BRPI0002276B1

BRPI0002276B1 - Conjugado, composição que compreende conjugados, composição farmacêutica, utilização de um conjugado ou composição e processso para a preparação de compostos

Info

Publication number: BRPI0002276B1
Application number: BRPI0002276-4A
Authority: BR
Inventors: Pascal Sebastian Bailon
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-07-03
Publication date: 2019-05-14
Also published as: FR2795734B1; DE60036053D1; FR07C0051I2; CO5190661A1; KR20010049676A; EP1839676A2; TNSN00147A1; IS5554A; BR0002276A; DOP2000000030A; ES2191511A1; LU91363I2; NO2009010I1; JP2001064300A; IS2492B; SG92717A1; HRP20000436B1; PL341187A1; PA8497801A1; AU736067B2

Abstract

"<um>conjugado, composição que compreende conjugados, composição farmacêutica, utilização de um conjugado ou composição e processo para a preparação de compostos<mv>". a presente invenção refere-se a conjugados de eritropoietina com poli (etileno glicol) que compreende uma glicoproteína de eritropoietina que possui pelo menos um grupo amino livre e que tem a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e as células vermelhas do sangue e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoietina humana e seus análogos que têm seqüência de eritropoietina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação ou uma reordenação de pelo menos um local de glicosilação; sendo a dita glicoproteína encadeada covalentemente a "n" grupos poli (etilenoglicol) da fórmula -co-(ch~ 2~)~ x~(och~ 2~ch~ 2~)~ m~^ -^ or, com o carbonil de cada grupo de poli (etileno glicol) formando uma aglutinação de amida com um dos ditos grupos amino; em que r é alquila inferior; x é 2 ou 3; m é cerca de 450 até cerca de 900; n é de 1 a 3; e n e m são escolhidos de maneira tal que o peso molecular do conjugado menos a glicoproteína de eritropoietina varia desde 20 quilodaltons até 100 quilodaltons.

Description

CONJUGADO, COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE CONJUGADOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, UTILIZAÇÃO DE UM CONJUGADO OU COMPOSIÇÃO E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS * Antecedentes da Invenção | 5 A eritropoese é a produção de células vert melhas do sangue, que ocorre para compensar a destrui ção de células. A eritropoese é um mecanismo fisioló-

gico controlado que possibilita que células vermelhas do sangue suficientes fiquem disponíveis para oxigena10 ção de tecido apropriada. A eritropoietina humana que se apresenta naturalmente (hEPO) é produzida no rim e é o fator de plasma humoral que estimula a produção de células vermelhas do sangue (Carnot, P e Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sei. 143: 432; Erslev, AJ *1953 Blood

8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson,

LO, Goldwasser, E, Freid, W e Plzak, LF (1957) Nature

179: 6331-4). A EPO que se apresenta naturalmente, estimula a divisão e a diferenciação de progenitores eritróides encarregados na medula óssea e exerce sua ati20 vidade biológica pela aglutinação a receptores nos precursores de eritróides (Krantz, BS (1991) Blood 77:419).

A eritropoietina tem sido manufaturada biossinteticamente utilizando-se tecnologia de recombina25 ção de DNA (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al.

(1986) Immunobiol. 72:213-224) e é o produto de um gene de EPO humano clonado inserido e espremido nas células de tecido ovariano do hamster chinês (células CHO) . Ά estrutura principal da forma de hEPO plenamente processada predominante, encontra-se ilustrada na SEQ ID NO:1. Existem duas ligações de bissulfureto entre Cys⁷-Cys¹⁶¹ e Cys²⁹-Cys³³. O peso molecular da cadeia de polipeptidio de EPO sem as metades de açúcar é 18.236 Da. Na molécula de EPO intacta, aproximadamente 40% do peso molecular são responsáveis pelos grupos de carboidratos que glicosilam a proteína nos locais de glicosilaçâo na proteína (Sasaki, H, Bothner, B, Deli, A e Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).

Uma vez que a eritropoietina é essencial na formação das células vermelhas do sangue, o hormônio é de utilidade no tratamento dos distúrbios do sangue caracterizados por produção de células vermelhas do sangue baixa ou defeituosa. Clinicamente, a EPO é utilizada no tratamento de anemia em pacientes de deficiência renal crônica (CRF)(Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, JW, Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) e em pacientes de AIDS e câncer submetidos a quimioterapia (Danna, RP, Rudnick, SA, Abeis, RI In: MB, Garnick, ed. Erythropoietin in Clinicai Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcei Dekker; 1990: p. 301-324). Não obstante, a biodisponibilidade de terapêutica de proteínas comercial-

mente disponível, tais como EPO, é limitada por seu semiperíodo de plasma curto e susceptibilidade à degradação de protease. Estes inconvenientes impedem-nas de alcançarem potência clínica máxima.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona um conjugado de eritropoietina, o referido conjugado compreendendo uma glicoproteína de eritropoietina que possui pelo menos um grupo amino livre e que tem a atividade 10 biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e de células vermelhas do sangue e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoietina humana e seus análogos que têm sequência de eritropoietina humana modificada pela 15 adição de 1 a 6 locais de glicosilação ou uma reordenação de pelo menos um local de glicosilação; sendo a dita glicoproteína encadeada covalentemente a n grupos poli (etilenoglicol) da fórmula -CO-(CH2)x(OCH2CH2)mOR , com o -CO (isto é, carbonil) de cada grupo de

poli(etileno glicol), formando uma aglutinação de amida com um dos ditos grupos amino; em que R é alquila inferior; x é 2 ou 3; m é cerca de 450 até cerca de 900; n édela3; enem são escolhidos de maneira tal que o peso molecular do conjugado menos a glicoproteína de 25 eritropoietina varia desde 20 quilodaltons até 100 quilodaltons. Esta invenção proporciona ainda composições que contêm os conjugados descritos neste contexto, em que a percentagem de conjugados na composição onde n é *9«

1, é de, pelo menos, noventa por cento.

Em comparação com a EPO não modificada (isto é, a EPO sem uma PEG anexada) e conjugados PEGEPO convencionais, os presentes conjugados possuem um semiperiodo de circulação e tempo de permanência de plasma aumentados, liberação diminuída, e atividade ín vivo clínica aumentada. Os conjugados desta invenção têm as mesmas utilizações da EPO. Em particular, os conjugados desta invenção são de utilidade para tratar 10 pacientes pelo estímulo da divisão e diferenciação dos progenitores de eritróide encarregados na medula óssea,

da mesma maneira que a EPO é utilizada para tratar pacientes .

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção proporciona conjugados, os referidos conjugados compreendendo uma glicoproteína de eritropoietina que é dotada de pelo menos um grupo amino livre e que tem a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumen20 tem a produção de reticulócitos e as células vermelhas do sangue, e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoietina humana e seus análogos que têm sequência de eritropoietina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação ou uma reordenação de 25 pelo menos um local de glicosilação; sendo a dita glicoproteina encadeada covalentemente a n grupos poli (etilenoglicol) da fórmula -CO-(CH₂)_x(OCH₂CH₂)mOR, com o -CO (isto é, carbonil) de cada grupo de poli(etileno glicol) formando uma aglutinação de amida· com um dos ditos grupos amino; em que R é alquila inferior; x é .2 ou 3; m é cerca de 450 até cerca de 900; n é de 1 a3; enem são escolhidos de maneira tal que o 5 peso molecular do conjugado menos a glicoproteína de eritropoietina varia desde 20 quilodaltons até 100 qui

lodaltons.

Constatou-se que os conjugados desta invenção podem ser usados da mesma maneira que a EPO não 10 modificada. Não obstante, os conjugados desta invenção são dotados de um semiperiodo de circulação e tempo de permanência de plasma aumentados, liberação diminuída, e atividade in vivo clínica aumentada. Por causa des-

tas propriedades, os conjugados desta invenção podem ser administrados uma vez por semana em vez das três vezes por semana para a EPO não modificada. É de se esperar que a freqüência de administração diminuída resulte em submissão de paciente aperfeiçoada que conduz a efeitos de tratamento aperfeiçoados, bem como quali2 0 dade de vida do paciente aperfeiçoada. Em comparação com os conjugados de EPO convencionais encadeados ao poli(etileno glicol) constatou-se que conjugados dotados de peso molecular e estrutura de encadeamento dos conjugados desta invenção são dotados de uma potência, estabilidade, AUC, semiperiodo de circulação, e perfil de custo vantajoso aperfeiçoados.

Os conjugados de acordo com esta invenção podem ser administrados em uma quantidade terapêutica-

mente efetiva a pacientes da mesma maneira que a EPO é administrada. A quantidade terapeuticamente efetiva é a quantidade de conjugado necessária para a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula 5 óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue. A quantidade de conjugado exata é uma questão de preferência sujeita a fatores tais como o exato tipo de condição que está sendo tratada, a condição do paciente que está sendo tratado, bem como os 10 outros ingredientes na composição. Por exemplo, 0,01 a μg por quilograma de peso corpóreo, de preferência, 0,1 a 1 gg por quilograma de peso corpóreo, poderão ser administrados, por exemplo, uma vez por semana.

As composições farmacêuticas que contêm o 15 conjugado poderão ser formuladas sob uma intensidade efetiva para administração por vários meios a um paciente humano que experimenta distúrbios sanguíneos caracterizados por produção de células vermelhas do sangue baixa ou defeituosa. As quantidades terapêutica20 mente efetivas médias do conjugado podem variar e em particular deverão ser baseadas nas recomendações e prescrição de um médico qualificado.

Os Produtos de eritropoietina glicoproteina preparados de acordo com esta invenção podem ser preparados em composições farmacêuticas adequadas para injeção com um carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável por meio de processos conhecidos na técnica.

Por exemplo, composições apropriadas foram descritas em ♦ ♦ ♦ · ♦ * ·♦

WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660, e WO 99/07401.

Entre os carreadores farmaceuticamente aceitáveis preferidos para a formulação dos produtos da invenção estão a albumina de soro humano, as proteinas de plasma 5 humano, e assemelhados. Os compostos da presente in-

venção podem ser formulados em 10 mM de amortecedor de fosfato de sódio/potássio, sob pH 7, contendo um agente de tonicidade, por exemplo, 132 mM de cloreto de sódio. Opcionalmente, a composição farmacêutica poderá conter 10 um preservativo. A composição farmacêutica poderá conter diferentes quantidades de eritropoietina, por exemplo, 10-1000 μg/ml, por exemplo, 50 μg ou 400 μg.

O termo eritropoietina ou EPO referese a uma glicoproteina, dotada da seqüência de aminoá15 cidos estabelecida em (SEQ ID NO:1) ou (SEQ ID N0:2) ou uma seqüência de aminoácidos substancialmente homóloga ás mesmas, cujas propriedades biológicas referem-se ao

estimulo da produção de células vermelhas do sangue e ao estimulo da divisão e diferenciação dos progenitores eritróides encarregados na medula óssea. Da maneira que são utilizados neste contexto, estes termos incluem as proteinas modificadas deliberadamente, tais como por exemplo, por mutagênese dirigida ou acidentalmente através de mutações. Estes termos também incluem aná25 logos que têm de 1 a 6 locais adicionais para glicosilação, análogos que têm pelo menos um aminoácido adicional na extremidade terminal carbóxi da glicoproteina, em que o aminoácido adicional inclui pelo menos um lo• ··♦ · * « « cal de glicosilação, e análogos que possuem uma seqüência de aminoácidos que incluem uma reordenação de pelo menos um local para glicosilação. Estes termos incluem eritropoietina humana tanto natural quanto produzida de maneira recombinante.

Os conjugados de eritropoietina desta invenção podem ser representados pela Fórmula I:

P-INHCO-CCHzHOCHsCH^-ORln (I) em que x, m, n e R são tais como anteriormente. Na Fórmula I, P é o resíduo de uma eritropoietina glicoproteína descrita neste contexto (isto é, sem o amino grupo ou amino grupos que formam um encadeamento de amida com o carbonil ilustrado na Fórmula I), tendo a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue.

De acordo com uma concretização preferida, da presente invenção, R é metil. De preferência, m varia entre cerca de 650 até cerca de 750 e n é preferentemente 1.

Na concretização de maior preferência da presente invenção, R é metil, m varia entre cerca de 650 até cerca de 750, e n é 1, isto é, o conjugado tal como definido anteriornente que tem a fórmula

[CH₃O(CH₂CH₂O)_rnCH₂CH₂CH₂CO-NH]_n-P • *·

em que m varia de 650 a 750, n é 1 e P é tal como definido anteriormente. De preferência, m é dotado de uma média de cerca de 680.

De preferência, a glicoproteina dos conju5 gados tais como definidos anteriormente é uma eritropoietina humana. A eritropoietina humana e proteínas análogas tais como definidas anteriormente podem ser expressas por ativação de gene endógeno. As glicoproteínas de eritropoietina humana são aquelas da SEQ ID 10 NO:1 e SEQ ID NO: 2, com maior preferência, aquelas da SEQ ID NO:1.

Além disso, P pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de resíduos de eritropoietina humana e seus análogos que têm de 1 a 6 locais adicio15 na is para glicosilação. Tal como exposto adiante de forma detalhada, a preparação e purificação de EPO são amplamente conhecidas na técnica. Por EPO entende-se a proteína natural ou de recombinação, de preferência, humana, conforme obtida a partir de qualquer fonte con20 vencional, tais como tecidos, síntese de proteínas, cultura de células com células naturais ou de recombinação. Qualquer proteínas que seja dotada da atividade de EPO, tais como muteínas ou proteínas de outro modo modificadas, encontram-se abrangidas. A EPO de recom25 binação pode ser preparada via expressão em linhas de células CHO-, BHK- ou HeLa, por tecnologia de DNA recombinante ou por ativação de gene endógeno. A expressão de proteínas, incluindo EPO, por ativação de gene (!) endógeno é amplamente conhecida na técnica e encontrase exposta, por exemplo, nas patentes U.S. N°s 5.733.761, 5.641.670, e 5.733.746, e nas publicações de patentes internacionais Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, 5 WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 e WO 91/09955, ficando o conteúdo de cada uma dessas patentes incorpo-

rado neste contexto por referência. As espécies de EPO preferidas para a preparação de produtos de glicoproteinas de eritropoietina, são as espécies de EPO huma10 na. Com maior preferência, as espécies de EPO é a EPO humana que é dotada da sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, com maior preferência, a sequência de aminoácidos SEQ ID MO:1.

De acordo com uma concretização, P pode ser o resíduo de um análogo de glicoproteína que tem de a 6 locais adicionais para glicosilação. A glicosilação de uma proteína, com um ou mais grupos de oligossacáridas, ocorre em locais específicos ao longo de uma espinha dorsal de proteína, e afeta enormemente as pro20 priedades físicas da proteína, tais como estabilidade, secreção, localização subcelular, e atividade biológica da proteína. A glicosilação é usualmente de dois tipos. Os oligossacáridas O-encadeados são fixados a resíduos de serina ou treonina e os oligossacáridas N25 encadeados são fixados aos resíduos de asparagina. Um tipo de oligossacárida encontrado nos oligossacáridas N-encadeado e O-encadeado é ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico), que é uma família de amino açúcares

• ··

que contêm 9 ou mais átomos de carbono. O ácido siálico é usualmente o resíduo terminal nos oligossacáridas N-encadeado e O-encadeado e, uma vez que ele é portador de uma carga negativa, confere propriedades ácidas à 5 glicoproteína. A eritropoietina humana, tendo 165 aminoácidos, contém três cadeias de oligossacáridas Nencadeados e uma de O-encadeado que compreendem cerca de 40% do peso molecular total da glicoproteína. A glicosilação N-encadeada ocorre nos resíduos de aspara10 gina localizados nas posições 24, 38, e 83 e a glicosilação O-encadeada ocorre em um resíduo de serina localizado na posição 12 6. As cadeias de oligossacáridas são modificadas com resíduos de ácido siálico terminais. A remoção enzimática de todos os resíduos de 15 ácido siálico a partir da eritropoietina glicosilada resulta na perda de atividade in vivo, mas não da atividade in vitro porque a sialilação da eritropoietina impede a sua aglutinação e subsequente liberação, pela proteína de aglutinação hepática.

As glicoproteínas da presente invenção incluem análogos de eritropoietina humana com uma ou mais

alterações na seqüência de aminoácido de eritropoietina humana que resulta em um aumento no número de locais para fixação de ácido siálico. Estes análogos de gli25 coproteína podem ser gerados por mutagênese dirigida ao local gue possui adições, retiradas, ou substituições de resíduos de aminoácidos que aumentam ou alteram os locais que ficam disponíveis para glicosilação. Os

análogos de glicoproteinas que têm níveis de ácido siálico maiores do que aqueles encontrados na eritropoietina humana são gerados pela adição de locais de glicosilação que não perturbam a conformação secundária ou terciária requerida para a atividade biológica. As glicoproteinas da presente invenção também incluem análogos dotados de níveis de fixação de carboidratos aumentados em um local de glicosilação que usualmente envolve a substituição de um ou mais aminoácidos em es10 treita proximidade com um local N-encadeado ou 0encadeado. As glicoproteinas da presente invenção também incluem análogos que são dotados de um ou mais aminoácidos que se estendem a partir da extremidade termi-

nal carbóxi da eritropoietina e proporcionam pelo menos um local de carboidrato adicional. As glicoproteinas da presente invenção também incluem análogos que são dotados de uma sequência de aminoácidos que incluem a reordenação de pelo menos um local para glicosilação.

Essa reordenação de local de glicosilação envolve a su20 pressão de um ou mais locais de glicosilação na eritropoietina humana e a adição de um ou mais locais de glicosilação que se apresentam não naturalmente. 0 aumento do número de cadeias de carboidratos na eritropoietina e, portanto, do número de ácidos siálicos por mo25 léculas de eritropoietina pode conferir propriedades vantajosas, tais como uma solubilidade aumentada, maior resistência à proteólise, imunogenecidade reduzida, semiperíodo de soro aumentado, e atividade biológica au13 mentada. Os análogos de eritropoietina com locais de glicosilação adicionais encontram-se expostos de maneira mais detalhada no pedido de patente europeu 640.619, de Elliot, publicado em 1 de março de 1995.

De conformidade com uma concretização preferida, as glicoproteinas da presente invenção compre-

endem uma sequência de aminoácidos que inclui pelo menos um local adicional para glicosilação, tais como, sendo que não se fica limitado às mesmas, eritropoieti10 nas que compreendem a sequência da eritropoietina humana modificada por uma modificação selecionada a partir das seguintes:

Asn³⁰Thr³²;

Asn⁵¹Thr⁵³;

Asn⁵⁷Thr⁵⁹;

Asn°⁹;

Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Val^S7Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser^S7Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸

Asn¹³⁸Thr¹^⁰;

Thr¹²⁵Thr¹⁴⁰;

Thr¹²⁵; e

Pro¹²⁴Thr¹²⁵.

A notação utilizada neste contexto para modificação da sequência de aminoácidos significa que a(s) posição(ões) da proteína não modificada correspondente (por exemplo, hEPO da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2) indicada pelo(s) número(s) sobrescritos é alterada para 10 o (s) aminoácido(s) que imediatamente precede(m) o (s) número(s) sobrescritos respectivos.

A glicoproteína também pode ser um análogo que possui pelo menos um aminoácido adicional na extremidade terminada carbóxi da glicoproteína, em que o 15 aminoácido adicional inclui pelo menos um local de glicosilação, isto é, o conjugado tal como definido anteriormente também se refere a um composto em que a gli-

coproteína é dotada de uma sequência que compreende a sequência de eritropoietina humana e uma segunda se20 qüência do término carbóxi da sequência de eritropoietina humana, em que a segunda sequência contém pelo menos um local de glicosilação. O aminoácido adicional poderá compreender um fragmento de peptídeo derivado da extremidade terminal carbóxi da gonatropina coriônica humana. De preferência, a glicoproteína é um análogo selecionado a partir do grupo que consiste de (a) eritropoietina humana dotada da sequência de aminoácidos Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro

Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID NO:3), que se estende a partir do término carbóxi; (b) o análogo em (a) compreendendo ainda EPO Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰; e (c) o análogo (a) compreendendo ain5 da EPO Asn³⁰ Vai⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰.

A glicoproteina poderá ser também um análogo que é dotado de uma sequência de aminoácidos a qual inclui uma reordenação de, pelo menos, um local para glicosilação. A reordenação poderá compreender uma supressão de qualquer um dos locais de carboidratos

N-encadeados na eritropoietina humana e uma adição de um local de carboidrato N-encadeado na posição 88, da seqüência de aminoácidos da eritropoietina humana. Com maior preferência, a glicoproteina é um análogo seleci15 onado a partir do grupo que consiste de EPO Gin²⁴ Ser⁸⁷

Asn⁸⁸ Thr⁹⁰; EPO Gin³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰; e EPO Gin⁸³ Ser⁸⁷Asn⁸⁸ Thr⁹⁰.

Da maneira que é utilizado neste contexto, alquila inferior significa um grupo de alquila linear 20 ou ramificada que é dotada de um a seis átomos de car-

bono. Exemplos de grupos de alquila inferior incluem metil, etil e isopropil. De acordo com a presente invenção, R é qualquer alquila inferior. Conjugados em que R é metil são preferidos.

0 símbolo m representa o número de resíduos de óxido de etileno (OCH₂CH₂) no grupo de óxido de poli(etileno). Uma única subunidade PEG de óxido de etileno tem um peso molecular de cerca de 44 daltons.

* · 4 4 4 4 4 « 4 ♦ 4 4

4 4 » 4 4 · « ♦ · · · · · — *«*♦··« · ♦ < · 44» <9 44 <4 «4 44 ·*♦· 4 44

Desta maneira, o peso molecular do conjugado (excluindo o peso molecular do EPO) depende do número m. nos conjugados desta invenção m varia entre cerca de 450 até cerca de 900 (correspondente a um peso molecular de cerca de 20 kDa até cerca de 40 kDa) , de preferência, entre cerca de 650 até cerca de 750 (correspondente a um peso molecular de cerca de 30 kDa) . 0 número m é selecionado de maneira tal que o conjugado resultante desta invenção é dotado de uma atividade fisiológica comparável à EPO não modificada, cuja atividade pode representar a mesma, mais do que, ou uma fração da atividade de EPO não modificada correspondente. Um peso molecular de cerca de um determinado número significa que ele está dentro de uma faixa considerável desse número tal como determinado por técnicas analíticas convencionais . 0 número m é selecionado de uma maneira tal que o peso molecular de cada grupo de poli (etileno glicol) que fica encadeado de uma maneira covalente à glicoproteina de eritropoietina, varia entre cerca de 20 kDa até cerca de 30 kDa, e é preferentemente de cerca de 30kDa.

Nos conjugados desta invenção, o número n é o número de grupos de polietileno glicol aglutinados covalentemente aos grupos amino livres (incluindo grupos ε-amino de um ácido amino lisina e/ou o grupo amino amino-terminal) de uma proteína de eritropoietina via encadeamento(s) de amida. Um conjugado de acordo com a presente invenção pode ter um, dois, ou três gru17 pos PEG por molécula de EPO. n é um inteiro que varia de 1 a 3, de preferência, n é 1 ou 2, e com maior preferência, n é 1.

O composto da Fórmula I pode ser preparado a partir do material polimérico conhecido:

(II)

em que R e m são tais como descritos anteriormente, pela condensação do composto de Fórmula II com a glicopro teina de eritropoietina. Os compostos de Fórmula II em que x é 3, são ésteres de poli(etileno glicol) (alcóxi inferior-PEG-SBA) succinimidil de ácido butírico, alcóxi alfa-inferior. Os compostos da Fórmula

II em que x é 2, são ésteres de poli (etileno glicol) (alcóxi inferior-PEG-SBA) succinimidil de ácido propiônico, alcóxi alfa-inferior. Qualquer processo convencional que seja adequado para fazer reagir um éster ativado com uma amina para formar uma amida poderá 20 ser utilizado. Na reação descrita anteriormente, o éster de succinimidil exemplificado é um grupo retirante que provoca a formação de amida. O uso de ésteres de succinimidil tais como os compostos da Fórmula II para produzir conjugados com proteínas estão expostos na pa25 tente U.S. N° 5.672.662, concedida em 30 de setembro de

1997 (Harris et al).

A EPO humana contém nove grupos amino livres, o grupo amino terminal-amino mais os grupos εamino de 8 resíduos de lisina. Quando o reagente de pegilação foi combinado com um composto SBA da Fórmula 5 II, constatou-se que foram produzidas, sob pH 7,5, uma Eêàeãã^odé¹¾C&¾^ttíⁿ¾iΓê^E¾i^ur^]a^:¾e dades residuais das espécies tri-pegiladas. Quando o reagente de pegilação foi um composto SPA da Fórmula 10 II, sob condições assemelhadas, exceto que a relação proteína:PEG foi de 1:2, produz-se principalmente a espécie mono-pegilada. A EPO pegilada pode ser administrada como uma mistura, ou como a espécie pegilada diferente separada por cromatografia permutadora de cáti15 ons. Pela manipulação das condições de reação (por exemplo, relação de reagentes, pH, temperatura, concentração de proteína, tempo de reação, e assemelhadas), as quantidades relativas das diferentes espécies pegiladas podem ser variadas.

Ά eritropoietina humana (EPO) é uma glicoproteína humana que estimula a formação de eritrócitos. A sua preparação e aplicação terapêutica encontram-se descritas em detalhes, por exemplo, nas patentes U.S.

N°s 5.547.933 e 5.621.080, EP-BO 148 605, Huang, S.L.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B

0.205.564, EP-B 0.209.539 e EP-B 0.411.678, bem como

Lai, P.H. et al._f J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, e Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 1205919 ♦ ^Λ * * 4·♦ ο • 4 » * - · ··

4 <*. Γ 4 «*44 * 4 4 4 * » · 4 44

44* »4 f· - * 4' 4 44 4« 44*

12076. A eritropoietina destinada a utilizações terapêuticas poderá ser produzida por intermédio de meios de recombinação (EP-B 0.148.605, EP-B 0.209.539 e Egrie, J.C., Strickland. T.W., Lane, J. et al. _f (198 6)

Immunolbiol. 72:213-224).

Os processos para a expressão e preparação de eritropoietina em meio isento de soro encontram-se expostos, por exemplo, na WO 96/35718, de Burg publicada em 14 de novembro de 1996, e na publicação de paten10 te européia No. 513.738, de Koch, publicada em 12 de junho de 1992. Adicionalmente às publicações mencionadas anteriormente, é sabido que é possível realizar a fermentação isenta de soro de células de CHO recombinantes que contêm um gene de EPO. Tais processos en15 contram-se descritos, por exemplo, na EP-A 0.513.738,

EP-A 0.267.678 e de uma forma geral por Kawamoto, T et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A

0.248.656, Kowar, J. e Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0.481.791, EP-A 0.307.247, EP-A

0.343.635, WO 88/00967.

Na EP-A 0.267.678 encontram-se descritas uma cromatografia de permuta iônica em S-Sepharose, uma HPLC de fase inversa preparatória em uma coluna de C₈ e 25 uma cromatografia de filtragem de gel, para a purificação de EPO produzida em cultura isenta de soro depois de diálise. Sob este aspecto, a etapa de cromatografia de filtragem de gel pode ser substituída por cromato20

grafia de permuta iônica em fluxo rápido de SSepharose. Propõe-se igualmente que uma cromatografia de corante em uma coluna Blue Trisacryl seja realizada antes da cromatografia de permuta iônica.

Um processo para a purificação de EPO recombinante encontra-se descrito por Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359. Neste processo, a EPO é tratada, não obstante, com uma solução de Tween® 20, fluoreto de fenilmetilsulfonil, etilmaleimida, pepsta10 tin A, sulfato de cobre e ácido oxâmico antes das eta-

pas de purificação. Publicações, incluindo a WO 96/35718, de Burg, publicada em 14 de novembro de 1996, expõem um processo para a preparação de eritropoietina em um processo de fermentação isento de soro (EPOsf).

A atividade específica da EPO ou conjugados de EPO de acordo com a presente invenção pode ser determinada por vários ensaios conhecidos na técnica. A atividade biológica das proteínas de EPO purificadas desta invenção são tais que a administração da proteína de EPO por injeção em pacientes humanos resulta em as células da medula óssea aumentarem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue em comparação com grupos de pacientes não inj etados ou de controle. A atividade biológica das proteínas de EPO, ou de seus fragmentos, obtidas e purificadas de acordo com esta invenção pode ser testada por processos de acordo com Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47:99-112 e Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio

1997(2). Um outro ensaio biológico para determinação

da atividade da proteína de EPO, o ensaio de rato normocitaêmico, encontra-se descrito no Exemplo 4.

Esta invenção proporciona uma composição compreendida de conjugados tais como descritos anteriormente. Uma composição que contém pelo menos noventa por cento de conjugados mono-PEG, isto é, em que n é 1, pode ser preparada tal como ilustrado no Exemplo 5. Usualmente os conjugados mono-PEG de glicoproteinas de eritropoietina são desej áveis porque eles tendem a ter atividade mais elevada do que os conjugados di-PEG. A percentagem de conjugados mono-PEG, bem como a relação das espécies mono- e di-PEG, pode ser controlada por agrupamento de frações mais amplas em torno do pico de eluição para diminuir a percentagem de frações mono-PEG ou mais estreitas para aumentar a percentagem de monoPEG na composição. Cerca de noventa por cento de conjugados ‘de mono-PEG é um bom equilíbrio de rendimento e atividade. Por vezes poderão ser desejáveis composi20 ções em que, por exemplo, pelo menos noventa por cento ou pelo menos noventa e seis por cento dos conjugados são espécies mono-PEG (n igual a 1). Em uma concretização desta invenção, a percentagem de conjugados onde n é 1 varia de noventa por cento a noventa e seis por 25 cento.

A invenção também se refere às composições farmacêuticas correspondentes que compreendem um conjugado ou uma composição tal como descrita anteriormente, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Os conjugados e composições da presente invenção são especialmente úteis para a preparação de medicamentos para o tratamento ou profilaxia de doenças 5 relacionadas com anemia em pacientes com deficiência renal crônica (CRF) , AIDS e para o tratamento de pacientes de câncer submetidos a quimioterapia.

Uma concretização adicional da presente invenção refere-se a um processo para o tratamento pro10 filático e/ou terapêutico de distúrbios que envolvem anemia em pacientes com deficiência renal crônica (CRF), AIDS e de pacientes de câncer submetidos a quimioterapia, que compreende a etapa de administrar a um paciente uma composição tal como descrita anteriormen te.

Além disso, a invenção refere-se a um processo para a preparação de compostos tais como descri-

tos anteriormente, processos esses que compreendem a condensação do composto da Fórmula II

(II) com uma glicoproteína de eritropoietina e em que R, m e X são tais como definidos anteriormente.

A invenção refere-se igualmente aos compostos tais como definidos anteriormente para o trata mento de doenças que estão associadas com anemia em pacientes com deficiência renal crônica (CRF), AIDS e pa-

cientes de câncer submetidos a quimioterapia.

A invenção será mais facilmente compreen5 dida pela referência aos exemplos seguintes, os quais ilustram, mas não limitam a invenção descrita neste contexto.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Fermentação E Purificação de EPO Humana

a) Preparação de Inóculo e Fermentação

Um frasco do Working Cell Bank, originário de uma linha de células de CHO de produção de EPO (pode ser usado ATCC CRL8695, exposto em EP 411.678 (Genetics Institute)) é retirado da fase gasosa do tanque de ar15 mazenamento de nitrogênio líquido. As células são transferidas para balões de vidro giratórios e cultivadas em meio de hidrogênio carbonato-amortecido em uma incubadora de C0₂ · Meios lizados para a preparação contram-se expostos no isentos de de inóculo pedido de soro típicos utie fermentação enpatente europeu

513.738, de Koch, publicado em 12 de junho de 1992, ou

WO 96/35718, de Burg publicado em 14 de novembro de

1996, por exemplo, contêm como meio DMEM/F12 (por exemplo, JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, 25 ordem No. 57-736) e adicionalmente hidrogênio carbonato de sódio, L+glutamina, D+glicose, insulina recombinante, selenita de sódio, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de ferro (II), asparagina, ácido aspártico, se24

rina e um estabilizador para células de mamíferos, tais como, por exemplo, álcool polivinílico, metil celulose, polidextrano, polietileno glicol, Pluronic F68, poligelin expansor de plasma (HEMACCEL®) ou polivinil pirro5 lidona (WO 96/35718).

As culturas são verificadas microscopicamente quanto à ausência de microorganismos de contaminação, e as densidades de células são determinadas.

Estes testes são realizados em cada etapa de divisão celular.

Depois do período de crescimento inicial, a cultura de células é diluída com meio fresco para a densidade de células de partida e submetida a um outro ciclo de crescimento. Este procedimento é repetido até ter sido obtido um volume de cultura de aproximadamente por balão de vidro rotativo. Depois de aproximadamente 12 duplicações, dispõe-se de 1 a 5 litros desta

cultura que é então usada como inóculo para o fermentador de inóculo 101.

Depois de 3 - 5 dias de cultivação adicionais, a cultura no fermentador 1001 pode ser usada como inóculo para o fermentador de produção 10001.

b) Colheita e Separação de Células utiliza-se um processo de realimentação de batelada, isto é, quando a densidade de células desejada é alcançada, aproximadamente 80% da cultura é colhida. A cultura restante é reabastecida com meio de cultura fresco e cultivada até a colheita seguinte. Uma

corrida de produção consiste de um máximo de 10 colheitas subsequentes: 9 colheitas parciais e uma colheita global ao final da fermentação. A colheita ocorre a cada 3-4 dias.

0 volume de colheita determinado é transferido para um vaso refrigerado. As células são removidas por meio de centrifugação ou filtragem e descartadas . O sobrenadante que contém EPO da etapa de centrifugação é filtrado em linha e coletado em um segundo 10 vaso refrigerado. Cada colheita é processada separadamente durante a purificação.

Um processo típico para a purificação da proteína-EPO encontra-se exposto na WO 96/35718, de Burg, publicada em 14 de novembro de 1996. O processo 15 de purificação é explicado em seguida.

a) Cromatografia de Blue Sepharose

A Blue Sepharose (Pharmacia) consiste de contas de Sepharose, à superfície das quais se faz aglutinar de forma covalente o corante azul Cibracon.

Uma vez que a EPO aglutina-se mais fortemente à Blue Sepharose do que a maior parte dos contaminantes não proteínicos, algumas impurezas proteínicas e PVA, a EPO pode ser enriquecida nesta etapa. A eluição da coluna de Blue Sepharose é realizada pelo aumento da concen-

tração de sal bem como do pH.

A coluna é preenchida com 80 - 100 1 de

Blue Sepharose, regenerada com NaOH e equilibrada com amortecedor -de equilíbrio (cloreto de sódio/cálcio .e acetato de sódio). O sobrenadante de fermentador acidulado e filtrado é carregado. Depois de concluída a carga, a coluna é lavada primeiro com um amortecedor semelhante ao amortecedor de equilíbrio que contém uma 5 concentração de cloreto de sódio mais elevada e consecutivamente com um amortecedor Tris-base. 0 produto é eluído com um amortecedor Tris-base e coletado em uma

única fração de acordo com o perfil de eluição principal .

b) Cromatografia de Butil Toyopearl

A Butil Toyopearl 650 C (Toso Haas) é uma

matriz baseada em polistireno à qual são acoplados covalentemente resíduos butil alifáticos. Uma vez que a EPO aglutina-se mais fortemente a este gel do que a maioria das impurezas e PVA, ela tem de ser eluída com um amortecedor que contém isopropanol.

A coluna é enchida com 30 - 40 1 de Butil

Toyopearl 650 C, regenerada com NaOH, lavada com amortecedor Tris-base e equilibrada com amortecedor Tris20 base que contém isopropanol.

O eluído de Blue Sepharose é ajustado para a concentração de isopropanol no amortecedor de equilíbrio de coluna e carregado na coluna. Então, a coluna é lavada com amortecedor de equilíbrio com concentração 25 de isopropanol aumentada. O produto é eluído com amortecedor de eluição (amortecedor Tris-base com. alto teor de isopropanol) e coletado em uma única fração de acordo com o perfil de eluição principal.

« · ♦ ♦ ♦ · · · · I

c) Cromatografia de Hidroxiapatita Ultrogel

A Hidroxiapatita Ultrogel (Biosepra) consiste de hidroxiapatita que é incorporada em uma matriz de agarose para aperfeiçoar as propriedades mecânicas.

A EPO tem uma baixa afinidade com a hidroxiapatita e pode, consequentemente, sei eluida sob concentrações de fosfato mais baixas do que as impurezas de proteína.

A coluna é enchida com 30 - 40 1 de Hidroxiapatita Ultrogel e regenerada com amortecedor de fos10 fato de potássio/cloreto de cálcio e NaOH, seguido por um amortecedor Tris-base. Então, é equilibrada com um amortecedor Tris-base que contém uma baixa quantidade de isopropanol e cloreto de sódio.

eluído que contém EPO da cromatografia de Butil Toyopearl é carregado na coluna. Subsequentemente, a coluna é lavada com amortecedor de equilíbrio e um amortecedor Tris-base sem isopropanol e cloreto de sódio. '0 produto é eluído com um amortecedor Tris-base que contém uma baixa concentração de fosfato de potás20 sio e coletado em uma única fração de acordo com o perfil de eluição principal.

d) HPLC de Fase Invertida em Vydac C4 material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste de partículas de sílica gel, cujas superfícies carregam cadeias de alquila-C4. A separação da EPO em relação às impurezas proteínicas é baseada nas diferenças da intensidade das interações hidrófobas. A eluição é realizada com um gradiente de acetonitrilo em

οι

Ο

4

4*4« «)*« ácido trifluoroacético diluído.

O HPLC de preparação é realizado utilizando-se uma coluna de aço inoxidável (enchida com 2,8 a 3,2 litros de silicagel Vydac C4). 0 eluído de Hidroxiapatatita Ultrogel é acidulado pela adição de ácido trifluoroacético e carregado na coluna de Vydac C4. Para lavagem e eluição utiliza-se um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético diluído. Coletamse frações e neutralizam-se imediatamente com amortecedor de fosfato. As frações de EPO que ficam dentro dos limites de IPC são agrupadas.

e) Cromatografia de Sepharose DEAE

O material de Sepharose DEAE (Pharmacia) consiste de grupos de dietilaminoetil (DEAE) que são aglutinados covalentemente à superfície de contas de Sepharose. A aglutinação da EPO aos grupos de DEAE é mediada por interações iônicas. Acetonitrilo e ácido trifluoroacético passam através da coluna sem serem retidos. Depois destas substâncias terem sido removidas por lavagem, as impurezas residuais são removidas por lavagem da coluna com amortecedor de acetato sob um baixo pH. Então, a coluna é lavada com amortecedor de fosfato neutro e a EPO é aluída com um amortecedor com intensidade iônica aumentada.

A coluna é enchida com fluxo rápido de Sepharose DEAE. O volume da coluna é ajustado para assegurar uma carga de EPO na faixa de 3 - 10 mg EPO/ml gel. A coluna é lavada com água e amortecedor de equi- 29 ♦ * • «

X* * »· * Μ · · ** ♦ ♦9» «**»* « <' jI 4 ♦ 4* r ♦ * t * » i, r«i * 4**4· 4 4 44« «4**14« 4 ·-í * ·,· r* *4 4* *i*1 4« M. 144* librio (fosfato de sódio/potássio). As frações agrupadas do eluído de HPLC são carregadas e a coluna é lavada com amortecedor de equilíbrio. Então, a coluna é lavada com amortecedor de lavagem (amortecedor de ace5 tato de sódio) seguida por lavagem com amortecedor de equilíbrio. Subsequentemente, a EPO é eluída a partir da coluna com amortecedor de eluição (cloreto de sódio,

fosfato de sódio/potássio) ção de acordo com o perfil

O eluído da e coletada em.uma única frade eluição principal.

coluna de Sepharose DEAE é

ajustado para a condutividade especificada. A substância da droga resultante é filtrada estéril em garrafas de Teflon e armazenada a -70°C.

EXEMPLO 2: Pegilação de EPO com mPEG-SBA

EPO purificada de acordo com o procedimento isento de soro do Exemplo 1 (EPOsf) foi homogênea conforme determinado por processos analíticos e ilus trado no padrão de isoforma típica que consistia de 8 isoformas. Ela tinha uma atividade biológica específi20 ca de 190.000 IU/mg, conforme determinado pelo ensaio de rato normocitaêmico. 0 reagente de pegilação utilizado foi um metóxi-PEG-SBA, que é um composto de Fórmula II em que R é metil; x é 3; em varia de 650 a 750 (média de cerca de 680, correspondente a um peso mole25 cular médio de cerca de 30 kDa).

Reação de Pegilação

A cem miligramas de EPOsf (9,71 ml de uma matéria-prima de 10,3 mg/ml de EPOsf, 5,48 μπιοί), foram

adicionados 10 ml de amortecedor de fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,5, contendo 506 mg de 30kDa metóxi-PEG-SBA (16,5 μ mol) (obtido a partir da Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) e misturados durante 2 horas à temperatura ambiente (20-23°C). A concentração de proteínas final foi de 5 mg/ml e a relação de proteína :reagente PEG foi de 1:3. Depois de duas horas, sustou-se a reação pela ajustagem do pH para 4,5 com ácido acético glacial e armazenou-se a -20°C, até ficar pron10 ta para purificação.

Purificação

1. Mistura de Conjugado: Encheram-se aproximadamente ml de SP-SEPHAROSE FE (resina permutadora catiônica de sulfopropil) em uma coluna de vidro AMICON (2,2 x 15 7,5 cm) e equilibrou-se com 20 mM de amortecedor de acetato, pH 4,5, a uma taxa de fluxo de 150 ml/hora.

Seis mililitros da mistura de reação contendo 30 mg de proteína foram diluídos 5 vezes com o amortecedor de equilíbrio e aplicados à coluna. Os materiais não ad20 sorvidos foram removidos por lavagem com o amortecedor e a mistura conjugada PEG adsorvida foi eluída da coluna com NaCl 0,175 M no amortecedor de equilíbrio. A coluna foi reequilibrada no amortecedor de partida. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e os seus graus 25 de pegilação foram determinados. Constatou-se que o eluído de NaCl 0, 175M continha mono- bem como di- e

quantidades residuais das espécies tri-pegiladas, enquanto que o eluído de 750 mM NaCl continha EPOsf não « * ♦«····♦ · · « ♦ ····♦· « ♦ ··· «· ·« ·· ♦··· ·*·♦ · modificada.

2. Di-PEG e Mono-PEG-EPOsf: A mistura de conjugado purificado, eluida a partir da coluna na etapa anterior, foi diluída 4 vezes com o amortecedor e reaplicada à coluna e lavada conforme descrito. Di-PEG-EPOsf e mono-PEG-EPOsf foram eluídos separadamente a partir da coluna, com NaCl O,1M e NaCl 0,175M, respectivamente.

Também se realizou eluição com NaCl 750πιμ para eluir qualquer EPOsf não modificada remanescente.

Alternativamente, a mistura de reação foi diluída 5 vezes com o amortecedor de acetato e aplicada à coluna de SP-Sepharose (~0,5mg proteína/ml gel) . a coluna foi lavada e adsorvida mono-PEG-EPOsf, di-PEG-

EPOsf e EPOsf não modificadas foram eluídas tal como

descrito na seção anterior.

Resultados

PEG-EPOsf foi sintetizada pela conjugação química de uma molécula PEG linear com um número de peso molecular médio de 30 kDa. A PEG-EPOsf foi deri20 vada a partir da reação entre os grupos amino principais da EPOsf e o derivado de éster de succinimidil de um PEG-ácido butírico 30 kDa, resultando em uma aglutinação de amida.

Os resultados encontram-se sumariados na

Tabela 1. A mistura de conjugados purificados era compreendida de mono- e di-PEG-EPOsf e apresentou-se isenta de EPOsf não modificada, conforme determinado por análise SDS-PAGE. A mistura de conjugados foi respon32

sável por 23,4 mg, ou 78%, do material de partida. A separação cromatográfica de permuta de cátions da monoe di-PEG-EPOsf, indicou que a relação da mono- para diPEG, na mistura de conjugados, era de aproximadamente

1:1. Depois que se concluiu a reação, a relação dos componentes individuais de Mono:Di:Não modificada, foi de 40:38:20 (%). O rendimento global foi aproximada-

mente quantitativo.

Tabela 1. Sumário dos Resultados de pegilação da EPOsf

Amostra Proteína (mg) Rendimento (%)

Mist. Rxn.	30	100
Mono-	12,0	40
Dl·	11,4	38
Não modificada	6.0	20
Mist. de Conjugados	23,4	78

EXEMPLO 3: Pegilação de EPQ com mPEG-SPA

Levou-se a reagir uma alíquota diferente da EPOsf utilizada no Exemplo 2, com 30 kDa metóxi-PEG15 SPA (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama).

A reação foi realizada segundo uma relação de proteína: reagente de 1:2 e as técnicas de purificação foram de acordo com o Exemplo 2. Produziu-se principalmente a espécie mono-pegilada.

0 EXEMPLO 4: Atividade in vivo de EPQ pegilada determinada pelo ensaio de rato normocitaêmico

É conhecido na técnica o bioensaio de rato

normocitaêmico (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2) e um processo na monografia de eritropoietina de Ph. Eur. BRP. As amostras foram diluídas com BSA-PBS. Ratos normalmente saudáveis, 7-15 se5 manas de idade, foram administrados s.c. 0,2 ml da fração EPO que continha EPO não pegilada ou EPO tridi-

ou mono-pegilada, proveniente do Exemplo 2 ou 3. Durante um período de 6 dias, sangue foi extraído por punção da veia da cauda e diluído de maneira tal que 1 10 μΐ de sangue estava presente em 1 ml de uma solução de coloração laranja acridina 0,15 pmol. O tempo de coloração foi de 3 a 10 minutos. As contagens de reticulócitos foram realizadas microfluorometricamente em um citômetro de fluxo mediante análise do histograma de fluorescência vermelha. As contagens de reticulócitos foram dadas em termos de valores absolutos (por 30.000 células vermelhas analisadas).

Para os dados apresen-

tados, cada grupo consistiu de 5 ratos por dia, e os ratos foram sangrados somente uma vez.

Em experiências separadas, administrou-se aos ratos uma única dose de EPO não modificada (25 ng de EPO), a mistura de PEG(SBA)-EPO proveniente do Exemplo 2 (10 ng de conjugado), EPOsf mono- e di-pegilada provenientes do Exemplo 2 (10 ng de conjugado), a

PEG(SPA)-EPO proveniente do Exemplo 3 (10 ng de conjugado) e solução de amortecimento. Os resultados encontram-se expostos na Tabela 2. Os resultados mostram a atividade superior e o semiperíodo prolongado da espécie EPO pegilada indicou as quantidades significativamente aumentadas de reticulócitos e a mudança do máximo de contagem de reticulócitos utilizando-se a mesma dose por rato (10 ng) , em comparação com uma dose de 25 ng 5 para a EPO não modificada.

TABELA 2

	EPO (Não modificada)	30 kDa SPA PEG	Mono 30K SBA	Di 30K SBA	Mistura de Coniuaados PEG-EPO SAB	Amortecedor de Controle

72h	1000	1393	1411	994	1328	857
96h	500	1406	1501	926	1338	697
120h	-200	1100	1182	791	944	701
144h	-0	535	535	665	660	708

EXEMPLO 5: Preparação de Predominantemente

mono-PEG-EPO

Reação de Pegilação

Iniciando-se com 100 is

EPOsf em 100 mM de amortecedor de fosfato de potássio.

pH 7,5, preparada de acordo com o

Exemplo

1, adicionakDa PEG-SBA dissolvidos em to de potássio ml

100 nado para produzir de mM, um ml. A concentração mM HC1. Amortecedor de fosfapH 7,5, suficiente, foi adiciovolume de mistura de reação para de proteína final foi de 5 mg/ml e a relação de proteína: reagente PEG foi de 1:1. A mistura de reação foi submetida a mistura durante 2 ho • ·· ras à temperatura ambiente (20 - 22°C) . Depois de 2 horas, sustou-se a reação pela ajustagem do pH para 4,5 com ácido acético glacial e armazenou-se congelada a 20°C até ficar pronta para purificação.

Purificação

A mistura de reação proveniente da etapa anterior foi diluida em 1:5 com 10 mM de acetato de só-

dio, pH 4,5 e aplicada a 300 ml de SP-Sepharose FF (resina permutadora catiônica de sulfopropil) acondici10 onada em uma coluna de 4,2 x 19 cm. A coluna foi previamente equilibrada com o mesmo amortecedor. Os efluentes da coluna foram monitorados a 280 nm com um monitor Gilson UV e registrados com um registrador Kipp and

Zonen. A coluna foi lavada com 300 ml ou 1 volume de leito de amortecedor de equilíbrio para remover os rea20 gentes excedentes, subprodutos de gomérico. Foi seguida de to de 100 mM de NaCl 100,

A mono-PEG-EPO foi então lavagem para se eluída reação e PEG-EPO com 2 volumes de olileiremover a di-PEG-EPO.

com

200 mM de NaCl.

Durante a eluição da mono-PEG-EPO, os primeiros 50 ml do pico de proteína foram descartados e a mono-PEG-EPO foi coletada como uma fração de

150 ml. A

EPOsf não modificada remanescente na coluna foi eluída com 750 mM de NaCl. Todos os amortecedores de eluição foram fei25 tos no amortecedor de equilíbrio. Todas as amostras

Size Exclusion

Chromatography (SEC) de alto desempenho.

O agrupamento mono-PEG-EPO obtido a partir da fração de 150 ml, que

não tinha EPOsf não modificada detectável, foi então concentrado para ~4,5-7,5 mg/ml e filtrado no amortecedor de armazenamento, 10 mM fosfato de potássio, loo mM NaCl, pH 7,5. A concentração/diafiltragem foi realiza5 da com Millipore Labscale™ TFF System, equipado com uma membrana 50 kDa cut off Millipore Pellicon XL Biomax 50, sob temperatura ambiente. A mono-PEG-EPO concentrada foi filtrada em condição estéril e armazenada congelada a 20°C.

Aproximadamente 75% da EPOsf foram pegilados. Depois da purificação, o rendimento total foi de ~30% de mono-PEG-EPO sem EPOsf não modificada detectável e em torno de 25% de di-PEG-EPO. Oligômeros e EPOsf não pegilada foram responsáveis pela proteína re15 manescente. O agrupamento mono-PEG-EPO obtido a partir da fração de 150 ml continha aproximadamente 90% de mono-PEG-EPO e aproximadamente 10% de di-PEG-EPO.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Conjugado caracterizado pelo fato de compreender uma glicoproteína de eritropoietina, em que a glicoproteína tem a sequência SEQ ID NO:1 e tem pelo menos um grupo isento de amino e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoietina humana; em que a glicoproteína é encadeada covalentemente a n grupos poli(etilenoglicol) da fórmula

-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)_m-OR com o -CO de cada grupo de poli(etileno glicol) formando uma aglutinação de amida com um dos grupos amino; em que

R é alquila inferior;

x é 2 ou 3;

m é 450 a 900;

n é de 1 a 3; e n e m são escolhidos de maneira tal que o peso molecular do conjugado menos a glicoproteína de eritropoietina varia desde 20 quilodaltons até 100 quilodaltons.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:

P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]_n (I) em que x, m, n e R são tais como definidos na reivindicação 1, e P é o resíduo da glicoproteína sem o(s) amino grupo(s) n que formam encadeamento(s) de amida com o(s) grupo(s) de poli(etileno glicol).
3. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R é metil.
4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que m varia de 650 a 750.
5. Conjugado, de acordo com qualquer uma das

2/6 reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que n é 1.
6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que R é metil; m varia entre 650 a 750 e n é 1.
7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de ter a fórmula [CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P

em que m varia de 650 a 750, n é 1 e P é tal como definido na reivindicação 1. 8. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo

fato de que a glicoproteína é uma eritropoietina humana.
9. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína de eritropoietina humana é expressa por ativação de gene endógeno.
10. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína tem a sequência de eritropoietina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação.
11. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína tem a sequência de eritropoietina humana modificada por meio de uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em:

Asn³⁰Thr³²;

Asn⁵¹Thr⁵³;

Asn⁵⁷Thr⁵⁹;

Asn⁶⁹;

Asn⁶⁹Thr⁷¹;

3/6

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Val^{* 87}Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸;

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰;

Thr¹²⁵Thr¹⁴⁰;

Thr¹²⁵; e

Pro¹²⁴Thr¹²⁵.

12. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína tem uma

sequência que compreende a sequência de eritropoietina humana e uma segunda sequência no término carbóxi da sequência de eritropoietina humana, em que a segunda sequência contém pelo menos um local de glicosilação.
13. Conjugado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência compreende uma sequência derivada da sequência terminal carbóxi de gonadotropina coriônica humana.
14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína tem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:

(a) sequência de eritropoietina humana e sequência SEQ ID NO:3 no término carbóxi da sequência de eritropoietina humana;

87 88 (b) sequência em (a) modificada por Ser Asn

Thr⁹⁰; e

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3 0 8 7 (c) sequência em (a) modificada por Asn Val Asn⁸⁸ Thr⁹⁰.
15. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína tem a sequencia de eritropoietina humana modificada por uma reordenação de pelo menos um local de glicosilação.
16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a reordenação compreende a supressão de qualquer um dos locais de glicosilação Nencadeados na eritropoietina humana e a adição de um local de glicosilação N-encadeado na posição 88, da sequencia da eritropoietina humana.
17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína tem a sequencia de eritropoietina humana modificada por meio de uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em:

Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰; _Gln ³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰; e _Gln ⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰. 18. Composição compreendendo conjugados caracterizada pelo fato de que cada um dos conjugados

compreende uma glicoproteína de eritropoietina que tem pelo menos um grupo amino livre e que tem a atividade biológica ín vívo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e de células vermelhas do sangue e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoietina humana e seus análogos que tem sequencia de eritropoietina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação ou uma reordenação de pelo menos um local de glicosilação; em que a glicoproteína é encadeada covalentemente a n grupos poli(etilenoglicol) da fórmula -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)_m-OR, com o -CO de cada grupo de

5/6 poli(etileno glicol), formando uma aglutinação de amida com um dos grupos amino; onde em cada um dos conjugados R é alquila inferior; x é 2 ou 3; m varia entre 450 a 900; n varia de 1 a 3; n e m são escolhidos de maneira tal que o peso molecular do conjugado menos a glicoproteína de eritropoietina varia desde 20 quilodaltons até 100 quilodaltons; a percentagem de conjugados em que n é 1 é pelo menos noventa por cento.
19. Composição compreendendo conjugados conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 17 caracterizada pelo fato de que a percentagem de conjugados onde n é 1 é de pelo menos noventa por cento.
20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que a percentagem dos conjugados onde n é 1 é de pelo menos noventa e dois por cento.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a percentagem de conjugados onde n é 1 é de pelo menos noventa e seis por cento.
22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que a percentagem de conjugados onde n é 1 varia entre noventa por cento até noventa e seis por cento.
23. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um conjugado ou reivindicações 1 qualquer uma das farmaceuticamente aceitável.

uma composição conforme excipiente

22 e um
24. Uso de um conjugado ou de uma composição conforme qualquer uma das reivindicações

1 a 22 caracterizado pelo fato de compreender a preparação de medicamentos para tratamento ou profilaxia de doenças relacionadas com anemia em pacientes com deficiência renal crônica (CRF) , AIDS e para o tratamento de pacientes de câncer submetidos à quimioterapia.

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25. Processo para a preparação de compostos conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 22 caracterizado pelo fato de que o processo compreende a condensação do composto da Fórmula II com uma glicoproteína de eritropoietina e em que R, m e x são tais como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.