DE1617660A1 - Verfahren zur Reinigung von rohem Gonadotropin - Google Patents

Description

betreffend
"Verfahren zur Reinigung von rohem Gonadotropin".

Die Erfindung "betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung von rohem Gonadotropin. Genauer "betrifft die Erfindung die Reinigung von Gonadotropin durch Fällung mit einem Alkohol unter Regelung der pH-Werte.

Unter Gonadotropinen oder gonadotropen Hormonen sind Hormone zu verstehen, die ursprünglich in dem Vorderlappen der Hypophyse.und im Harn nachgewiesen wurden. Diese wurden ferner im Serum und in der Placenta und dem Harn schwangerer Frauen und in dem Endometriutn-Gewe"be und Serum trächtiger Stuten aufgefunden. Gonadotropine können Ovarien und Testes stimulieren und in diesen morphologische und funktionelle Veränderungen hervorrufen. Diese Substanzen sind proteinartig und

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mehr oder weniger wasserlöslich. Sie unterscheiden sich nach ihrer Herkunft und ihrer chemischen Vorbehandlung.

Man kann folgende zwei Gruppen von Gonadotropinen unter scheiden;

a) Gonadotropine» die in dem Hypophysenvorder lappen auftreten:

Diese Gruppe umfasst das Follikelreifungshormon (FSH), den Interstitiumfaktor (ICSH) und das Prolactin oder lactogene Hormon und

b) Gonadotropine, die aus anderem Rohmaterial, als dem Hypophysenvorderlappen, isoliert werden. Diese Gruppe umfaßt hauptsächlich:

1) Das Ch^orion- oder placentare menschliche Gonadotropin (HCG), das aus der Placenta und dem Harn schwangerer Frauen isoliert werden kann?

2) Gonadotropine aus dem Harn von Kastraten und von Frauen in der Menopause (HMG) und

3) Serum-Gonadotropine, die im Serum trächtiger Stuten vorkommen (PMSG).

Das aus dem menschlichen Harn erhältliche HMG, das FSH enthält, ist ein therapeutisch wertvolles Präparat. Das aus dem Harn schwangerer Frauen erhältliche HCG wird in der Therapie verwendet und ist gegenwärtig auch für immunochemische Bestimmungen dieses Hormons, z. B. hei

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SchwangersOhaf tsuntersüchungen und zur Diagnose von lurnoren, die dieses Hapmon sekretieren, wichtig. Das Serumgonadotropin (PMSGr), das aus dem Serum trächtiger Stuten hergestellt werden kamrundwworin die FSH-Afctivität überwiegt, stimuliert sowohl die Reifung der Follikel, als auch die Spermatogenese, und das Inters ti tium der Ovarien und Testes und ist daher therapeutisch wichtig. Es ist klar, daß die Reinigung dieser Hormone, zur Vermeidung unerwünschter IFebenreakt ionen» große Bedeutung für die Therapie und für immunochemische Bestimmungsmethoden besitzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung roher Konzentrate von Gonadotropinen durch fraktionierte Fällung mit Alkohol aus einer wässrigen Lösung dieser Konzentrate.

Aus Acta Endocrinol., Band 47, 1964, Seite 409, ist es bereits bekannt, daß aus einer Lösung eines rohen Konzentrats von HMG in einer wässrigen, etwa 4 $igen Ammoniumacetatlösung und bei einer Äthanolkonzentration von 60 VoI„-# (v/v) verschiedene aktive Fraktionen durch stufenweise Erhöhung der Alkoholkonzentration auf 85 Vol.-?S (v/v) gefällt werden können. Bei einer Äthanolkonz ent ration von 65 bis 70 i> kann so Material gefällt werden, das hauptsächlich FSH-Aktivität aufweist und bei höheren Alkoholkonzentrationen werden aktive Substanzen gefällt, die hauptsächlich ICSH-Aktivität aufweisen.

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In der niederländischen Patentschrift 6 402 059 wird offenbart, daß aus einer lösung eines einigermaßen gereinigten Präparates von gonadotropem Hormon aus menschlichem Menopause-Harn in einer 70 #igen Äthanollösung, die 10 fo Ammoniumacetat enthält, die aktive Substanz mit absolutem Äthanol, das 10 fo Ammoniumacetat enthält, gefällt werden kann.

Ferner wird in der USA-Patentschrift 2 238 868 offenbart, daß Serumgonadotropini aus seiner lösung in einem Gemisch aus Wasser und Alkohol bei dem pH-Wert 6 durch Erhöhung der Alkoholkonzentration auf 70 fo gefällt werden kann.

Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß eine viel bessere Reinigung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt werden kann, das folgende Stufen umfaßt: Herstellung einer klaren lösung eines rohen Gonadotropinpräparats, die einen Alkohol mit einem Molenbruch von zumindest 0,33 enthält, einen pH-Wert von etwa 6 bis etwa 9 aufweist und zumindest ein in Wasser-Alkoholgemisehen lösliches Salz, mit einem Molenbruch von höchstens 0,016 und Wasser mit einem Molenbruch von etwa 0,50 bis etwa 0,65 enthält, Hinzufügen zumindest einer Säure zu dieser lösung, bis der gemessene pH-Wert etwa 3 bis etwa 6 beträgt, gleichzeitige Erhöhung der Alkoholkonzentration für die selektive Fällung des Gonadotropins und gegebenenfalls anschließend dessen Isolierung.

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Unter "Molenbrueh" ist der Bruch, η,,/η zu verstehen, der das Verhältnis der Anzahl n^ von Molekülen des Bestandteils i eines homogenen, gasförmigen, flüssigen oder festen Gemisches zu der Gesamtzahl der Moleküle η "bedeutet.

Als Ausgangsmaterial werden Lösungen roher Gonadotropinpräparate verwendet, aus welchen die in wässrig-alkoholischen Lösungen mit einem Molenbruch von zumindest 0,33 nicht löslichen Verunreinigungen entfernt wurden. Dieses Ausgangsmaterial kann z. B», wie folgt, hergestellt werdens Zunächst wird das rohe Gronadotropinpräparat mit soviel einer wässrigen, 10 folgen Ammoniumacetatlösung mit einem pH-Wert von etwa 6 "bis etwa 9 extrahiert, bis eine Lösung von etwa 0,25 bis etwa 2 $ Protein entsteht, wobei die Temperatür niedrig, z. B. auf etwa +4° bis etwa -3° 0 gehalten wird. Nach ausreichend langer Extraktionsdauer wird ein Alkohol der Lösung hinzugefügt, bis dessen Molenbrueh einen Wert von 0,33 erreicht* Der entstandene Niederschlag wird nach Stehen über Haeht bei einer Temperatur von etwa +4 bis etwa -7 G abgetrennt. Die klare Mutterlauge wird als Ausgangsmaterial für die vorliegende fraktionierung verwendet.

Im allgemeinen kann man jedes Salz verwenden, das in dem flüssigen, zur Fällung der aktiven Substanz benutzten System löslich ist. Z. B. kann man Ammoniumsalze der nachstehend genannten organischen Säuren, die bei der Fällung benutzt

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werden können, verwenden. Ferner kann man die Salze dieser Säuren mit einem Amin, z. B. einem aromatischen Amin, wie Anilin, einem heterocyclisclien Amin, wie Pyxidin, Pyridazin, Pyrazin, Pyrrol, Imidazol und aliphatischen Aminen, wie Methylamin, A'thylamin, Dimethyl- und Diäthylamin und Derivaten dieser Amine verwenden. Auch die Salze quaternär er Ammoniumbasen, wielrihydroxymethylaminomethan und A'thylendiamin-tetraessigsäure können verwendet werden. Vorzugsweise verwendet man Ammoniumsalze, insbesondere solcher organischer Säuren, die frei der Fällung verwendet werden können, z. B. von Essigsäure. Die Funktion dieser Salze hei der erfindungsgemäßen Reinigung besteht darin, daß sie in dem verwendeten System eine allgemeine lösende Wirkung ausüben, was von wesentlicher Bedeutung bei dem vorliegenden Verfahren ist. Daher wird erfindungsgemäß eine Säure oder ein Säuregemisch der Lösung des Gonadotropins bei einer für fraktionierte Fällungen üblichen niederen Temperatur zugegeben, bis eine Vorrichtung zur Anzeige des pH-¥ertes einen Wert zwischen etwa 3 und etwa 6 anzeigt, wobei man gleichzeitig einen Alkohol zufügt. Fach Stehen von wenigen Stunden bis wenigen Tagen wird der entstandene Niederschlag, der einen größeren Teil der biologisch aktiven Substanz enthält, vorzugsweise durch Zentrifugieren isoliert und anschließend mit einer flüchtigen organischen Flüssigkeit, wie Äthanol, Methanol und Äther, gewaschen und getrocknet.

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Geeignete Säuren sind sowohl wasserlösliche organische Säuren, als auch einbasische anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoff säure. Als Beispiele geeigneter organischer Säuren sind niedere aliphatische Carbonsäuren,wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Malonsäure und Bernsteinsäure zu erwähnen. Ferner sind halogenierte, aliphatische Säuren, wie Mono- und Trichloressigsäure und durch andere Gruppen, z.B. Hydroxyl-, Keto- oder Aminogruppen substituierte Säuren, wie Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Glutaminsäure und Asparaginsäure und ferner ungesättigte Carbonsäuren verwendbar.

Vorzugsweise verwendet man eine organische.Säure, allein oder in Kombination mit einer anorganischen Säure, wodurch eine stärker selektive Fällung der aktiven Substanz erfolgt und die Verunreinigungen in Lösung bleiben. Dies trifft insbesondere bei einem Molenbruch der Chlorwasserstoffsäure von etwa 0,009 und der Essigsäure von etwa 0,035 zu.

In dem vorliegenden Verfahren wird ein nieder er, aliphatischer Alkohol, wie Methanol, Äthanol oder Propanol, der unter den Bedingungen der Reinigung praktisch vollständig mit Wasser mischbar ist, verwendet.

Bei der Gewinnung dieser Hormone in gereinigtem Zustand fungiert der Alkohol als Fällungsmittel. Jedoch wird durch diesen nicht nur die aktive Substanz, sondern werden auch die

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begleitenden "Verunreinigungen gefällt, so daß die gewünschte Reinigung durch Fällung mit Alkohol allein nicht erzielt werden kann.

Es wurde gefunden, daß man bei HGG-Präparaten am besten von klaren Lösungen mit einem Molenbruch des Äthanols von etwa 0,4 aufgeht. Bei IMG-Präparaten geht man vorzugsweise "von einem niedrigeren Molenbruch, d. h. 0,33» aus und steigert diesen auf etwa 0,4» wobei praktisch alle FSH-haltige Substanz gefällt wird.

Die biologischen Aktivitäten der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Präparate wwurden, wie folgt, bestimmt: Das HGG oder IGSH wurde gegen den internationalen Standard für Choriongonadotropin im Samenblasentest bestimmt. Dieser Test ist analog den Prostats-Test nach J. A. Loraine, J. Endocrinol, Band 6, 1950, Seite 319 unterscheidet sich jedoch dadurch, daß den zu untersuchenden Lösungen auch Albumin in einer Menge von etwa 0,1 Gew.-?» zugesetzt wird, um das Hormon zu stabilisieren. Der Samenblasentest ist spezifisch für IGSH. HIiG wurde durch Vergleich mit dem internationalen Bezugspräparat (IRP) Hl-IG 24 in dem sogenannten Zunahmetest (augmentation test) nach S. L. Steelman and Έ. M. Pohley, Endocrinology, Band 53, 1953» Seite 604» bestimmt, wobei die Aktivität in mg-Äquivalenten ausgedrückt wird. Die Zunahme ist spezifisch für FSH.

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!Fach dem erfindungsgemäßen Terfahren kann man Konzentrationen mit einer Potenz von 1500 bis 10000 I.E,/mg herstellen, je nach der Aktivität des verwendeten Ausgangsmaterials, Indem man z. B. von HCG-Präparaten mit einer biologischen Aktivität von 500 "bis 3000 I.E./mg, bestimmt nach dem Samenblasentest, ausgeht. Auf gleiche ¥eise kann man z. B. konzentrierte HMG-Präparate mit einer ]?SH-Aktlvität von einigen Zehn mg-Xquivalenten IRP/mg zu einer Potenz von vielen Hundert mg-Äqulvalenten IRP/mg konzentrieren.

Die Ausbeuten an aktivem Material, auf Basis der verschiedenen iüests berechnet, kann etwa 60 bis über 90 fo der ursprünglichen Einheiten betragen. Die Erfindung ergibt ein einfaches und wirksames Terfahren zur Reinigung roher Gonadotropine. Ferner können nach dem erfindungsgemäßen Yerfahren Verunreinigungen entfernt werden, die bei einer weiteren Reinigung stören könnten. So können die erfindungsgemäß herstellbaren Produkte ausgezeichnet weiter zu Präparaten von bisher nicht erzielbarer hoher Reinheit verarbeitet werden.

Die Erfindung wird anhand nachstehender Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

10 g eines HCG-Konzentrats mit einer biologischen Aktivität von 2500 I.E./mg wurden bei einer Temperatur von -1 EJ in 2 1

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einer wässrigen, 10 $igen Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 6,5 suspendiert. Nach, einer Extraktionszeit von 15 Stunden wurden dem Gemisch 4162 ml 96 $iges Äthanol zugegeben, wodurch man Molenbrüche von 0,398 Ithanol, 0,588 Wasser und 0,014 Ammonium-

acetat erzielte. Nach 24-stündigem Stehen bei -6° 0 wurde der praktisch inaktive Niederschlag mit einem Gehalt von nur 158 I.S./mg durch Zentrifugieren mit 5000 χ g abgetrennt.

Der klaren Mutterlauge wurden 500 ml Eisessig und 4,31 1 96 $iges Äthanol hinzugefügt, worauf ein pH-Wert von 5,6 gemessen wurde. Man erhielt so nachstehende Molenbrüche: Wasser 0,437, Ammoniumacetat 0,009, Äthanol 0,52 und Essigsäure 0,03. Mach 24-stündigem Stehen bei -6° C wurde der entstandene aktive Niederschlag durch Zentrifugieren mit 5000 χ g isoliert, mit Äthanol und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt so 4,215 g Substanz mit einer biologischen Aktivität von 5400 I.E./mg, bestimmt nach dem Samenblasentest. Die Ausbeute betrug 91 $> der eingesetzten Einheiten.

Durch Erhöhung des Molenbruches von Äthanol erhielt man weitere 15 ^ der ursprünglich eingesetzten Gewichtsmenge, die jedoch die sehr niedrige Aktivität von etwa 50 I.E./mg aufwiesen.

Beispiel 2

9673 mg einegilCGr-Präpatates, mit einer Aktivität von 1740 I.E./mg, wurden in 2000 ml einer wässrigen 10 $igen Ammonium-

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acetatlösung des pH-Wertes 7,9 suspendiert, wobei man die !Temperatur auf 2° G hielt. Nach. 48-stündigem Stehen wurden 5385 ml 96 5&iges Äthanol zugegeben, wodurch man Molenbrüche von 0,432 Äthanol, 0,56 Wasser und 0,013 Ammoniumacetat erzielte. STach 15-stündigera Stehen bei -5 G wurde der entstandene Niederschlag abzentrifugiert, gewaschen und getrocknet, wobei man 4945 mg Substanz mit einer Aktivität von 450 1.13./mg erhielt.

Der klaren Mutterlauge wurden gleichzeitig 515 ml Eisessig, I652 ml absolutes Äthanol, 214 ml Wasser, 82 g Chlorwasserstoffsäure und 320 mg Natriumhydroxid zugegeben. In diesem Gemisch v.'urde ein pH-Wert von 3,85 gemessen und die Molenbrüche der zugefügten Bestandteile waren; Wasser 0,49, Ammoniumacetat 0,01, Äthanol 0,46, Essigsäure 0,035, Chlorwasserstoffsäure 0,009 und

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Natriumliydroxyd 5 2 10 . Die Temperatur wurde auf -5 G gehalten.

Hach 48-stündigem Stehen bei dieser Temperatur wurde der entstandene Miederschlag in üblicher Weise isoliert, gewaschen und getrocknet, wobei man 1019 mg Substanz mit einer biologischen Aktivität von 8600 I.E./mg erhielt,, entsprechend 60 $ der in der klaren Hormonlösung vorhandenen Einheiten.

Durch weiteren Zusatz von 10 1 70 vol.-^igem (v/v) Äthanol zu der Mutterlauge erhielt man folgende Molenbrüche: Wasser 0,54, JLmmonlTiniacetat 0,005, Äthanol 0,44, Essigsäure 0,017, Chlor-

—5 wasserstoff säure 0,004 und NaOH 1,5 x 10 . Nach 2,5-tägigern Stellen bei -5° 0 konnte eine weitere Fraktion von 176 mg, mit

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einer Aktivität von etwa ή500 I.E./rag, isoliert werden. Durch, weitere Steigung des Alkoholgehaltes konnte schließlich eine letzte aktive Fraktion von 293 rag, mit einer Aktivität von 2700 J.K./mg, gewonnen werden.

Beispiel. 3

7,25 g eines HIiG-Präparates mit einer FSH-Aktivität/rng entsprechend 50 mg IRP im Ratten-Zunahme test und einer ICSII-Aktivität/mg entsprechend 20 I.E. HCG in dem Saraenblasentest, wurden 12 Stunden in 1450 ml einer wässrigen 10 $igen Ammoniumacetatlösung des pH-Wertes 7,5 bei -1 C extrahiert. Hierauf wurden der Suspension tropfenweise 2175 ml 96 $iges Äthanol hinzugefügt, wodurch man folgende Molenbrüche erzielte: Äthanol 0,33» Wasser 0,65 und Ammoniumacetat 0,02. Fach Stehen über Facht bei -1 C wurde der entstandene Fiederschlagj zusammen mit dem nach der Extraktion verbliebenen unlöslichen Rückstand entfern k. Das abgetrennte Material wog 1,040 g und wies im Zunahrnetest eine Aktivität von unter 2,2 mg-Äquivalent IRP/tng auf. Der erhaltenen klaren Kutterlauge wurden weitere 454 ml absolutes Äthanol hinzugefügt, bis man nachstehende Molenbrüche erzielte: Äthanol 0,376, Wasser 0,609 und Ammoniumacetat 0,015. Der beim Stehen über Facht entstandene Fiederschlag wurde abgetrennt, gewaschen, getrocknet und auf seine Aktivität geprüft. Man erhielt 700 mg mit einer Aktivität im Zunahmetest von 10 mg-Äquivalent IRP/rng. Dieses Präparat zeigte keine Aktivität im Samenblasentest. Diese Fraktion enthielt nur 1,9 $ der eingesetzten Einheiten.

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Schließlich wurden Ghlorwasserstoffsäiire, Essigsäure und Äthanol der klaren Lösung hinzugefügt, bis zur Erzielung folgender Molenbrüche: öhlorwasserstoffsäure 0,004, Essigsäure 0,03 und Äthanol 0,40, Der Molenbruch von Wasser war 0,553 und der von Ammoniumaeetat 0,013* lach Stehen über lacht bei -1⁰O wurde der entstandene niederschlag in der oben beschriebenen Weise isoliert, gewaschen und getrocknet, wobei man 65O mg Substanz mit einer Aktivität im Zunähmetest von 440 mg-Äquivalent IRP/mg erhielt_o Die Aktivität je mg im Samenblasentest entsprach 2 I.E. HGG. Die Ausbeute betrug nach dem Zunahrnetest 79 ^. Durch weiteren Zusatz von Äthanol zur Mutterlauge, bir> zu einem Molenbruch von 0,55» erhielt man einen weiteren niederschlag mit einer ICSH-Aktivität/mg entsprechend 40 I.E. HCG- im Samenblasentest und mit der verhältnismäßig niederen IPSH-Aktivität ¥on 10 bis 20 mg-lquivalent IltP/rag.

Bat ent anspr üolie

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Claims (6)

8 MlTNCHKX !> SCIIWBiUKUNTH VSS TKLEFO.v 32 (Ht Sl J»· I1B OTB CT PATE NT ΜΡνΠΓΚΝ 11-30 950 Patentanspruch. ";e , *

1. Verfahren zur Reinigung roher Gonadotropin-Präparate durch Fällung mit einem Alkohol in saurem Medium, dadurch gekennzeichnet , öaß man eine klare Lösung des Präparates herstellt, mit einem pH-Wert von etwa 6 bis etv/a und enthaltend, als Molenbrüche ausgedrückt, zumindest 0,33 eines Alkohols, ferner enthaltend zumindest ein in Wasser— Alkoholgeniischen.-lösliclies Salz mit einem Molenbruch von höchstens 0,016 und, als Molenbruch ausgedrückt, etwa 0,50 bis etwa 0,65 Wasser, und daß man dieser Lösung zumindest eine Säure hinzufügt, bis der gemessene pH-Wert etwa 3 bis etwa beträgt und gleichzeitig die Alkoholkonzentration zur selektiven !Fällung des Gonadotropins erhöht, worauf man gegebenenfalls das Gonadotropin isoliert*

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure eine organische Säure verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz ein Ammoniumsalz der organischen Säure verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial eine Lösung eines HCG-Präparates verwendet, die Äthanol in einer Menge, als Molenbruch ausgedrückt, von etwa 0,4 enthält.

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5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial ein HCG-'J?räparat verwendet und ein Geminch aus Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure zufügt, v/obei man deren JTengen, als Molenbrüche ausgedrückt, auf etwa 0,009, bzw. 0,035 einstellt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Erhöhung der Alkoholkonzentration, bin

der Molenbruch desselben etwa 0,40 beträgt, die anwendende FS¹I-haltige Substanz ausfällt.

BAD ORIGINAL —"c

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