CZ305297A3

CZ305297A3 - Parenterální farmaceutický prostředek na bázi analogu monomerního inzulínu

Info

Publication number: CZ305297A3
Application number: CZ973052A
Authority: CZ
Inventors: Michael Rosario Defelippis; Bruce Hill Frank
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 1998-02-18
Also published as: CO4700482A1; IL117696A0; PL322626A1; AU720300B2; JPH11502856A; AU5381296A; NO974498L; US5952297A; PE38797A1; CN1185114A; KR19980703425A; HUP9801700A3; MX9707428A; NZ305719A; BR9607935A; EA199700285A1; CA2216516A1; EP0735048A1; AR002976A1; WO1996030040A1

Description

Parenterální farmaceutický prostředek na bázi analogu monomerního inzulínu, krystal inzulínového analogu a způsob jeho přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká monomerních analogů lidského inzulínu. Zvláště se týká parenterálního farmaceutického prostředku na bázi analogu monomerního inzulínu. Prostředek zajištuje prodloužené trvání účinku.

Dosavadní stav techniky

Už dlouhou dobu je známo, že inzulín lze s úspěchem krystalovat společně se zinkovými ionty k získání četných typů stabilních krystalů s delším účinkem než rozpustný nebo amorfní nekrysta 1 ický inzulín. Na začátku 50. let byla vyvinuta nová forma krystalů hovězího inzulínu. která obsahovala pouze inzulín a zinek v acetátovém pufru s neutrální hodnotou pH. Ha 11as-M011er a kol. Science 116, str. 394 až 398 (1952). Tento inzulínový prostředek se vyhnul fosfátovým iontům, které reagují silně s ionty zinku a vytvářejí nerozpustné deriváty fosfátu zinku. Prostředky obsahující pouze krystalický inzulín v acetátovém pufru se nazývají Ultralente. Krystaly připravené tímto způsobem se zde označují jako krystaly Ultralente.

V poslední době byly vyvinuty analogy monomerního inzulínu, které si uchovávají biologickou aktivitu jako nativní lidský inzulín, jsou však náchylné k dimerizaci a k samovolnému přechodu na formu s vyšší molekulovou hmotností. Chybějící samočinná asociace se projevuje poměrně rychlejším nástupem aktivity. Tyto analogy inzulínu zajištují nástup rychlé absorpce k časovému umístění injekce a vrcholného působení inzulínu do ··· · ·· ······ • · · · · · · · · · * · · · · ···· • ······ · · · ···· • · · · · · · ·· · ······· ·· · větší blízkosti postpranginální exkurse glukosy spojené s odezvou na jídlo.

Podstata vynálezu

Parenterální farmaceutický prostředek na bázi analogu monomerního inzulínu s protrahovaným účinkem , spočívá podle vynálezu v tom, že je tvořen v podstatě sterilní vodnou suspensi 20 J/ml až 500 J/ml analogu inzulínu, přibližně 5 mg/ml až přibližně 10 mg/ml chloridu sodného, přibližně 0,2 až přibližně 2,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru, přibližně 0,04 mg/ml až přibližně 20,0 mg/ml iontů zinku a fyziologicky vhodnou konzervační látkou o hodnotě pH přibližně 6,5 až přibližně 7,8, přičemž méně než 5 % analogu, obsaženého v suspenzi, je v rozpuštěném stavu.

Vynález se týká formulace monomerního analogu inzulínu, který má protrahovaný účinek. Vzhledem tomu, že monomerní analogy inzulínu se neshlukují a neasociují se jako inzulín, je překvapivé, že lze získat stálé analogové krystaly. S překvapením formulace podle vynálezu poskytují předem určovatelné protrahované působení.

Dále se vynález týká krystalů analogu inzulínu, připravených vysrážením krystalů z roztoku obsahujícího v podstatě přibližně 200 až přibližně 1200 J/ml analogu inzulínu, přibližně 50 mg/ml až přibližně 100 mg/ml chloridu sodného, přibližně 2,0 až přibližně 20,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru, a molární nadbytek iontů zinku při hodnotě pH přibližně 5,0 až přibližně 6,0.

Veškeré zkratky aminokyselin zde použité jsou zkratky přijaté Americkým úřadem pro vynálezy a ochranné známky uvede• · né v 37 C.F.R. § 1 822 (b) (2) .

Označením analog inzulínu” a monomerní analog inzulínu se zde míní analogy inzulínu, které jsou méně náchylné k samočinné asociaci než lidský inzulín. Monomerním analogem inzulínu je lidský inzulín, ve kterém je Pro v poloze B^{2 8} substituován Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a Lys v poloze B²⁹ je lysin nebo prolin; des(B²⁸-B³⁰); nebo desíB²⁷). Monomerní analogy inzulínu jsou popsány v literatuře Chance a kol. americká přihláška vynálezu číslo 07/388 201, (číslo publikace EPO 383 472) a Brange a kol. číslo publikace EPO 214 826.

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že jsou možné ještě jiné modifikace analogu inzulínu. Tyto modifikace jsou v oboru v široké míře akceptovány a zahrnují náhradu feny1 a 1ani nového zbytku v poloze B¹ asparagovou kyselinou; náhradu threoninového zbytku v poloze B³⁰ alaninem; náhradu zbytku šeřinu v poloze B⁹ asparagovou kyselinou; vypuštění aminokyselin v poloze B^l sanotné nebo v komb inac i s vypuštění m v poloze B² a vypuštění threoninu z polohy B³⁰. Obzvlášt výhodnými analogy inzulínu jsou lidský inzulín Lys^B28Pro^B29 (B²⁸ je Lys; B²⁹je Pro) a Asp^B28 - 1 idský inzulín (B²⁸ je Asp).

Pojmem Ultralente inzulín jsou označovány formulace obsahující krystaly inzulínu připravené v acetátovém pufru v podstatné shodě s údaji Ha 1las-M01ler a kol., Science 116, str. 394 až 398 (1952). Krystaly, připravené tímto způsobem, se zde označují jako krystaly Ultralente inzulínu.

Pojem krystaly analogu inzulínu znamená krystaly analogu inzulínu připravené zde popsaným způsobem.

Písmeno J znamená standardní mezinárodní jednotku • · · · · · • · · • · · • · · · ·

- 4 aktivity inzulínu.

Pojmem v podstatě se zde míní více než 95 %, s výhodou 98 %. Například v podstatě krystalický znamená více než z 95 % krystalický materiál.

Pojem ošetřování (treating) popisuje činnost a péči o pacienta za účelem potlačení nemoci, stavu, nebo poruchy a zahrnuje podávání prostředků podle vynálezu k prevenci nástupu příznaků nebo komplikací, k dosažení úlevy od příznaků nebo komplikací, nebo k eliminaci onemocnění, stavu nebo poruchy.

Označení fyziologicky vhodné konzervační činidlo znamená m-kresol, methylparaben, resorcinol, fenol nebo jiné konzervační činidlo, používané v oboru.

Označení fyziologicky vhodný pufr je v oboru známé. Mezi fyziologicky vhodné pufry patří octan sodný, ethylacetát nebo jiný pufr, který nereaguje silně se zinkem.

Pojem iont zinku je odborníkům známý. Zdrojem zinku je s výhodou sůl zinku. Příkladně se jako sůl zinku uvádí acetát, bromid, chlorid, fluorid, jodid a sulfát zinečnatý. Pracovníkům v oboru je známo, že existuje řada dalších solí zinku, kterých by bylo možno použít v prostředcích podle vynálezu.

Jak už bylo uvedeno, týká se vynález krystalů analogů inzulínu a formulací analogu inzulínu s protrahovaný účinkem. Krystaly analogů inzulínu se získávají precipitací krystalů z roztoku obsahujícího v podstatě přibližně 200 až přibližně 1200 J/ml inzulínového analogu, přibližně 50 až přibližně 100 mg/ml chloridu sodného, přibližně 2,0 až přibližně 20,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru a molárního nadbytku zinečnatých • · · » · · ······ « · · ···» ·· ·

5_ ···· · ···* • ······ · · · ···· iontů při izoe1ektrické hodnotě pH analogu, obecně pH přibližně 5,0 až přibližně 6,0,

S výhodou se krystaly analogů inzulínu připravují vysrážením krystalů z roztoku obsahujícího v podstatě přibližně 400 až přibližně 1000 J/ml analogu zinku, přibližně 65 mg/ml až přibližně 75 mg/ml chloridu sodného, 5,0 až přibližně 10,0 mg/ ml octanu sodného a přibližně 0,1 mg/ml až přibližně 0,5 mg/ml zinečnatých iontů při hodnotě pH přibližně 5,5 až přibližně 5,9. Nejvýhodněji se krystaly analogu inzulínu připravují vysrážením krystalů z roztoku obsahujícího v podstatě 400 J/ml analogu inzulínu, přibližně 70 mg/ml chloridu sodného, přibližně 8,0 mg/ml octanu sodného a 0,15 mg/ml zinečnatých iontů při hodnotě pH přibližně 5,5 až přibližně 5,6.

Krystaly se vytvářejí, když se hodnota pH nastaví na isoelektrický bod analogu. Hodnota pH se nastavuje na 5,0 až 6,0 z kyselejšího pH nastavením zásaditosti roztoku fyziologicky vhodnou zásadou, jako je hydroxid sodný. Podobně se hodnota pH nastavuje na 5,0 až 6.0 ze zásaditější hodnoty pH nastavením kyselosti roztoku fyziologicky vhodnou kyselinou, například kyselinou chlorovodíkovou.

S výhodou se připraví dva roztoky, které zkombinováním poskytnou roztok obsahující v podstatě přibližně 200 až přibližně 1200 J/ml analogu inzulínu, přibližně 50 mg/ml až přibližně 100 mg/ml chloridu sodného, přibližně 2,0 až přibližně 20,0 fyziologicky vhodného pufru a molární nadbytek zinečnatých iontů pří isoelektrické hodnotě pH analogu. První roztok, nadále sekce analogu inzulínu, obsahuje přibližně 300 J/ml až přibližně 2000 J/ml analogu inzulínu a molový nadbytek zinečnatých iontů při kyselé hodnotě pH přibližně 2,0 až přibližně 3,0. Druhý roztok, nadále pufrová sekce, obsahuje přibližně

130 mg/ml až přibližně 270 mg/ml chloridu sodného, přibližně 5,0 až přibližně 55,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru se zásaditou hodnotou pH přibližně 10,5 až 12,5. Po smísení se hodnota pH vyrovná na isoe 1 ektrický bod analogu, pH přibližně 5,0 až 6,0. Krystaly se vysrážejí z roztoku. Nadále se tento roztok oznčuje jako krystalová sekce.

Při hodnotě pH přibližně 5,0 až 6,0 se vysrážejí krystaly za míchání přibližně 6 až 72 hodin. Přesný čas pro úplný růst krystalů však závisí na zvoleném analogu a na použitých podmínkách. Krystaly podle vynálezu jsou dobře definované, tvaru ronboedru.

S výhodou se do matečného roztoku dávají očkovací krystaly k vytvoření rovnoměrnějšího rozdělení velikosti krystalů a k urychlení krysta 1 izace. Příprava očkovacích krystalů je v oboru známa a mohou být připraveny z lidského, z hovězího nebo z vepřového inzulínu nebo z analogu inzulínu.

Vzhledem k tomu, že monomerní analogy inzulínu samočinně neasociují, nejsou fyzikální vlastnosti a chrakteristiky analogu obdobné inzulínu. Například různé monomerní analogy vykazují malou nebo žádnou asociaci navozenou zinkem. To je dramaticky odlišné od inzulínu, který je téměř výhradně v hexamerní konfiguraci v přítomnosti zinku. Jelikož je zapotřebí nejméně dvou atomů zinku k doplnění s každým inzulínovým hexamerem k vytvoření správného krystalu Ultralente inzulínu, je dosti překvapivé, že krystaly analogu inzulínu se tvoří za podmínek obdobných podmínkám, užitým k přípravě Ultralente inzulínu.

Kromě toho se krystaly připravují s výhodou v přítomnosti nízkých hladin fenolu, přibližně 500 až 3000 ppm. Protože konzervativní vazbu, která je při molárních poměrech, nutí analog « · ·

Ί

ke spontánní asociaci, je překvapivé, že ke krystalizaci dochází s monomerním analogem v nepřítomnosti vysoké konzervační koncentrace. Podle toho je tvoření krystalů neočekávané vzhledem k omezené tendenci monomerních analogů tvořit hexamery. To je v kontrastu s inzulínem, který ochotně tvoří hexamery v přítomnosti zinku bez ochrany.

Kromě toho je v oboru známo, že fenolová konzervační činidla upravují krystalizaci Ultralente. Je proto překvapivé, že krystaly analogů se tvoří s obsaženými fenolovými konzervačními činidly za popsaných podmínek.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků na bázi krystalů analogů inzulínu, vhodných k léčení cukrovky subkutánními injekcemi. Parenterální farmaceutické prostředky obsahují v podstatě sterilní vodné suspense přibližně 20 J/ml až přibližně 500 J/ml analogu inzulínu, přibližně 5 ng/ml až přibližně 10 mg/ml chloridu sodného, 0,2 až přibližně 2,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru, s obsahem zinečnatých iontů přibližně 0,04 mg/ml až přibližně 20,0 mg/ml a fyziologicky vhodné konzervační činidlo při hodnotě pH 6,5 až přibližně 7,8, takže méně než 5 % obsaženého analogu je v rozpuštěném stavu. S výhodou je ve farmaceutickém prostředku v rozpuštěném stavu méně než 2 % analogu.

Zde popsané farmaceutické prostředky analogu inzulínu se připravují v oboru o sobě známými způsoby k přípravě prostředků ultralente lidského inzulínu. Suspense krystalů analogu inzulínu se zředí ředicím roztokem obsahujícím fyziologicky vhodný pufr a konzervační činidlo. Hodnota pH se nastaví na přibližně 7,3 až přibližně 7,4.

Farmaceutické prostředky (nebo také formulace) podle vyná• · lezu, obsahující analog inzulínu vedou k pomalé absorpci analogu, takže popřípadě stačí jedna injekce denně.

Farmaceutický prostředek obsahuje konzervační činidlo, jako je methylparaben a zinek v množství přibližně 0,04 až přibližně 20.0 mg/ml při hodnotě pH přibližně 7,1 až přibližně 7,5. Chlorid sodný, obsažený v krystalech, slouží jako isotonické činidlo. Pracovníkům v oboru je ovšem známo, že pokud je to nutné, dá se isotonicity dosáhnout chloridem sodným nebo jiným isotonickým v oboru známým činidlem, například glycerinem. Rovněž je pracovníkům v oboru známo, že jsou k dispozici četná jiná konzervační činidla. Podle výhodného provedení je celková koncentrace zinku přibližně 0,04 mg/ml až přibližně 0,1 mg/ml, s výhodou 0,08 mg/ml pro formulaci J40 a přibližně 0,1 až přibližně 0,24 mg/ml, s výhodou 0,14 mg/ml pro formulaci JI 00.

Hodnota pH může být upravena fyziologicky vhodným pufrem. Takovým pufrem je octan sodný anebo jiný pufr, který nereaguje silně se zinkem.

Nejvýznamnější je, že časové působení formulace je dále rozšířeno přidáním dodatečného zinku do formulace, takže celková koncentrace zinku je přibližně 0,5 až přibližně 20 mg na 100 jednotek, s výhodou přibližně 0,5 až přibližně 7 mg na 100 jednotek inzulínu. Dodatečný zinek se přidává po kompletaci a formulaci krystalů. Formulace vyztužené zinkem mají více než 50 % celkového obsahu zinku ve formulaci v rozpustné frakci, spíše než v komplexu s inzulínem. Hodnota pH zinkem vyztužené formulace je obvykle 6,0 až 7,4.

Vynález se dále týká analogových formulací inzulínu sestávajících v podstatě ze směsi krystalického a amorfního ma• « • · · • · · · · • « · · · fl ’ · » teriálu, podobných formulaci Leňte a výlučně amorfních formulací, podobných Semi-Lente. Tyto směsi zaručují předem určovatelné prodloužené působení s rychlejším nástupem. Kromě toho zaručují formulace delší trvání účinku než rozpustný analog inzulínu.

Specifické zde popsané podmínky krystalizace zajišfují výlučně krystalické prostředky. Jestliže se podmínky změní, vytvoří se různá množství amorfního, nekrysta 1 ického materiálu. Obecně odstranění halogenidu z pufrové sekce nebo krystalizace při neutrální hodnotě pH místo při isoe1ektrickém bodu produkuje nekrysta1ický materiál. Kombinace těchto modifikací se používá k přípravě amorfního produktu k zajištění úplné produkce amorfního materiálu. Jelikož každý monomeriní analog bude mít mírně odlišné optimální podmínky pro výrobu výlučně krystalického produktu, je pracovníkům v oboru zřejmé, že jsou možné jiné postupy a jiné podmínky pro přípravu amorfního materiálu. Například přidání pufru se silnou afinitou k zinečnatým iontům úplně přeruší krystalizací.

S výhodou se připraví koncentrovaná suspense zinkového amorfního analogu vysrážením částic amorfního analogu zinek-inzulín z roztoku obsahujícího v podstatě přibližně 200 J/ml až přibližně 1200 J/ml analogu inzulínu, přibližně 2,0 až přibližně 20.0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru, přibližně 50,0 mg/ml až přibližně 100 mg/ml chloridu sodného a molární nadbytek zinečnatých iontů při hodnoě pH přibližně 7,0 až přibližně 7,5.

Formulace semi-Lente analogu se připraví rozředěním koncentrované suspense amorfního analogu zinek-inzulín, k získání formulace obsahující v podstatě přibližně 20 J/ml až přibližně 500 J/ml analogu inzulínu, přibližně 5 mg/ml až přibližně 10 mg/ml chloridu sodného. 0,2 až přibližně 2,0 mg/ml fyziologie10

• · · · · • · · · · « • · · · • · · · · · • · ♦ · ······· tt * ky vhodného pufru, s o bsahem zinečnatých iontů přibližně 0,07 mg/ml až přibližně 20,0 mg/ml a fyziologicky vhodného konzervačního činidla při hodnotě pH přibližně 6,5 až přibližně 7,8 tak, přičemž méně než hmotnostně 5 % analogu obsaženého v suspensi je v rozpuštěném stavu.

Formulace Lente-like analogu inzulínu je směsí 70 % krystalického a 30 % amorfního materiálu. Krystalická část se připraví způsobem popsaným zde pro krystaly analogu inzulínu. Amorfní materiál se připraví jak je zde popsáno pro semilente like analog inzulínu. Krystalická a amorfní část se zkombinují obvyklými způsoby.

Analog inzulínu podle vynálezu může být připraven jakýmkoliv o sobě známým způsobem syntézy peptidů včetně klasického způsobu (v roztoku), způsobem v pevné fázi, po 1o-syntetickými způsoby a nověji rekombinantními DNA způsoby.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Díly a procenta jsou míněny hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příprava 1

Příprava očkovacích krystalů

Metodologie přípravy očkovacích krystalů Lente-seed je v oboru známá a je popsána v knize Jorgan Schlictkru11, Insulin Crystals: IV. The Preparation of Nuclie, Seeds and Monodisperse Insulin Crystals Suspensions Acta Chemica Scandinavica, 11, str. 299 až 302 (1957).

• · a · a · a ·

Příklad 1

Příprava krystalů monomerního analogu

Sekce lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29

Do odměrné baňky s magnetickým míchadlem se vnese 1,034 g krystalů lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29 (endogenní obsah zinku 0,51 %, koncentrace fenolu 939 ppm). Krystaly se suspendují v přibližně 30 ml vody Milli—Q™. Přidá se 0,464 ml podíl 10 mg/ml kyselého roztoku oxidu zinečnatého k doplnění celkového množství zinku na 4,64 mg. Hodnota pH se nastaví na 2,77 pomocí 10% kyseliny chlorovodíkové. Po úplném vyčeření roztoku se přidá voda Milli-Q™ k doplnění celkové hmotnosti roztoku na 40 g. Konečný roztok analogu (nadále analogová sekce) se zfiltrtuje přes 0,22 um filtr (Millipore Sterivex™-GV Filter Unit)

Pufrová sekce:

Do odměrné baňky s magnetickým míchadlem se vnese 0,565 g octanu sodného, 4,947 g chloridu sodného. K rozpuštění soli se použije přibližně 25 g vody Milli-Q™ a hodnota pH se nastaví 10% roztokem hydroxidu sodného na přibližně 11 . Po nastavení hodnoty pH se roztok doplní vodou Milli-Q™ na 30 g. Roztok (nadále pufrový roztok) se zfiltrtuje přes 0,22 um filtr (Millipore Sterivex™-GV Filter Unit). Pufrový roztok se nastaví na hodnotu pH 12,01 pomocí 0,25 ml 10% roztoku hydroxidu sodného k dosažení hodnoty pH 5,6 po spojení s analogovým roztokem.

Krystalizace:

K přípravě 50 ml 400 J/ml krystalů (nadále krystalová sekce) se použije následujících podmínek. Do krysta 1 i začni nádoby se vnese 29,716 ml analogové sekce. Za níchání se přidá do nádoby celkové množství 18,75 ml pufrové sekce. Po 60-sekundové prodlevě se přidá do nádoby 1,544 ml očkovací směsi lidského inzulínu (funkcionalita = 4) při | funkcionalitě násobené gramy analogu. V míchání se pokračuje 24 hodin při teplotě místnosti.

Příklad 2

Farmaceutická příprava analogu inzulínu s prodlouženým účinkem 40 J/ml

Ředicí roztok:

Zásobní roztok methy1parabenu (2 mg/g ) se připraví rozpuštěním 0,6 g methy1parabenu ve vodě Milli-Q™ na konečnou hmotnost 300 g. Do odměrné baňky s magnetickým míchadlem se vnese 277,78 g zásobního roztoku me thyparabenu, 0,444 g octanu sodného, 4,785 g kyselého roztoku oxidu zinečnatého. Hodnota pří se nastaví na 5,53 pomocí 10% roztoku hydroxidu sodného. Přidá se voda Milli-Q™ k doplnění celkové hmotnosti roztoku na 500 g a roztok se zfiltruje přes 0,22 μηι filtr (Millipore Sterivex™-GV filtrační jednotka).

Formu láce:

Do ředicího roztoku se přidá 0,020 ml podíl 10% kyseliny chlorovodíkové a 0,750 ml podíl 10% roztoku hydroxidu sodného k úpravě hodnoty pH na 7,72 tak, že sloučením krystalové sekce a ředicího roztoku se nastaví konečná hodnota pH na 7,3 až 7,4. Do odměrné nádoby s magnetickým míchadlem se vnese 360 g ředicího roztoku (při 90 % koncového objemu měrná hmotnost • 999 • « ••ί

1,000) a pak 42,40 g krystalové sekce (při 10 % konečného objemu měrná hmotnost= 1,060). Konečná hodnota pH se upraví na 7,27 až 7,34 pomocí 0,10 ml 10% roztoku hydroxidu sodného. Příklad 3

Charakteristika krystalů a konečné formulace

Krystaly lidského inzulínu Lys®²⁸ Pro®²⁹ , připravené uvedeným způsobem, se zkoumají mikroskopicky a zjistí se, že po 24-hodinové krystalizací sestávajíí převážně z romboedrů o velikosti 10 pm. Také konečných 40 J/ml Lys®²⁸ Pro®²⁹ se zkoumá mikroskopicky a podrobí se řadě analytických testů k ověření přípravy a budoucího procesu. Mikroskopické zkoumání konstatuje obsah romboedrických krystalů ve formulaci. Při 14 000 otáčkách za minutu se odstreduje 1 ml podíl pečlivě resuspendované formulace po dobu 10 minut. Supernatant se opatrně odstraní a do 800 pl se přidá 1 pl 9,6M kyseliny chlorovodíkové. Podíl 10 pl se pak injektuje do systému chromatografie HPLC pracujícího způsobem reversní fáze. Výsledky tohoto testu ukazují, že supernatant obsahuje 0,034 J/ml nezkrvsta 1 izovaného lidského inzulínu Lys®²⁸ Pro®²⁹. Celková schopnost formulace se stanoví okyselením 1 ml resuspendovaného prostředku za použití 3 pl 9,6 M kyseliny chlorovodíkové a následným zředěním vzorku na 5 ml Ο,ΟΙΜ kyselinou chlorovodíkovou. Podíl 20 pl vzorku se injektuje do systému HPLC pracujícího způsobem reversní fáze. Celková zjištěná potence formulace je 43,6 J/ml. čistota formulace se zjistí chromatografií reversní fáze přímým injektováním 20 pl okyseleného (3 pl 9,6M kyseliny chlorovodíkové) 1 ml podílu do vzorku. Zjištěná čistota je 98,3% na píku oproti celkovému základu. Obsah polymeru s vysokou molekulovou hmotností se zjistí chromatografií HPLC vylučující velikost přímým injektováním 20 pl okyseleného podílu 1 ml. Celková hladina polymeru je 0,17 % na píku oproti celkovému

zák1adu.

Příklad 4

Zkouška rozpustnosti in vitro

Tento způsob je modifikací postupu publikovaného v literatuře (Graham and Pomeroy J. Pharm. Pharmacol. 36, str.427 až 430, 1983). Způsob, o kterém se v oboru soudí, že je vhodný pro předpovědí biologické odezvy, používá míru rozpouštění krystalů po významném zředění pufrem nevázajícím zinek za cestu k předpovědi rychlosti, s jakou se krystalická formulace bude rozpouštět po subkutánním injektování do zvířat.

Prostředek (LysPro v tabulce I) krystalického lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29 (40 J/ml) se testuje oproti Humulinu™ Ultralente a oproti dvěma 40 J/ml prostředkům lidského inzulínu Leňte. Dávky (0,2 ml) těchto suspensí se vnesou do 20 ml O,1M Tris (tris-hydroxymethy1aminomethan, Ma11inckrodt, Paris, KY) pufru pH 7,5 a míchá se při teplotě místnosti ve skleněné baňce. V časových periodách po 0,5, 3 a 8 hodinách se odebírají 0,2 ml podíly míchaných vzorků a zfiltrují se filtrem 0,2 pm Acrodisc^R. Chromatografií HPLC s reversní fází se kvantifikuje množství inzulínu ve filtrátu. Maximální obsah inzulínu se stanoví počátečním zkoušením nefi 11rovaného okyseleného podílu. Hodnoty se uvádějí jako procento maximálního množství inzulínu v každém vzorku.

• · • · ·

Tabulka I

Zkouška rozpustnosti in vitro v závislosti na čase

Vzorek	0,5	čas v hodinách
3	8
Humulin™ Ultralente	17,7 %	51,0 %	90,4 %
Humulin™ Leňte 1	4 3,0 %	74,9 %	98,2 %
Humulin™ Leňte 2	4 5,6 %	61,7 %	80,1 %
Krystaly LysPro	26,0 %	67,6 %	9 5,0 %

Výsledky v tabulce I ukazují, že rozpouštěcí vlastnosti krystalů mají prodloužený účinek.

Příklad 5

Příprava krystalů lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29

Do odměrné baňky s magnetickým míchadlem se vnese 1,048 g zinku a méně než 500 ppm krystalů lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29-hI (koncentrace fenolu neměřitelná). Krystaly se suspendují v přibližně 30 ml vody a přidá se 0,942 ml podíl 10 mg/ml kyselého roztoku oxidu zinečnatého. Hodnota pH se nastaví na 2,6 pomocí 10% kyseliny chlorovodíkové a 10% roztokem hydroxidu sodného. Po úplném vyčeření roztoku se přidá voda k doplnění celkové hmotnosti roztoku na 38,95 g. Konečný roztok se zfiltrtuje přes 0,22 pm filtr (Millipore Sterivex™-GV Filter Unit).

Pufrová sekce

Do odměrné baňky s magnetickým míchadlem se vnese 0,565 g octanu sodného, a 4,947 g chloridu sodného. K rozpuštění soli » » •••i pH se nastaví 10%

11,52. Po nastavení se použije přibližně 25 g vody a hodnota roztokem hydroxidu sodného na přibližně hodnoty pH se roztok doplní vodou na 30 g. Konečný roztok se zfiltrtuje přes 0,22 pm filtr (Millipore Sterivex™-GV Filter Unit) .

Krystal izace:

Ke zjištění správné hodnoty pH pufrové sekce, potřebné k dosažení hodnoty pH 5,5 až 5,6 pro podmínky konečné krystalizace se připraví zkušební směs Lys®²⁸ Pro®²⁹-hl a pufrové sekce (0,75 ml Lys®²⁸ Pro®²⁹-hl a 0,45 ml pufrové sekce). Hodnota pH pufrové sekce se nastaví na 12,13 pomocí 0,28 ml 10% roztoku hydroxidu sodného k dosažení výsledné hodnoty pH 5,6 po smísení se sekcí Lys®²⁸ Pro®²⁹-hl. K přípravě 50 ml 400 J/ml lidského inzulínu Lys^B28Pro®²⁹ (krysatlové sekce) se použije následujícího způsobu: Do krystalizační nádoby se vnese 30,61 g sekce lidského inzulínu Lys®²⁸ Pro®²⁹, kterou je sekce lidského inzulínu Lys^B28Pro®²⁹ plus očkovací krystaly odpovídající 62,5 % objemu krystalové sekce. Za stálého míchání se do nádoby přidá celkem 18,75 ml pufrové sekce při 37,5 % krystalové sekce. Po 60-sekundové prodlevě se přidá do krystalové sekce 0,824 ml očkovací směsi lidského inzulínu (funkcionalita = 2) při | funkcionalitě znásobené gramy Lys®²⁸ Pro®²⁹-hl. V míchání se pokračuje 48 hodin při teplotě místnosti, (hl = human insu1in).

Suspense se po 48 hodinách zkoumá mikroskopicky (při zvětšení 600 x) a konstatuje se, že směs obsahuje dobře definované romboedrické krystaly, krystaly neúplného tvaru a amorfní materiál.

• ······ · · · ·e. <

• · · · * · · · ·····» ·» «

Příklad 6

Příprava amorfního precipitátu lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29

Sekce lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29

Do odměrné baňky s magnetickým míchadlem se vnese 0,994 g zinek obsahujících krystalů lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29(endogenní zinek 0,43 %, koncentrace fenolu 2663 ppm ). Krystaly se suspendují v přibližně 30 ml vody a do roztoku se přidá 0,515 ml podíl 10 mg/ml kyselého roztoku oxidu zinečnatého. Hodnota pH se nastaví na 3,6 pomocí 0,220 ml 10% kyseliny chlorovodíkové. Po úplném vyčeření roztoku se přidá voda k doplnění celkové hmotnosti roztoku na 40 g. Konečný roztok se zfiltrtuje přes 0,22 pm filtr (Millipore Sterivex™-GV Filter Unit).

Pufrová sekce

Do odměrné baňky s magnetickým míchadlem se vnese 0,565 g octanu sodného a 4,947 g chloridu sodného. K rozpuštění soli se použije přibližně 25 g vody a hodnota pH se nastaví 10% roztokem hydroxidu sodného na přibližně 12,6. Po nastavení hodnoty pH se roztok doplní vodou na 30 g. Konečný roztok se zfiltrtuje přes 0,22 pm filtr (Millipore Sterivex™-GV Filter Unit).

Amorfní suspense

Ke zjištění správné hodnoty pH pufrové sekce, potřebné k dosažení hodnoty pH 7,2 až 7,4 pro podmínky konečné krystalizace, se připraví zkušební směs Lys^B28 Pro®²⁹-hl a pufrové sekce (0,75 ml sekce Lys^B28Pro^B29-hl a 0,45 ml pufrové sekce).

• · • · · ·

• · · • · · · • · · · · · •00··

Do pufrové sekce se přidá další 10% kyselina chlorovodíková k nastavení hodnoty pH 12,2. Konečný roztok směsi obsahuje 31,25 ml sekce Lys^B28 Pro^B29-hI a 18,75 ml pufrové sekce při hodnotě pH 7,3. V míchání se pokračuje 24 hodin při teplotě míst nos t i.

Suspense se po 48 hodinách zkoumá mikroskopicky (zvětšení 600 x) a konstatuje se, že směs obsahuje výlučně amorfní materiál.

Příklad 7

Příprava krystalické a amorfní směsi

K přípravě formulace Lente-like se smísí 70 % krystalické suspense Lys^B28Pro^B29-hl podle příkladu 1 a 30 % amorfní suspense Lys^B28Pro^B29-hl podle příkladu 6.

Průmyslová využitelnost

Krystal analogu inzulínu, připravitelný definovaným způsobem a vhodný pro výrobu pro výrobu parenterálního farmaceutického prostředku s protrahovaným účinkem..

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY («^ΤΤΓΠΓίΠΤΓ

1. Parenterální farmaceutický prostředek na bázi analogu monomerního inzulínu s protrahovaným účinkem , vyznačující se t í m, že je tvořen sterilní vodnou suspensí 20 až 500 J/ml analogu inzulínu, 5 až 10 mg/ml chloridu sodného, 0,2 až 2,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru, 0,04 až 20,0 mg/ml iontů zinku a fyziologicky vhodnou konzervační látkou o hodnotě pH 6,5 až 7,8, přičemž méně než 5 % analogu, obsaženého v suspenzi, je v rozpuštěném stavu a obsahuje-li prostředek m-kresol, resorcinol nebo fenol, je jejich koncentrace menší než 3000 ppm.

2. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že analogem inzulínu je lidský inzulín Lys^B28Pro^B29

3. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že analogem obsaženým v suspensí je v podstatě krystalický materiál.

4. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že koncentrace analogu inzulínu je 40 J/ml, koncentrace chloridu sodného je 7 mg/ml, pufrem je 1,6 mg/ml octanu sodného a hodnota pH je 7,01 až 7,4

5. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že koncentrace analogu inzulínu je 100 J/ml, koncentrace chloridu sodného je 7 mg/ml, pufrem je 1,6 mg/ml octanu sodného a hodnota pH je 7,01 až 7,4

6. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že analogem obsaženým ·· ···· ·· · * ·· • · · ···· • · · · · ···· • ····· > · , · ·»· <

• · · · · · · ·· · ··· ·«·· ·· · v suspensi je v podstatě amorfní materiál.

7. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že analogem obsaženým v suspensi je ze 70 % krystalický a ze 30 % amorfní materiál.

8. Krystal analogu inzulínu, vyznačující se t í m, že je připravítelný srážením krystalů z roztoku obsahujícího v podstatě 200 až 1200 J/ml analogu inzulínu, 50 mg/ml až 100 mg/ml chloridu sodného, 2,0 až 20,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru a molární nadbytek zinečnatých iontů při hodnotě pH 5,0 až 6,0.

9. Krystal analogu inzulínu, vyznačující se t í m, že je připritelný smísením prvního roztoku obsahujícího 300 J/ml až 2000 J/ml analogu inzulínu, 500 ppm až 3000 ppm fenolu a molární nadbytek zinečnatých iontů při hodnotě pH 2,0 až 3,0 a druhého roztoku obsahujícího 130 mg/ml až 270 mg/ml chloridu sodného, 5,0 až 55,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru s hodnotou pH 10,5 až 12,5, přičemž konečný roztok má hodnotou pH 5,0 až 6,0.

10. Krystal analogu inzulínu podle nároku 9 a 10 , v y značující se tím, že analogem inzulínu je lidský inzulín Lys®²⁸ Pro®²⁹,

11. Způsob přípravy krystalů lidského inzulínu Lys®²⁸ Pro®²⁹ , vyznačující se tím, že se smísí první roztok obsahující 300 J/ml až 2000 J/ml analogu inzulínu a molární nadbytek zinečnatých iontů o hodnotě pH 2,0 až 3,0 a druhý roztok obsahující 130 až 270 mg/ml chloridu sodného, 5,0 až 55,0 mg/ml fyziologicky vhodného pufru o hodnotě pH 10,4 až 12,5, přičemž konečný roztok má hodnotou pH 5,0 až 6,0.