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Die Erfindung betrifft die Verwendung des luteinisierenden
Hormons oder eines Isoformen oder eines Gemisches von
Isoformen des luteinisierenden Hormons zur Herstellung
eines Medikaments zur Förderung des renalen Wachstums bei
Menschen.
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Die CA 102, Nr. 90 348 W (1985) und "Endocrinology" 116,
Seiten 616 ff, eine Studie von Nomura et al., beinhalten
bekanntlich die Beobachtung renaler, aus Ratten erhaltener
Zellen, die mit LH-RH behandelt worden sind. Genauer gesagt
wurden Nierenscheiben erhalten aus
kastrierten-hypophysektomierten männlichen Ratten, die mit einer einzigen
Injektion mehrerer verschiedener Gonadotropin-Präparationen
(zweier LH-Fraktionen aus Schafen, einer LH-Fraktion aus
Rindern und einer hCG-Fraktion) oder mit einem Trägerstoff
behandelt worden waren, die dann in einem Puffer inkubiert
wurden, der [³H]-Thymidin enthielt. Nur eine der oben
genannten, eine LH-Präparation aus dem Schaf, steigerte den
Einbau von [³H]-Thymidin in renale DNA, wobei ein Peak 8-10
Stunden nach der Injektion auttrat und darum als Renotropin
bezeichnet wurde. Jedoch wurde bei hypophysektomierten
Ratten mit intakten Hoden eine solche Wirkung nicht
beobachtet. Während ferner Testosteronpropionat allein den
basalen Einbau bei kastrierten-hypophysektomierten Ratten
nicht veränderte, stoppte es den durch Renotropin
stimulierten Einbau. Diese Ergebnisse legen nahe, daß Androgene,
ob testikularen Ursprungs oder exogen verabreicht, den
gesteigerten Einbau von [³H]-Thymidin hemmen, der durch
Renotropin stimuliert wird. Diese antagonistische Wirkung
des Androgens wurde ebenfalls mit T&sub4; beobachtet, jedoch zu
einem geringeren Ausmaß. Die Ergebnisse, die keinen anderen
bekannten pituitären Hormonen zugeschrieben werden konnten,
bestätigen die Anwesenheit von Renotropin, und legen nahe,
daß eine komplexe Wechselwirkung besteht zwischen diesem
Faktor und zwei weiteren renalen wachstumfördernden
Hormonen, Testosteron und T&sub4;.
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Bei dem bisherigen Stand der Technik wird nichts über die
Förderung des renalen Wachstums bei Menschen berichtet,
d.h., wie allgemein bekannt, ein besonders wichtiges
medizinisches Gebiet. Somit betrifft die Erfindung
Verbesserungen auf diesem medizinischen Gebiet, um
medizinische Mittel zu schaffen, die zur Nierenbehandlung bei
Menschen geeignet sind.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die oben
erwähnte Anwendung des Patentanspruches, d.h zur
Herstellung eines entsprechenden Medikamentes.
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Die Herstellung eines Isoformen oder eines Gemisches aus
Isoformen des luteinisierenden Hormons, das eine Aktivität
auf die Förderung des renalen Wachstums aufweist, umfaßt
Fraktionieren und Reinigen des luteinisierenden Hormons
gemäß dem Unterschied im isoelektrischen Punkt.
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Genauer gesagt ist ersichtlich, daß die Verwendung des
luteinisierenden Hormons oder eines Isoformen oder Gemisches
von Isoformen des iuteinisierenden Hormons zur Förderung
des renalen Wachstums bei Menschen nun brauchbar ist.
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In "Biology of Reproduction" 34, 571-578 (1986) wurde die
Existenz verschiedener Formen einiger Hormone beschrieben,
und die Bezeichnung "Isoforme" wurde in diesem Zusammenhang
verwendet. Somit bedeuten die Bezeichnungen "Isomeres" und
"Isomere", soweit hier verwendet, "Isoformes" bzw.
"Isoforme".
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In diesem Fall handelt es sich um einen renalen
Wachstumsförderer, der ein Isomeres des luteinisierenden
Hormons enthält, das als Wirkprinzip eine Aktivität auf die
Förderung des renalen Wachstums aufweist. Es wurde
gefunden, daß durch die Verabreichung des renalen
Wachstumsförderers die Zahl der renalen Zellen zunimmt oder
daß die renale Funktion gesteigert wird. Somit wird die
Niere aktiviert, wenn eine Abnahme der renalen Zellen oder
eine Verringerung der renalen Funktion vorliegt.
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Als Hintergrund bei diesen Forschungen wurde bedacht, daß
hypophysektomierte Mäuse immer eine deutliche Abnahme des
renalen Gewichtes zeigen und daß außerdem möglicherweise
irgendein Faktor existiert, der das renale Wachstum in der
Hypophyse steuert. Somit wurde versucht, einen renalen
Wachstumsfaktor zu finden, der in der Hypophyse vorhanden
ist. Folglich wurde eine hormonartige Komponente isoliert,
die von der Hypophyse aus das renale Wachstum fördert. Sie
wurde RGF (oder Renotropin) (cf. Nippon Rinsho, 44 (1),
getrennte Ausgabe, 84-88 (Januar 1986)) genannt.
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Es wurde jedoch gefunden, daß das so erhaltene RGF ein
Rohprodukt ist, das eine instabile Aktivität zeigt und
verschiedene Verunreinigungen enthält, die antagonistische
Wirkungen aufweisen.
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Um RGF als reine Komponente zu erhalten, wurde der folgende
Weg eingeschlagen, d.h. es kann eine einzige Bande eines
aktiven Bestandteils erhalten werden, indem rohes RGF
fraktioniert und gereinigt wird, das aufgrund der
Verschiedenheit im isolelektrischen Punkt isoliert worden
ist.
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Die Analyse dieser einzigen Bande und die Bestimmung der
Primärstruktur davon zeigten überraschenderweise, daß sie
ein Isomeres des luteinisierenden Hormons darstellt.
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Es ist bekannt, daß das luteinisierende Hormon nicht eine
einzige Verbindung ist, sondern ein Glycoprotein, welches
eine Vielzahl von Isomeren umfaßt. Dies wird durch den
mikrostrukturellen Polymorphismus davon verursacht.
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Es wurde berichtet, daß das luteinisierende Hormon des
Schafs an der α-Untereinheit heterogene Amino-terminale
Sequenzen und an der β-Untereinheit heterogene
Carboxylterminale Sequenzen aufweist (D.N. Ward, Int. J. Peptide
Protein Res., 27, 70-78 (1986)). Weiterhin wurde berichtet
daß das menschliche luteinisierende Hormon durch
Säulen-Elektrofocussierung in sieben Peaks aufgetrennt wurde (cf.
M. Yano, J. Jap. Tocol. Gynecol., 37, (5), 103-712 (1985)).
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Es wurde somit bisher niemals beobachtet, daß das
luteinisierende Hormon und dessen Isomere eine Wirkung auf die
Förderung des renalen Wachstums haben.
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In der Praxis der Erfindung wurde gezeigt, daß die höchste
Aktivität auf die Förderung des renalen Wachstums durch ein
Isomeres des luteinisierenden Hormons erreicht wird, bei
dem eine Untereinheit α&sub3; an eine weitere Untereinheit β&sub3;
gebunden ist und daß somit der renale Wachstumsförderer ein
entsprechendes Isomeres des luteinisierenden Hormons als
aktiven Bestandteil enthält. Vorzugsweise umfaßt dieses
Isomere des luteinisierenden Hormons eine Untereinheit α&sub3;,
die an eine weitere Untereinheit β&sub3; gebunden ist.
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Das Verfahren zur Herstellung des Isomeren des
luteinisierenden Hormons, welches eine Aktivität auf die Förderung
des renalen Wachstums aufweist, umfaßt das Fraktionieren
und Reinigen eines rohen renalen Wachstumsfaktors gemäß dem
Unterschied im isoelektrischen Punkt.
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Die Fraktionierungs- und Reinigungsbehandlung gemäß dem
Unterschied im isoelektrischen Punkt, wie hier beschrieben,
bedeutet eine Behandlung, bei der Ampholyte, wie Proteine,
gemäß dem jedem Material eigenen isoelektrischen Punkt
voneinander fraktioniert und dann getrennt gesammelt werden.
Beispielsweise kann dies durch eine Chromatofocussierung
oder Elektrofocussierung durchgeführt werden.
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Als roher renaler Wachstumsfaktor, der erfindungsgemäß als
Ausgangsmaterial verwendet werden soll, können Extrakte des
rohen luteinisierenden Hormons eingesetzt werden, die aus
Urin, Blut oder Organen von Säugern erhalten worden sind,
wie von der Maus, vom Schaf oder Schwein. Alternativ kann
ein Rohprodukt verwendet werden, das aus einem Kultursystem
erhalten worden ist, welches künstlich gentechnologisch
hergestellt worden ist. Weiterhin kann ein Material
eingesetzt werden, das mit einem synthetischen chemischen
Reaktionssystem erhalten worden ist. Jedenfalls wird als
Ausgangsmaterial ein Gemisch eines Isomeren des
luteinisierenden Hormons, das eine Wirkung auf die Förderung des
renalen Wachstums aufweist, mit jenen, die eine solche
Wirkung nicht aufweisen, eingesetzt.
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Beispielsweise wird der rohe renale Wachstumsfaktor
folgendermaßen aus einem Organ erhalten. Eine wäßrige
Ammoniumsulfatlösung wird zu der Hypophyse gegeben. Das
resultierende Gemisch wird homogenisiert und zentrifugiert.
Der Überstand wird gereinigt und lyophilisiert. Dann wird
das lyophilisierte Material aufgelöst und durch eine Reihe
von Chromatographiebehandlungen gereinigt, beispielsweise
mit den Typen Sephadex (eingetragenes Warenzeichen),
CM-Cellulose, Con-A etc. Als Ergebnis wird ein roher
renaler Wachstumsfaktor (RGF) erhalten.
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Der so erhaltene rohe renale Wachstumsfaktor (RGF) wird
gemäß dem Unterschied im isoelektrischen Punkt fraktioniert
und gereinigt, um so als einzige Bande ein Material zu
ergeben, das eine Aktivität auf die Förderung des renalen
Wachstums besitzt.
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Das so als einzige Bande erhaltene Material, das eine
Aktivität auf die Förderung des renalen Wachstums besitzt,
kann in zwei konstitutionelle Untereinheiten α und β
getrennt werden. Tatsächlich verschwindet die renale
Wachstumsförderungsaktivität, nachdem das Material in diese
Untereinheiten geteilt worden ist.
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Die Trennung kann beispielsweise durch Reversed Phase-
Flüssigkeitschromatographie durchgeführt werden. In dem
Trennmuster zeigen die Untereinheiten α und β jeweils eine
Vielzahl von Peaks, je nach Kettenlängen der Aminosäuren.
Es wurde bestätigt, daß diese Peaks mehreren kürzeren
Aminosäurenketten entsprechen, die durch Schneiden der
Untereinheiten α und β erhalten worden sind, wobei die
Ketten bereits zuvor erwähnt worden sind.
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Obwohl ein Material, bei dem eine Untereinheit α&sub3; an eine
weitere Untereinheit β&sub3; gebunden ist, eine leichte
luteinisierende Hormonaktivität besitzt, unterscheidet es sich von
den anderen Isomeren des luteinisierenden Hormons dadurch,
daß es eine bemerkenswerte Aktivität auf die Förderung des
renalen Wachstums aufweist.
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Die Untereinheiten α&sub3; und β&sub3; sind die, die durch die
Schneidevorgänge am wenigsten beeinträchtigt werden. Unter
den verschiedenen Kombinationen der Untereinheiten, die
wieder aneinander gebunden werden, zeigte die, die die
Untereinheiten α&sub3; und β&sub3; aufwies, die höchste Aktivität auf
die Förderung des renalen Wachstums.
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In den Zeichnungen zeigt Figur 1 den Proteingehalt jeder
durch isoelektrische Focussierung erhaltenen Fraktion eines
rohen renalen Wachstumsfaktors aus Beispiel 1.
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Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung
ausführlicher.
Beispiel 1
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10 mmol Phenylmethylsufonylfluorid wurden zu etwa 350 g
Schweine-Hypophyse und zu 1 l einer 0,15 M wäßrigen Lösung
aus Ammoniumsulfat gegeben. Das resultierende Gemisch wurde
in einem Waring-Mixer unter Kühlung zwei Minuten lang
homogenisiert. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 4,0 wurde
das homogenisierte Gemisch ausreichend lange unter Kühlung
stehengelassen. Dann wurde es zentrifugiert und der
Überstand gesammelt. Nach einer weiteren Einstellung des
pH-Wertes auf 3,0 mit einer 0,5 M wäßrigen Lösung aus
Metaphosphorsäure wurde die resultierende Lösung
zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Nach Einstellen des pH-
Wertes des Überstandes auf 6,5 bis 7,0 wurde Ammoniumsulfat
dazugegeben, bis eine 50%ige Sättigung erreicht wurde. Dann
wurde das Gemisch erneut ausreichend lange unter Kühlung
stehengelassen. Anschließend wurde es zentrifugiert. Der
Niederschlag wurde gesammelt und in 50 bis 100 ml einer 0,2
M Lösung aus zweibasigem Kaliumphosphat suspendiert. Die
Suspension wurde in ein Dialyseröhrchen übergeführt und
unter Kühlung ausreichend lange dialysiert. Dann wurde der
Inhalt herausgenommen und dessen pH-Wert wiederum auf 8,5
eingestellt. Das erhaltene Material wurde lyophilisiert.
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Das so erhaltene lyophilisierte Pulver wurde in einer 0,01
M Lösung aus zweibasigem Natriumphosphat aufgelöst und auf
eine SP-Spehadex -Säule aufgegeben, die mit dem oben
erwähnten Puffer equilibiriert worden war. Die mit
zweibasigem 0,1 M Natriumphosphat eluierten Fraktionen wurden
gesammelt und lyophilisiert.
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Das lyophilisierte Pulver wurde in einer kleinen Menge
einer 0,05 M Lösung aus Ammoniumhydrogencarbonat aufgelöst
und über ein Molekularsieb unter Verwendung einer
Sephadex G-100 -Säule fraktioniert, wobei dasselbe
Puffersystem eingesetzt wurde. Die Fraktionen mit einem
Molekulargewicht von etwa 40 000 wurden gesammelt und
lyophilisiert.
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Das so erhaltene, trockene Pulver wurde in einer kleinen
Menge einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 0,3 M
Natriumchlorid aufgelöst und dann unter Verwendung einer
Concanavalin A-Sepharose (eingetragenes Warenzeichen)-Säule
fraktioniert, wobei dasselbe Puffersystem eingesetzt wurde.
Die mit 0,2 M Methylmannosid eluierten Fraktionen wurden
gesammelt und unter Kühlung ausreichend lange dialysiert
und dann lyophilisiert. So wurden etwa 25 mg eines rohen
renalen Wachstumsfaktors (RGF) erhalten.
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Anschließend wurde dieses Rohprodukt fraktioniert und gemäß
dem Unterschied im isoelektrischen Punkt gereinigt, indem
eine isoelektrische LKB-Focussierungssäule einer Kapazität
von 100 ml (Produkt von LKB Produkter AB) verwendet wurde.
Als Trägerampholyten wurden Ampholin pH 3,5-10, Ampholin pH
9-11 und Ampholin pH 7-9 eingesetzt (Ampholin =
eingetragenes Warenzeichen). Ein Sorbitdichtegradient (5 bis 50 %)
wurde hergestellt, und das obengenannte, in 2 ml einer
Dichtelösung aufgelöste Rohprodukt wurde auf die Mitte der
Säule aufgegeben (Dichtegradientenlösung: Sorbit 27 g,
destilliertes Wasser 34,9 ml, Ampholin (pH 9-11) 2,1 ml;
leichte Gradientenlösung: Sorbit 2,7 g, destilliertes
Wasser 52,3 ml, Ampholin (pH 9-11) 0,3 ml, Ampholin (pH
3,5-10) 0,2 ml, Ampholin (pH 7-9) 0,2 ml. Eine 1 M
Natriumhydroxidlösung und eine 0,01 M Essigsäurelösung
wurden als Elektrodenlösungen verwendet. Der Strom wurde bei
800-1 500 V, bei 4 ºC, 24 Stunden lang angeschaltet. Nach
Beendigung des Stromdurchgangs wurden 1,5 ml-Portionen des
Materials mit einem Fraktionssammler gesammelt. Dann wurde
der pH-Wert jeder Fraktion bei 4 ºC sofort bestimmt (COM-
11: Produkt von Denki Kagaku Kogyo K.K., Elektrodentyp CE
105 C, Standardpufferlösung: Produkt von Wako Pure
Chemicals Co., Inc.). Gleichzeitig wurde der Proteingehalt
einer jeden Fraktion bestimmt. Figur 1 zeigt das
Chromotographiemuster.
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Als Ergebnis wurden Fraktionen von 104 ug , 281 ug, 415 ug
und 103 ug mit einem pH-Wert über 10,32, einem pH-Wert von
10,32 bis 10,15, einem pH-Wert von 10,15 bis 9,89 bzw.
einem pH-Wert unter 9,89 aus etwa 1,5 mg des rohen renalen
Wachstumsfaktors erhalten.
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Jede Fraktion wurde unter Kühlung ausreichend lange
dialysiert, um Ampholine und Sorbit zu entfernen und dann
lyophilisiert, um ein Pulver zu ergeben.
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Der rohe renale Wachstumsfaktor wurde mehrmals gereinigt,
indem die isoelektrische Focussierung unter denselben
Bedingungen wiederholt wurde wie die, die oben eingesetzt
worden sind. Die Fraktionen desselben pI-Bereiches wurden
vereinigt. Der pI-Wert von cardialem Pferdemyoglobin (Typ
III: Produkt von Sigma Chemicals Co.), welches als
Standardprotein verwendet wurde, betrug 7,97.
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Bewertung der Aktivität auf die renaie Wachstumsförderung:
Es wurde bestimmt, welche Fraktion unter den oben
erhaltenen das renale Wachstum fördern würde.
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Die Wirkung auf die Förderung des renalen Wachstums von
Renotropin wurde bestimmt mit dem Wissen über die Wirkung
auf die Förderung der DNA-Synthese renaler Zellen.
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Männliche CD-Ratten (geboren am selben Tag,
durchschnittliches Körpergewicht 100 g) wurden einer Hypophysektomie und
Kastration unterzogen und dann neun Tage lang gefüttert.
Nach der Bestätigung darüber, ob die Operation richtig
ausgeführt worden war oder nicht, wurden die Ratten in zwei
Testgruppen und eine Kontrollgruppe aufgeteilt, wobei jede
Gruppe aus mindestens fünf Tieren bestand.
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50 ug jeder Fraktion, die durch die obige isoelektrische
Focussierung fraktioniert worden war, wurden in 150 ul
eines 50 mM Boratpuffers (pH 7,5) aufgelöst, der 0,1 % RSA
enthielt, und jeder Ratte subcutan injiziert. Nach acht
Stunden wurden die Tiere durch Abschneiden des Kopfes und
Ausbluten getötet. Dann wurde die rechte und die linke
Niere herausgenommen. Nach dem Abschälen der Kapsel wurden
von jeder Niere zwei Scheiben entlang der corticomedullären
Achse hergestellt. Diese Scheiben wurden bei 37 ºC zwei
Stunden lang in 2 ml Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer (pH 7,5)
inkubiert. Dieser Puffer wurde zuvor mit einem Gasgemisch
belüftet, bestehend aus 95 % Sauerstoff und 5 %
Kohlendioxid. Dann wurden 74 kBq/ml (2 uCi/ml) 1,2-Methyl-
3H-Thymidin (Produkt von New England Nuclear Corp.)
hinzugegeben (die Einheit 1 uCi entspricht 3,7 x 10&sup4; S&supmin;¹). Nach
Beendigung der Inkubation wurden die Scheiben mit einer 4
mM Thymidinlösung gespült und bei -20 ºC aufbewahrt.
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Zu den aufbewahrten Scheiben wurden 4 ml destilliertes
Wasser gegeben. Das resultierende Gemisch wurde unter
Verwendung eines Ultradispersionsgerätes (Produkt von
Yamato Kagaku K.K.) homogenisiert. Dann wurde die darin
enthaltene DNA gemäß einem von A. Fleck und H.M. Munro (cf.
Biochem. Biophys. Acta, 55, 571 (1962)) vorgeschlagenen
Verfahren extrahiert. Die extrahierte DNA wurde gemäß einem
von J.R.W. Wannemacher, J.W.L. Banks und W.H. Wunner (Anal.
Biochem., 11, 320 (1965)) vorgeschlagenen Verfahren
hydrolysiert und dann bestimmt unter Verwendung von Rinder-
Thymus-DNA (Typ I, Produkt von Sigma Chemical Co.) als
Standard-DNA. Gleichzeitig wurde die Radioaktivität von 0,5
ml extrahierter DNA auf herkömmliche Weise bestimmt.
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Die Aktivität der renalen Zellen auf die Förderung der DNA-
Synthese wurde bestimmt durch Radioaktivität/gesamter DNA-
Gehalt und in Prozent einer jeden Gruppe angegeben, indem
der Quotient der Kontrollgruppe als 100 % definiert wurde.
Als Ergebnis zeigte die Fraktion mit einem pH-Wert von über
10,32 eine Aktivität auf die Förderung der DNA-Synthese von
109 %, die Fraktion mit einem pI-Wert von 10,32 bis 10,15
zeigte 130 % (dicker Pfeil in Figur 1) , die Fraktion mit
einem pI-Wert von 10,15 bis 9,89, die den größten
Proteingehalt zeigte, zeigte keine Wirkung auf die
Förderung der DNA-Synthese (98 %) und die Fraktion mit
einem pH-Wert unter 9,89 zeigte 115 % (dünner Pfeil in Figur
1). Die Fraktion mit einem pI-Wert von 10,32 bis 10,15 und
die mit einem pI-Wert unter 0,89 (9,89 bis 9,32) enthielt
eine Komponente, die das renale Wachstum förderte. Darüber
hinaus enthielt die Fraktion mit einem pI-Wert von über
10,32 ebenfalls die Komponente, die das renale Wachstum
förderte, obwohl deren Aktivität gering war.
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Die Wirkung auf die Förderung der DNA-Synthese des rohen
renalen Wachstumsfaktors derselben Charge wurde
gleichzeitig bestimmt. Somit wurden 112 % Aktivität beobachtet.
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Wirkung der Komponente, die das renale Wachstum fördert,
auf das renale Wachstum in vivo:
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Männliche CD-1-Mäuse (geboren am selben Tag,
durchschnittliches Körpergewicht 17 g) wurden einer Hypophysektomie und
Kastration unterworfen und dann 9 Tage lang gefüttert. Nach
der Bestätigung darüber, ob die Operation richtig
durchgeführt worden war oder nicht, wurden die Mäuse in zwei
Testgruppen und eine Kontrollgruppe von jeweils zehn Tieren
aufgeteilt. 40 ug der Fraktion mit einem pI-Wert von 10,32
bis 10,15, wie sie oben durch die isoelektrische
Focussierung erhalten worden war, wurden in 150 ul 50 mM
Boratpuffer (pH 7,5) aufgelöst, der eine 0,1%ige RSA Lösung
enthielt. Die anderen 40 ug-Portionen der Fraktion mit dem
pI-Wert von 10,32 bis 10,15 wurden gleichermaßen behandelt.
Die resultierende Lösung wurde jedem Tier in einer Dosis
von 150 ul/Tag kontinuierlich fünf Tage lang subcutan
injiziert. Am sechsten Tag wurde das Tier durch Abschneiden des
Kopfes und Ausbluten getötet. Dann wurde die rechte und
linke Niere herausgenommen. Nachdem die Kapsel abgeschält
worden war, wurden diese Nieren lyophilisiert. Das
Verhältnis des Gewichts der trockenen Nieren zum gesamten
Körpergewicht der Ratte wurde berechnet, und die Differenz
im Nierengewicht zwischen Test- und Kontrollgruppe wurde
geprüft. Als Ergebnis zeigte die Testgruppe eine Zunahme im
Nierengewicht auf 110 %, was nahelegt, daß die verwendete
Fraktion eine Wirkung auf die Förderung des renalen
Wachstums hatte.
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Trennung und Wiederverknüpfung der α- und β-Untereinheiten
bei der Komponenten, die das renale Wachstum fördert:
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Die Fraktion mit einem pI-Wert von 10,32 bis 10,15, die
durch isoelektrische Focussierung fraktioniert worden war,
wurde einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
unterworfen, und die so getrennten Untereinheiten wurden
gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden in einer kleinen
Menge einer 0,1%igen wäßrigen Trifluoressigsäurelösung
(TFA) aufgelöst und dann getrennt mit einer Reversed Phase-
Säule (Baker Bond wide pore Butyl C&sub4;: Produkt von Baker
Research Products) mit einem linearen Gradienten (10 %-50
%) unter Verwendung von 2-Propanol/ Acetonitril (7:3), der
0,1 % TFA als Lösungsmittel enthielt.
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Die Untereinheiten α und β wurden jeweils als drei
Hauptpeaks erhalten, die α&sub1;, α&sub2; und α&sub3;; und β&sub1; , β&sub2; und β&sub3;
in der Reihenfolge der Elution, genannt wurden. Wurden 3 mg
der Probe getrennt, so wurden 230 ug α&sub1;, 450 u α&sub2;, 350 ug
α&sub3;, 410 ug β&sub1;, 570 ug β&sub2; und 60 ug β&sub3; erhalten. Als
Ergebnis der Analyse der Aminosäurezusammensetzung etc.
wurde gefunden, daß α&sub3; und β&sub3; die Isomere des
luteinisierenden Hormons waren, die am wenigsten zersetzt waren.
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Es wurden äquimolare Mengen von α&sub1; und β&sub1;; α&sub2; und β&sub2; sowie
α&sub3; und β&sub3; vergemischt. Jedes so erhaltene Gemisch verblieb
bei 37 ºC in einer kleinen Menge 1%iger wäßriger
Ammoniumcarbonatlösung, um so zu versuchen, die
α-Untereinheit mit der β-Untereinheit zu verknüpfen. Anschließend
wurde das Gemisch mit einer TSK Gel 3 000 SW-Säule (Produkt
von Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.) entsalzt und dann
lyophilisiert. Die Aktivitäten dieser Proben wurden, wie oben
beschrieben, miteinander verglichen auf der Grundlage der
Wirkungen auf die Förderung der DNA-Synthese. Als Ergebnis
zeigte die Kombination α&sub3;/β&sub3; die höchste Aktivität, d.h.
sie war etwa 2,5 so hoch wie die der Kombination α&sub1;/β&sub1;, zum
Unterschied von der Kontrollgruppe.
Beispiel 2
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100 g Hypophysenpulver vom Schaf (Produkt von Waitaki NZ
Refrigerating Ltd.) wurden in 400 ml kaltem Wasser
suspendiert. Dann wurden 1,5 l einer 0,15 M Ammoniumsulfatlösung
hinzugegeben. 10 mmol Phenylmethylsulfonylfluorid wurden
hinzugegeben und das resultierende Gemisch mit dem Polytron
unter Kühlung vermischt. Nach Einstellen des pH-Wertes auf
4,0 wurde das homogenisierte Gemisch ausreichend lange
unter Kühlung stehengelassen und dann zentrifugiert. Der
Überstand wurde gesammelt und auf dieselbe Weise behandelt,
wie in Beispiel 1 beschrieben. Dann wurde er mit einer SP-
Sephadex -Säule, einer Sephadex G-100-Säule und mit einer
Concavalin A-Sepharose -Säule behandelt, um so den rohen
renalen Wachstumsfaktor zu ergeben.
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Weiterhin wurden 5 mg des rohen renalen Wachstumsfaktors
durch isoelektrische Focusssierung, wie in Beispiel 1,
fraktioniert. Als Ergebnis wurden erhalten eine Fraktion
mit einem pI-Wert von über 9,85, die Fraktion mit einem pI-
Wert von 9,85 bis 9,60, die Fraktion mit einem pI-Wert von
9,60 bis 9,10, die Fraktion mit einem pI-Wert von 9,10 bis
8,60, die Fraktion mit einem pI-Wert von 8,60 bis 7,30 und
die Fraktion mit einem pI-Wert unter 7,30. Als Ergebnis
desselben Biotests, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde
bestätigt, daß die Fraktion mit einem pI-Wert von über 9,85
eine Komponente enthielt, die das renale Wachstum fördert.
Beispiel 3
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750 ml menschlicher Hypophysenextrakt (Produkt von
KabiVitrum AB) wurden zentrifugiert. Der resultierende
Niederschlag wurde gesammelt und in 70 ml einer 0,2 M
wäßrigen zweibasigen Kaliumphosphatlösung suspendiert. Die
resultierende Suspension wurde drei Minuten lang auf 60 ºC
erwärmt und dann zwei Tage lang unter Kühlung dialysiert.
Der Inhalt wurde herausgenommen. Es wurde 0,13 M
Ammoniumsulfat hinzugegeben. Nach Einstellen des pH-Wertes
auf 4,0 wurde der pH-Wert des Gemisches mit einer 0,5 M
Metaphosphorsäurelösung wieder auf 3,0 eingestellt. Dann
wurde das Gemisch unter Kühlung stehengelassen und
zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, ausreichend lange
unter Kühlung dialysiert und dann lyophlilisiert.
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Dann wurde er auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1
beschrieben, unter Verwendung einer SP-Sephadex -Säule und
einer Sephadex G-100 -Säule behandelt, um so einen Extrakt
aus dem rohen luteinisierenden Hormon zu ergeben.
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Dieser rohe Extrakt des luteinisierenden Hormons wurde mit
einer Concanavalin A-Sephadex-Säule behandelt, um so einen
rohen renalen Wachstumsfaktor zu ergeben.
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Der erhaltene rohe renale Wachstumsfaktor wurde durch
isoelektrische Focussierung fraktioniert. Jede so erhaltene
Fraktion wurde demselben Biotest unterworfen, wie in
Beispiel 1 beschrieben. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß
eine Fraktion mit einem pI-Wert von 9,05 bis 9,90 eine
Komponente enthielt, die das renale Wachstum fördert.