AT201235B - Verfahren zur Herstellung von zur Injektion geeigneten Präparaten des adrenocorticotropen Hormons mit erhöhter und verlängerter Wirksamkeit - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von zur Injektion geeigneten Präparaten des adreno- corticotropen Hormons mit erhöhter und verlängerter Wirksamkeit 
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstel- lung von neuen Präparaten des adrenocortico- tropen Hormons (ACTH), die die bisher be-   kannten   um ein Vielfaches an Wirksamkeit 5 übertreffen und gegenüber dem normalen
ACTH eine wesentlich verlängerte Wirksamkeit besitzen. 



   Die günstigen therapeutischen Wirkungen dieses, aus den Hypophysen-Vorderlappen der ) Wirbeltiere gewonnenen Hormons sind allge- mein bekannt und es hat daher in den letzten
Jahren nicht an Versuchen gefehlt, zu Präpa- raten dieses Hormons mit lang anhaltender
Wirkung zu gelangen. 



    . Präparate   mit verzögerter Resorption, bei denen das Hormon mit einem oder mehreren   Trägerstoffen,   wie Aluminiumphosphat, gege- benenfalls in Verbindung mit Vehikeln wie
Gelatine oder Polyvinylpyrrolidon, kombiniert ist, sind bereits bekannt (s. Univ. Michigan Med. 



   Bull. 16,152 (1950). In diesen Präparaten be- findet sich der Trägerstoff meist in kolloidalem
Zustand oder in Form einer Suspension. Die
Viskosität dieser Dispersionen ist oft so gross, dass sie nur nach vorheriger Erwärmung zur
Injektion geeignet sind. Manche dieser Präpa- rate verursachen überdies nach der Injektion lokale Reizwirkungen. 



   Demgegenüber sind die erfindungsgemäss her- gestellten ACTH-Präparate nicht nur von länge- er Wirksamkeit, sondern sie besitzen auch eine wesentlich höhere Aktivität (bestimmt nach dem
Sayer-Test, s. Endocrinology 42, 379, (1948) als auf Grund des ACTH-Gehaltes zu erwarten wäre, ohne die oben erwähnten Nachteile auf- zuweisen. Die Herstellung der neuen Präparate erfolgt in der Weise, dass das Hormon in einem zur Injektion geeigneten sauren wässerigen
Lösungsmittel bei einem pH von   ungefähr  
3, 0 bis 5, 0 mit einem oder mehreren Salzen der Metalle Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer oder
Eisen zu einem ACTH-Metallkomplex umgesetzt wird. 



   Der in der so erhaltenen sauren Lösung oder Suspension vorliegende ACTH-Komplex ist lach der Injektion zufolge der Pufferwirkung der Gewebeflüssigkeit schwer löslich und wird 
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    Die Reihenfolge, in der ACTH, die Metallverbindung und das Lösungsmittel zusammengebracht werden, ist ohne wesentliche Bedeutung. Meist mischt man eine saure Lösung von ACTH in einem Lösungsmittel, welches bereits z. B. Phenol und Glycerin enthält, mit einer Lösung eines oder mehrerer Metallsalze. Schliesslich wird die erhaltene Mischung auf den gewünschen Gehalt an ACTH, z. B. 20 Einh./cm3, aufgefüllt : Die erfindungsgemäss hergestellten Präparate können auf ihre Wirksamkeit nach drei verschiedenen Testmethoden geprüft werden, die nachstehend kurz erläutert werden : 1. Der Glykogenablagerungs-Test wird an hypophysektomierten hungernden Ratten durchgeführt, die während der 8stündigen Versuchszeit Glukoseinjektionen erhalten. Der ersten Gruppe wird zur Kontrolle das Lösungsmittel allein injiziert.

   Die zweite Gruppe erhält eine einzige subkutane Injektion mit einer bestimmten Menge von normalem ACTH. Die dritte Gruppe erhält achtmal, nach je einer Stunde, eine Injektion mit je einem Achtel der Gesamtmenge von normalem ACTH, und die vierte Gruppe eine einzige Injektion mit dem auf verlängerte Wirksamkeit zu untersuchenden Präparat mit der gleichen Menge an ACTH-Einh. wie bei der zweiten und dritten Gruppe. Nach Ablauf der Versuchszeit werden die Tiere getötet und es wird der Gehalt an Leberglykogen, der nach Verabreichung von ACTH erhöht ist, bestimmt. Werden zum Beispiel statt einer einzigen Injektion acht Injektionen mit je einem Achtel der Gesamtmenge gegeben, so erfolgt eine stärkere Erhöhung.

   Durch Vergleich des Ergebnisses einer einzigen Injektion des zu prüfenden Präparates mit dem Ergebnis von acht Injektionen mit je /g der gleichen Menge normalem ACTH kann man feststellen, ob das untersuchte Präparat eine verlängerte Wirksamkeit besitzt. 



  2. Der Eosinophilen-Test wird an normal ernährten Tieren, z. B. Hunden, angewendet. Einer Gruppe von Versuchstieren wird normales ACTH injiziert, einer weiteren das auf verlängerte Wirksamkeit zu untersuchende Präparat. 



  In regelmässigen Zeitabständen (z. B. alle drei Stunden) wird das Blutbild bestimmt. Wie bekannt, bewirkt ACTH eine Abnahme der eosinophilen Leukozyten. 8 Stunden nach Injektion von etwa 50 Einh. ACTH ist das Blutbild wieder normal. Manche der erfindungsgemäss herstellbaren Präparate zeigen jedoch bei diesem Test eine mindestens 40 Stunden anhaltende Wirkung. 



  3. Der Thymus-Verkleinerungs-Test wird zweckmässig an Ratten-Nestlingen durchgeführt. 



  Intramuskuläre Injektion von ACTH bewirkt eine Abnahme des Thymusgewichts und eine Zunahme des Gewichtes des Nebennierenmarks. 



  Während mit normalem ACTH die Gewichtsabnahme der Thymus kaum feststellbar und die   Gewichtszunahme des Nebennierenmarks nur sehr gering ist, wird nach Injektion einer entsprechenden Menge des erfindungsgemäss herstellbaren Präparates eine äusserst starke Gewichtsabnahme der Thymus und eine sehr starke Gewichtszunahme des Nebennierenmarks beobachtet. Die Präparate weisen im Vergleich mit der gleichen Menge normalem ACTH eine mindestens 10- bis 20fache Wirksamkeit auf. 



   Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der nach dem   erfindungsgemässen   Verfahren erhältlichen Präparate. Die Aktivität der Ausgangsprodukte wird in diesen Beispielen in USP-Einheiten angegeben. Unter 1 USP-Einh. wird die Menge ACTH verstanden, die im Test von Sayer (Endocrinology 42, 379-393, 1948) die gleiche Wirkung zeigt wie 1 mg des Provisional   USP-standard"wie   z. B. in Recent Progress in Hormone Research Vol. X, 266 (1954) beschrieben ist. 



   Beispiel   1 :   Eine Lösung von 73, 5 mg ACTH 
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36 USP-Einh./mgpH = 3 eingestellt und mit demselben Lösungsmittel auf 10 cm3 verdünnt wird. Es wird ein Präparat mit 10 Einh.   ACTRjcm3 erhalten,   das sich sowohl im Thymus-Verkleinerungs-Test als auch im Glykogenablagerungs-Test als hochaktiv erweist. 



   Beispiel   2 :   Eine Lösung von 41, 6mg ACTH aus Schweinehypophysen mit einer Wirksamkeit von   2, 4 USP-Einh./mg   in 4   cm3   des in Beispiel 1 genannten Lösungsmittels wird mit   0, 8 cm3   einer Kobaltsulfatlösung, entsprechend 10 mg   Kobaltjcm3,   im gleichen Lösungsmittel versetzt. Die Mischung wird auf 9 cm3 verdünnt, das pH auf 3, 5 eingestellt und auf 10   cm3   aufgefüllt, so dass das Präparat 10 Einh.   ACTH/cm3   enthält. Es erweist sich im Eosinophilen-Test während mindestens 40 Stunden wirksam. 
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 in 8   cm3   des vorerwähnten Lösungsmittels wird mit 0, 32 cm3 einer Zinkchloridlösung, entsprechend 37, 5 mg Zn/cm3, versetzt und das pH auf 3, 8 eingestellt.

   Nach Auffüllen auf 10 cm3 enthält das Präparat 20 Einh.   ACTRjcm3.   Im Thymus-Test erweist es sich als ungefähr 15fach wirksamer als normales ACTH. 
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 dieses Präparat hochwirksam. 



   Beispiel 5 : Eine Lösung von 80 mg ACTH mit einer Wirksamkeit von   2, 5 USP-Einh./mg   

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 in 5 cm3 Wasser (enthaltend 1, 0% Phenol und   4, 0%   Glycerin) wird mit 2   cm3   einer wäs- serigen Zinkchloridlösung, entsprechend 10 mg   Zinkjcm3,   und dann mit 0, 4 cm3 einer   Na3P04-  
Lösung, welche 83, 3mg NasPO4/cmS enthält, versetzt. Die Mischung wird mit 0, 1 n Salzsäure auf pH = 5 eingestellt. Nach Verdünnen mit
Wasser wird ein ACTH-Präparat mit erhöhter und verlängerter Wirksamkeit erhalten, das   I 20 USP-Einh. jcmS   enthält. Pharmakologische
Untersuchungen zeigen, dass nach Abtrennen des
Niederschlages nahezu keine Aktivität in der
Mutterlauge anwesend ist.

   Das ACTH hat sich demnach in komplex gebundener Form an das unlösliche Zinkphosphat angelagert. 



   Beispiel 6 : Eine Lösung von 80 mg ACTH mit einer Wirksamkeit von   2, 5 USP-Einh./mg   in   3 cm3 Wasser   (enthaltend 1% Phenol) wird mit einer wässerigen Zinkchloridlösung, ent- sprechend 10 mg   Zn/cms,   und dann mit   2, 5 cm3   einer   NaHPO-Lösung   versetzt, welche 73, 3 mg
NaH2PO4/cm3 enthält, wonach das pH mit
Natronlauge auf einen Wert von 4, 5 eingestellt wird. Schliesslich wird mit Wasser auf 10 cm3 aufgefüllt. Die Suspension enthält 20 USP-
Einh/cm3 und hat eine verlängerte Wirksam- keit. In Lösung sind nur wenige Prozente des zugefügten ACTH anwesend ; nahezu alles
ACTH ist in komplex gebundener Form im
Niederschlag vorhanden. 



   Beispiel   7 :   Eine Lösung von 73, 5 mg ACTH mit einer Wirksamkeit von 1, 36 USP-Einh./mg in   6 cm3   Lösungsmittel (enthaltend   0, 5%   Phe- nol und   0, 75% NaCI)   wird mit 1 cm3 einer 30 mg Nickel enthaltenden Nickelsulfatlösung versetzt und nach Einstellen des pH auf 3, 7 mit dem Lösungsmittel auf 10 cm3 verdünnt. Man erhält ein Präparat mit 10 Einh.   ACTH/cm3.   



   Beispiel 8 : Eine Lösung von 27, 7 mg ACTH mit einer Wirksamkeit von 3, 6 USP-Einh./mg in   6 cm3   des in Beispiel 1 genannten Lösungsmittels wird mit 2 cm3 Zinkchloridlösung, welche 10 mg enthält, versetzt und nach Einstellen des pH auf 4, 3 auf 10   cm3   verdünnt, so dass das Präparat 10 Einh. ACTH/cm3 enthält. 



   PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von zur Injektion geeigneten Präparaten des adrenocorticotropen Hormons mit erhöhter und verlängerter Wirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, dass das Hormon (ACTH) in einem sauren wässerigen Lösungsmittel, vorzugsweise einer wässerigen Lösung von 0, 5% Phenol und   2, 5%   Glycerin, bei einem pH von ungefähr 3, 0 bis 5, 0 mit einem oder mehreren Salzen der Metalle Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer oder Eisen zu einem 
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Claims (1)

1. kennzeichnet, dass als Metallsalz ein Zinksalz. insbesondere Zinkchlorid, verwendet wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Metallsalz in einer Menge angewendet wird, die etwa 5 bis 15 mg Metall pro 100 Einheiten ACTH entspricht.