CZ193794A3

CZ193794A3 - Pharmaceutical preparation of human insulin

Info

Publication number: CZ193794A3
Application number: CZ941937A
Authority: CZ
Inventors: James Arthur Hoffmann
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1993-08-13
Filing date: 1994-08-10
Publication date: 1995-03-15
Also published as: NO942959D0; DK0646379T3; TW326394B; CN1109364A; EP0646379B1; BR9403204A; NZ264197A; PH30757A; EP0646379A1; IL110581A0; CO4230235A1; KR950005324A; ZA945939B; AU7024794A; PL177002B1; RU2135205C1; NO942959L; US5534488A; AU674975B2; PL304600A1

Description

Farmaceutický prostředek lidského inz

Oblast techniky

Vynález spadá do oboru lidské medicíny a zvláště se týká ošetřování diabetes. Především se vynález týká farmaceutického Prostředku, který obsahuje molekulu lidského inzulínu, která při Podáni blíže napodobuje bazálni hladiny inzulínu v normálním lidském těle Dosavadní stav techniky

Hlavním terapeutickým cílem při ošetřování diabetes je fyziologické řízení hladiny glukózy v krvi. Pro tento účel jsou dostupné četné různé obchodní produkty a farmaceutické prostředky. Pro rychlé zvýšení glukózy, ke kterému dochází v období jídla, jsou nejvhodnější rychle Působící inzulínové produkty, jako jsou například Humulin Regular nebo tak zvané monomerní inzulínové analogyJiným důležitým zdrojem glukozového zatížení nemocných je nízká hladina uvolňování bazálni glukózy z jater - Je to primárně výsledkem postprandiálních metabolických procesů, jako jsou riaříklad glukorieogeneze a glykogenolyza- V případě diabetických jedinců se toto bazálni uvolňováni glukózy může Podstatně zvýšit v noci a vede k prodloužené periodě hyperglycemia, zvláště v časných ranních hodinách vede k Jevu, označovanému jakožto úsvitový Jev (dawn pheriomen). Tyto Periody hyperglycemia se Jeví jakožto důležitý přispěvatel vysokým hladinám glykatovariých proteinů, často měřených jakožto glykosylovaný hemoglobin- Konstrukce těchto derivatizovaných proteinových produktů navozuje Při dlouhodobých aplikacích, spojených s diabetes, neuropatii, nefropatii a retinoPatiiIdeální inzulínový farmaceutický prostředek se zřetelem na bazálni uvolňování glukózy by měl zajišťovat pomalou, stálou infuzi inzulínu do krevního systému, aby bylo zajištěno nizké uvol2 ňováni glukózy z jater. Se zřetelem na ideální bazální účinnost v čase je riejlepším parenterálriim produktem obchodně dostupný hovězí inzulín Ultralente- Při vstřikováni jednou denně zaručuje nízké, stálé uvolňováni inzulínu do krevního systému bez jakéhokoliv inzulínového plku Hlavním problémem hovězího Ultralente je však skutečnost, že hovězí inzulín má odlišný sled aminokyselin od lidského inzulínu- Lidské tělo může Považovat hovězí inzulin za cizí Protein Chronické vstřikováni této imunogenické látky diabetickým Jedincům může vést- k vytvořeni. Protilátak k inzulínu- To může vést ke změnám doby působení inzulínu a potence a k. jiným problémům spojeným s jedincovým aktivovaným imunním systémem. 2 těchto důvodů zůstává hovězí Ultralente neideálriím, parenterálriim inzulínovým farmaceutickým prostředkem.

Rozdíly typů inzulínů Ultralente

Příchod nové rekombinantní ONA technologie a nových enzymatických technik, pro Převádění vepřového inzulínu na lidský inzulin vedlo k nadměrné nabídce lidského inzulínu od roku 1980. Překonáním problémů se shora uvedeným hovězím Ultralente byla logicky příprava lidských krystalů Ultralente a jejich zpracování na farmaceutické prostředky pro Parenterální podání- Formy krystalů, tvary krystalů, velikosti krysdtalů, způsoby přípravy a formulace farmaceutických prostředků lidského a hovězího Ultralente jsou v podstatě stejnéAvšak několik let klinických zkoušek vedlo ke konečnému zjištěni, že tyto Produkty identické nejsou- Skutečně klinické zprávy naznačují, že lidský Ultralente rychleji působí než hovězí Ultralente, zatímco vepřový Ultralente je se zřetelem na dobu Působení mezi oběma těmito farmaceutickými prostředky- V klinické praxi to vedlo k tomu, že mnozí lékaři a diabetologové doporučovali systém vstřikování dvakrát denně pro lidský Ultralente- Kromě toho výrazný Pík absorpce inzulínu do krevního oběhu se pozoruje 12 hodin Po subkutanním podání- Tento jev nejen snižuje vhodnot tohoto produktu pro protipúsobení ke stálému vylučování bazální glukózy Jater, vede také k hyperinsulinemia, která sa3 motná může vést k makrovaskulárním komplikacím.

Důvody rozdílů časového Působení lidského a hovězího inzulínu produktů Ultralente nejsou plně známy. Přítomnost protilátek k hovězímu inzulínu není primární příčinou tohoto rozdílu v časovém působení- Některé výzkumy ukázaly že inzulín z liského Ultralente se mnohem rychleji absorbuje z místa vstřiku než hovězí Ultralente. Další objasnění tohoto problému vyplynulo ze zkoušek rozpouštění, dále popsaných. Na základě modifikací dříve popsaných zkoušek se zjistilo, že krystal, hovězího Ultralente po zředění potřebuje mnohem delší dobu k rozpuštění než srovnatelný lidský krystal Ultralente- Rozdíly sledu aminokyselin mezi hovězím a lidským inzulínem podobně vytvářejí mírný rozdíl inzulínového hexameru se zřetelem na krystaly, což může vést k rozdílu jejich následné rozpouštěcí rychlosti- Po vstřikriutí do podkožní tkáně toto zpožděné rozpouštění hovězích krystalů vede k jejich prodloužené absorpci a k prodlouženému biologickému působeníSyntéza lidských inzulínových analogů byla zkoumána jakožto jedna z cest Prodloužení doby Jejich působení- Obzvláště se prováděly modifikace například Gly<^A21lArg<^B27Thr-NH2^(B30) lidského inzulínu (Jorgensen a kol-, British Medicaal Journal 299, str415 až 419 (1989) a modifikace Polohy Glu<^B13> (Hansen, Biophysical Chemistry 39, str- 107 až 110, 1991). Avšak v každém z těchto případů zavedení nového aminokyselinového sledu vytvářelo cizí molekulu Pro lidské tělo a tak potenciálně stejnou nebo dokonce vyšší imunogenitu než hovězí inzulín- Použití Přirozené lidské inzulínové molekuly by bylo Proto rozhodně lepší než zavádění nové inzulínové molekuly- V žádném případě nebylo popsáno, že by se vysoce zinkem obohaceně lidské prostředky Ultralente ani látky pro přípravu takových prostředků za účelem prodloužení doby působení imunologicky výhodného lidského Ultralente prostředku vyrovnaly bilologickému časovému působeni farmakokineticky výhodného farmaceutického prostředku hovězího Ultralente nebo byly lepšíZinek a inzulín

Již mnoho let Je známo, že inzulín může úspěšně společně krystalovat s atomy zinku k získáni četných typů stálých krystalů s delší dobou působení než rozpustný nebo amorfní, riekrystalický inzulín. Jako komplexačriiho činidla pro inzulín bylo také použito rybího proteinu protamín k prodloužení doby působení inzulínu avšak pro svoji heterogenitu a možnou imunogenicitu je toto řešení málo atraktivní pro subkutánní léčebné chronické PodáváníV časných letech 1950 byly vyvinuty nové formulace hovězích inzulínových krystalů, které obsahují pouze inzulín a zinek v acetátovém pufru Při neutrální hodnotě pH (Hallas-Moller a kol - , Science 116, str- 394 až 398, 1952)- Tento Leňte inzulín se j'e prost fosfátových iontů, které silně vzájemně působí se zinečnatými ionty za vytváření nerozpustných derivátů fosforečnanu zi~ riečnatého- Prostředky, obsahující pouze krystalický inzulín v acetátovém pufru, jsou označovány Jakožto Ultralente- Krystaly, připravené tímto způsobem, se zde označuji jakožto inzulínové krystaly UltralenteJakkoliv Je zapotřebí pouze dvou atomů zinku k vytvoření komplexu s každým inzulínovým hexamerem k vytvořené vlastních Ultralente krystalů, určitý molárrii nadbytek zinku je v každém prostředku Ultralente a zjistilo se, že je vhodné podávat hovězí Ultralente vstřiknutím Jednou denně (Schlichtkrull, Insulin Crystals, Ejnar Munksgaard Publishers, Copenhagen, 1958). V téže publikaci (str- 92) se uvádí: Zdá se, že trvání působení se poněkud zkracuje, když se vepřový inzulín nahradí hevězím inzulínem v Ultralente. Proto k zajištění konstantního odměřování terapeutických suspenzí je nutné přidržet se Přísně Jehnoho a téhož typu inzulínu nebo nalézt Pevný poměr mezi inzulínem od různých typů, Podobně se uvádí, že vepřový Ultralente inzulín se mnohem rychleji absorbuje diabetiky než hovězí Ultralente inzulín (Brange, 6alenics of Insulin, str. 28, Springer-Verlag, Berlin, 1987). Avšak právě Prostřednictvím těchto rozdílů typů*se zjistilo, že vepřový inzulín je podobnější struktuře lidského inzulínu a proto je méně imunogenický než hovězí inzulín- Možné změny farmaceutického prostředku k prodloužení doby působení vepřového.Ultralente, aby byl ekvivalentní se zřetelen na dobu působení nebo lepší než hovězí

Ultralerite nebyly však árii doloženy ani navrženy- Ve skutečnosti se již dříve (Hallas-Moller, Diabetes 5, str-7 až 15. 1956) zjistilo, že koncentrace zinku nad 0,2 mg na 100 jednotek inzulínu by nebylo pomocí pro prodlouženou dobu Působení Leňte (nebo Ultralente) inzulínových farmaceutických prostředků jakéhokoliv tyPuUvádí se, že přibližně 0,09 mg zinku na 100 jednotek inzulínu se váže na nerozpustné hovězí Ultralerite krystaly (14 atomů zinku na inzulínový hexamer) zatímco Poměrně nízká koncentrace, Přibližně 0,05 mg/ml volného zinku, zůstává nevázána v suPernataritu- Zjistilo se, že obě tyto koncentrace zůstávají konstantní i když se sila inzulínové formulace zvýší z 40 J/ml na 100 J/ml (Brange, Oaleriics of Insulin, str- 37, Springei-—Verlag, Berlin, 1987) .

V americkém patentovém spise číslo 5 070186 se uvádí, že inzulínové farmaceutické prostředky obsahující vysokou koncentraci (0,02 až 0,05M) katioritu hořčíku jakožto jiného dvoumocného kovu, Poskytují rychleji působícví inzulínové produkty- Avšak nyní Se s překvapením zjistilo, že přidání pevného chloridu nebo acetátu zinečriatého nebo koncentrovaného vodného roztoku chloridu nebo acetátu zinečriatého Přímo do farmaceutického prostředku lidského Ultralente na konečnou celkovou koncentraci zinku Přibližně 0,5 až Přibližně 20 mg na 100 jednotek inzulínu prodlužuje rozpouštění krystalů a může prodloužit jeho biologickou dobu působeni, která Je pak tak pomalá jako v případě hovězího Ultralerite nebo dokonce i pomalejší- Zjistilo se také, že tato modifikace Je výsledkem doprovodného snížení hodnoty pH z přibližně 7,4 na tak nízkou hodnotu jako je 6,2- Dále se zjistilo, že výsledkem této modifikace je, že většina přidaného zinku zůstává v superriataritu a není vázána na nerozpustný inzulínový krystal- Nemění rovněž významně tvar a velikost krystalů nebo chemickou stabilitu inzulínu ve farmaceutických prostředcích po určité době skladováníPodstata vynálezu

Farmaceutický prostředek lidského Inzulínu Podle vyriá6 lezu je zaležen ria tem, že obsahuje suspenzi inzulínových krystalů Ultralente a přibližně 0,5 až přibližně 20 mg zinku na 100 jednotek inzulínu v prostředku jako celku.

Vynález je tedy zaměřen na inzulínový prostředek obsahující suspenzi Ultralente inzulínových krystalů za celkové koncentrace zinku v prostředku přibližně 0,5 mg až přibližně 20 mg na 100 jednotek inzulínu - Více než 50 % zinku v prostředku Je v rozpustné frakci spíše než ve formě komplexu s inzulínem. Tento inzulínový Prostředek má hodnotu pH obecně přibližně 6,0 až přibližně 7,4. Tento zinkem modifikovaný prostředek, má charakteristiky velmi dlouhodobě působícího lidského inzulínového produktuJednotlivé výrazy a zkratky zde mají následující význam:

Výraz koncentrace zinku v prostředku jako celku znamená celkovou koncentraci zinku v prostředku at je již zinek komplexně vázán s inzulínem nebo je v rozpustné forměVýrazem Ultralente inzulín se míní prostředek obsahující inzulínové krystaly, připravené v acetátovém pufru v podstatě Podle Hallas-Mollera a kol-, Science, 116, str- 394 až 398, (1952). Krystaly, připravené timto způsobem, se zde označuji jakožto inzulínové krystaly UltralenteVýrazem J se míní standardní mezinárodní jednotka inzulínové účinnostiVýrazem Zn se mini zinek.

¥

VSchny Použivné zkratky aminokyselin se Používají v souladu s americkým úřadem patentů a ochranných známek podle 37 C.F.R. § 1.822 (b) (2) (1990).

Vynález je zaměřen na inzulínový prostředek obsahující suspenzi krystalů Ultralente a zinek v koncentraci Přibližně 0,5 až 30 mg na 100 jednotek inzulínu v prostředku jakožto celku- Více než 50 X zinku v prostředku je v rozpustné frakci spíše než ve formě komplexu s inzulínem. Tento inzulínový prostředek má hodnotu pH obecně přibližně 6,0 až přibližně 7,4. Kromě toho inzulínový prostředek podle vynálezu neobsahuje »Jiné proteiny, jako je Protamin- Prostředek může obsahovat konzeravační přísadu nebo isotonická činidla a může také obsahovat*Pufr, který nevykazuje silnou reakci se zinkem- Tento zinkem modifikovaný prostředek se vyznačuje velmi dlouhodobým působením.

Prostředky podle vynálezu se mohou připravovat přidáváním zinku do předem připravených suspenzí Ultralente inzulínových krystalů nebo přidáním zinku po krystalizačním stupni při výrobě Ultralente. Zinek se může přidávat v pevné formě nebo ve formě roztoku. Nebo se suspenze krystalů Ultralente může přidávat do pevného zinku nebo do roztoku zinkuPodle vynálezu se jakožto zinku může používat různých zinečriatých solí- Jakožto příklady zinečnatých solí se uvádění acetát, bromid, chlorid, fluorid, jodid a síran ziriečnatý- Pro pracovníky v oboru je zřejmé, že se mohou používat četné jiné zinečnaté soli pro přípravu zinkem modifikovaných Ultralente inzulínových prostředků- S výhodou se však používá acetátu nebo chloridu ziriečnatého pro výrobu zinkem modifikovaných Ultralente inzulínových Prostředků podle vynálezu, jelikož tyto soli rievriášeji další chemické ionty do obchodně dostupných farmaceutických prostředků Ultralente.

Vynález je tedy zaměřen ria podstatné zvýšení koncentrace zinku v supernatantu farmaceutických prostředků lidského Ultralente bez výrazné modifikace samotných krystalů UltralenteS překvapením se zjistilo, že tyto farmaceutické prostředky lidského Ultralente obohacené zinkem mohou Prodloužit dobu rozpouštění nerozpustných krystalů inzulínu a Prodloužit tak dobu biologického Působení ve srovnáním s nemodifikovanými farmaceutickými . prostředky lidského Ultralente.

Vypuštění výrazných modifikací krystalů Ultralente může být /·· důležité z několika důvodů- Především se farmaceutických prostředků Ultralente používá při chronickém podáváni diabetikům po /dobu 40 let a samotného lidského Ultralente Již téměř 10 letZinkem modifikované farmaceutické Prostředky vykazují rekordní bezpečnost. Dále by podstané zvýšení zinku v komplexní formě s krystaly inzulínu mohlo vést k agregaci krystalů. V průběhu doby by se mohly vytvářet shluky, čímž by se farmaceutické prostředky stávaly nepoužitelnými. Zkoušky se zinkem modifikovaných farmaceutických prostředků lidského inzulínového Ultralente podle vynálezu nevykazuji podstatněji modifikované nebo shluklé inzulínové krystaly- Konečně modifikace inzulínového krystalu zinkem by mohla vést k.e změně samotné inzulínové struktury, což by mohlo měnit jeho biologické vlastnosti nebo dokonce jeho imunogenicituSoučasný pokles hodnoty pH, ke kterému dochází Při přípravě modifikovaných farmaceutických prostředků Ultralente, může být také důležitý- Je známo, že vrůstající koncentrace rozpustných zinečnatých iontů zbyěuje chemické Štěpení inzulínu mezi zbytkem A8 (threoniri) a A9 (seriri) i když je inzulín přítomen ve formě nerozpustných krystalů (Brange a kol-, Pharmaceutical Research 9, str- 715 až 726, 1992). Mírné snížení hodnoty pH inzulínových farmaceutických prostředků Pod 7 minimalizuje tuto Stěpicí reakci a tím zlepSuje dlouhodobou stabilitu- Je rovněž možné, že tento Pokles hodnoty pH může být částečně zodpovědný za minimální vzájemné působení nadbytku zinku s inzulínovým krystalem, jelikož je známo, že se vzájemné působení proteinů a zinku snižuje v kyselejších oblastech hodnot pH (Schlichtkrull, Insulin Crystals, Ejnar Munksgaard Publishers, Copenhagen, 1958).

Nové, zinkem mldifikované farmaceutické prostředky lidského Ultralente Podle vynálezu mají dalSí přídavné charakteristiky. Způsob přípravy je možný dlouho Po Přípravě originálního farmaceutického Prostředku lidského Ultralente- Takovým způsobem se mohou přidávat různé koncentrace zinku dokonce podle Potřeby Jednotlivých nemocných v závislosti na žádoucí době působení- Pro tyto farmaceutické prostředky není zapotřebí žádných nových excipientů, komplexotvorných látek, chemikálií nebo organických rozpouštědel, takže lze předcházet let neznámé toxicitě při dlouhodobém podávání chemických látek po mnoho let- Konečně hodnota pH konečného roztoku 6,0 až 7,4 Je velmi blízká hodnotě pH podkožní tkáně (7,4), takže nevede k žádnému dráždění- -

Vynález se tedy týká farmaceutických prostředků lidských krystalů Ultralente, vhodných pro ošetřování diabetes subkutanním vstřikováním; takové injekce poskytuji pomalou absorpci inzulínu takže popřípadě stačí Jedno vstřiknuti denně- Farmaceutické pros9 tředky podle vynálezu mohou rovněž obsahovat, konzervační přísadu, jako je například methylparaben, činidlo Pro isotorilcltu, například chlorid sodný, přičemž celkový obsah zinku je Přibližně 0,5 až 20 mg na 100 inzulínových jednotek a hodnota pH je 6,0 až 7,4. Pracovníkům v oboru je jasné, že lze použít také jiných konzervačních činidel a jiných činidel k úpravě isotonicity v prostředcích podle vynálezu- Podle výhodného provedení celkový obsah zinku je přibližně 0,5 až 7 mg na 100 inzulínových jednotek a hodnota pH je 6,2 až 7,2. Podle jiného výhodného Provedení Je hodnota pH pro všechny koncentrace zinku výsledkem přidání vhodného množství pevného chloridu zinečnatého, pevného acetátu zinečnatého nebo koncentrovaného vodného roztoku těchto činidel do Předem formulovaného roztoku lidského Ultralerite, to znamená, že se neprovádí žádná další úprava hodnoty pH.

Pro srovnání se dále uvádí koncentrace zinku a inzulínu uvedené v literatuře a v patentových spisech, přičemž se v tabulce I uvádějí ekvivalenty zinku a inzulínu ve směsi a v tabulce II ekvivalenty zinku v roztoku.

Tabulka I

Kombinace ziriek/inzuliri ' mekv % Zn v krystalu μΜ μΜ

Zn/g bezvodého Zn/μΜ Ζπ/μΜ inzulínu inzulínu inzulínu inzulinmg μ9(9βη»β)

Zri/100 jedno- Zn/Jedn. tek inzulínu inzulínu hexameru

0,12 0,31 0,89 2,66 4,43

66,00

0,38 1,00 2,75 8,00

12,70

68,50

85,30

0,33

0,90

2,51

7,75

12,80

192,50

514,20

2,0

5,4

15,1

46,5

77,0

1155,0

3086,0

0,013

0,035

0,100

0,300

0,500

7,500

20,000

0,13 0,35 1 ,00 3,00 5,00

75,00

200,00

177,00

Tabulka II Zinek v roztoku

mekv Zn/1	X Zn	mg Zn/ml	mM Zn/1
0,306	0,001	0,01	0,153
0,612	0,002	0,02	0,306
1,530	0,005	0,05	0,765
3,060	0,010	0,10	1,530
6,120	0,020	0,20	3,060
15,300	0.050	0,50	7,650
30,600	0,100	1 ,00	15,300
61,200	0,200	2,00	30,600
153,000	0,500	5,00	76,500
306,000	1,000	10,00	153,000
612,000	2,000	20,00	306,000
Následující	Příklady	praktického provedení	vynález blíže

objasňuji bez záměru Jeho jakéhokoliv omezeníPříklady Provedeni

Příklad 1

Příprava zinkem modifikovaných farmaceutických prostředků lidského Ultralente

Použije se Humulinu Ultralente (Lilly, Indianopolis, IN) a Ultralente (hovězího) inzulínu nastaveného suspenzí inzulínu a ziriku USP (Novo Nor disk, Baksvaerd, Dánsko) , obou v koncentraci 100 inzulínových jednotek na ml (J100). Těchto formulací, obsahujících celkovou koncentraci zinku přibližně 0,15 ?m<j/ml, se použ je bud přímo nebo Po zředění na J40 pomocí sterilního*ředidla Sterile Oiluerit Pro Ultralente inzulín (Lilly), který obsahuje 0,05 mg zinku- Do předem zvážených vzorků pevného chloridu zinečriatého (EM Science, Cherry Hill, NJ) se Přidá Přímo ro2tok J100 nebo J40 inzulínu Ultralente- Alternativně se přidají tto farmaceutických

1 prostředků JI00 Humuliri Ultralente různá množství koncentrovaných roztoků chloridu ziriečnatého (100 mg/ml vody) nebo octanu ziriečnatého s nastavenou hodnotou pH (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, 200 mg/ml vody). Celková koncentrace zinku se stanov! bud kombinaci vypočtených koncentraci zinku v inzulínu, v rozpouštědle a v reagericiich, nebo se zjišťuje experimentálně atomovou absorpční spektroskopií.

Příklad 2

Hodnota pH zinkem modifikovaných farmaceutických prostředků lidského Ultralente

Běžné farmaceutické prostředky Ultralente mají hodnotu pH přibližně 7,4. Zinkem modifikované farmaceutické prostředky Ul-

tralerite se připral Podle příkladu 1 a zjišťuji se jejich pH. Údaje Jsou v tabulce III-	hodnoty
Tabulka III
Síla	Způsob Použité	•celkově
inzulínu	přidání Zn-ěiriidlo	Konečné mg	mg Zr./100	Konečné
Vzo- (J/ml)	Zr.	Zri/ml	J inzulínu	pH

rek prostředku

1	40	žádný	žádné	0,09	0,23	7,38
2	40	Pevný	chlorid	0,25	0,63	7,30
3	40	Pevný	chlorid	0,59	1,48	7,03
4	40	Pevný	chlorid	1,09	2,73	6,80
5	40	Pevný	chlorid	2,40	6,00	6,75
6	40	Pevný	chlorid	7,31	18,28	6,34
7	100	žádný	žádné	0,15	0,15	7,37
8	100	Pevný	chlorid	2,60	2,60	6,84
9	100	Pevný	chlorid	7,40	7,40	6,41
10	100	Pevný	chlorid	12,20	12,20	6,21
11	97	vodný	chlorid	1,59	1,64	6,80
12	94	vodný	chlorid	2,92	3,11	6,73

13	93	vodný	chlorid	3,81	4,10	6,63
14	91	vodný	chlorid	4,55	5,00	6,59
15	83	vodný	chlorid	8,18	9,86	6,41
16	91	vodný	acetát	5,60	6,15	6,75
17	83	vodný	acetát	10,09	12,16	6,51

* stanoveno

Hodnoty pH těchto farmaceutických prostředků jasně mírně poklesly Po přidání zinečnatého reakěního činidla- Vzorky, připravené s acetátem zinečriatým, vykazují menší pokles hodnoty pH než vzorky připravené s chloridem zinečriatým. V dalších popsaných příkladech, s výjimkou příkladu 38 se neprovádějí žádné další úpravy hodnoty pH v roztocích takto připravených.

Zjišťuje se také, že přidáni nepatrných množství roztoků hydroxidu sodného do těchto zinkem zesílených farmaceutických prostředků Po Přidání zinečnatého činidla může Poněkud zvýěit hodnotu pH. Nastavení hodnoty pH farmaceutických prostředků až na pH 7,4 přísadou větších množství hydroxidu sodného, způsobuje v§ak okamžité vytváření chuchvalcovitých sraženin pravděpodobně druhu hydroxidu zinečnatého, což činí farmaceutický prostředek nepoužitelným pro další účely. Na druhé straně přísada kyselých roztoků, Jako například kyseliny chlorovodíkové nebo octové ke snížení hodnoty pH po přípravě zinkem zesílených farmaceutických prostředků Ultralente, nezpůsobuje žádné problémy se sraženinami, avšak chromatografická analýza HPl_C supernatantú dokládá, že malá přídavná procenta krystalů Ultralente se během tohoto okyselování rozpouštějí- Okyselování rozředěnou kyselinou octovou se jeví jako nejlepší, jelikož minimalizuje nebo eliminuje rozpouštění inzulínu, jako v příkladě 38. Proto Jelikož lze bezpečně provádět mírné úpravy hodnot pH těchto zinkem zesílených suspenzí Ultralente, není vynález omezen pouze na hodnoty pH, které jsou výsledkem přísad specifických zinkových reakčních činidel13

Příklad 3

Koncentrace zinku ve farmaceutických prostředcích lidského Ultralente modifikovaných zinkem

A. Podobné jako u vzorku θ Podle příkladu 2 se připraví zinkem zesílený farmaceutický prostředek, lidského Ultralente- Množství 1 ml z každé ze tří suspenzí se stanovenou celkovou koncentrací zinku 0,7 až 2,5 mg na 100 inzulínových jednotek, a z nezměněného inzulínového farmaceutického prostředku Humulin Ultralente se ručně míchá Po dobu 30 minut při teplotě 25 “C a Pak. se uloží při teplotě 5 °C po dobu 20 hodin- Každá suspenze se pak vede 0,2 pm filtrem Acrodisc^R (Oelman Sciences, Ann Arbor, MI). Filtrát se zředí 9 ml 0,1N kyseliny chlorovodíkové. Nerozpustné krystaly zůstanou na filtru a rozpustí se pomalým proléváním 10 ml 0,1N kyseliny chlorovodíkové každým filtrem. Stanovuje se koncentrace zinku v těchto roztocích atomovou absorpcí a zpět se vypočtou koncentrace zinku v supernatantech nebo v inzulínových krystalech původního farmaceutického prostředku. Výsledky jsou u? vedeny v tabulce IV,

Tabulka IV

Vzorek. Vázaný zinek Volný zinek Celkový zinek v supernatantu

číslo	mg/ml	mg/ml	%
1	0,12	0,07	36,8
2	0,19	0,63	76,8
3	0,18	1 ,30	87,8
4	0,20	2,60	92,9
Tato	zkouška	dokládá, že	většina zvlášť	Přidaného zinku
zůstává v	supernatantu a neváže	se s krystalem	inzulínu ani na
formu komplexu ani	kovalentně-

B. Podobně jako v případě vzorku 8 podle příkladu 2 se připraví 20 ml farmaceutického prostředku obsahujícího přibližně 2,5 mg/ml zinku-V případě Poloviny této suspenze se hodnota pH (6,81) neupravuje, zatímco hodnota pH druhé poloviny se nastavuje na 6,15 přidáním malého objemu zředěné kyseliny octové- Suspnze se uloží Při teplotě 5 “C. V různé době se stanovuje koncentrace zinku v supernatantech a v nerozpustných krystalech shora popsaným způsobem. Hodnoty, získané Při těchto zkouškách, jsou uvedeny v tabulce V.

Tabulka V Hodnota Dny při	Vázaný zinek	Volný zinek	Celkový zinek v supernatantů
PH	5 “C	mg/ml	mg/ml	%

	0	0,27	2,18	89,0
	2	0,26	2,75	91,4
	4	0,37	2,14	85,3
	7	0,39	2,50	86,5
6,81	10	0,35	2,50	87,7
	15	0,42	2,25	84,3
	21	0,36	2,75	88,4
	28	0,35	3,25	90,3
	0	0,29	2,14	88,1
	2	0,28	2,18	88,6
	4	0,25	2,12	89,4
	7	0,40	2,50	86,2
6,15	10	0,30	3,00	90,9
	15	0,33	2,50	88,3
	21	0,35	2,50	87,7
	28	0,33	2,75	89,3

Tato zkouška dokládá, že nastavení hodnoty pH zředěnou kyselinou octovou nemění rozděleni zinku mezi supernatantem a nerozpustnými inzulínovými krystaly- Dokládá také, že<rozdělení zinku se Při uložení nijak výrazně nemění- Většina zinku zůstává v su15 pernatantové frakci v obou uvedených farmaceutických prostředcích Přiklad 4

Stabilita zinkem modifikovaných farmaceutických prostředků lidského Ultralente

A. Způsobem podle příkladu 2 se připraví několik, zinkem zesílených farmaceutických prostředků lidského Ultralente a zkoušejí se mikroskopicky za 43 násobného zvětšení- VSechriy suspenze vykazují typickou rhombohedrální formu krystalů Ultralente, zjištěnou v nemodifikovaných prostředcích. Velikost, tvar a integrita krystalů v zinkem modifikovaných suspenzích je skutečně nerozlišitelná od nemodifikovaných suspenzí- Přítomnost výrazného množství cizích, nepatřících nerozpustných nekrystalických částic v těchto prostředcích se nezjistila.

Tyto farmaceutické prostředky se chovají pří víření stejně Jako nemodifikované farmaceutické prostředky Ultralente- Po víření vykazuje krystalická suspenze rovněž stejné charakteristiky usazování jako nemodifikované farmaceutické Prostředky Ultralente jak se zřetelem ria dobu potřebnou k dokonalému usazení krystalů tak se zřetelem ria objem, který krystaly zaujímajíB. Připraví se zinkem zesílený farmaceutický inzulínový prostředek lidského Ultralente, obsahující přibližně 7,5 mg/ml zinku (podobně jako vzorek 9 podle příkladu 2). Nemodifikovaný farmaceutický inzulínový prostředek lidského Ultralente (podobně jako vzorek 7 podle příkladu 2) se používá ke kontrolním účelům. Oba vzorky se ukládají při teplotě 5 “C r»a dobu přibližně jednoho roku- Pak se inzulínové krystaly opět rozpustí ve zředěné kyselině chlorovodíkové a hodnotí se jejich čistota systémem reverzní fázové vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPlC). Používá se při teplotě 40 C kolony 4,6 x 250 mm Zorbax C-8, obsahující částice o velikosti pórů 15 r»m. Inzulín se hodnotí při rychlosti průtoku 0,7 ml/min v gradientu acetonitrilu obsahujícím 0,225 M síran amonný při hodnotě pH přibližně 2.

Po jednom roce je čistota nemodifikovaného farmaceutického inzulínového Prostředku lidského Ultralente 96,4JK s několika n&~ ideritifikovanými piky vždy v oboru 0,2 % a s A2‘idesamidoinzulinovým pikem o přibližně 1 Farmaceutický inzulínový prostředek lidského Ultralente, obsahující 7,5 mg/ml zinku, po jednom roce vykazuje celkovou čistotu inzulínu 96,8 X s několika neidentifikovanými píky vždy v oboru 0,1 až 0,2 % a s A2i<iesamidoinzulinovým pikem o přibližně 1 X- Nový, neznámý pik. eluujíci Před inzulínem, nepozorovaný ve vzorku nemodifikovaného farmaceutického inzulínového Prostředku lidského Ultralente, je obsažen 0,3

Tyto zkoušky dokládají, že farmaceutické prostředky modifikované zinkem si podržují svoji stabilitu krystalů Ultralente s hlediska svého rozméru a tvaru- Rovněž při vysokých koncentracích zinku ve farmaceutických prostředcích Ultralente nemění výrazněji chemickou čistotu inzulínové molekuly po skladování Po dobu jednoho roku Při teplotě 5 “C.

Příklad 5

Zkouška rozpustnosti

Tato zkouška Je modifikací dříve popsané zkoušky (Graham a Pomeroy, J- Pharm. Pharmacol- 36, str-427 až 430, 1983). Využívá rychlosti rozpouštění inzulínového krystalu po výrazném zředění pufrem nevázajícím zinek jakožto cesty předpovídání rychlosti, kterou se bude krystalický prostředek rozpouštět po sukutanním vstřikriutí živočichům. Je to proto, že pro inzulínové suspenze je rychlost rozpouštění nerozpustného inzulínu po vstřikriutí hlavním faktorem pro biologickou odezvu- Proto se může usuzovat, že inzulínový farmaceutický prostředek, který se rozpouští mnohem pomaleji Při této zkoušce ve srovnání s lidským Ultralente, bude pomaleji působit v případě biologických modelů- Podobným způsobem jako vzorek 8 podle příkladu 2 se připraví tři zinkem zesílené farmaceutické prostředky lidského Ultrat leňte, obsahující zinku 0,35, 0,7 a 2,5 mg/ml. Objem 0,5 ml těchto suspenzí a 0,5 ml podíl nemodifikovaného farmaceutického pros17 tředku J100 lidského a hovězího Ultralente se vždy přidá do 50 ml pufru 0, 1M tris (tris-hydroxymethylaminomethan, Mallinckrodt, Paris, KY) o hodnotě pH 7,5 za míchání při teplotě 25 C ve skleněné baňce o obsahu 80 ml. V době tří a osmi hodin se odeberou alikvotní podíly míchaných suspenzí a vedou se filtrem 0,2 um Acrodisc^R. Kvantitativně se stanovuje množství inzulínu ve filtrátu reverzní fázovou chromatografií HP|_C. Stanovuje se maximální obsah inzulínu HPLC v nefiltrovariém okyseleném alikvotním podílu. V podstatě není žádný solubilizovariý irizulin na začátku zkoušky rozpustnosti - Hodnoty, zjištěné při zkoušce, jsou uvedeny v tabulce VI,

Tabulka VI

Ultra^-	Stnovená	Maximální množství	Maximální množství
lente	koncentrace	rozpustného inzulínu	rozpustného inzulínu
	zinku	(3 hodiny)	(8 hodin)
typ	mg/ml	%	%
lidský	0,15	16,30	44,70
lidský	0,35	4,50	10,70
lidský	0,70	2,40	6,30
lidský	2,50	1,10	3,20
hovězí	0,15	3,20	6,20

Tato zkouška dokládá, že nemodifikovaný lidský Ultralente se znova rozpouští mnohem rychleji než modifikovaný hovězí Ultralente. Dokládá také, že Přidání zinku do lidského Ultralente do koncentrace přibližně 0,7 mg na 100 inzulínových Jednotek způsobuje, že se inzulínové krystaly rozpouštějí stejnou rychlostí jako nemodifikované krystaly hovězího Ultralerite.Při dodání lidskému Ultralente koncentrace zinku přibližně 2,5 mg na 100 inzulínových jednotek způsobuje dokonce Pomalejší rychlost rozpouštění, riež jakou má nemodifikovaný hovězí Ultralente inzulín.

Přiklad 6

Kontinuální průtoková zkouška rozpouštění

Tato zkouška je modifikací dříve popsané průtokové zkoušky (Brange, Galenics of Insulin, str. 46 Spinger-Verlag, 8erlin, 1987 a Graham a Pomeroy, J. Pharm. Pharmacol- 36, str-427 až 430, 1983), Zředí se 2 ml podíly nemodifikovaného liského a hovězího Ultralente inzulínu a vzorku lidského Ultraleňte obsahuícího 0,7 mg zinku na 100 inzulínových jednotek (jako popsáno v příkladu 5) vždy 48 ml 0,1M pufru tris při hodnotě pH 7,5. Každých 50 ml suspenze se bezprostředně vede filtrem 0,2 p.m Acrodisc* a promyje se 5 ml vody. Každý filtr se pak umístí in-line na eluční trubku systému FPlC (Pharmacia, Piscataway, NJ), Každým filtram se čerpá čerstvý 0,11*1 pufr tris o hodnotě pK 7,5 při Průtokové rychlosti 1 ml/min. Absorbance eluantu pod filtrem se kontinuálně monitoruje spekteroskopicky pro eluování .inzulínu Po více než dvě hodiny při vlnové délce 214 nanometrů. Různé Podíly eluantu se rovněž zkoušejí reverzní fázovou chromatograf ií HP|_C k potvrzení přítomnosti lidského nebo hovězího inzulínu.

Inzulín v hovězích Ultralente krystalech je pouze velmi pomalu rozpustný v čerstvém tris pufru. Eluování hovězího inzulínu se potvrzuje chromatografií HPlC podílu eluantu. Inzulín v nemodifikovaných lidských Ultralente krystalech vykazuje rychlejší rozpouštění s pikem při přibližně 35 minutách a udržuje se Poměrně vysoké rozpouštění v průběhu celé zkoušky. Farmaceutický prostředek lidského Ultralente, obsahující 0,7 mg/ml zinku, vykazuje velmi podobnou odezvu jako nemodifikovaný vzorek lidského Oltraleňte, nikoliv v§ak Jako hovězí Ultralente. To potvrzuje, že časný filrační stupeň při zkoušce odstraňuje veškerý nevázaný zinek z tohoto farmaceutického prostředku a zbylé krystaly se -chovají zcela podobně jako nemodifikované krystaly lidského Ultralente. To jasně dokládá podstatný rozdíl rychlosti rozpouštění lidských a hovězích inzulínových krystalů. Hodnoty z této zkoušky jsou uvedeny v tabulce VII.

Tabulka VII

Relativní absorbance

Doba Ultralente hovězí Ultralente lidský Ultralente lidský min 0,7 mg/ml Zn

0	0	0	0
2,5	12,5	3,5	12,5
5,0	9,0	8,0	11,5
10,0	8,0	23,0	19,0
15,0	7,0	38,0	31,7
20,0	7,9	52,0	45,0
25,0	8,0	59,0	60,0
30,0	7,4	63,0	72,0
35,0	8,1	64,0	79,5
40,0	8,0	61,0	79,0
45,0	8,3	57,5	73.0
50,0	7,8	52,0	68,0
55,0	8,2	45,5	60,0
60,0	8,5	40,0	52,2
65,0	8,5.	36,0	45,5
70,0	8,8	31,5	39,5
75,0	9,0	29,5	36,3
80,0	9,7	26,0	25,0
90,0	9,6	23,0	22,1
100,0	10,4	20,2	22,1
110,0	11,0	18,5	24,3
120,0	11,2	16,6	24,0
130,0	12,0	15,1	21,6

Příklad 7

Zkouška farmaceutického Prostředku Ultralente na králících

Farmaceutický prostředek hovězího Ultralente (J40) a lidského

Ultralente (J40), přiraveriý jako vzorek 1 až 6 podle Příkladu 2, se zkouší za použití normálních králíků. Používá se novozélandslých bílých králíků, většinou samiček, vždy o hmotnosti 2,7 až kg, ve věku Půl roku až 4 roky, které se nechají bez potravy 16 hodin před podáním zkušebního vzorku- Inzulínové suspenze se vždy vstřikují deseti králíkům subkutanně na zadní šíji v dávce 0,2 jednotek ria 1 kg hmotnosti- V různých Intervalech se odebírá 100 ul objem krve z okrajových ušních cév, smísí se s 900 ul objemy antikoagularitu (EDTA-natriumfluorid) a analyzují se na obsah glukózy- Hodnoty glukózy se standardizují k reflektování původního obsahu glukózy, naměřeného Před vstřikriutím vzorku- Hodnoty, zjištěné při této zkoušce, Jsou uvedeny v tabulce VIII.

Tabulka VIII

Vzo- Ultra- Stnoveriá Procento původního obsahu glukózy v krví

rek	leňte	koncentrace zinku	hodiny po vstřiknutí
1	2	3	4
číslo	typ	mg/ml		%
1	lidský	0,09	60,6	65,2	89,0	90,4
2	lidský	0,25	56,7	67,8	91,4	91,4
3	lidský	0,59	60,4	58,9	78,1	85,5
4	lidský	1 ,07	81,8	78,6	95,2	95,6
5	lidský	2,40	92,8	80,9	80,3	88,6
6	lidský	7,31	96,0	84,1	80,9	85,9
7	hovězí	0,15	60,1	60,1	96,7	95,7

Profil Působení v Čase v případě králíků je mnohem kratší než v případě lidí. Toto potlačení působení v čase vede k nevhodnoti tohoto Pokusného zvířete k doložení významu rozdílu mezi farmaceutickými prostředky nemodifikovaného lidského a hovězího Ultralente (vzorek 1 ve srovnání se vzorkem 7). Vzdor tomuto omezení tato zkouška dokládá, že biologické působení lidského inzulínu Ultralente se dramaticky změní při přidání dostatečného množství zinku do farmaceutického prostředku- Jak dokládají vzorky 4 až 6, zaCátek silné biologické odezvy se posune nad jednu hodinu s nejhlubším bodem mezi 2 a 4 hodinami- Maximální pokles glukózy v krvi se také snižuje z Přibližně 40 X v^připadě \ vzorků 1 až 3 (nejhlubší bod. 1 hodina) r»a toliko přibližně /20%

Pokles v případě vzorků 4 až 6 (nejhlubší bod 2 až 4 hodiny).

Farmaceutické prostředky s dostatečným obsahem zinku tedy jasně dokládají prodloužené působení ve srovnání s nemodifikovanými farmaceutickými prostředky lidského nebo hovéiho UltralentePrůmyslová využitelnost

Inzulínový farmaceutický prostředek obsahující suspenzi krystalů Ultralente a celké množství zinku 0,5 až 20 mg ria 100 jednotek inzulínu, Přičemž více než 50 % celkového obsahu zinku v prostředku zůstává v rozpustné frakci, spíše než v komplexní vazbě s inzulínem a hodnota pH prostředku je 6,0 až 7,4 má charakter produktu pomalu uvolňujícího lidský inzulin-

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY *

1- Farmaceutický prostředek lidského inzulínu, v y z n a č u j í c í s e t i m , že obsahuje suspenzi inzulínových » krystalů Ultralente a přibližně 0,5 až přibližně 20 mg zinku r«a 100 jednotek inzulínu v prostředku jako celku2. Farmaceutický prostředek lidského inzulínu Podle nároku

1, vyznač u j í c í se t í tn , že obsahuje přídavně konzervační činidlo 3- Farmaceutický prostředek, lidského inzulínu podle nároku
2, vyznačující se tím, že obsahuje přídavně činidlo upravující isotoriicitu.

4. Farmaceutický prostředek lidského inzulínu podle nároku
3, vyznačujíc! se tím, že obsahuje přídavně pufr 5. Farmaceutický prostředek, lidského inzulínu podle nároku
4, vyznačující se tím, že obsahuje celkově přibližně 0,
5 až Přibližně 7 mg zinku na 100 jednotek inzulínu
6. Způsob přípravy inzulínového farmaceutického prostředku podle nároku 1 až 5,vyznačující se tím, že se míchá zinek s inzulínovými krystaly Ultralente.

I
7 - Způsob podle nároku 1 až 5, vyznačující se t

t í m , že se Používá zinečnaté soli volené ze souboru zahrnujícího acetát, bromid, chlorid, jodid, fluorid a síran zinečnatý-