JP4865728B2 - ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を防止する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリペプチドの三硫化物誘導体の、液体培地中でのそれらの生産又は処理の間の形成を防止するための方法に関する。
特に、本発明は、三硫化物誘導体を実質的に含まないか又はその含まれる量が減少した、ヒト成長ホルモン、又それらの中間体、誘導体、類似体、変異体又は突然変異体の生産に関しする。
ジスルフィド結合を含むポリペプチドの多くが三硫化物誘導体を形成することが知られている。それらの中にはスーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキンムテイン（mutein）及び成長ホルモン（GH）がある。しかしながら、原理的には、ジスルフィド結合を含む他のポリペプチド、例えばインスリン、インターロイキン及びある種の凝固因子(VII因子のような)が、特異的な条件下で潜在的に三硫化物誘導体を形成し得る。
三硫化物誘導体を形成すると知られている最も研究されているポリペプチドは成長ホルモン(GH)、特にヒト成長ホルモンである。用語「ヒト成長ホルモン」(hGH；時に、特に「ソマトロピン」又は「ソマトトロピン」とも呼ばれる)は、一般に、２つのジスルフィド架橋によって架橋結合された、191アミノ酸残基の単鎖から成るタンパク質(ポリペプチド)ホルモンであって、それらの単量体形態が約22000 (22 kDa)の分子量を有するものを指すものと理解される。ヒトの下垂体から単離された成長ホルモン製剤は均質ではない。例えば、同じ遺伝子から生産されたより小さい(20 kDa)変異体が知られている。妊娠中の胎盤によって発現される「基本のhGH」変異体(hGH-V)は、別々の遺伝子の産物であるもう一つの類似体/変異体であり；22 kDa hGHポリペプチドのように、191アミノ酸残基から成るが、該配列の種々の位置において13アミノ酸残基が、22 kDa hGHにおけるものと異なる[例えば、Bewley et al., Adv. Enzymol. 42, 73-166 (1975)、及びFrankenne et al., J. Clin. Endocrin. and Metabol. 66, 1171-1180 (1988)を参照]。
hGH (即ち、22 kDaポリペプチド)において、４つのシステイン残基が存在し2つのジスルフィド架橋を生じている。第一のジスルフィド架橋は、Cys 53及びCys 165の間の大きいループを形成し、一方、第二のジスルフィド架橋は、Cys 182及びCys 189の間の小さいループを形成する。小さいループは、分子の表面に位置し、一方大きいループはhGH分子中に包埋している。三硫化物架橋形成は、小さいループと大きいループの両方において形成し得る。
ヒト成長ホルモンは、幼児期の間の縦方向の骨の成長及び正常な成長発達のために特に必須である。骨折の治癒、脂肪組織の分解及び活動後の疲労症候群の最小化の促進を含む、
hGHの他の多くの効果又は適用が知られている。
hGHの他の多くの効果又は適用が知られている。
工業的規模での、治療的に有用なポリペプチド、例えばhGHの製造は、現在では、通常、組換え技術の使用によって達成される。発達した組換え方法の中には、大腸菌のような、細菌宿主を使用するものもある。一方、他の方法は、酵母(例えば、セレビシア・サッカロミセス(Cerevisiae saccharomyces))のような真核生物の微生物を宿主として使用する。
生産(発酵)後、組換えポリペプチドを含む培地は、通常、さらに処理される。そのような処理の間に該ポリペプチドは、遠心分離、微細濾過及び／又は限外濾過のような、種々の抽出及び精製方法に供される。
ポリペプチドを生産するための従来の組換え製造方法を用いて遭遇する問題の一つは、ポリペプチド副産物の形成である。ジスルフィド結合を含むポリペプチドの生産において、誘導体、特に三硫化物誘導体の形成は問題である。
問題の三硫化物誘導体は、該ペプチド分子が、分子内で「三硫化物架橋」を形成する余分の（extra）硫黄原子を含むものである。そのような三硫化物誘導体は、成長ホルモンの生産の間に単離され、望ましくない副産物を構成する。
よって、WO 94/24157は、天然のhGHと比較して余分の硫黄原子を含むhGHの疎水性誘導体を検出する方法を開示している。hGHの疎水性誘導体の余分の硫黄原子は、「三硫化物架橋」を形成し、hGH三硫化物誘導体(TS-hGH)を生じる。さらなる開示は、該hGH三硫化物誘導体を、システイン、グルタチオン、2-メルカプトエタノール又はジチオスレイトールのようなメルカプト化合物で処理することによって、このhGH三硫化物誘導体をその天然のhGH形態に転換する方法である。
さらに、該hGHの三硫化物誘導体は、アンダーソンらの「Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli,」（Int. J. Peptide Protein Res. 47 (1996) pp. 311-321）、及びA.ジェスパーソンらの「Characterisation of a trisulfide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli」（Eur. J. Biochem. 219 (1994) pp. 365-373 (1994) ）に開示されており、また、三硫化物誘導体は、他のペプチド、即ち組換えスーパーオキシドジスムターゼ [Briggs et al., Biochem. Biophys. Acta, 537 (1978) pp. 100-109] 及びインターロイキンのムテイン [J. Breton et al., J. Chromatogr. A 709 (1) (1995) pp. 135-46] についても報告されている。
WO 96/02570は、hGH三硫化物誘導体を、該誘導体を亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム又は亜硫酸アンモニウムのような亜硫酸塩化合物で、又は亜硫酸マグネシウム又は亜硫酸カルシウムのような亜硫酸アルカリ土類金属塩で処置することによって、天然形態のhGHに転換する他の方法を開示している。
WO 00/02900は、特に、発酵工程の間又はその後の金属塩（例えば、カリウム塩又はナトリウム塩）の添加によって特徴付けられる、低い量の三硫化物を有する組換えペプチドを生産する方法を開示している。
WO 04/31213は、特に、遺伝的に改変された宿主細胞中の「成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド」の組換え生産において生産された三硫化物イソ型不純物の量を減少するための方法を開示しており、ここにおいて、該不純物は、「メルカプト化合物」(亜硫酸塩、グルタチオン、β-メルカプト-エタノール、ジチオスレイトール、システイン及びその他によって例証される)と接触される。該出願はまた、形成された三硫化物の量における減少を達成するためのキレート剤又は金属塩の使用を開示している。
驚くべきことに、液体培地中でのポリペプチドの生産及び／又は処理の間の、ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成が、例えば、問題のガスの気泡の流れを通過させることによる該培地のエアレーションによるような、該液体培地をガスでストリッピングするプロセスによって、最小にされるか又は防止されることができることが発見された。
上記したように、本発明の一つの側面は、ポリペプチドを含有する液体培地（典型的には水性培地）中におけるポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を減少させるか又は実質的に防止する方法に関し、該方法は、該液体培地をガスでストリッピングすることを含む。
ポリペプチド
関心のあるポリペプチドは、天然又は合成起源であってよく、本発明の方法は、従って、組換えポリペプチド又は制御された条件下で他の方法によって生産されたポリペプチドへの適用に限定されないが、潜在的に、任意の起源、例えば、植物又は動物から抽出されたポリペプチドに適用されることができる。
関心のあるポリペプチドは、天然又は合成起源であってよく、本発明の方法は、従って、組換えポリペプチド又は制御された条件下で他の方法によって生産されたポリペプチドへの適用に限定されないが、潜在的に、任意の起源、例えば、植物又は動物から抽出されたポリペプチドに適用されることができる。
既に記載したように、多くのポリペプチドが三硫化物誘導体を形成しやすいことが知られている。それらのポリペプチド、特に治療的ポリペプチドは、通常、一以上のジスルフィド結合を含み、それらの中にスーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキン ムテイン（mutein）及び成長ホルモン(GH)がある。原理的には、ジスルフィド結合を含む他のポリペプチド、例えばインスリンなども、適切な条件下で潜在的に三硫化物誘導体を形成できる。
TS誘導体不純物を形成すると知られている最も研究されたポリペプチドは、成長ホルモン(GH)であり、本発明の態様において、該関心のあるポリペプチドは、哺乳類の成長ホルモン（例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ又はネコのGH)、トリのGH、又はサケ、マス又はマグロ起源のGHのような成長ホルモンであり、特にヒト成長ホルモン(hGH)であり、とりわけ組換え的に生産されたhGH (rhGH)である。成長ホルモン(GH)という用語は、本発明の文脈において、以下のものをも包含する：切断型のGH、即ち、切断型の成長ホルモンであって、一以上のアミノ酸残基が欠失したもの；GH類似体であって、置換が抗原性又は活性の減少のような何らかの有害な効果をもたらさない限りは、天然分子における一以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で、特に天然のアミノ酸残基で置換されたもの；及びGH誘導体、例えば、脱アミドされたか又はスルホキシド化された形態の成長ホルモン、或いは、N-又はC-末端伸長(Met-hGH、Met-Glu-Ala-Glu-hGH又はAla-Glu-hGHのような)を有する形態のもの。他の関連するGH誘導体は、例えばGH活性の遅延性の持続時間を達成するために、GH (例えばhGH)が、アルブミン、例えばヒト血清アルブミンのような分子（例えば、WO 97/24445を参照)、又はポリエチレングリコール(PEG) (例えば、WO 03/044056を参照)のような水溶解性ポリマーと接合したものを含む。既に示したように、成長ホルモン自体の中で、ヒトの治療に関して好ましい成長ホルモンは、正常なhGH [即ち、天然のヒト成長ホルモン、特に、天然のホルモンと同じである、組換え的に生産されたヒト成長ホルモン(rhGH)]であり、後者のタイプのhGHの切断型、類似体及び誘導体が、本発明の内容に関連する。
ストリッピング（Stripping）
本願の文脈において、用語「ストリッピング」は、適切なガス(下記参照)による、適切な速度及び温度で、及び適切な持続時間での、液体培地のエアレーションによる、揮発性成分(例えば、環境条件下でその自然な状態がガスである、溶解した成分)の、該液体培地からの置換又は除去を指す。
本願の文脈において、用語「ストリッピング」は、適切なガス(下記参照)による、適切な速度及び温度で、及び適切な持続時間での、液体培地のエアレーションによる、揮発性成分(例えば、環境条件下でその自然な状態がガスである、溶解した成分)の、該液体培地からの置換又は除去を指す。
これは、例えば、問題のガスを液体培地中に、撹拌又は他の混合手段の下で或いは撹拌又は他の混合手段なしで、通過させることによって(例えば、ガスの気泡の流れを培地中に送ることによって)、或いは、相の間でガスの拡散が生じる大きい液相/気相界面を創造する他の方法によって行われる。この関連において、所望のストリッピング効果を達成するために調整され得るパラメーターには以下のものが含まれる：
ガス(ストリッピングガス)及び液体培地の間の接触時間；
ストリッピングガスの液体培地中への導入／通過の速度；
用いるストリッピングガスの容量；
気相と液相の接触表面積の大きさ；
撹拌/混合の活発さ；
液体培地のpH；及び
液体培地及び／又はストリッピングガスの温度。
ガス(ストリッピングガス)及び液体培地の間の接触時間；
ストリッピングガスの液体培地中への導入／通過の速度；
用いるストリッピングガスの容量；
気相と液相の接触表面積の大きさ；
撹拌/混合の活発さ；
液体培地のpH；及び
液体培地及び／又はストリッピングガスの温度。
硫化水素は、適切な硫黄含有源(例えば、ジスルフィド-架橋-含有ポリペプチド自体)の存在下において、液体培地中で適切な酸化還元条件下で形成され得、本発明に関して、硫化水素(H2S)及び／又はそれらの脱プロトン化形態(即ちHS- 及び／又はS2-)の存在が、ポリペプチドの三硫化物(TS)誘導体の形成に重要な役割を果たすと信じられている（下記参照）。
何らかの理論に結びつけられてはいないが、H2Sが、ジスルフィド架橋を含有するあるポリペプチド[例えば、ヒト成長ホルモン(hGH)のような成長ホルモン(GH)]のTS誘導体の形成を、図２に模式的に説明した2つの機構の一つ又は両方によって誘導し得るということが信じられている。提案された第一の機構において(図２の上部)、溶液中に存在する酸化剤(「Ox.」と示す)、例えば酸素(O2)は、H2SにおけるＳの酸化によって作用して、ポリペプチド中の三硫化物架橋の形成を伴う。提案された第二の機構において(図２の下部)、該ポリペプチド自体が酸化剤として作用し、H2Sの存在下において三硫化物架橋を形成する。
何らかの理論に結び付けられてはいないが、問題の液体培地からのH2Sの置換又は除去が、望ましくないTS誘導体の形成を減少又は排除する主要な役割を果たし得ると思われる。
硫化水素は、弱酸であり、水溶液中でそれぞれ陰イオン性の種HS-及びS2-で動的に平衡状態で存在する、適度に水溶性のガスである。溶液中のH2Sの割合が、約９以上のｐＨ値で極度に小さく、約４のｐＨで100%に近いということが、２０℃の水中におけるｐＨの関数として３つの種H2S、HS-及びS2-のそれぞれの分布を示す図１から明らかである（下記参照）。H2Sが環境条件下でガス状態で存在する問題の3つの種の１つのみで与えられ、液体培地中のH2Sの存在が、ポリペプチドのTS誘導体の形成に関して実際に極めて重要である場合、ガスによる液体培地のストリッピングが、pH≦9で、例えばpH≦8、例えばpH≦6の液体培地中で起こることが適切であると考えられる。しかしながら、溶液中の３つのスルフィド種(H2S、HS-及びS2-)の間の平衡が急速であるために、９を超えるｐＨでガスストリッピングを行うことが原理的に可能であるということは言わなければならない。
本発明の方法におけるガスストリッピングの間の液体培地のpHの選択は、もちろん、関心のあるポリペプチドの、それらの他の誘導体(例えば、ダイマー又はそれらの高オリゴマー、それらの脱アミド形態、それらのスルホキシド化形態など)の形成に対する安定性、沈殿の回避などのような他の要因によっても影響される。
ストリッピングガス
本発明の方法における液体培地のストリッピングに用いられるガスは、原理的には、関心のあるポリペプチド(又は液体培地中に含まれる他の中心的又は必須の成分)と著しく反応しないか、又は有害に影響しない任意のガスであってよい；従って、例えば、空気、酸素、窒素、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素又はそれらの組合せのようなガスが、本発明に従って潜在的に用いられ得る。しかしながら、液体培地中のH2Sの存在が、ポリペプチドTS誘導体の形成に関して中心的に重要であるという、本発明者らの確信（上記参照）が正しい場合、それに関連する使用に最も適切なそれらのガスは、実質的に化学的に不活性であり、特に、酸化、還元又は他の反応を引き起こすことに関して、及び／又は液体培地に適するpH条件に影響することに関して不活性であり、並びに、実質的に純粋な形態で、容認できるコストで容易に入手可能であるガスであると思われる。これに関して特に関連するガスは、窒素(N2)及びより大量の、容易に入手可能ないわゆる「貴ガス」[ヘリウム(He)、ネオン(Ne)、アルゴン(Ar)、クリプトン(Kr)及びキセノン(Xe)を含む]のメンバー、特にヘリウム及びアルゴン、とりわけアルゴンを含む。それらのガス(特にN2、He及びAr)は容易に、種々の容量のシリンダー中の圧縮形態で、高純度状態で(典型的には、N2について≧99.8 容量%、及びHe及びAr について≧99.9容量%以上) 商業的に入手可能である。
本発明の方法における液体培地のストリッピングに用いられるガスは、原理的には、関心のあるポリペプチド(又は液体培地中に含まれる他の中心的又は必須の成分)と著しく反応しないか、又は有害に影響しない任意のガスであってよい；従って、例えば、空気、酸素、窒素、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素又はそれらの組合せのようなガスが、本発明に従って潜在的に用いられ得る。しかしながら、液体培地中のH2Sの存在が、ポリペプチドTS誘導体の形成に関して中心的に重要であるという、本発明者らの確信（上記参照）が正しい場合、それに関連する使用に最も適切なそれらのガスは、実質的に化学的に不活性であり、特に、酸化、還元又は他の反応を引き起こすことに関して、及び／又は液体培地に適するpH条件に影響することに関して不活性であり、並びに、実質的に純粋な形態で、容認できるコストで容易に入手可能であるガスであると思われる。これに関して特に関連するガスは、窒素(N2)及びより大量の、容易に入手可能ないわゆる「貴ガス」[ヘリウム(He)、ネオン(Ne)、アルゴン(Ar)、クリプトン(Kr)及びキセノン(Xe)を含む]のメンバー、特にヘリウム及びアルゴン、とりわけアルゴンを含む。それらのガス(特にN2、He及びAr)は容易に、種々の容量のシリンダー中の圧縮形態で、高純度状態で(典型的には、N2について≧99.8 容量%、及びHe及びAr について≧99.9容量%以上) 商業的に入手可能である。
三硫化物誘導体は、原理的には、問題のタイプのポリペプチドの生産及び精製の間の任意の段階において形成し得る。しかしながら、生産後の精製工程の間、特に濾過工程の間の、TS誘導体の形成を回避することが非常に重要であるという徴候がある；よって、例えば、組換えヒト成長ホルモン(hGH)の場合、TS-hGHの実質的な形成は、特に生産自体に続く濾過の間に生じることが明らかになった。
本発明の方法は、特に、関心のあるポリペプチドの生産(例えば、ポリペプチドを発現する組換え的に改変された微生物を含む培地中での発酵による生産)に続く処理、例えば、濾過、微細濾過、限外濾過、カラム分離などのような下流の(生産後)分離及び／又は精製工程と組合せての処理によく適する。ヒト成長ホルモンに関して用いられる場合、該方法は、生産手順の後から最後の精製工程の前までの間に適切に適用される。
本発明の方法のさらなる態様において、所望のポリペプチドの安定性に影響するか、又はその望ましくない誘導体の形成を減少させる化合物は、生産後の処理工程と関連して液体培地に加えられてよい。よって、例えば、亜硫酸塩(例えば、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸カリウムのような亜硫酸アルカリ金属)又はメルカプト化合物(例えば、グルタチオン、β-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエチルアミン、システイン及びシスチンから成る群から選択される一以上の化合物)は、本発明の方法においてストリッピングに供される液体培地に加えられてよい。
本発明のさらなる側面は以下のものに関する：
本発明の方法によって得られたか又は得られる、TS誘導体を実質的に含まないポリペプチド(特に、TS-hGH誘導体を実質的に含まない組換えヒト成長ホルモン(rhGH))；
薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に、そのようなポリペプチドを含む(特に、そのようなrhGHを含む)薬学的組成物；
ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態を治療する方法であって、本発明の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの治療的有効量を、そのような状態を有する被験者に投与することを含む方法；及び
本発明の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの、ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態の治療のための薬剤の製造における使用。
本発明の方法によって得られたか又は得られる、TS誘導体を実質的に含まないポリペプチド(特に、TS-hGH誘導体を実質的に含まない組換えヒト成長ホルモン(rhGH))；
薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に、そのようなポリペプチドを含む(特に、そのようなrhGHを含む)薬学的組成物；
ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態を治療する方法であって、本発明の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの治療的有効量を、そのような状態を有する被験者に投与することを含む方法；及び
本発明の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの、ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態の治療のための薬剤の製造における使用。
医薬投与
本発明の薬学的組成物に関して、適切な担体又は希釈剤の例は、当該分野の通常の技術者には周知である。
本発明の薬学的組成物に関して、適切な担体又は希釈剤の例は、当該分野の通常の技術者には周知である。
特に、hGH/rhGHに関して、与えられた被験者/患者の、ここに記載された方法での成長ホルモンによる治療の措置は、当該分野の技術者によって決定され得る。投与される一日の用量は、医師によって決定されることができ、特に、投与の経路、被験者又は患者の年齢、体重及び状態に依存する。hGHの都合のよい一日の投与量は、典型的には、約0.001mg/体重kg 〜約2.0 mg/体重kgの範囲であり、しばしば約0.01 mg/体重kg 〜約1.0 mg/体重kgの範囲である。
成長ホルモン (例えばhGH)は、一日の間に単回の用量で又は繰り返される用量で投与されてよく、及び、治療される個体がそのような治療をもはや必要としなくなるまで、ここに記載された方法での投与が継続されてよい。投与経路は、注入（連続的又はパルス状）、注射、肺吸入によるか、或いは経口又は経鼻によるような、該ホルモンを適切な又は所望の作用部位に効率的に輸送する任意の経路であってよい。現在好ましい経路には、非経口経路（例えば、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射又は皮下注射を介して、又はインプラントによって)が含まれる。成長ホルモンは、それぞれの投与経路に適した剤形に処方されることができる。該組成物又は剤形は、都合のよい形態、例えばエアロゾル、溶液又は懸濁液であってよい。
GH（例えばhGH）組成物は、全身性の注射又は注入に適する形態であってよく、そのようなものとして、滅菌水又は等張性生理食塩水又はグルコース溶液のような、適した液体媒体により処方されてよい。該組成物は、当該分野で周知である従来の滅菌技術によって滅菌されてよい。得られた水溶液は、そのような使用のためにパッケージに入れられて良く、又は、それらは、無菌状態下で濾過され凍結乾燥されてよく、該凍結乾燥製剤は、投与の前に、適切な滅菌水性媒体と組み合わされる。該組成物は、緩衝剤、張度調整剤などのような、およその生理的条件に必要な薬学的に許容される補助的な物質を含んでよい。緩衝剤の非限定的な例には、クエン酸塩及びヒスチジンが含まれ；張度調整剤の非限定的な例にはスクロース及びマンニトールのような糖、及びアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩化物のような塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化カルシウムなどが含まれる。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン及び水である。水性液体製剤は、特に都合がよいことには、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート[ポリソルベート20（例えば、TweenTM 20）のような]又はポロキサマー[ポロキサマー188（例えば、PluronicTM F68）又はポロキサマー407（例えば、LutrolTM F127)のような]を含むことができ、また、ベンジルアルコール、フェノール又はクレゾール（例えば、m-クレゾール)のような保存剤がしばしば組み込まれる。
GH(例えばhGH)を持続性放出製剤の形態で提供することは有利であり得る。そういうものとして、該組成物は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又は乳酸/グリコール酸コポリマーのような、薬学的に許容される適切な生分解性のポリマー中に封入されたか又は分散された、成長ホルモンを含むマイクロカプセル又は微小粒子として処方されてよい。
経鼻投与のためのGH製剤は、エアロゾル施用のために、液体担体、特に水性担体に溶解されたか又は懸濁された成長ホルモンを含んでよい。該担体は、可溶化剤（例えば、プロピレングリコール）、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）又はシクロデキストリンのような吸収エンハンサー、又はパラベンのような保存剤のような添加剤を含んでよい。
成長ホルモン（例えばhGH）は、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995)」に開示されているような、医薬組成物を処方する確立された任意の方法によって処方されることができる。
実施例１：発酵ブロスからのH 2 Sのストリッピング
発酵ブロス、組換え微生物[組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をコードする遺伝子を含む発現カセットを含有する大腸菌]を含むサンプルを、hGH生産バッチから取り出した。該サンプルをホモジナイズし、6つのサブサンプル、それぞれ1500 mlを、2000 mlの測定シリンダーに入れ、磁力によって撹拌した。サブサンプルからのH2Sのストリッピングを、窒素ガス（例えば、エア・リキッド デンマークA/S、Ballerup, Denmarkから入手可能；純度≧99.8%)を、各サブサンプル（温度20℃）に、該測定シリンダーの底に伸ばされたシリコンチューブを介して15-20 l/hourの流速で通気することによって行った。サブサンプル１は、ストリッピングなし（コントロール）、サブサンプル２はストリッピングに2.5時間供され、一方、サブサンプル3、4、5及び6は、ストリッピングに20時間供された。
発酵ブロス、組換え微生物[組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をコードする遺伝子を含む発現カセットを含有する大腸菌]を含むサンプルを、hGH生産バッチから取り出した。該サンプルをホモジナイズし、6つのサブサンプル、それぞれ1500 mlを、2000 mlの測定シリンダーに入れ、磁力によって撹拌した。サブサンプルからのH2Sのストリッピングを、窒素ガス（例えば、エア・リキッド デンマークA/S、Ballerup, Denmarkから入手可能；純度≧99.8%)を、各サブサンプル（温度20℃）に、該測定シリンダーの底に伸ばされたシリコンチューブを介して15-20 l/hourの流速で通気することによって行った。サブサンプル１は、ストリッピングなし（コントロール）、サブサンプル２はストリッピングに2.5時間供され、一方、サブサンプル3、4、5及び6は、ストリッピングに20時間供された。
この方法でのガス-ストリッピング後、サブサンプルを、研究室スケールの微細濾過システム[改変されたポリエーテルスルホン(BIOMAXTM-1000)膜を用いるMillipore LabscaleTM TFFシステム]を用いて精製し、収集された浸透液中の極めて低いTS-hGH形成を得た。しかしながら、サブサンプル4、5及び6の場合、微細濾過の前に、ナトリウム硫化物（Na2S）が、それぞれ約5、10及び15 ppmの濃度で添加された。
hGHの測定
微細濾過されたサブサンプル中のhGHの量を、hGH配向ELISA方法を用いて測定した：この方法においては、ヒト成長ホルモンに対して作られたモルモットのポリクローナル抗体がマイクロテストプレートに結合される。この抗体（コーティング抗体）は、該サンプルからの成長ホルモンと反応する。hGHに対して作られた、ペルオキシダーゼ標識されたモルモットのポリクローナル抗体(検出抗体)は、次いで、固定された成長ホルモンと反応する。酵素基質(ペルオキシダーゼ基質)の添加の際、ペルオキシダーゼ標識された抗体におけるペルオキシダーゼ活性は、該サンプル中の成長ホルモンの濃度と比例する強度で色の発達をもたらす。該反応は、酸の添加によって停止され、その吸光度が光度計で、450 nmで、並びに620 nmの参照波長で読まれる。
微細濾過されたサブサンプル中のhGHの量を、hGH配向ELISA方法を用いて測定した：この方法においては、ヒト成長ホルモンに対して作られたモルモットのポリクローナル抗体がマイクロテストプレートに結合される。この抗体（コーティング抗体）は、該サンプルからの成長ホルモンと反応する。hGHに対して作られた、ペルオキシダーゼ標識されたモルモットのポリクローナル抗体(検出抗体)は、次いで、固定された成長ホルモンと反応する。酵素基質(ペルオキシダーゼ基質)の添加の際、ペルオキシダーゼ標識された抗体におけるペルオキシダーゼ活性は、該サンプル中の成長ホルモンの濃度と比例する強度で色の発達をもたらす。該反応は、酸の添加によって停止され、その吸光度が光度計で、450 nmで、並びに620 nmの参照波長で読まれる。
TS-hGHの測定
TS-hGHのレベルを、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって測定した：最適化された測定条件は、サンプル中のhGH濃度がおよそ0.71 g l-1で得られることが発見され、サンプルはそれ故、それらをこの特定のhGH濃度に調節するために希釈された。初期のhGH濃度は、下式に従って277 nmでの吸光度測定から決定される：
chGH ＝吸光度 (277 nm) × 0.82 (g l-1で）。
TS-hGHのレベルを、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって測定した：最適化された測定条件は、サンプル中のhGH濃度がおよそ0.71 g l-1で得られることが発見され、サンプルはそれ故、それらをこの特定のhGH濃度に調節するために希釈された。初期のhGH濃度は、下式に従って277 nmでの吸光度測定から決定される：
chGH ＝吸光度 (277 nm) × 0.82 (g l-1で）。
総容量15 μlの調整されたサンプルを、200 mm長で4.6 mm幅のカラムにアプライした。次いで、以下の二つの溶出液：
Ａ：1M (NH4)2SO4；0,1M Na2HPO4；pH 6.5
Ｂ：0,1M Na2HPO4；5% v/v CH3CN；pH 6.5
による勾配溶出を、以下の表にまとめたように行った：
他の条件は以下のとおり：
温度、調整されたサンプル：2℃〜8℃
温度、カラムヒーター：28℃±2℃
波長、UV検出：220 nm。
Ａ：1M (NH4)2SO4；0,1M Na2HPO4；pH 6.5
Ｂ：0,1M Na2HPO4；5% v/v CH3CN；pH 6.5
による勾配溶出を、以下の表にまとめたように行った：
温度、調整されたサンプル：2℃〜8℃
温度、カラムヒーター：28℃±2℃
波長、UV検出：220 nm。
次いで、調査されたサンプルにおけるTS-hGHの相対的な量(重量パーセント)を、以下の式から得た：
この方法において、調査されるサンプルに含まれるTS-hGHの定量化の限界（LOQ）は20 ngである。サンプルについて測定された結果を検証するために、各シリーズの最初と各シリーズの最後にも標準を測定する。
H 2 Sの測定
液体サンプル中の硫化水素濃度を、MERCK SpectroquantTM クイックテストを用いて測定した。この試験は、光度分析を用いて、水性サンプル中に溶解している全ての硫化物種を、0.03〜3.3 ppmに及ぶ範囲の濃度で測定するよう設計される。試験キットは、色反応を起こす３つの異なる試薬を含む：硫化水素は、N,N’-ジメチル-1,4-フェニレンジアンモニウムジクロリド(試薬2)と反応して、無色のロイコメチレンブルーを与え、これは次いで、硫酸第二鉄(試薬3)によって酸化されてメチレンブルーになる。スルファミド酸(試薬1)は、亜硝酸塩からの干渉を防止する。メチレンブルーを産生する色反応は、665 nmで最大の明白な吸収をもたらし、ブランクはこの波長でほとんど吸収を示さない。未濾過の発酵ブロスにおけるH2Sレベルの測定のために、３つの試薬を添加した後ブロスを遠心分離した(10分、5000 rpm)。既知の濃度のH2S標準溶液を較正のために用いた。
液体サンプル中の硫化水素濃度を、MERCK SpectroquantTM クイックテストを用いて測定した。この試験は、光度分析を用いて、水性サンプル中に溶解している全ての硫化物種を、0.03〜3.3 ppmに及ぶ範囲の濃度で測定するよう設計される。試験キットは、色反応を起こす３つの異なる試薬を含む：硫化水素は、N,N’-ジメチル-1,4-フェニレンジアンモニウムジクロリド(試薬2)と反応して、無色のロイコメチレンブルーを与え、これは次いで、硫酸第二鉄(試薬3)によって酸化されてメチレンブルーになる。スルファミド酸(試薬1)は、亜硝酸塩からの干渉を防止する。メチレンブルーを産生する色反応は、665 nmで最大の明白な吸収をもたらし、ブランクはこの波長でほとんど吸収を示さない。未濾過の発酵ブロスにおけるH2Sレベルの測定のために、３つの試薬を添加した後ブロスを遠心分離した(10分、5000 rpm)。既知の濃度のH2S標準溶液を較正のために用いた。
結果を下記表１に示す。
それらの実験は、H2SがTS-hGH形成に関与するということ、及び、ホモジナイズされた発酵ブロスからのH2Sのストリッピングが、微細濾過されたホモジネート中のTS-hGHの形成の減少（サブサンプル２）又はほとんどの排除（サブサンプル３）をもたらすということを示している。
実施例２：発酵槽におけるH 2 Sのストリッピング
発酵ブロス、組換え微生物[組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む大腸菌]を含むサンプルを、hGH生産バッチから取り出し、ホモジナイズした。5つの同じサブサンプルを、ホモジナイズされたバルクサンプルから取り出した。それらのサブサンプルの一つ（サブサンプル１）は、ストリッピングに供さなかった；残り４つのサブサンプルは、下記表２に詳述した条件を用いて、窒素ストリッピング[窒素通気された(泡立たせた)、撹拌された発酵槽容器（B. Braun BiostatTM CT；正常作動容量１リットル）において、制御されたpH及び温度で]に供した。実験２及び３は、ｐＨを制御せずに行い、表２に与えられたｐＨ値は初期値である。
発酵ブロス、組換え微生物[組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む大腸菌]を含むサンプルを、hGH生産バッチから取り出し、ホモジナイズした。5つの同じサブサンプルを、ホモジナイズされたバルクサンプルから取り出した。それらのサブサンプルの一つ（サブサンプル１）は、ストリッピングに供さなかった；残り４つのサブサンプルは、下記表２に詳述した条件を用いて、窒素ストリッピング[窒素通気された(泡立たせた)、撹拌された発酵槽容器（B. Braun BiostatTM CT；正常作動容量１リットル）において、制御されたpH及び温度で]に供した。実験２及び３は、ｐＨを制御せずに行い、表２に与えられたｐＨ値は初期値である。
該サンプルを次いで、実施例１で記載したような微細濾過に供した。hGH及びTS-hGHの含有量の分析は、実施例１で記載したのと同様に行った。結果を下記の表３に示す。
Claims (10)
- ポリペプチドを含む液体培地中における該ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を減少するか又は防止するための方法であって、該方法は、前記液体培地を、酸素、二酸化炭素、窒素(N 2 )、ヘリウム(He)、アルゴン(Ar)、ネオン(Ne)、クリプトン(Kr)、キセノン(Xe)、及びそれらの組合せから成る群から選択されるガスでストリッピングすることを含む方法。
- 前記ポリペプチドが、一以上のジスルフィド結合を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、組換え的に生産されたポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、組換え的に生産されたhGH (rhGH)及びそれらの切断型から選択される、請求項３に記載の方法。
- 前記ストリッピングが、前記ポリペプチドの生産の間又は生産後の処理の間に行われる、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記ストリッピングが、前記ポリペプチドの生産後の処理の間に行われる、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記ガスが、窒素(N2)、ヘリウム(He)及びアルゴン(Ar)から成る群から選択される、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、ストリッピング手順の後に一以上の精製工程に供される、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
- 少なくとも一つの濾過工程を含む、請求項８に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの生産後に前記液体培地に亜硫酸塩又はメルカプト化合物が添加される、請求項５〜９の何れか一項に記載の方法。
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