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Verfahren zur Herstellung von stabilen Insulinkristallsuspensionen
mit protrahierter Wirkung Es ist bekannt, Insulin aus einem wäßrigen Medium, das
ein die Kristallisation förderndes Metall, vorzugsweise Zink, enthält, dadurch auskristallisieren,
daß das wäßrige Medium auf einen pH-Wert zwischen 5 und 7 eingestellt wird. Mm den
pH während der Kristallisation zu fixieren, wird eine Puffersubstanz zugesetzt,
im allgemeinen Natriumphosphat, Natriumzitrat, Ammoniumacetat oder Natriumacetat.
In manchen Fällen wird auch ein organisches Lösungsmittel zur Verhinderung einer
Ausfällung von amorphem Insulin zugesetzt, beispielsweise Aceton, Propyl-, Buty1-
oder Amylalkohol.
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Derart hergestellte Insulinkristalle sind rhomboedrischer Struktur
und enthalten im Kristallgitter gebundene Ionen der die Kristallisation fördernden
Metalle in einer von den angewandten Kristallisationsbedingungen abhängigen Menge.
Der Metallgehalt kann in Prozentsätzen, bezogen auf getrocknetes Kristallgut, oder
in Metallmilliäquivalenten pro Gramm der getrockneten Kristalle ausgedrückt werden.
Unter getrockneten Kristallen werden solche verstanden, die einen derartigen Wassergehalt
aufweisen, daß der Gehalt an Proteinstickstoff bei ungefähr 14,2% liegt. Mit Zink
als Beispiel kann man durch die Kristallisation Insulinkristalle erhalten, die bis
zu 1% Zink enthalten, was ungefähr 0,35 Miniäquivalenten von Zink pro Gramm der
getrockneten Kristalle entspricht.
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Bei der Kristallisation von Insulin aus Rinderpankreasdrüsen werden
Kristalle erhalten, welche die Form von Zwillingskristallen, »Sternen« oder deformierten
Rhomboedern besitzen, auch dann, wenn eine Rekristallisation durchgeführt wurde,
es sei denn, daß Halogenionen in einer Konzentration von mehr als 0,2 Mol pro Liter
im wäßrigen Kristallisationsmedium anwesend sind. In diesem Falle erscheinen die
Kristalle als scharfkantige, von ebenen Kristallflächen begrenzte Rhomboeder. An
Stelle eines Zusatzes von Halogeniden kann man auch Triäthanolaminhydrochlorid,
Harnstoff oder Formamid verwenden.
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Mittels der verschiedenen oben beschriebenen Insulinkristalle hat
man Insulinpräparate mit protrahierter Wirkung dadurch hergestellt, daß man die
Kristalle in einem wäßrigen Injektionsmedium suspendiert hat, das einen solchen
Gehalt an Ionen der die Kristallisation des Insulins fördernden Metalle, vorzugsweise
Zink, enthält, daß die suspendierten Insulinkristalle bei neutraler Reaktion mindestens
0,35 Milliäquivalente der erwähnten Metalle pro Gramm der getrockneten Kristalle
enthalten.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
stabilen Insulinpräparaten mit protrahierter Wirkung durch Suspendieren in einem
wäßrigen Injektionsmedium von an sich bekannten Insulinkristälen, -die scharfkantige,
von ebenen Kristallflächen begrenzte Rhomboeder darstellen. Die Erfindung besteht
darin, daß man von aus Rinderpankreasdrüsen gewonnenen Insulinkristallen ausgeht,
die erhaltene Suspension auf einen pH-Wert von etwa 7 einstellt und der Suspension
in bekannter Weise einen solchen Gehalt an Ionen der die Kristallisation des Insulins
fördernden Metalle, vorzugsweise Zink, gibt, daß die suspendierten Insulinkristalle
weniger als 0,35 Milliäquivalente an den vorerwähnten Metallen pro Gramm der getrockneten
Kristalle enthalten.
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Während man bisher der Ansicht gewesen ist, daß es für die therapeutische
Wirkung von Insulinkristallsuspensionen mit protrahierter Wirkung ohne Bedeutung
ist, welchen pH-Wert zwischen etwa 5 und 8 die Suspensionen besitzen, wurde bei
den im Zusammenhang mit der Erfindung durchgeführten Versuchen festgestellt, daß
der pH-Wert von Suspensionen von Rinderinsulinkristallen für deren therapeutische
Stabilität überraschenderweise von ausschlaggebender Bedeutung ist. Nur bei einem
pH-Wert von ungefähr 7 (6,5 bis 7,5) bleibt die therapeutische Wirkung auch bei
einer 2wöchigen Aufbewahrung bei etwa 40° C praktisch erhalten. Bei Aufbewahrung
von Insulinkristallsuspensionen
bei einem niedrigeren pH-Wert und
bei Temperaturen oberhalb 20° C erfolgt eine Steigerung der protrahierten Wirkung
in Abhängigkeit der Aufbewahrungsdauer und -temperatur.
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Es konnte auch nicht vorausgesehen werden, daß rian eine klinisch
brauchbare protrahierte Wirkung erhalten würde, wenn die suspendierten Insulinkristalle
bei neutraler Reaktion weniger als 0,35 Milliäquivalente an der die Kristallisation
des Insulins fördernden Metalle pro Gramm der getrockneten Kristalle enthalten,
und daß diese Wirkung nur mit aus Rinderpankreasdrüsen gewonnenen Insulinkristallen
erhältlich ist.
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Die erfindungsgemäß hergestellten Insulinpräparate weisen eine mäßig
protrahierte Wirkung auf. Sie haben eine kürzere Wirkungsdauer als die der Suspensionen
von Insulinkristallen mit mehr als 1% Zink bei neutraler Reaktion der Suspensionen,
erlauben jedoch bei zweimaliger Injektion pro Tag eine fast gleichbleibende protrahierte
Wirkung, die in gewissen Fällen von Medizinern dieser Richtung bevorzugt wird.
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Das Verfahren nach der Erfindung hat demjenigen Verfahren gegenüber,
bei welchem man eine Suspension von Insulinkristallen mit einem Zinkgehalt über
1% bei neutraler Reaktion herstellt, den Vorteil, daß man mit geringem Zinkgehalt
auskommen kann. Es erübrigt sich ein zusätzlicher Zinkzusatz. Man kann einfach das
Rinderinsulin in bekannter Weise unter sterilen Bedingungen kristallisieren und
dann durch Verdünnung auf neutrale Reaktion und auf die therapeutisch brauchbare
Insulinkonzentration einstellen. Auch kann man beliebige, gegebenenfalls zinkbindende
Pufferstoffe, wie Phosphat- oder Zitratpuffer, verwenden.
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Die Herstellung der Kristallsuspensionen erfolgt unter aseptischen
Bedingungen. Vorzugsweise wird die Suspension isotonisch eingestellt, beispielsweise
durch Zusatz von Natriumchlorid. Ferner kann ein Konservierungsmittel zugesetzt
werden, beispielsweise p-Oxybenzoesäuremethylester und gegebenenfalls auch eine
Puffersubstanz, beispielsweise ein Acetat-, Phosphat- oder Zitratpuffer. Die Kristalle
werden vorzugsweise unter Verwendung von Zink als kristallisationsförderndes Metall
hergestellt. Zusammen mit oder an die Stelle von Zink können auch andere die Kristallisation
fördernde Metalle, beispielsweise Nickel, Cadmium, Kobalt und Kupfer, verwendet
werden.
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Zur Erläuterung der nach der Erfindung erreichten Stabilität der hergestellten
Insulinkristallsuspensionen und der erreichten verlängerten Insulinwirkung wird
auf die Blutzuckerkurven der Abbildung verwiesen. Diese Kurven werden in folgender
Weise erhalten: Es werden nach dem Verfahren des nachstehenden Beispiels 1. vier
verschiedene Insulinkristallsuspensionen mit den pH-Werten 5,0, 5,5, 6,0 und 7,0
hergestellt. Jede dieser Suspensionen wird in zwei Teile geteilt und der eine Teil
bei 4° C und der andere Teil bei 45° C jeweils während einer Dauer von 2 Wochen
gelagert. Die biologische Wirkung der aufbewahrten Suspensionen wird dann in üblicher
Weise bei Kaninchen geprüft, wodurch die gezeigten Blutzuckerkurven erhalten werden.
Die Kurven zeigen deutlich die mangelhafte therapeutische Stabilität der Suspensionen
mit einem pH-Wert von 5,0, 5,5 und 6,0 und die vorzügliche Stabilität der Suspension
mit einem pH-Wert von 7,0, wenn sämtliche Suspensionen bei erhöhter Temperatur gelagert
werden.
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Wenn die acht untersuchten Insulinkristallsuspensionen, deren Kurven
aufgezeigt sind, angesäuert werden, so daß Insulinlösungen gebildet werden, dann
weisen die erhaltenen Insulinlösungen nach Einspritzen auf Kaninchen alle dieselbe
biologische Wirkung auf,. die sich im Laufe kurzer Zeit, d. h. ohne Verzögerung,
entfaltet. Da die den drei oberen Kurven entsprechenden Präparate also die gleiche
Menge aktiven Insulins wie die anderen den fünf unteren Kurven entsprechenden Präparate
enthalten, werden sie eine viel längere Wirkungszeit als die fünf anderen Präparate
aufweisen als Kompensation dafür, daß sie, wie die Kurven zeigen, am Anfang nicht
so kräftig wie die fünf anderen Präparate wirken. Die den drei oberen Kurven entsprechenden
Präparate wirken somit mehr protrahiert als die den fünf unteren Kurven entsprechenden
Präparate. Beispiel 1 Es wird eine sterile Mischung hergestellt, bestehend aus 1,7°/o
Insulin aus Ochsenpankreas, 0,013% Zink in der Form von Zinkchlorid, 0,1 Mol Natriumacetat
und 7 "/o Natriumchlorid zusammen mit so viel steriler Salzsäure, daß der pH-Wert
der Mischung.5,5 beträgt. Die so gewonnenen Kristalle haben die Form scharfkantiger
Rhomboeder mit ebenen Kristallflächen und enthalten 0,7% Zink entsprechend 0,21
Milliäquivalent Zink pro Gramm. Die Kristalle haben eine biologische Wirksamkeit
von etwa 23 internationalen Einheiten pro Milligramm.
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Ein Teil der so hergestellten Kristallsuspensionen des Insulins wird
mit 9 Teilen sterilisiertem 0,11% p-Oxybenzoesäuremethylester enthaltenden Wasser
verdünnt. Anschließend wird der pH-Wert der Suspension durch Zugabe 1 n-Natronlauge
auf 7,0 eingestellt. Die Insulinkristalle in dieser Susperision zeigen einen Zinkgehalt
von 0,7%. Die hergestellte Suspension ändert bei Aufbewahrung in längerer Zeit selbst
bei erhöhter Temperatur ihre therapeutische Wirkung nicht. Beispiel 2 Es wird eine
sterile Mischung hergestellt, die 1,70,/o Insulin von Ochsenpankreas, 0,13% Zink
in der Form von Zinkchlorid, 0,05 Mol Natriumzitrat und 71/o Natriumchlorid enthält.
Aus dieser Mischung wird das Insulin durch Zusatz steriler Salzsäure in einer solchen
Menge, daß der pH-Wert der Mischung 6 beträgt, auskristallisiert. Die erhaltenen
Kristalle haben die Form scharfkantiger Rhomboeder mit ebenen Kristallflächen und
enthalten etwa 0,7% Zink, entsprechend 0,21 Miniäquivalenten Zink pro Gramm.
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Die erhaltene Kristallsuspension des Insulins wird mit so viel sterilisiertem
Wasser, das 0,11% p-Oxybenzoesäuremethylester enthält, verdünnt, daß schließlich
die Kristallsuspension 40 internationale Insulineinheiten pro Kubikzentimeter enthält,
nachdem die Suspension durch Zusatz von 1 n-Natronlauge auf das pH 7 eingestellt
worden ist. Infolge des Gehalts an Zitratpuffer indem Kristallisationsmedium steigt
der Zinkgehalt in den suspendierten Kristallen nicht an, wenn die Suspension ein
pH 7 aufweist.
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Die so erhaltene Kristallsuspension des Insulins weist eine der gemäß
Beispiel 1 hergestellten Suspension
entsprechende protrahierte
Wirkung und dieselbe Stabilität auf.
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Man kann auch von Rinderinsulinkristallen mit einem höheren Zinkgehalt
als etwa 1% ausgehen, wenn man einen zinkbindenden Pufferstoff wie Natriumphosphat
verwendet. Durch Einstellung der Kristallsuspension auf ein pH von etwa 7 binden
die Phosphationen so viel Zink, daß der Zinkgehalt der suspendierten Kristalle auf
weniger als 111/o absinkt.