウムによる還元と、 ゲル浸透クロマトグラフィ、限外濾過、疏水性相互作用クロマトグラフィ、親和 力クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィまたは有機溶媒好ましくはエ タノールの添加による水性溶液からの沈澱と、出発材料として使用されるヘパリ ンの分子量より少なくない分子量を有する生成物を収集することからなる新規な 豚ヘパリン誘導体の製造方法に関する。 本発明はかくして本発明の新規なヘパリン誘導体がまた豚ヘパリンが出発材料と して使用されるとき得られる方法に関する。豚ヘパリンに関して穏やかな硫酸化 は過沃素酸塩による酸化およびそれに続く解重合の前に実施される。この穏やか な硫酸化は豚ヘパリンの合計硫酸塩含量を増強しかつまた過沃素酸塩による酸化 を受け易い非硫酸塩化グルコン酸およびイズロン酸からなるビシナルヒドロキシ ルグループの幾つかを阻止する。この硫酸化はかくしてヨーロッパ特許出願第２ ８７４７７号明細書に記載されたものよりも少ない度合いの豚ヘパリンの解重合 になる。 虚血性心臓病および関連の血管障害の治療および冠状側副局所潅流の発育率の増 強のための薬剤の製造用生成物の使用が要求される。虚血性心臓病および関連の 血管障害の治療および治療投与における生成物の投与による冠状側副の発育率の 増強方法はまた本発明の一部分である。　本発明の１つの態様は本発明の新規な ヘパリン誘導体の分子量である。第６図に示されるように分子量４８００の低い 分子量ヘパリン（ヘパリン部片）は同一投与量において標準ヘパリンと同一の良 好な作用を示さなかった。第６図は冠状側副発育の増強に関して新規なヘパリン の分子量の重要性を示す。 本発明のさらに他の態様は新規なヘパリンの抗ＦＸａ活性が本発明の新規なヘパ リンの製造用の出発材料として使用される標準のヘパリンの活性の１０％以下に 減少されるということである。これは表１に示される。注入可能な等級の標準ヘ パリンに共通して見出される抗ＦＸａ活性は１２０ないしｌ　９０　Ｉ　Ｕ／ｍ ｇである。抗ＦＸａ活性の減少は過沃素酸塩による酸化処理、アルカリ処理およ び還元により発生される。この処理はまた最終生成物の分子量に影響を及ぼす。 かくして過沃素酸塩酸化がｐＨ３で行われるとき生成物の抗ＦＸａ活性は比較的 高く、残された元の活性の２０〜４０％であった。これはまたヨーロッパ特許第 １４１８４−Ｂ号明細書に示されている。しかしながら、７のｐＨが使用された とき、分子量４８００の低分子量ヘパリン（ヘパリン部片）が得られた。かくし て４〜５かつ好ましくは４．５以下のｐＨが本発明の新規なヘパリン誘導体の製 造における過沃素酸塩工程に使用された。 活性化された部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）抗凝固剤分析評価におい て本発明の新規なヘパリン誘導体の活性は抗ＦＸａ分析評価における活性より常 に高い。 ＡＰＴＴ／抗ＦＸａ比は標準ヘパリンにおける０、８〜１．２および多くの低分 子量ヘパリンに関する０、５〜０．０５の比に比べて３〜３５である。 新規なヘパリン誘導体中に見出された犬の生体内の抗凝固剤活性レベルは一般的 な外科における血栓プロフイラキスに臨床的に使用される（これは第３図および 第４図に見られることができる）。本発明の新規なヘパリン誘導体はしたがって またアンチトロンビン潜在能力を有する一方さらに標準ヘパリンに関する望まな い出血副作用特性の損失を有する。アンチスロンビン活性はウサギの生体内で指 示された（表２）。 新規なヘパリンのさらに他の態様は出血時間の延長が出血のいかなる危険もなし に標準のヘパリンより高くかつより有効な投与量で投与されるような本発明の新 規な生成物を許容するため非常に重要である出血時間の延長の減少（これは表１ から見ることができる）である。出血時間の減少された延長によりここでは少な くとも７５％の減少を意味する。 本発明の他の態様は出発材料に使用するヘパリンの硫酸塩含量に等しいかまたは 好ましくはそれ以上である新規なヘパリンの高い硫酸塩含量である。 新規なヘパリンのこの高い硫酸塩含量は、硫酸塩基に富んでいるヘパリン、例え ば牛の肺からのヘパリンを出発材料として使用し、 ヘパリンの非硫酸塩化ウロン酸の半分を除去する記載された過沃素酸塩方法のご とき方法を使用することにより出発ヘパリンの抗凝固剤活性を減少しかくして新 規なヘパリン誘導体中の硫酸塩化されたウロン酸の比率を増加し、 非常に硫酸塩化された成分に関連して新規なヘパリン誘導体を強化する分別方法 を使用することにより得られる。かかる分別方法はナトリウム、カルシウム、亜 鉛またはバリウム塩の水溶液からの生成物を水混和性の溶媒によりかつカルシウ ム、亜鉛およびバリウム塩の場合において、これらの塩をナトリウム塩に変換す る分別後、または疏水性相互作用、カチオン交換または親和力グロマトグラフイ を含むクロマトグラフ法により促進することができる。この分別方法は記載され た過沃素酸塩方法の前または後に実施することができるかまたは両方の技術がと もに使用することができる。親和力クロマトグラフィリガンドの例はセファロー ス（商標）に結合することができるトロンビンである。 本発明の新規なヘパリン誘導体の硫酸塩含量を増強するためのこれらの方法に加 えて化学的硫酸化がさらに同様に硫酸塩含量を増強するために任意に使用するこ とができる。 本発明の生成物の化学的硫酸化は硫酸塩化されている生成物の解重合または劣化 を発生しないように十分に穏やかにされるべきである。例えば二酸化硫黄の複合 体により低温度で乾燥ジメチルフォルミド中に溶解されたそれらのトリブチルア ンモニウム塩およびピリジンまたはトリエチルアミンのごとき有機塩基を処理し かつ次いで過沃素酸塩方法において分別に使用される方法の１つを使用して硫酸 塩化させた生成物を純粋培養かつ純化することにより硫酸塩化されることができ る。ヘパリンの化学的硫酸化はこのように一般に抗ＦＸａ分析評価により測定さ れたようなヘパリン抗凝固剤活性を減少するのでより穏やかな過沃素酸塩方法が 過沃素酸塩方法が単独で使用されるときに比して化学的な硫酸化と組み合わされ るとき使用される。本発明の異なる実施において、製造は、豚ヘパリンに関して 言及された方法である、過沃素酸塩方法により追随される穏やかな部分化学的硫 酸化により開始する。 本発明はかくして虚血性心臓病および関連の血管障害の治療用の新規なヘパリン 誘導体に関する。これらのヘパリン誘導体は、滑らかな筋肉細胞増殖を抑制する 、冠状側副形成を有効に高めるために高い投与量で投与させることができかつそ れらはまた同時に出血の危険なしにアンチトロンビン作用に寄与するプラズマの 抗凝固剤活性の抑制された低レベルを提供することができる。 臨床経験において１日−回のみの皮下注射が例えば臨床アンチトロンビン治療に おいて標準ヘパリンの場合に一般的であるように１日に２〜３回の皮下または静 脈注射に代えて投与することを必要とする。新規なヘパリン誘導体の投与量は皮 下注射によりまたは貯蔵調製により０、　５　＝　１５　ｍｇ／　ｋ　ｇ／日の 範囲にすることができた。 静脈注入または注射が使用され得る。 以丁に新規なヘパリン誘導体の製造の非限定の例を幾つか説明する。 例 例１、ヘパリン誘導体１ 標準の生肝ｌ＼バリン（１００ｇ）、Ｍｗ＝１０．Ｏ○Ｏがナトリウムアセテー トバッファ（２，５リツトル）（０，０５１’ｖＩナトリウムアセテート、０． ２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５，○）内に溶解されかつ４°Ｃに冷却された。ナト リウムアセテートバッファ（２，５リツトル）に溶解された過沃素酸塩ナトリウ ム（１０７ｇ、０．５０モル）が添加されかつ混合物が２日間攪拌された。エチ レングリコール（１００ｍｌ）が過剰過沃素酸塩を破壊するために添加されかつ 混合物が数時間室温で放置された。溶液はセファデックスＧ−１５コラムで脱塩 された。脱塩された生成物を含有する部片は８１ｇ過沃素酸塩酸化ヘパリン供給 して凍結乾燥された。 過沃素酸塩酸化ヘパリンは０．０２Ｍ水酸化ナトリウム（４，２５リツトル）内 に溶解されかつ４０分間室温で放置されかつ次いで２．５時間ホウ化水素ナトリ ウム（４，２５ｇ）で還元された。過剰ホウ化水素が酢酸（２８ｍｌ）で分解さ れた。この溶液は次いでＤＥＡＥ−セファロースコラムでイオン交換クロマトグ ラフィにより分別された。０．７Ｍないし２Ｍの間で抽出した部片が収集されか つ中空ファイバ（アミコンＨ］、　Ｐ　３−２０、カットオフ３０００）を使用 して脱塩された。ヘパリン誘導体は冷たいエタノール（レチンテートの重量の２ ．５倍）の添加により沈澱された。沈諏物は収集されかつ真空中で乾燥され３１ ｇのヘパリン誘導体１を産出した。 元素分析によりＮは２．１％およびＳは１３．５％であった。伝導性滴定により モル比ＳＯ３／ＣＯ２は２゜８２であった。ケル浸透クロマトグラフィにより分 子量は１１０００Ｄａであった。この例において出発材料として使用されるヘパ リンに関してＳは１３％、モル比Ｓ○３／Ｃ○２は２．４７およびゲル浸透クロ マトグラフィによる分子重量は１００００Ｄａであった。抗ＦＸａ活性は、出発 標準ヘパリンに関して、８ＩＩｊ／ｍｇ、ＡＰＴＴ５４　ＩＵ／ｍｇおよびアン チトロンポン活性はそれぞれ１２６　Ｉ　Ｕ／ｍｇ、、ｌ　５１　Ｉ　Ｕ／ｍｇ および１２４ＩＵ／ｍｇに比して４ＩＵ／ｍｇであった。ヘパリン／補助要因Ｉ Ｉ依存アンチトロンビン活性（トレフセン、デーエム等、血液（１９８５）６６ ．７６９−７７４）が研究されかつ出発標準ヘパリンに比してならびに中間の過 沃素酸塩酸化ヘパリンに比してかつ同様に過沃素酸塩酸化、解重合および還元さ れたヘパリンに比して２倍に増加されることが見出された。 例２ 生肝ヘパリン（１００ｇ）が例１に関して酸化され、エチレングリコールが添加 されかつ溶液が中空ファイバ（アミコンＨＩＰ３−２０カットオフ３０００）を 使用して脱塩された。凍結乾燥が７８ｇ酸化ヘパリンを供給した。この材料（４ ，０ｇ）が００１Ｍ水酸化ナトリウム（２００ｍｌ）に溶解されかつ２時間室温 で放置されかつ次いで３時間にわたってホウ化水素ナトリウム（０゜１８ｇ）に より還元された。過剰なホウ化水素は酢酸（５ｍｌ）により分解された。溶液の ｐＨは次いで水酸化ナトリウム（２Ｍ）により６．３に調整された。溶液は限外 濾過により脱塩された。凍結乾燥が３．７ｇの過沃素酸塩酸化、解重合および還 元生成物を供給した。この生成物を分別するためにセファデックスＧ−７５コラ ムでケル浸透クロマトグラフィに従わされ、２００ｇが０．２Ｍ塩化ナトリウム 内に溶解されかつ次いで０．　６５ｍ１／分の量でコラム（５Ｘ８３ｃｍ）を通 された。 高分子量部片が収集されかつ限外濾過により脱塩された。 凍結乾燥が０．３４ｇの新規なヘパリン誘導体を供給した。元素分析によりＳは １４．３％そして抗ＦＸａは７ＩＵ／ｍｇおよびＡＰＴＴは５５ＩＩｊ／ｍｇで あった。 例３ 生肝ヘパリン（２，０ｇ）がナトリウムアセテートバッファ（５０ｍｌ）（０， ０５Ｍナトリウムアセテート０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４，○）内に溶解さ れかっ４°Ｃに冷却された。ナトリウムアセテートバッファ（５０ｍｌ）に溶解 された過沃素酸塩ナトリウム（２゜１４ｇ、１０ｍモル）が添加されかつ溶液が ３日間７゜Ｃで放置された。エチレングリコール（２ｍｌ）が過剰過沃素酸塩を 破壊するために添加されかつ溶液が１時間室温で放置され、限外濾過（アミコン Ｙ　Ｍ　２　）により脱塩された。レテネートがｐＨ６，５に中和されかつ凍結 乾燥が１．７８ｇの過沃素酸塩酸化ヘパリン供給して凍結乾燥された。過沃素酸 塩酸化ヘパリンが０，０１Ｍ水酸化ナトリウム（８０ｍ　ｌ　）内に溶解されか つ２時間室温で放置され、次いで３時間ホウ化水素ナトリウム（８０ｍ　ｇ　） で還元された。過剰ホウ化水素が酢酸（２ｍ　ｌ　）で分解され、ｐＨ６，５Ｉ に中和されそしてカットオフ８０００Ｄａを有する膜を使用して限外濾過により 分別された。限外濾過器に維持された高分子量部片が凍結乾燥された。元素分析 によりＳは１３．５％、抗Ｆ　Ｘ　ａは５ＩＵ／ｍ、ｇおよびＡＰＴＴは２６Ｉ Ｕ／ｍｇであった。 例４、ヘパリン誘導体２ ヘパリン誘導体１　（１００ｇ、５＝１３．５％）が水（２０ｍｌ）内に溶解さ れかつカチオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０水素形式において）（２ Ｘ２Ｑｃｍ）を通されそして水（８０ｍｌ）とともに抽出された。溶出物がトリ ーｎ−ブチルアミン−エタノール１：９（１１ｍｌ）でｐＨ５，８に゛中和され そしてジエチルエーテル（２ｘ６０ｍｌ）とともに抽出された。水性層が凍結乾 燥されかつ次いで真空中で乾燥された。乾燥生成物は乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチルフォ ルムアミド（１５ｍｌ）中に溶解されそして三酸化硫黄トリエチルアミン複合体 （３，０ｇ）が添加された。溶液は３日間室温で維持され、次いでエタノール（ １５０ｍｌ）に溶解された３％ナトリウムアセテートに注入された。混合物が遠 心分離されかつ沈澱物がエタノール（２Ｘ２０ｍｌ）で水洗され、２Ｍ塩化ナト リウム内に溶解されかつ限外濾過（アミコンＹＭ２、カットオフ１０００）され た。レチンテートが水で洗浄されかつ次いでカチオン交換樹脂（アンバーライト ＩＲ−１２０、水素形式）を通されかつ水とともに抽出された。溶出物がＯ，１ Ｍ水酸化ナトリウムによりｐＨ６，２に中和されかつ０．８８ｇを産出するよう に凍結乾燥した。元素分析は１５．７％のＳの含量を示した。カス・ビー及びゲ ナロ・エッチ（１９７５）、炭水化物Ｒｅ　ｓ、３９，１６８−１７６による伝 導性滴定によるモル比Ｓ○３　／ｃ○２は３．９２であった。ゲル浸透クロマト グラフィによる分子重量はｌ１００ＯＤａであった。抗ＦＸａ活性は３ＩＵ／ｍ ｇそしてＡＰＴＴ活性は１０２ＩＵ／ｍｇであった。 例５ 豚粘膜ヘパリン（５，Ｏｇ、１１．３％Ｓ）が水（７５ｍ１）内に溶解されかつ カチオン交換樹脂（ダウエックス５０ＷＸ８水素形式において）（２，５Ｘ２４ ｃｍ）を通されそして水（１５０ｍｌ）とともに抽出された。 溶出物がトリーｎ−ブチルアミン−エタノール１：９（５０ｍｌ）でｐＨ５，５ に中和されそしてジエチルエーテル（２Ｘ１５０ｍｌ）とともに抽出された。水 性層が７．５６ｇの生成物を産出するように凍結乾燥された。 トリブチルアンモニウム塩（０，５０ｇ）が真空中で乾燥されそして乾燥Ｎ、Ｎ −ジメチルフォルムアミド（５ｍ　ｌ　）中に溶解されそして二酸化硫黄トリエ チルアミン複合体（０，１５ｇ）が添加された。溶液は１８時間室温で維持され かつ次いでエタノール（４５ｍｌ）に溶解された３％ナトリウムアセテートに注 入された。混合物が遠心分離されかつ沈澱物がエタノール（２Ｘ３０ｍｌ）で水 洗され、２Ｍ塩化ナトリウム内に溶解されかつ限外濾過（アミコンＹＭＩ、カッ トオフ１０００）された。 レチンテートが水で洗浄されかつ０．３２ｇを産出するように凍結乾燥された。 硫酸塩化ヘパリン（０，２０ｇ）がナトリウムアセテートバッファ（５ｍｌ）（ ○、ＯｂＭナトリウムアセテート、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５，０）内に 溶解された。ナトリウムアセテートバッファ（５ｍｌ）に溶解された過沃素酸塩 ナトリウム（２１４ｍｇ、１ｍモル）が添加されかつ溶液が１日間＋８°Ｃで放 置された。エチレングツコール（０，５ｍ　ｌ　）が活力Ｕされかつ混合物が数 時間室温で放置され、次いで溶液が限外濾過により脱塩された。過沃素酸塩酸化 ヘパリンがＯ，１Ｍ水酸化ナトリウム内に溶解されかつ２時間室温で放置されか つ次いでホウ化水素ナトリウム（１４ｍｇ）で還元された。 過剰ホウ化水素が酢酸（０，２ｍ１）で分解された。この溶液がＤＥＡＥ−セフ ァロースコラムでイオン交換クロマトグラフィにより分別された。０．７Ｍない し２Ｍの間で抽出した部片が収集されかつさらにカットオフ１０００Ｄａを有す る膜を使用して限外濾過により分別された。レチンテートがｌｏｏｍｇを産出す るように凍結乾燥された。元素分析によりＳは１３．８％であった。 化学的および生物学的試験 分子量分布 第１図は請求された方法に従って牛の肺から生成されたヘパリンの化学的処理お よび分別後のＨＰＬＣ（スダハルター・ジエイ等、　（１９８９）　、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、６８９２−６８９７による）によるゲル浸透クロマトグラフィ での分子量分布を示す。 牛の肺から生成された臨床に使用されるヘパリン（第１図の曲線１）がｐＨ４な いし５で過沃素酸塩で酸化されたとき第１図の曲線２による分布が得られた。ホ ウ化水素ナトリウムによる還元がそれに続く解重合を行うための強力な塩基によ る処理後思いがけなく出発生肝ヘパリン（第１図の曲線１）に比して分子量分布 （第１図の曲！ａ３）の非常に小さな移動を示した生成物が得られた。 それに反して、同一の方法により豚ヘパリンから得られた生成物は分子量分布の かなりの移動を示した。曲線５を第２図の曲線３と比較。曲Ｍ５に見られる低い 分子量への移動は低分子量ヘパリンを示すヨーロッパ特許出願第２８７４７７号 明細書に示された分子量分布の減少と同様であった。 第３図は豚ヘパリンに関する請求された方法に従う豚の腸粘膜から生成されたヘ パリンの化学的処理および分別後ＨＰＬＣ（スダハルター・ジエイ等、　（１９ ８９）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４．６８９２−６８９７による）による ゲル浸透クロマトグラフィでの分子量分布を示す。 臨床使用のヘパリンが硫酸化され、過沃素酸塩酸化され、水酸化ナトリウムによ り解重合されかつホウ化水素により還元される豚の腸粘膜（第３図の曲線６）か ら生成されたとき第３図の曲線７による分布が得られた。ホウ化水素による還元 がそれに続く解重合を行うための強力な塩基による処理後思いがけなく豚の腸粘 膜（第３図の曲線６）から生成された出発ヘパリンに比して分子量分布（第３図 の曲線８）の非常に小さな移動を示す生成物が得られた。 これは種々の生成物が異なる種類からの臨床ヘパリンが過沃素酸塩酸化およびア ルカリ解重合の同一方法に関して出発材料として使用されるとき得られたことを 示す。 第１図の曲線３に示した生成物はさらに第１図の曲線４に示される分子量分布の 新規な生成物を付与するために例１により分別に従わされる。本発明の新規なヘ パリンを付与するための他の分別方法は例２および３に記載されている。 アンチファクターＩＩａ強化活性の決定新規なヘパリン誘導体のアンチファクタ ーＩＩａ強化活性はアンチトロンビンと複合体を形成する装置において決定され る。アンチトロンビン−ヘパリン誘導体混合物は１分間フフクターＩＩにより３ ７°Ｃで保温された。 ファクターＩＩａの量はヘパリン誘導体の濃度に比例してアンチトロンビン−ヘ パリン誘導体混合物により中和される。残りのファクターＩＩａ活性は発色体基 板Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を使用して測定さ れた。形成されたｐＮＡの割合がヘパリンに関する第４回国際標準を使用して形 成されたｐＮＡＫ割合に比較された。 動物の抗凝固活性の試験 新規なヘパリン誘導体が２匹のピーグル犬に１０ｍｇ／　ｋ　ｇで投与された。 塩水中で溶液（０，２ｍｌ／ｋｇ）が作られかつ犬の首に皮下で注射された。５ 　ｍ、　１の血液サンプルが０．５ｍｌの０．１３Ｍクエン酸塩ナトリウムを含 有するベノジエクト（商標）を使用して収集された。４つの血液サンプルが９時 間まで］時間ごとに１サンプルにより追随された実験の最初の１時間中に引き出 された。血液サンプルは１０分間室温で保持され、ＡＰＴＴ分析に関して直ちに 取られる、血漿の分離のために遠心分離された。残りのプラズマは抗ＦＸａ活性 の分析　。 まで−２０’Ｃで凍結保持された。抗ＦＸａがベルグクビイスト・デー、ヘンデ ー・ニー、シューディン・イーおよびホルマー・イー（１９８３）トロンビンＲ ｅｓ、。 ３２．３８１−３９１にしたがって実施された。ＡＰＴＴ分析評価はティエン・ ニー・エヌおよびり−・エム（１９７５）、トロンビンＲｅｓ、、７，７７７− ７７８にしたがって実施された。抗Ｆ　Ｘ　ａおよびＡＰＴＴ分析評価における ヘパリン誘導体１に関する結果はそれぞれ第４図および第５図に見られる。抗Ｆ Ｘａ活性は注射後約１時間から犬の血漿中に測定されることができた。 この活性は第４図に示される９時間後いかなる減少も示さなかった。またＡＰＴ Ｔ活性の延長は９時間後まだ存在した（第５図参照）。 第４図および第５図に見られる抗凝固活性のレベルはヘパリンが一般外科におい て血栓症ブロフイラキスに臨床使用されるとき通常認められるレベルを示す。本 発明のヘパリン誘導体はそれゆえまたアントロンビン潜在能力を有する一方標準 ヘバリンに関するさほどでもない望まない出血副作用をまだ有する。活性化部分 トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）抗凝固評価分析において本発明の新規なヘ パリン誘導体は常に抗凝固分析評価における活性より高い。比ＡＰＴＴ／抗ＦＸ ａは標準ヘパリンにおける０、８〜１．２の比に比べて３〜３５になっておりか つ多くの低分子量ヘパリンに関しては０．５〜０．０５になっている。 抗凝固活性に関する血漿濃度（第４図および第５図）はまた長期間（少なくとも ９時間）抗凝固活性の一致したレベルを示すことにおいて標準ヘパリンを超える 利点がある。これは臨床使用において１日１回だけの皮下注射が例えば臨床アン チトロンビン治療において標準ヘパリンの場合に一般的であるような１日に２〜 ３回の皮下または静脈注射の代わりに投与することが必要であることを意味する 。 出血時間試験 デジアナ・イー、カリオニ・ニー、キンタナ・ニー、ゲタノ・ジー、１９７９、 トロンビンＲｅｓ、１５，１９１−１９７によるテンプレート出血時間試験がメ ブマル／ステソリド（デュメツクスＡ／Ｓコペンハーゲン９により麻酔された２ ００〜２５０ｇの重さがあるスプラーゲーダーレイラットにおいて実施された。 テンプレート装置（シンプレート、ゼネラル・ダイグノステクス、デュルハム、 ＮＣ）が大きな静脈を避けるように注意して、尻尾の背側部分に長手方向に適用 された。傷からの出血はその場合に、吸い取り紙により、３０秒毎に慎重に除去 された。最小６匹のラットが各合成物および投与量に使用された。出血時間は瞬 間から測定され、尻尾は最初の出血の抑止まで切られた。出血時間は３０秒の精 度により記録された。２つの出血時間、すなわち、薬剤投与前１０分および薬剤 投与後１０分、が常に各ラットにおいて決定されそして結果は出血時間の延長と して表される。（表１参照） 表１．　ラットにおけるヘパリンの出血時間合成物　抗ＦＸａｌｌ　ＡＰＴＴ＃ 　投与量　出血時間の延長ＩＵ／ｍｇ　ＩＵ／ｍｇ　ｍｇ／ｋｇ　分＃＃標準ヘ パリン　１２６　１５１　２　１２．８ヘパリン誘導体１　８　５４　２　０． ７ヘパリン誘導体２　３　１０２　２　０．５＃　使用された抗凝固分析評価は 動物の抗凝固活性の試験により記載する。 ＃＃　出血時間（ｍｍ）は薬剤投与後１０分およびその前１０分出血時間の差異 として表される。 新規なヘパリン誘導体の出血時間の減少はそれがいがなる出血の危険もなしに標 準ヘパリンより高いかつより有効な投与量で投与されるような本発明の新規な生 成物を許容するため非常に重要である。 動物のアンチトロンビン作用の試験 ヘパリン誘導体１の生体内アンチトロンビン作用がウニスラー兎血栓症モデル（ ウニスラー等、Ｊ、Ａｐｐｌ。 Ｐｈｙｓ　ｉｏｌ、　１４．１９５９．９４３−９４６）において試験された。 兎はアトロピンおよびヒプノーム（商標）により前投薬されかつベンドパルビト ンにより麻酔された。各頚静脈の部分が周囲組織から自由にされかつ支流が縛ら れた。試験合成物は投与量１および３゜５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇで静脈に注射（ 時間Ｏ）された。薬剤投与後１５分で兎の凝固組織は硝子活性化ヒト血漿の静脈 注射によって活性化された。このトロンビン攻撃後正確に３０秒で右頚静脈の２ ｃｍの長さの部分が不活発な血液を達成するために１０分間だけ密封された。部 分が次いで切断されそしてその含量がペトリ皿に注入されかつ目視で検査されそ して血栓症が、もしあるならば、以下に記載される装置によりり評価された。他 の１５分（試験合成物の注入後３０分）後先は新たなトロンビン攻撃を受けかつ 左頚静脈が密封されそして記載されたように検査された。この方法は我々に２つ の場合（投与後１５および３０分）においてヘパリン誘導体ｌのアンチトロンビ ン作用を研究させかっしたがってアンチトロンビン作用の存続時間を評価するこ とができる。ヘパリン誘導体１は各投与量グループにおいて少なくとも６匹の兎 により２回の投与量で評価された。試験合成物のアンチトロンビン活性は以下に 定義される評価装置により評価される。 評価　血管内容物の組成 Ｏ密封された血管部分内にどのような目視可能な繊維素ストランドもない血液を 示す。 １　小さな、目視が困難な繊維素ストランドに等しい。 ２　幾つかの非常に小さい繊維素塊に等しい。 ３　］または２つのより大きな塊に等しい。 ４　純粋培養された血管の鋳型を形成する大きな血栓の形成を示す。 ヘパリン誘導体１のアンチトロンビン活性は０（高いアンチトロンビン）から１ 　（非アンチトロンビン）の範囲にある「アンチトロンビン指数」により説明さ れる。 この指数は非アンチトロンビン基準合成物（生理学的Ｎａｃ１）により得られる 評価である４Ｘｎを有する各投与量グループにおけるトロンビン評価の合計を割 ることにより得られる。ヘパリン誘導体１のアンチトロンビン活性、特別な抗Ｆ Ｘａ活性８ＩＵ／ｍｇが各投与量グループにおいて少なくとも６匹の兎を使用し て３．５および１ｍｇ／ｋｇで試験された。各個の兎に関するアンチトロンビン 評価として表される結果ならびに同一投与量を受容した兎のグループに関するア ンチトロンビン指数が表２に要約されている。 表２．　兎におけるアンチトロンビン活性ｌ田ｇ／ｋｇ　３，２，３，１，３， １，２，１　４，４，４，４，２，１　０．４７　０．７９この実験は出血時間 が延長されない（表１）投与量における請求された新規なヘパリン誘導体のアン チトロンビン活性を非常に明瞭に示す。 滑らかな筋肉細胞についての抗増殖作用本発明の新規なヘパリンは細胞培養にお いて成長されたラットからの動脈中の滑らかな筋肉細胞の成長について抗増殖作 用を示した。細胞増殖の５０％の抑制が細胞培養媒体中の５０μｇ／ｍｌの濃度 により得られた。これは臨床使用の標準へバリンが使用されるとき必要とされる 同一濃度である。 冠状側副発育の増強 本発明の新規なヘパリンによる冠状側副発育の増強はフジタ等、（１９８７）ジ ャパニーズ・サーキュレーション・ジャーナル、５１，３９５−４０２により記 載された方法により検査された。この作業において側副を促進することが知られ ている幾つかの心筋虚血の存在において、ヘパリンが冠状側副の発育を促進した ことが示されている。この発表の実験におけるヘパリンの投与量は二重のり−ホ ワイト凝塊時間として測定された犬の血漿中の抗凝固活性を維持するようなその 能力により決定された。 標準ヘパリン、ヘパリン誘導体１、低分子量ヘパリン（分子量４８００のヘパリ ン部片）の作用および冠状側副の増強についての非処理の制御は第６図に示され ている。ヘパリン誘導体１、またはヘパリンの存在においてのみ冠状側副発育の 増強が必要とされる閉鎖の数における統計的に顕著な（ｐ＜０．０５）減少とし て示されることが可能である。本発明の新規なヘパリン誘導体１がｔｏｍｇ／ｋ ｇ体重の投与量で皮下投与により１日１回投与されたとき冠状側副発育の同一程 度の増強がフジタ等（１９８７）により使用された標準ヘパリンに見られたよう に認められた（第６図参照）。 リーーホワイト凝塊時間の延長 リーーホワイト凝塊時間の延長における統計的に顕著な減少は前に使用されたヘ パリン濃度に比して新規なヘパリン誘導体に関して観察された、第７図参照。（ リーーホワイト凝塊時間試験はクリニカル・インタープレチージョン・オブ・ラ ボラトリ−・テスト、ゴーダル編集（１９５０）ページ３０に記載されている） 。 犬の血液中のりｍ−ホワイト凝塊時間（凝塊時間増加％）の延長は標準ヘパリン （３，６ｍｇ／ｋｇ）またはヘパリン誘導体１　（ｌ　Ｏｍｇ／　ｌ　ｋ　ｇ） による皮下注射により処理した。ヘパリン誘導体１の投与量はヘパリンに関して より３倍大きかったが凝塊時間の延長はそれにも拘わらずより小さかった。 Ｆｉｇｕｒｅ　１゜ Ｆｉｇｕｒｅ　２゜ Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｆｉｇｕｒｅ　４ Ｆｉｇｕｒｅ　５ Ｆｉｇｕｒｅ　６ Ｆｉｇｕｒｅ　７ 要約 本発明は牛または豚のヘパリンからの新規なヘパリン誘導体に関し、該誘導体の ヘパリンに等しいかまたはそれより多い分子量を有し、出発ヘパリンの硫黄含量 に等しいかまたはそれより高いかまたは少なくとも１３％Ｗ／Ｗである硫黄含量 を示し、それが作られた標準ヘパリンの１０％以下の抗ＦＸａ分析評価の抗凝固 活性を有し、３〜３５のＡＰＴＴ活性／抗ＦＸａの活性の比を示し、生体内投与 後のラットの尻尾において測定されるようなそれから作られた標準ヘパリンに比 して出血時間の低減された延長を示し臨床使用のヘパリンに等しいかまたはそれ より良好な犬の冠状側副の発育の割合の増加を示す。 本発明はまた新規な牛および豚のヘパリン誘導体の製造方法に関する。虚血性心 臓病および関連の血管障害の治療および冠状側副潅流の発育の割合の増加用薬剤 の製造のためのこの生成物が使用される。 国際調査報告 ｌ内１ｆｉ＠１１＠＋ｗｌ轟−−１ｅＩＩ１１−１１−ＰＣＴ／５Ｅ９２１００ ２４３１−−１ａ−ａｌａｅ−ｉｃｅ＋−ｍ＆ＰＣＴ／ＳＥ９２１００２４３国 際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）標準ヘパリンに等しいかまたはそれより大きい分子量を有し、 開始ヘパリンの硫黄含量に等しいかまたはそれより大きいかまたは少なくとも１ ３％ｗ／ｗである硫黄含量を示し、 それが作られる標準ヘパリンの１０％以下の抗ＦＸａ分析評価において抗凝固活 性を有し、 ３〜３５の抗ＦＸａ／ＡＰＴＴ活性の比を示し、生体内投与後ラツト追跡におい て測定されるようなヘパリンに比較される出血時間の減少された延長を示し、そ して 臨床使用ヘパリンに等しいかまたはそれより良好な冠状側副の発育率の増加を示 すことを特徴とする牛または豚ヘパリンからの新規なヘパリン誘導体。 ２）以下の工程、すなわち、 暗がりにおける０〜１０°ＣでｐＨ４〜５での過沃素酸塩による酸化と、 アルカリによる部分的な解重合と、 ホウ化水素ナトリウムによる還元と、 ゲル浸透クロマトグラフイ、限外濾過、疏水性相互作用クロマトグラフイ、親和 力クロマトグラフイ、イオン交換クロマトグラフイまたは有機溶媒好ましくはエ タノールの添加による水性溶液からの沈澱を使用することにより得られた生成物 の分別と、 出発材料として使用された標準ヘパリンの分子量より少なくない分子量を有する 生成物を収集する工程とからなることを特徴とする新規な牛ヘパリン誘導体の製 造方法。 ３）穏やかな化学的硫酸化と、 暗がりにおける０ないし１０°ＣでｐＨ４〜５での過沃素酸塩による酸化と、 アルカリによる部分的な解重合と、 ホウ化水素ナトリウムによる還元と、 ゲル浸透クロマトグラフイ、限外濾過、疏水性相互作用クロマトグラフイ、親和 力クロマトグラフイ、イオン交換クロマトグラフイまたは有機溶媒好ましくはエ タノールの添加による水性溶液からの沈澱と、開始材料として使用されるヘパリ ンの分子量より少なくない分子量を有する生成物を収集することを特徴とする新 規な豚ヘパリン誘導体の製造方法。 ４）さらに、化学的硫酸化からなることを特徴とする請求の範囲第２項または第 ３項に記載の製造方法。 ５）虚血性心臓病および関連の血管障害の治療用薬剤の製造のための請求の範囲 第１項による生成物の使用。 ６）冠状側副局所灌流の発育の割合の増加用薬剤の製造のための請求の範囲第１ 項による生成物の使用。 ７）治療投与量において請求の範囲第１項による生成物の投与による虚血性心臓 病および関連の血管障害および冠状側副の発育割合の増加の治療方法。