JP2002520332A - 少量のトリスルフィドを有する組換えペプチドの製造法 - Google Patents
少量のトリスルフィドを有する組換えペプチドの製造法Info
- Publication number
- JP2002520332A JP2002520332A JP2000559129A JP2000559129A JP2002520332A JP 2002520332 A JP2002520332 A JP 2002520332A JP 2000559129 A JP2000559129 A JP 2000559129A JP 2000559129 A JP2000559129 A JP 2000559129A JP 2002520332 A JP2002520332 A JP 2002520332A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- trisulfide
- amount
- recombinant
- metal salt
- cell concentrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 21
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 21
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 19
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 11
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 10
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000001340 alkali metals Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract description 31
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- -1 mercapto compound Chemical class 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 4
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 229940063135 genotropin Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 208000003068 pituitary dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、発酵工程の間又は後の金属塩の添加を特徴とする、少量のトリスルフィドを有する組換えペプチドの製造法に関し、発酵工程の間又は後の金属塩の添加を特徴とする、組換えペプチドの製造におけるトリスルフィドの量を減少させる方法に関する。ペプチドは、好ましくはヒト成長ホルモンであり、塩は、好ましくはリン酸カリウム又はリン酸ナトリウムである。
Description
【０００１】 本発明は、発酵工程の間又は後の金属塩の添加を特徴とする、少量のトリスル
フィドを有する組換えペプチドの製造法に関し、発酵工程の間又は後の金属塩の
添加を特徴とする、組換えペプチドの製造におけるトリスルフィドの量を減少さ
せる方法に関する。ペプチドは、好ましくはヒト成長ホルモンであり、塩は、好
ましくはリン酸カリウム又はリン酸ナトリウムである。
フィドを有する組換えペプチドの製造法に関し、発酵工程の間又は後の金属塩の
添加を特徴とする、組換えペプチドの製造におけるトリスルフィドの量を減少さ
せる方法に関する。ペプチドは、好ましくはヒト成長ホルモンであり、塩は、好
ましくはリン酸カリウム又はリン酸ナトリウムである。
【０００２】 背景 ペプチドの組換え製造において、特に医薬品の製造において、所望のタンパク
質の異型のような夾雑物の量は、経済的な面からも、治療の面からも、可能な限
り減少させなければならない。
質の異型のような夾雑物の量は、経済的な面からも、治療の面からも、可能な限
り減少させなければならない。
【０００３】 ペプチドの組換え製造において、ジスルフィド架橋に余分な硫黄原子を有する
異型が見出されることがあり、本発明は、この問題に関する。
異型が見出されることがあり、本発明は、この問題に関する。
【０００４】 ヒト成長ホルモンｈＧＨは、１９１アミノ酸の単鎖からなるタンパク質である
。分子は、２つのジスルフィド架橋により架橋されており、その単量体型は２２
ｋＤａという分子量を有する。
。分子は、２つのジスルフィド架橋により架橋されており、その単量体型は２２
ｋＤａという分子量を有する。
【０００５】 ｈＧＨ調製物は、ヒト下垂体から調製されていたが、現在市場に出ている産物
は組換え法により製造されたｒｈＧＨである。
は組換え法により製造されたｒｈＧＨである。
【０００６】 ２つの型の治療に有用な組換えｈＧＨ調製物が、市場に存在する。その２つの
型とは、真正ｈＧＨ、例えばゲノトロピン（Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ）（登録商標
）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ ＡＢ）及びＮ末端に付加的なメチオニ
ン残基を有するアナログ、例えばソマトノーム（Ｓｏｍａｔｏｎｏｒｍ）（登録
商標）である。ｈＧＨは下垂体小人症又はターナー症候群の患者において線形の
成長を刺激するために使用されるが、その他の適用も提唱されている。
型とは、真正ｈＧＨ、例えばゲノトロピン（Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ）（登録商標
）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ ＡＢ）及びＮ末端に付加的なメチオニ
ン残基を有するアナログ、例えばソマトノーム（Ｓｏｍａｔｏｎｏｒｍ）（登録
商標）である。ｈＧＨは下垂体小人症又はターナー症候群の患者において線形の
成長を刺激するために使用されるが、その他の適用も提唱されている。
【０００７】 ヒト成長ホルモンｈＧＨの新規な異型が見出されており、Ｐａｖｌｕら，１９
９３、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ３，２５７−２６５を参照されたい。この
異型は、同定され特徴決定されている。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９９６，Ｉｎｔ
．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｒｅｓ．４７，３１１−３２１を参照
のこと。大腸菌におけるｈＧＨの発現において形成される異型は、ｒｈＧＨより
も疎水性が高く、構造的にはｒｈＧＨのトリスルフィド異型として定義されてい
る。その異型は、大腸菌における合成においてのみ形成され、ヒト下垂体由来の
ｈＧＨ調製物中には見出されていない。
９３、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ３，２５７−２６５を参照されたい。この
異型は、同定され特徴決定されている。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９９６，Ｉｎｔ
．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｒｅｓ．４７，３１１−３２１を参照
のこと。大腸菌におけるｈＧＨの発現において形成される異型は、ｒｈＧＨより
も疎水性が高く、構造的にはｒｈＧＨのトリスルフィド異型として定義されてい
る。その異型は、大腸菌における合成においてのみ形成され、ヒト下垂体由来の
ｈＧＨ調製物中には見出されていない。
【０００８】 組換え法により製造されたペプチド中のこのトリスルフィドの現象は、組換え
スーパーオキシドジスムターゼ（Ｂｒｉｇｇｓら，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５３７，１００−１０９）及びインターロイキン
のムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）（Ｂｒｅｔｏｎ Ｊら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
．Ａ．，１９９５，７０９（１），１３５−４６）に関しても記載されている。
スーパーオキシドジスムターゼ（Ｂｒｉｇｇｓら，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５３７，１００−１０９）及びインターロイキン
のムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）（Ｂｒｅｔｏｎ Ｊら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
．Ａ．，１９９５，７０９（１），１３５−４６）に関しても記載されている。
【０００９】 国際特許公開第９４／２４１２７号には、成長ホルモンの疎水性誘導体を天然
型の成長ホルモンに変換するための方法が開示されている。成長ホルモンの疎水
性誘導体は、余分な硫黄原子を含む。その方法は、成長ホルモンの誘導体のメル
カプト化合物による化学的処理である。例としては、システイン、グルタチオン
、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールが挙げられている。
型の成長ホルモンに変換するための方法が開示されている。成長ホルモンの疎水
性誘導体は、余分な硫黄原子を含む。その方法は、成長ホルモンの誘導体のメル
カプト化合物による化学的処理である。例としては、システイン、グルタチオン
、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールが挙げられている。
【００１０】 国際特許公開第９６／０２５７０号には、成長ホルモンの誘導体を天然型へ変
換するための、亜硫酸塩化合物による化学的処理を含む方法が開示されている。
余分な硫黄原子を含む、既に形成された成長ホルモンの変換のための酸化還元反
応において、メルカプト化合物及び亜硫酸塩化合物が使用される。
換するための、亜硫酸塩化合物による化学的処理を含む方法が開示されている。
余分な硫黄原子を含む、既に形成された成長ホルモンの変換のための酸化還元反
応において、メルカプト化合物及び亜硫酸塩化合物が使用される。
【００１１】 発明 我々は、組換えペプチド、例えばタンパク質及び比較的小さいペプチドの両方
の製造におけるトリスルフィドの量を減少させるための新規な方法を見出した。
本発明は、従来の提唱のように、形成された成長ホルモンのトリスルフィドを天
然型に変換するのではなく、発酵の間又は後に既に、好ましくは過剰の金属塩を
添加することにより、組換えペプチドの製造におけるトリスルフィドの量を減少
させることができるという、新規かつ予想外の発見に基づいている。
の製造におけるトリスルフィドの量を減少させるための新規な方法を見出した。
本発明は、従来の提唱のように、形成された成長ホルモンのトリスルフィドを天
然型に変換するのではなく、発酵の間又は後に既に、好ましくは過剰の金属塩を
添加することにより、組換えペプチドの製造におけるトリスルフィドの量を減少
させることができるという、新規かつ予想外の発見に基づいている。
【００１２】 この誘導体の量の減少は、培地中のＨ２Ｓの活性の阻害及び余分な硫黄原子を
含む修飾型成長ホルモンの形成の阻止によるものである。
含む修飾型成長ホルモンの形成の阻止によるものである。
【００１３】 添加は、発酵の後、例えば発酵が完了し、細胞が収集された後、その後の工程
の前に直接的に実施されうる。添加は、例えば、塩を含む緩衝液を用いて実施さ
れうる。
の前に直接的に実施されうる。添加は、例えば、塩を含む緩衝液を用いて実施さ
れうる。
【００１４】 タンパク質は、任意の組換えタンパク質でありうるが、好ましくはヒト成長ホ
ルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びブタ成長ホルモン（ｐＧＨ
）のような、ヒトであっても動物であってもよい組換え成長ホルモンである。
ルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びブタ成長ホルモン（ｐＧＨ
）のような、ヒトであっても動物であってもよい組換え成長ホルモンである。
【００１５】 金属塩は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の中から選択される任意の金属
でありうる。
でありうる。
【００１６】 ｐＨは、好ましくは、ｐＨ７以下である。より好ましくは、ｐＨは、ｐＨ６．
８以下であり、最も好ましくは、ｐＨは、ｐＨ６．０以下である。
８以下であり、最も好ましくは、ｐＨは、ｐＨ６．０以下である。
【００１７】 ｐＨ制御は、金属塩を含む選択された緩衝液を用いて達成されうる。
【００１８】 金属は、好ましくはナトリウム又はカリウムのようなアルカリ金属であり、塩
は、好ましくはナトリウム又はカリウムのリン酸塩又は酢酸塩である。
は、好ましくはナトリウム又はカリウムのリン酸塩又は酢酸塩である。
【００１９】 遊離のスルフィド・イオンの濃度は、モル過剰（ｍｏｌａｒ ｅｘｃｅｓｓ）
の金属塩の添加により最少限に抑えられる。
の金属塩の添加により最少限に抑えられる。
【００２０】 使用される金属塩は、好ましくは亜硫酸塩又はメルカプト化合物ではない。
【００２１】 添付の請求の範囲により、本発明は定義される。
【００２２】 図面の簡単な説明 図１は、抽出物中のトリスルフィドＧＨの量を示す図である。
【００２３】 図２は、ＧＨ中のトリスルフィド形成の誘導及び阻害を示す図である。
【００２４】 以下の実施例においては、組換え製造されたｈＧＨが製造又は使用されている
が、請求の範囲に記載される発明は、このペプチドに限定されない。トリスルフ
ィド異型は、トリスルフィドＧＨと呼ばれる。
が、請求の範囲に記載される発明は、このペプチドに限定されない。トリスルフ
ィド異型は、トリスルフィドＧＨと呼ばれる。
【００２５】 実施例 既知の方法に従い、ｈＧＨを大腸菌において製造した。欧州特許第１７７３４
３号、実施例８を参照することができる。
３号、実施例８を参照することができる。
【００２６】 大腸菌の形質転換体を培地中で発酵させ、培養物を曝気しながら攪拌し、グル
コースを添加した。グルコース及び曝気を中止することにより、発酵を停止させ
た。この時点で、参照試料を採取した。その後、細胞を収集した。
コースを添加した。グルコース及び曝気を中止することにより、発酵を停止させ
た。この時点で、参照試料を採取した。その後、細胞を収集した。
【００２７】 純粋なｈＧＨの製造のため、既知の方法に従い、収集した細胞を濃縮し、洗浄
し、凍結により可溶化し、解凍し、精製した。
し、凍結により可溶化し、解凍し、精製した。
【００２８】 実施例１ ｐＨの変動、実験室スケール 培養物を収集し、微小濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により細胞を
濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．３であった。細胞濃縮物の４つのバッチを
採取した。３つのバッチ（５００ｍｌ）においては、それぞれＨＣｌ又はＮａＯ
Ｈを用いて、ｐＨを６．５、７．０及び７．８に調整した。第４のバッチは、未
処理の比較試料である。その後、細胞濃縮物を凍結させた。
濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．３であった。細胞濃縮物の４つのバッチを
採取した。３つのバッチ（５００ｍｌ）においては、それぞれＨＣｌ又はＮａＯ
Ｈを用いて、ｐＨを６．５、７．０及び７．８に調整した。第４のバッチは、未
処理の比較試料である。その後、細胞濃縮物を凍結させた。
【００２９】 ４つのバッチを解凍し、１０ｍＭトリスＨＣｌ及び１ｍＭ Ｎａ２−ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．２）を含有する緩衝液を用いて細胞濃縮物を２倍に希釈した。遠心分
離により無細胞抽出物を得た。
（ｐＨ８．２）を含有する緩衝液を用いて細胞濃縮物を２倍に希釈した。遠心分
離により無細胞抽出物を得た。
【００３０】 抽出物中のトリスルフィドＧＨの量を決定した。
【００３１】 結果を図１に示す。
【００３２】 トリスルフィドＧＨの量は、ｐＨ７．８において最も高いことが見出された（
１２％）。これは、ｐＨを変化させていない第４のバッチに匹敵していた。
１２％）。これは、ｐＨを変化させていない第４のバッチに匹敵していた。
【００３３】 ７．０を超えるｐＨは、この実験において余りに多量のトリスルフィドＧＨを
与えたため、ｐＨは低くするべきである。
与えたため、ｐＨは低くするべきである。
【００３４】 実施例２ パイロット・スケール 培養物を収集し、微小濾過により細胞を濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．
２であった。細胞濃縮物を２つの部分に分割した（約３０Ｌ）。細胞濃縮物Ａを
約１容量の水で洗浄し、その後−３０℃で凍結させた。
２であった。細胞濃縮物を２つの部分に分割した（約３０Ｌ）。細胞濃縮物Ａを
約１容量の水で洗浄し、その後−３０℃で凍結させた。
【００３５】 細胞濃縮物Ｂは、約１容量の０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．６で
洗浄した。細胞濃縮物Ｂ中のｐＨは６．８であった。その後、細胞濃縮物を−３
０℃で凍結させた。
洗浄した。細胞濃縮物Ｂ中のｐＨは６．８であった。その後、細胞濃縮物を−３
０℃で凍結させた。
【００３６】 解凍後、トリスＨＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝液を用いた透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎ）により、濃縮された細胞を抽出し、トリスルフィドの量を決定した
。トリスルフィドＧＨの量は、細胞濃縮物Ａにおいては６％、細胞濃縮物Ｂにお
いては約３％であり、Ａにおいては、Ｂと比較して２倍であった。これは、低ｐ
Ｈ及び金属塩緩衝液が、成長ホルモンのトリスルフィド異型の量を減少させるこ
とを示した。
ａｔｉｏｎ）により、濃縮された細胞を抽出し、トリスルフィドの量を決定した
。トリスルフィドＧＨの量は、細胞濃縮物Ａにおいては６％、細胞濃縮物Ｂにお
いては約３％であり、Ａにおいては、Ｂと比較して２倍であった。これは、低ｐ
Ｈ及び金属塩緩衝液が、成長ホルモンのトリスルフィド異型の量を減少させるこ
とを示した。
【００３７】 実施例３ パイロット・スケール 収集前に採取された参照試料中のトリスルフィドの量を決定した。培養物を収
集し、微小濾過により細胞を濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．２であった。
細胞濃縮物を２つの部分に分割した（約３０Ｌ）。細胞濃縮物Ｃを約１容量の水
で洗浄し、その後−３０℃で凍結させた。
集し、微小濾過により細胞を濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．２であった。
細胞濃縮物を２つの部分に分割した（約３０Ｌ）。細胞濃縮物Ｃを約１容量の水
で洗浄し、その後−３０℃で凍結させた。
【００３８】 細胞濃縮物Ｄは、約１容量の０．９％ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。細胞濃縮物
中のｐＨは７．２であった。その後、細胞濃縮物を−３０℃で凍結させた。
中のｐＨは７．２であった。その後、細胞濃縮物を−３０℃で凍結させた。
【００３９】 解凍後、トリスＨＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝液を用いた透析濾過により、濃縮された
細胞を抽出し、トリスルフィドの量を決定した。トリスルフィドＧＨの量は、抽
出物Ｃにおいては約５％、Ｄにおいては約４．８％であり、ＣとＤは同等であっ
た。抽出物Ｃ中のトリスルフィドＧＨ：参照試料中のトリスルフィドＧＨの比は
、５．０％：２．０％＝２．５であり、抽出物Ｄ中のトリスルフィドＧＨ：参照
試料中のトリスルフィドＧＨの比は、４．７％：２．０％＝２．４であった。
細胞を抽出し、トリスルフィドの量を決定した。トリスルフィドＧＨの量は、抽
出物Ｃにおいては約５％、Ｄにおいては約４．８％であり、ＣとＤは同等であっ
た。抽出物Ｃ中のトリスルフィドＧＨ：参照試料中のトリスルフィドＧＨの比は
、５．０％：２．０％＝２．５であり、抽出物Ｄ中のトリスルフィドＧＨ：参照
試料中のトリスルフィドＧＨの比は、４．７％：２．０％＝２．４であった。
【００４０】 これは、ペリプラズム抽出物に関して、金属塩の添加のみならず、低ｐＨも重
要であることを示した。
要であることを示した。
【００４１】 実施例４ パイロット・スケール 収集前に採取された参照試料中のトリスルフィドの量を決定した。培養物を収
集し、微小濾過により細胞を濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．２であった。
細胞濃縮物（Ｅ）を、１ｍｌ／Ｌの３７％ＨＣｌが添加された約１容量の０．０
２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。細胞濃縮物Ｅ中のｐ
Ｈは５．９であった。その後、細胞濃縮物を−３０℃で凍結させた。
集し、微小濾過により細胞を濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．２であった。
細胞濃縮物（Ｅ）を、１ｍｌ／Ｌの３７％ＨＣｌが添加された約１容量の０．０
２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。細胞濃縮物Ｅ中のｐ
Ｈは５．９であった。その後、細胞濃縮物を−３０℃で凍結させた。
【００４２】 解凍後、トリスＨＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝液を用いた透析濾過により、濃縮された
細胞を抽出し、トリスルフィドの量を決定した。
細胞を抽出し、トリスルフィドの量を決定した。
【００４３】 抽出物Ｅ中のトリスルフィドＧＨ：参照試料中のトリスルフィドＧＨの比は、
１．６％：１．４％＝１．１であった。
１．６％：１．４％＝１．１であった。
【００４４】 これは、金属塩の添加及び低ｐＨによりトリスルフィドＧＨの量を減少させる
ことができることを示した。
ことができることを示した。
【００４５】 実施例５ パイロット・スケール 収集前に採取された参照試料中のトリスルフィドの量を決定した。培養物を収
集し、微小濾過により細胞を濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．２であった。
細胞濃縮物を２つの部分に分割した（約３０Ｌ）。８．０３ｇ／Ｌの酢酸ナトリ
ウム×３Ｈ２Ｏ及び２．３５ｍｌ／Ｌの酢酸（１００％）を含有する約１容量の
酢酸緩衝液で、細胞濃縮物Ｆを洗浄した。細胞濃縮物Ｆ中のｐＨは５．９であっ
た。その後、細胞濃縮物を−３０℃で凍結させた。
集し、微小濾過により細胞を濃縮した。細胞濃縮物中のｐＨは７．２であった。
細胞濃縮物を２つの部分に分割した（約３０Ｌ）。８．０３ｇ／Ｌの酢酸ナトリ
ウム×３Ｈ２Ｏ及び２．３５ｍｌ／Ｌの酢酸（１００％）を含有する約１容量の
酢酸緩衝液で、細胞濃縮物Ｆを洗浄した。細胞濃縮物Ｆ中のｐＨは５．９であっ
た。その後、細胞濃縮物を−３０℃で凍結させた。
【００４６】 ０．５ｍｌ／Ｌの濃Ｈ２ＳＯ４が添加された約１容量の０．０２５Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で、細胞濃縮物Ｇを洗浄した。細胞濃縮物Ｇ中の
ｐＨは５．９であった。その後、細胞濃縮物を−３０℃で凍結させた。
トリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で、細胞濃縮物Ｇを洗浄した。細胞濃縮物Ｇ中の
ｐＨは５．９であった。その後、細胞濃縮物を−３０℃で凍結させた。
【００４７】 解凍後、トリスＨＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝液を用いた透析濾過により、濃縮された
細胞を抽出し、トリスルフィドの量を決定した。
細胞を抽出し、トリスルフィドの量を決定した。
【００４８】 抽出物Ｆ中のトリスルフィドＧＨ：参照試料中のトリスルフィドＧＨの比は、
３．４％：３．１％＝１．１であり、抽出物Ｇ中のトリスルフィドＧＨ：参照試
料中のトリスルフィドＧＨの比は、２．６％：３．１％＝０．８であった。
３．４％：３．１％＝１．１であり、抽出物Ｇ中のトリスルフィドＧＨ：参照試
料中のトリスルフィドＧＨの比は、２．６％：３．１％＝０．８であった。
【００４９】 これは、金属塩の添加及び低ｐＨにより、トリスルフィドＧＨの量を減少させ
ることができることを示した。
ることができることを示した。
【００５０】 実施例６ 緩衝液及びｐＨの比較 ２５０μｌの純粋なｈＧＨ（ゲノトロピン（登録商標）の産物由来）を含む水
（２．４３６ｍｇ／ｍｌ）＋２５０μｌの異なる１００ｍＭ緩衝液（表１参照）
を混合した。飽和Ｈ２Ｓ（０．１１Ｍ）を含む蒸留水を、調製直後に使用した。
５０μｌの蒸留水（対照）又はＨ２Ｓを含む３つの異なる希釈液を、各試料に添
加した（それぞれ、０．５、０．１、及び０．０２ｍＭのＨ２Ｓ）。
（２．４３６ｍｇ／ｍｌ）＋２５０μｌの異なる１００ｍＭ緩衝液（表１参照）
を混合した。飽和Ｈ２Ｓ（０．１１Ｍ）を含む蒸留水を、調製直後に使用した。
５０μｌの蒸留水（対照）又はＨ２Ｓを含む３つの異なる希釈液を、各試料に添
加した（それぞれ、０．５、０．１、及び０．０２ｍＭのＨ２Ｓ）。
【００５１】 その後の濃度は、１．１１ｍｇ ｈＧＨ／ｍｌであった。
【００５２】 ｈＧＨのトリスルフィド異型の調製のため、これらの溶液を、異なる濃度のＨ ２ Ｓと共に室温にて３時間インキュベートした。
【００５３】 ２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）中の全ての試料のインキュベーション、
凍結、解凍、及び脱塩の後、トリスルフィドの量を分析した。
凍結、解凍、及び脱塩の後、トリスルフィドの量を分析した。
【００５４】 緩衝液は、標準表に従い調製された。
【００５５】 表１ リン酸Ｎａ（ｐＨ７．８） リン酸Ｎａ（ｐＨ７．０） リン酸Ｎａ（ｐＨ６．５） リン酸Ｎａ（ｐＨ６．０） クエン酸Ｎａ（ｐＨ６．２） トリスＨＣｌ（ｐＨ７．６） クエン酸アンモニウム（ｐＨ６．２） 結果を、図２に示す。
【００５６】 クエン酸アンモニウムは、低ｐＨにもかかわらず、トリスルフィドの減少を与
えなかった。
えなかった。
【００５７】 ｐＨ６．０のリン酸Ｎａは、最も良好な結果を与えたが、それよりも高いｐＨ
のリン酸Ｎａも使用されうる。
のリン酸Ｎａも使用されうる。
【００５８】 これは、純粋なｈＧＨに関して、金属塩の添加がトリスルフィドの量にとって
重要であることを示した。
重要であることを示した。
【図１】 抽出物中のトリスルフィドＧＨの量を示す図である。
【図２】 ＧＨ中のトリスルフィド形成の誘導及び阻害を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4H045 AA20 BA10 CA40 DA31 EA30 FA74 GA40
Claims (10)
- 【請求項１】 発酵工程の間又は後の金属塩の添加を特徴とする、少量のト
リスルフィドを有する組換えペプチドの製造法。 - 【請求項２】 発酵工程の間又は後の金属塩の添加を特徴とする、組換えペ
プチドの製造におけるトリスルフィドの量を減少させる方法。 - 【請求項３】 添加が発酵後に直接的に実施される、請求項１又は２のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項４】 金属塩がアルカリ金属及びアルカリ土類金属の中から選択さ
れる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 ｐＨがｐＨ７以下である、請求項１から４のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項６】 金属が好ましくはカリウム又はナトリウムである、請求項１
から５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 塩が好ましくはカリウム又はナトリウムのリン酸塩又は酢酸
塩である、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 ペプチドが、好ましくは成長ホルモンであり、より好ましく
はヒト成長ホルモンである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 組換え産物中のトリスルフィドの量を減少させるための、発
酵工程の間又は後の組換えペプチドの製造における金属塩の使用。 - 【請求項１０】 発酵工程の間又は後の金属塩の添加による、組換えペプチ
ドの製造におけるトリスルフィドの量を減少させるための金属塩の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9802454-0 | 1998-07-08 | ||
| SE9802454A SE9802454D0 (sv) | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Production of peptides |
| PCT/SE1999/001222 WO2000002900A1 (en) | 1998-07-08 | 1999-07-05 | Method for the production of recombinant peptides with a low amount of trisulfides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002520332A true JP2002520332A (ja) | 2002-07-09 |
| JP2002520332A5 JP2002520332A5 (ja) | 2006-06-01 |
Family
ID=20412012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000559129A Pending JP2002520332A (ja) | 1998-07-08 | 1999-07-05 | 少量のトリスルフィドを有する組換えペプチドの製造法 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7232894B1 (ja) |
| EP (1) | EP1095055B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002520332A (ja) |
| AT (1) | ATE248855T1 (ja) |
| AU (1) | AU755083B2 (ja) |
| CA (1) | CA2344506C (ja) |
| DE (1) | DE69911024T2 (ja) |
| DK (1) | DK1095055T3 (ja) |
| ES (1) | ES2207255T3 (ja) |
| IL (1) | IL140668A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ509179A (ja) |
| PT (1) | PT1095055E (ja) |
| SE (1) | SE9802454D0 (ja) |
| WO (1) | WO2000002900A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006516021A (ja) * | 2002-09-20 | 2006-06-15 | ファルマシア コーポレイション | Ｐｅｇ化タンパク質の凝集レベルを低下させるための方法 |
| JP4865728B2 (ja) * | 2004-12-29 | 2012-02-01 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を防止する方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7670823B1 (en) | 1999-03-02 | 2010-03-02 | Life Technologies Corp. | Compositions for use in recombinational cloning of nucleic acids |
| MXPA01013236A (es) | 1999-06-28 | 2002-06-21 | Genentech Inc | Metodos para hacer ligando apo-2 mediante el uso de iones metalicos divalentes. |
| US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Pharmacia Corporation | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| ZA200501841B (en) * | 2002-08-28 | 2007-06-27 | Pharmacia Corp | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| DE602004027538D1 (de) | 2003-12-01 | 2010-07-15 | Life Technologies Corp | Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon |
| US9005926B2 (en) | 2009-10-02 | 2015-04-14 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| WO2012158551A1 (en) | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| BR112017001403A2 (pt) | 2014-07-24 | 2017-11-21 | Genentech Inc | métodos para conjugar um agente com uma fração de tiol em uma proteína que contém pelo menos uma ligação trissulfeto |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5256546A (en) * | 1983-07-15 | 1993-10-26 | Bio-Technology General Corp. | Bacterial expression of porcine growth hormone |
| US4985544A (en) * | 1987-08-04 | 1991-01-15 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for renaturing fish growth hormone |
| DK44593D0 (da) | 1993-04-20 | 1993-04-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af et polypeptid |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| ZA955789B (en) | 1994-07-15 | 1996-03-11 | Novo Nordisk As | A method of converting a hydrophobic derivative of a polypeptide into the native form |
-
1998
- 1998-07-08 SE SE9802454A patent/SE9802454D0/xx unknown
-
1999
- 1999-07-05 AT AT99933442T patent/ATE248855T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-07-05 AU AU49496/99A patent/AU755083B2/en not_active Ceased
- 1999-07-05 PT PT99933442T patent/PT1095055E/pt unknown
- 1999-07-05 DK DK99933442T patent/DK1095055T3/da active
- 1999-07-05 DE DE69911024T patent/DE69911024T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-05 IL IL14066899A patent/IL140668A0/xx unknown
- 1999-07-05 NZ NZ509179A patent/NZ509179A/xx unknown
- 1999-07-05 EP EP99933442A patent/EP1095055B1/en not_active Revoked
- 1999-07-05 WO PCT/SE1999/001222 patent/WO2000002900A1/en active IP Right Grant
- 1999-07-05 ES ES99933442T patent/ES2207255T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-05 JP JP2000559129A patent/JP2002520332A/ja active Pending
- 1999-07-05 CA CA2344506A patent/CA2344506C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-05 US US09/743,023 patent/US7232894B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-05-18 US US11/750,692 patent/US20070232792A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006516021A (ja) * | 2002-09-20 | 2006-06-15 | ファルマシア コーポレイション | Ｐｅｇ化タンパク質の凝集レベルを低下させるための方法 |
| JP4865728B2 (ja) * | 2004-12-29 | 2012-02-01 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を防止する方法 |
| US8530191B2 (en) | 2004-12-29 | 2013-09-10 | Novo Nordisk A/S | Method for preventing formation of trisulfide derivatives of polypeptides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7232894B1 (en) | 2007-06-19 |
| EP1095055A1 (en) | 2001-05-02 |
| WO2000002900A1 (en) | 2000-01-20 |
| AU4949699A (en) | 2000-02-01 |
| ATE248855T1 (de) | 2003-09-15 |
| DK1095055T3 (da) | 2003-12-22 |
| ES2207255T3 (es) | 2004-05-16 |
| CA2344506C (en) | 2010-05-11 |
| DE69911024D1 (de) | 2003-10-09 |
| CA2344506A1 (en) | 2000-01-20 |
| EP1095055B1 (en) | 2003-09-03 |
| US20070232792A1 (en) | 2007-10-04 |
| SE9802454D0 (sv) | 1998-07-08 |
| IL140668A0 (en) | 2002-02-10 |
| PT1095055E (pt) | 2003-12-31 |
| NZ509179A (en) | 2003-01-31 |
| AU755083B2 (en) | 2002-12-05 |
| DE69911024T2 (de) | 2004-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20070232792A1 (en) | Method for the Production of Recombinant Peptides with a Low Amount of Trisulfides | |
| EP0397420B1 (en) | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence | |
| US4421685A (en) | Process for producing an insulin | |
| EP0192629B2 (en) | Method of somatotropin solubilization and naturation | |
| AU4330889A (en) | Stable bioactive somatotropins | |
| AU705192B2 (en) | Method for producing a correctly folded, biological active recombinant protein | |
| US20030212248A1 (en) | Process to increase protein stability | |
| JP2844484B2 (ja) | 組換え蛋白質の生産方法 | |
| US6034224A (en) | Method for solubilization and naturation of somatotropins | |
| Gross et al. | The reaction of cyanogen bromide with S-methylcysteine: fragmentation of the peptide 14–29 of bovine pancreatic ribonuclease A | |
| EP0037256B1 (en) | Process for producing an insulin | |
| US4975529A (en) | Method of folding somatotropins | |
| HU207526B (en) | Process for renaturating false recombinants of insuline precursors | |
| ZA200101585B (en) | Process for the preparation of active somatotropin from inclusion bodies. | |
| DE69028396T2 (de) | Acetylierte heterologe polypeptide | |
| EP0226639B1 (en) | Process for preparing heterogenic protein | |
| EP2619222B1 (en) | Improved process for production of recombinant human growth hormone | |
| JPH1036312A (ja) | ピルビン酸を含む液のｐＨの調製方法 | |
| MXPA99006232A (en) | Method for solubilization and naturation of somatotropins | |
| JPS63123393A (ja) | ヒトインタ−ロイキン−２の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060307 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060307 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060406 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20071012 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20071012 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090420 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090928 |