DE69911024T2 - Methoden zur herstellung von rekombinanten peptiden mit einer geringen menge von trisulfiden - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Alkali- oder Erdalkalimetall-Salzes bei der Erzeugung von Rekombinations-Peptiden während oder nach der Fermentations-Stufe zur Verringerung der Menge an Trisulfiden in dem Rekombinations-Produkt. Das Peptid ist vorzugsweise menschliches Wachstumshormon und das Salz vorzugsweise ein Kalium- oder Natrium-phosphat.
- Hintergrund
- Bei der Erzeugung von Peptiden durch Rekombinations-Verfahren, insbesondere bei der Erzeugung von Pharmazeutika, sollte die Menge der Kontaminationen, wie Varianten des gewünschten Proteins, vom wirtschaftlichen und therapeutischen Standpunkt aus so weit wie möglich verringert werden.
- Bei der Erzeugung von Peptiden durch Rekombinations-Verfahren finden sich manchmal Varianten mit einem zusätzlichen Schwefelatom in einer Disulfid-Brücke, und die vorliegende Erfindung bezieht sich auf dieses Problem.
- Menschliches Wachstumshormon, hGH, ist ein Protein, das aus einer einzelnen Kette mit 191 Aminosäuren besteht. Das Molekül ist über zwei Disulfid-Brücken quervernetzt und die monomere Form hat ein Molekulargewicht von 22 kDa.
- hGH-Zubereitungen wurden aus menschlichen Hypophysen hergestellt, aber die Produkte, die derzeit auf dem Markt sind, sind durch Rekombinations-Methoden erzeugt worden rhGH.
- Zur Zeit sind zwei Arten von therapeutisch geeigneten Rekombinations-hGH-Zubereitungen auf dem Markt: Die authentische, z. B. Genotropin®, Pharmacia & Upjohn AB, und eine analoge mit einem zusätzlichen Methionin-Rest an dem N-terminalen Ende, z. B. Somatonorm®.
- hGH wird angewandt, um das Längenwachstum von Patienten mit hypophysärem Minderwuchs oder Turners Syndrom zu stimulieren, aber andere Indikationen wurden ebenfalls angegeben
- Es wurde eine neue Variante von menschlichem Wachstumshormon, hGH, gefunden und hierzu wird auf Pavlu et al., 1993, Bioseparation 3, 257–265 verwiesen. Diese Variante wurde identifiziert und charakterisiert, s. Andersson et al., 1996, Int. J. Pep tide, Protein,. Res. 47, 311–321. Es hat sich gezeigt, daß die Variante, die während der Expression von hGH in Escherichia coli gebildet wird, stärker hydrophob ist als rhGH und sie ist strukturell definiert worden als eine Trisulfid-Variante von rhGH. Die Variante wird nur während der Synthese in E. coli gebildet und ist in hGH-Präparaten aus menschlichen Hypophysen nicht gefunden worden.
- Dieses Phänomen der Trisulfide in Peptiden, die durch Rekombinations-Methoden erzeugt worden sind, ist auch für Rekombinations-Superoxid-Dismutase beschrieben worden (Briggs et al., 1987, Biochem., Biophys. Acta, 537, 100–109) und für ein mutiertes Protein von Interleukin (Breton, J., et al., J. Chromatogr. A., 1995, 709(1), 135–146).
- In der WO 94/24127 ist eine Methode zur Umwandlung eines hydrophoben Derivat eines Wachstumshormons in die native Form des Wachstumshormons angegeben. Das hydrophobe Derivat des Wachstumshormons enthält ein zusätzliches Schwefelatom. Die Methode besteht in der chemischen Behandlung des Derivats des Wachstumshormons mit einer Mercapto-Verbindung. Als Beispiele sind Cystein, Gluthation 2-Mercapto-ethanol und Dithiothreitol angegeben.
- In der WO 96/02570 ist eine Methode angegeben, umfassend die chemische Behandlung mit einer Sulfit-Verbindung zur Umwandlung des Derivats des Wachstumshormons in die native Form. Mercapto-Verbindungen und Sulfit-Verbindungen werden in der Redox-Reaktion zur Umwandlung des bereits gebildeten Wachstumshormons, das ein zusätzliches Schwefelatom enthält, angewandt.
- Die Erfindung
- Es wurde nun eine neue Verwendung eines Alkali- oder Erdalkalimetall-Salzes bei der Erzeugung von Rekombinations-Peptiden während oder nach der Fermentations-Stufe zur Verringerung der Menge an Trisulfiden in dem Rekombinations-Produkt gefunden. Die Rekombinations-Peptide können z. B. sowohl Proteine als auch kleinere Peptide sein.
- Die Erfindung beruht auf der neuen und unerwarteten Feststellung, daß die Menge an Trisulfiden bei der Erzeugung von Rekombinations-Peptiden verringert werden kann durch Zusatz eines Metallsalzes, vorzugsweise im Überschuß, schon während oder nach der Fermentation und nicht, wie früher angegeben, durch Umwandlung des entstandenen Trisulfids des Wachstumshormons in die native Form.
- Diese verringerte Menge des Derivats beruht auf der Hemmung der Aktivität von H2S in dem Medium und der Vermeidung der Bildung des modifizierten Wachstumshormons, das ein zusätzliches Schwefelatom enthält.
- Der Zusatz kann direkt nach der Fermentation, z. B. nachdem die Fermentation beendet ist und die Zellen geerntet worden sind, und vor weiteren Verfahrensstufen erfolgen.
- Der Zusatz kann z. B. mit einem Puffer erfolgen, der das Salz enthält.
- Das Protein kann irgendein Rekombinations-Protein sein, ist aber vorzugsweise Rekombinations-Wachstumshormon, das sowohl menschliches als auch tierisches sein kann, wie menschliches Wachstumshormon (hGH), Rinder-Wachstumshormon (bGH) und Schweine-Wachstumshormon (pGH).
- Das Metallsalz kann ein Salz irgendeines Metalls, ausgewählt aus Alkali- und Erdalkalimetallen sein.
- Der pH ist vorzugsweise gleich oder kleiner als pH 7. Insbesondere ist der pH gleich oder kleiner als 6,8 und vor allem ist der pH gleich oder kleiner als 6,0.
- Die Einstellung des pH-Wertes kann erreicht werden mit einem ausgewählten Puffer, der das Metallsalz enthält.
- Das Metall ist vorzugsweise ein Alkali, wie Natrium oder Kalium, und das Salz ist vorzugsweise Natrium- oder Kaliumphosphat oder -acetat.
- Die Konzentration an freien Sulfid-Ionen wird durch Zusatz des Metallsalzes in einem molaren Überschuß minimal gehalten.
- Das verwendete Metallsalz ist vorzugsweise kein Sulfid und keine Mercapto-Verbindung.
- Die beiliegenden Ansprüche definieren die Erfindung.
-
1 zeigt die Menge an Trisulfid-GH in den Extrakten. -
2 zeigt angegeben, um Induktion und Hemmung der Trisulfid-Bildung in GH. In den unten angegebenen Beispielen wurde ein durch Rekombination erhaltenes hGH hergestellt oder verwendet, aber die beanspruchte Erfindung ist nicht auf dieses Peptid beschränkt. Die Trisulfid-Variante wird als Trisulfid-GH bezeichnet. - BEISPIELE
- hGH wurde nach bekannten Methoden in E. coli erzeugt. Es wird auf die
EP 177343 - Der Transformant von E. coli wurde in dem Medium fermentiert, die Kultur wurde unter Belüften bewegt und es wurde Glucose zugegeben. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Bezugsprobe entnommen. Anschließend wurden die Zellen geerntet. Zur Erzeugung von reinem hGH wurden die geernteten Zellen konzentriert, gewaschen durch Gefrieren löslich gemacht und nach bekannten Methoden gereinigt.
- Beispiel 1 Variation des pH-Wertes Labormaßstab
- Die Kultur wurde geerntet und die Zellen durch Mikrofiltration konzentriert. Der pH in dem Zellkonzentrat betrug 7,3. Es wurden vier Ansätze von Zellkonzentrat genommen. In drei Ansätzen (500 ml) wurde der pH mit HCl bzw. NaOH auf 6,5, 7,0 und 7,8 eingestellt. Der vierte Ansatz ist die nicht behandelte Vergleichsprobe. Anschließend wurden die Zellkonzentrate gefroren.
- Die vier Ansätze wurden aufgetaut und die Zellkonzentrate wurden zweifach mit einem Puffer verdünnt, der 10 mM Tris-HCl und 1 mM Na2-EDTA, pH 8,2, enthielt. Durch Zentrifugieren wurden zellfreie Extrakte erhalten.
- Die Menge an Trisulfid-GH wurde bestimmt.
- Das Ergebnis ist in
1 angegeben. - Es hat sich gezeigt, daß die Menge an Trisulfid-GH bei pH 7,8 am höchsten war (12%). Das könnte mit dem vierten Ansatz verglichen werden, bei dem der pH nicht verändert war.
- Ein pH über 7,0 ergab eine zu große Menge an Trisulfid-GH, so sollte der pH niedriger sein.
- Beispiel 2 Pilotmaßstab
- Die Kultur wurde geerntet und die Zellen wurden durch Mikrofiltration konzentriert. Der pH in dem Zellkonzentrat betrug 7,2. Das Zellkonzentrat wurden in zwei Anteile (etwa 30 l) aufgeteilt Das Zellkonzentrat A wurde mit etwa 1 Volumen Wasser gewaschen und anschließend bei –30°C gefroren.
- Das Zellkonzentrat B wurde mit etwa 1 Volumen 0.05 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,6, gewaschen. Der pH-Wert in dem Zellkonzentrat B betrug 6,8. Das Zellkonzentrat wurde anschließend bei –30°C gefroren.
- Nach dem Auftauen wurden die konzentrierten Zellen durch Diafiltration mit Tris-HCl/EDTA-Puffer extrahiert und die Menge an Trisulfiden wurde bestimmt. Die Menge an Trisulfid-GH betrug 6% in Extrakt A und etwa 3% in Extrakt B und somit das Doppelte in A verglichen mit B. Das zeigt, daß ein niedriger pH und der Metallsalz-Puffer die Menge der Trisulfid-Variante des Wachstumshormons verringert.
- Beispiel 3 Pilotmaßstab
- Die Menge an Trisulfiden in der Bezugsprobe, die vor der Ernte entnommen worden war, wurde bestimmt. Die Kultur wurde geerntet und die Zellen wurden durch Mikrofiltration konzentriert. Der pH in dem Zellkonzentrat betrug 7,2. Das Zellkonzentrat wurde in zwei Anteile (etwa 30 l) aufgeteilt Das Zellkonzentrat C wurde mit etwa 1 Volumen Wasser gewaschen und anschließend bei –30°C gefroren.
- Das Zellkonzentrat D wurde mit etwa 1 Volumen 0.9% NaCl in Wasser gewaschen. Der pH in diesem Zellkonzentrat betrug 7,2. Das Zellkonzentrat wurde anschließend bei –30° C gefroren.
- Nach dem Auftauen wurden die konzentrierten Zellen durch Diafiltration mit Tris-HCl/EDTA-Puffer extrahiert und die Menge an Trisulfiden wurde bestimmt. Die Menge an Trisulfid-GH betrug 5% in Extrakt C und etwa 4,8% in D und somit das Gleiche in C und D. Das Verhältnis von Trisulfid-GH in Extrakt C : Vergleichsprobe betrug 5% : 2,0% = 2,5 und das Verhältnis von Trisulfid-GH in Extrakt D : Vergleichsprobe betrug 4,7% : 2,0% = 2,4.
- Das zeigt, daß für einen periplasmatischen Extrakt nicht nur der Zusatz eines Metallsalzes, sondern auch der niedrige pH-Wert von Bedeutung ist.
- Beispiel 4 Pilotmaßstab
- Die Menge an Trisulfiden in der Bezugsprobe, die vor der Ernte entnommen worden war, wurde bestimmt. Die Kultur wurde geerntet und die Zellen durch Mikrofiltration konzentriert. Der pH in dem Zellkonzentrat betrug 7,2. Das Zellkonzentrat (E) wurde mit etwa 1 Volumen 0,025 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, gewaschen, zu dem 1 ml/l HCl 37% zugesetzt war. Der pH in dem Konzentrat (E) betrug 5,9. Das Zellkonzentrat wurde anschließend bei –30° C gefroren.
- Nach dem Auftauen wurden die konzentrierten Zellen durch Diafiltration mit Tris-HCl/EDTA-Puffer extrahiert und die Menge an Trisulfiden wurde bestimmt.
- Das Verhältnis von Trisulfid-GH in Extrakt E : Vergleichsprobe betrug 1,6% : 1,4% = 1,1.
- Das zeigt, daß die Menge an Trisulfid-GH durch Zusatz eines Metallsalzes bei niedrigem pH-Wert verringert werden kann.
- Beispiel 5 Pilotmaßstab
- Die Menge an Trisulfiden in der Bezugsprobe, die vor der Ernte entnommen worden war, wurde bestimmt. Die Kultur wurde geerntet und die Zellen wurden durch Mi krofiltration konzentriert. Der pH in dem Zellkonzentrat betrug 7,2. Das Zellkonzentrat wurde in zwei Anteile (etwa 30 l) aufgeteilt Das Zellkonzentrat F wurde mit etwa 1 Volumen Acetat-Puffer, enthaltend Natriumacetat × 3H2O, 8,03 g/l und Essigsäure (100%)% 2,35 ml/l gewaschen. Der pH in dem Zellkonzentrat F betrug 5,69 Das Zellkonzentrat wurde anschließend bei –30°C gefroren.
- Das Zellkonzentrat G wurde mit etwa 1 Volumen 0,025 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, gewaschen, zu dem 0,5 ml/l konz. H2SO4 zugesetzt waren. Der pH-Wert in dem Zellkonzentrat (G) betrug 5,9. Das Zellkonzentrat wurde anschließend bei –30°C gefroren.
- Nach dem Auftauen wurden die konzentrierten Zellen durch Diafiltration mit Tris-HCl/EDTA-Puffer extrahiert und die Menge an Trisulfiden wurde bestimmt.
- Das Verhältnis von Trisulfid-GH in Extrakt F : Vergleichsprobe betrug 3,4% : 3,1% = 1,1 und das Verhältnis von Trisulfid-GH in Extrakt G : Vergleichsprobe betrug 2,6% : 3,1 % = 0,8.
- Das zeigt, daß die Menge an Trisulfid-GH durch Zusatz eines Metallsalzes bei niedrigem pH-Wert verringert werden kann.
- Beispiel 6 Vergleich von Puffern und pH-Werten
- 250 μl reines hGH (aus der Produktion von Genotropin®) in Wasser (2,436 mg/ml) + 250 μl unterschiedlicher 100 mM Puffer, s. Tabelle 1, wurden vermischt. Gesättigtes H2S (0,11 M) in destilliertem Wasser wurde unmittelbar nach der Herstellung verwendet. 50 μl destilliertes Wasser (Vergleich) oder H2S in drei unterschiedlichen Verdünnungen wurde zu jeder Probe zugegeben. (0,5, 0,1 bzw. 0,02 mM H2S)
- Die Konzentration betrug anschließend 1,11 mg hGH/ml.
- Diese Lösungen wurden mit den unterschiedlichen Konzentrationen an H2S 3 h bei Raumtemperatur inkubiert zur Erzeugung der Trisulfid-Variante von hGH.
- Nach Inkubation, Einfrieren, Auftauen und Entsalzen aller Proben in 25 mM Tris-HCl bei pH 7,6 wurde die Menge an Trisulfid bestimmt.
- Die Puffer wurden nach Standardtabellen hergestellt. Tabelle 1
Na-phosphat, pH 7,8 Na-phosphat, pH 7,0 Na-phosphat, pH 6,5 Na-phosphat, pH 6,0 Na-citrat, pH 6,2 Tris-HCl, pH 7,6 Ammonium-citrat, pH 6,2 - Das Ergebnis ist in
2 gezeigt. - Ammonium-citrat führte zu keiner Verringerung der Trisulfide, trotz des niedrigen pH-Wertes.
- Na-phosphat mit pH 6,0 führte zu dem besten Ergebnis, aber auch Na-phosphat mit einem höheren pH-Wert kann angewandt werden.
- Das zeigt, daß für reines hGH der Zusatz eines Metallsalzes von Bedeutung ist für die Menge an Trisulfiden.
Claims (8)
- Verwendung eines Alkali- oder Erdakalimetall-Salzes bei der Erzeugung von Rekombinations-Peptiden während oder nach der Fermentations-Stufe zur Verringerung der Menge an Trisulfiden in dem Rekombinations-Produkt.
- Verwendung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den Zusatz des Salzes während oder nach der Fermentations-Stufe
- Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Zusatz direkt nach der Fermentation erfolgt.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der pH-Wert gleich oder niedriger als 7 ist.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Metall vorzugsweise Natrium oder Kalium ist.
- Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Salz vorzugsweise Natrium- oder Kalium-phosphat oder -acetat ist.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Peptid Wachstumshormon ist.
- Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Peptid menschliches Wachstumshormon ist.
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