AT231062B - Verfahren zur Herstellung von Insulinkristallsuspensionen mit protrahierter Wirkung - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von Insulinkristallsuspensionen mit protrahierter Wirkung 
Es ist bekannt, Insulin aus einem wässerigen Medium zu kristallisieren, welches Ionen - in der Folge M-Ionen genannt-eines oder mehrerer der kristallisationsfördernden Metalle   (Zn, Cd, Co, Ni und Cu),   vorzugsweise Zink, enthält und einen PH-Wert im Bereich von   5.   5 bis 7 aufweist. Bei der Kristallisation wird   eine Puffersubstanz, ubUcherweise Natriumphosphat, Natrtumzitrat, Ammoniumazetat   oder Natriumazetat verwendet. Hinsichtlich der Verwendung von   Nairiumpnosphatpuffer   und Ammoniumazetatpuffer wird auf die   USA-Patentschrift Nr. 2, 143, 590   verwiesen und hinsichtlich der Verwendung von Natriumzitratpuffer auf die USA-Patentschrift Nr. 2, 626, 228.

   Manchmal wird auch ein Zusatz von Lösungsmitteln verwendet, welche in der Lage sind, die Ausfällung von amorphem Insulin zu verhindern. Beispiele hiefür sind Azeton, Propyl-, Butyl- und Amylalkohol. 



   Die so erhaltenen Insulinkristalle enthalten M-Ionen in chemischer Bindung innerhalb ihrer eigenen Kristallstruktur und die Menge dieser M'Ionen ändert sich je nach den angewandten Kristallisationsbedingungen. Diese Menge kann als Anzahl Metallatome pro Einheitszelle, d. h. pro kristallographischer Einheit mit 390 Atomen   Proteinstickstoff,   als prozentuale Menge von Metall in den getrockneten Kristallen oder als Metallmenge in   Grammäquivalenten   pro Gramm der getrockneten Kristalle ausgedrückt werden. Unter getrockneten Kristallen sind hiebei Kristalle zu verstehen, welche einen derartigen Wassergehalt aufweisen, dass sie einen Proteinstickstoffgehalt von ungefähr 14,   2%   zeigen. 



   Bei der Verwendung von Zitratpuffer erhält man Kristalle, welche zwei Metallatome pro Einheitszelle enthalten, was einem Gehalt   von 0, 34% Zink entspricht. Bei Anwendung des Verfahrens nach der   USA-Patentschrift Nr. 2, 143, 590, gemäss welchem die Kristallisation in Gegenwart von Natriumphosphatpuffer und die Umkristallisation in Gegenwart von Ammoniumazetatpuffer ohne Zusatz von Zinkionen erfolgt, enthalten die um kristallisierten Kristalle drei Atome Zink pro Einheitszelle der Kristalle, was einem Zinkgehalt von 0,   521o   entspricht. 



   Wenn man das Insulin aus einer Lösung in Abwesenheit von zinkfällenden Substanzen, wie beispielsweise Phosphationen, oder von Substanzen, welche Zinkkomplexverbindungen bilden, wie beispielsweise Zitrationen, auskristallisiert und hiebei beispielsweise einen Natriumazetatpuffer verwendet, so werden die erhaltenen Kristalle, wenn ein genügend hoher Gehalt von   M -Ionen im Kristallisationsmedium   angewandt wurde, bis zu fünf Metallatome pro Einheitszelle enthalten, was im Falle von Zink einem Zink- 
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 satzes von Natriumchlorid, in einer genügend hohen Konzentration aufweist (vgl. österr. Patentschrift
Nr. 191545). Auf Kristalle dieser Art bezieht sich die Erfindung nicht. 



   Wenn man Insulinkristalle mit einem Zinkgehalt von 0,   520/0   in destilliertem Wasser suspendiert hat und diese Suspension hierauf Kaninchen   injiziert hat (s. J. Pharm. 58 [1936], S. 93-104), stellt man fest,   dass die Wirkung kaum von der raschen und kurzzeitigen Wirkung einer Lösung der Kristalle unterschieden werden kann. Wenn anderseits M-Ionen in einem geeigneten Verhältnis zur Kristallsuspension zugegeben werden, wird, wie bekannt ist, eine hohe protrahierte Wirkung erzielt, da sich die suspendierten Kristalle bei neutraler Reaktion (dem pH-Wert des Blutes) mit denM-Ionen unter Bildung einer wenig löslichen und langsam resorbierbaren Insulin-Metallverbindung vereinigen, welche mindestens 5-6 Metallatome pro   Einheitszelle enthält (vgl. Science, Bd. 116, Nr. 3015 [1952j, S. 394-398).    



   Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass es zur Erzielung einer stark protrahierten Wirkung von Insulinkristallsuspensionen nicht Voraussetzung ist, dass eine derartige Absorption von die Kristallisa- tion fördernden Metallen durch die Insulinkristalle bei einem pH-Wert der Suspension von 7 stattfindet. 



   Die Erfindung, welche sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Insulinkristallsuspensionen mit protrahierter Wirkung bezieht, basiert auf den folgenden Erkenntnissen. 



   Wenn   Ochsen- oder   Kälberinsulinkristalle der oben angegebenen Art in einem wässerigen Medium suspendiert werden, welches einen pH-Wert von 5,5 und eine derartige Zusammensetzung aufweist, dass der Gehalt an freien M-Ionen der so hergestellten Suspension so niedrig ist, dass bei einem pH-Wert des Mediums von 7 die Insulinkristalle weniger als 5-6 Metallatome pro Einheitszelle enthalten, so findet man, dass diese Suspension keine wesentlich protrahierte Wirkung aufweist. Wenn anderseits die Suspension auf einen pH-Wert von 7 eingestellt wird, so erweist sich die Wirkung der Suspension überraschenderweise als wesentlich prolongiert. Dies ist umso überraschender, wenn man die Eigenschaften von aus Schweinepankreasdrüsen hergestellten Insulinkristallen betrachtet.

   Wenn eine Suspension wie die oben angegebene Suspension aus Schweineinsulin hergestellt wird und diese Suspension auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt wird, so weist sie keinen protrahierten Effekt auf und sie weist auch keinen protrahierten Effekt auf, wenn der pH-Wert auf 7 geändert wird, wobei die Schweineinsulinkristalle in Lösung gehen. 



   Es hat sich weiters erwiesen, dass die Wirkungsdauer von wässerigen Suspensionen von   Ochsen- oder   Kälber-Insulinkristallen erhöht wird, wenn diese Suspensionen längere Zeit bei Raumtemperatur oder bei höheren Temperaturen gelagert werden und wenn sie einen PH-Wert aufweisen, der wesentlich unterhalb von 7 liegt, während sich die Wirkungszeit praktisch nicht ändert, wenn die Suspensionen einen pH-Wert von ungefähr 7 (6,   5 - 7,   5) aufweisen. Ein Insulinpräparat soll stabil sein, und es haben ausgeführte Versuche gezeigt, dass die Stabilität dieser Suspensionen bei einem pH-Wert von ungefähr 7   (6,     5-7, 5)   und nur innerhalb dieses pH-Bereiches erhalten wird. 



   Gemäss den obigen Beobachtungen besteht das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von wässerigen injizierbaren Insulinkristallsuspensionen von aus Rinderpankreas gewonnenen Insulinkristallen mit rhomboedrischer Struktur in Form von Zwillingskristallen, Sternen oder deformierten Rhomboedern darin, dass man die Suspensionen der Insulinkristalle, die zweckmässig vorher keinem Trocknungsprozess unterworfen wurden, auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 einstellt und puffert und den Gehalt an Ionen 
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 drüsen stammt und welche denselben pH-Wert aufweist. Die Stabilität der Suspensionen wird dadurch bei der Lagerung nicht beeinflusst. 



   Das folgende Beispiel veranschaulicht das erfindungsgemässe Verfahren. 



   Beispiel   : 3, 48 g Ochsen-Insulinkristalle   mit einem Gehalt von   0,78ho   Zink    werden in 100 cm3   Wasser suspendiert und durch Zugabe von 4 cm3   in-cl   gelöst, die Lösung wird steril gefiltert und mit sterilem Wasser auf 150 cm3 verdünnt. Zu dieser Lösung werden 50   crr     ? 0, 4-molares   Natriumacetat gesetzt, welches so viel Natriumhydroxyd enthält, dass das Gemisch einen pH-Wert von 5, 5 aufweist.

   Nach dem Mischen kristallisiert das Insulin unter langsamem, vierundzwanzigstündigem Rühren, worauf die Suspension durch Zugabe von 1800    cm3     Methyl-p-oxy-benzoatlösung   mit einem Gehalt von   0, lilo   Methyl-p-oxy-benzoat, 14 g Natriumchlorid und so viel NaOH verdünnt wird, dass der pH-Wert der endgültigen   Suspension 7, 3 - 7, 4   beträgt. 



   Anstatt wie im obigen Beispiel einen Natriumazetatpuffer zu verwenden, kann auch Natriumphosphat-oder Natriumzitratpuffer verwendet werden. Es ist auch möglich, Insulinkristalle zu verwenden, welche einen geringeren Zinkgehalt aufweisen, oder Insulinkristalle, welche einen Gehalt an andern, die Kristallisation fördernden Metallen als Zink aufweisen. 



   Ausserdem   können   zum wässerigen Suspensionsmedium zusätzlich noch Ionen von die Kristallisation fördernden Metallen zugesetzt werden. 



   PATENTANSPRÜCHE : 
1. Verfahren zur Herstellung von wässerigen injizierbaren Insulinkristallsuspensionen von aus Rinderpankreas gewonnenen Insulinkristallen mit rhomboedrischer Strukrur in Form von Zwillingkristallen, Sternen oder deformierten Rhomboedern, dadurch gekennzeichnet, dass man die Suspensionen der Insulinkristalle, die zweckmässig vorher keinem Trocknungsprozess unterworfen wurden, auf einen pH-Wert zwischen 6, 5 und 7, 5 einstellt und puffert und den Gehalt an Ionen eines oder mehrerer der die Kristallisation des Insulins fördernden Metalle, vorzugsweise Zink, so bemisst, dass er weniger als   13.A.10'   Milliäquivalente pro   l   beträgt, wobei A die Anzahl der Insulineinheiten pro   cm3   bedeutet, so dass die suspendierten Insulinkristalle bei PH 7 der Suspension weniger als 0,

   25 Milliäquivalente der genannten Metalle pro Gramm der getrockneten Kristalle enthalten.

Claims (1)

1. 2. Weitere Ausgestaltung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Sinne der Erzielung einer Initialwirkung der Suspension eine Lösung von Insulin aus Schweinepankreasdrüsen zugesetzt wird, welche denselben pH-Wert aufweist.