KR100608415B1 - 폴리알킬렌 글리콜산 첨가제 - Google Patents

폴리알킬렌 글리콜산 첨가제 Download PDF

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Abstract

생물약제, 예컨대 폴리펩타이드, 당, 단백질 및 치료학적 활성의 저분자로 콘쥬게이트화하여 상기 약제의 생물학적 활성 콘쥬게이트를 제조하기 위한 신규한 부류의 활성화된 폴리알킬렌 글리콜산과 이들의 활성 에스터 반응물질, 및 상기 콘쥬게이트의 제조방법.

Description

폴리알킬렌 글리콜산 첨가제{POLYALKYLENE GLYCOL ACID ADDITIVES}
본 발명의 분야는 폴리알킬렌 글리콜산 및, 치료학적 활성의 생물약제를 사용하여 치료학적 활성의 폴리알킬렌 글리콜 콘쥬게이트를 제조하기 위한 치료학적 활성의 생물약제에의 상기 폴리알킬렌 글리콜산의 결합에 관한 것이다.
생물약제(예컨대 단백질 및 펩타이드)에의 친수성 폴리알킬렌 글리콜 선형 중합체(PAG로서 공지됨)의 화학적 결합은 잘 공지되어 있고, 생물공학에서 통상적으로 사용된다. 가장 통상적인 폴리알킬렌 글리콜 분자는 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG로서 공지됨)이다.
PAG의 생물공학 적용의 예로서, 일부의 PAG의 활성 유도체는 유익한 결과를 갖는 생물약제, 예컨대 단백질 및 효소에 결합되어 있다. PAG는 유기 용매중에 가용성이기 때문에, 효소 또는 단백질과 같은 생물약제에 결합된 PAG는 유기 용매중에 가용성이고 활성인 생성된 콘쥬게이트를 제조할 수 있다. 단백질에 PAG의 결합은, 비개질된 단백질과 비교할 때 PAG-단백질 콘쥬게이트의 면역원성 및 신장 제거 속도를 감소시킬 수 있다. 또한, 생물약제, 예컨대 단백질에 PAG의 결합은 이들 PAG 콘쥬게이트에 대한 혈액 순환 주기를 상당히 증가시킬 수 있다.
생물약제(예컨대 단백질)와 PAG 복합체 제조에서, 특정 생물약제의 약물동력학은 약물의 효능 및 효과 지속 기간 모두를 조절할 것이다. 면역원성, 수불용성 및 생체내에서 생물약제, 특히 단백질 및 폴리펩타이드의 짧은 반감기의 관점에서, 이들 생물약제의 제거 속도를 감소시켜 지속적인 작용이 달성되는 것이 중요하다. 이는 단백질 및 이의 분자 크기상의 전하에 의해 모두 효과적일 수 있는 사구체 여과를 피하거나 또는 저해함으로써 달성될 수 있다(브레너(Brenner) 등의 문헌[Am.J.Physiol., 234, F455(1978)]). 분자 부피를 증가시키고 효능있는 에피토프 위치를 마스킹함으로써 치료 생물약제, 예컨대 펩타이드 및 단백질을 중합체로 개질시키면 제거의 속도 뿐만 아니라 생물약제, 특히 단백질의 항원성 모두가 효과적으로 감소되는 것으로 나타났다. 감소된 단백질 가수분해, 증가된 수 용해성, 감소된 신장 제거 및 수용체-매개 제거에 대한 입체 장애는 많은 메카니즘에 의해 생물약제, 예컨대 폴리펩타이드 및 단백질의 주쇄에 PAG 중합체의 결합이 약물의 약물동력학 특성을 증강시키는데 유익하다. 따라서, 데이비스(Davis)등의 미국 특허 제 4,129,337 호는 단백질, 예컨대 효소 및 인슐린에 PEG 결합하여 이 생물약제의 생물학적 활성의 실질적인 비율을 유지하면서 면역원성 생성물을 보다 덜 제조하는 것을 개시하고 있다.
생물약제, 예컨대 단백질의 개질을 위해 다양한 활성 PAG(특히 PEG) 반응물질이 개발되었으며(예를 들어 문헌[Zalipsky, et al. and Harris et al. in :Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnicla and Biomedical Applications;(J.M. Harris ed.) Plenum Press: New York, 1992; Chap.21 and 22)]), 이들 대부분은 PEG와 생물약제 사이의 연결기의 형성을 요구한다. 이들 반응물질의 일부는 콘쥬게이트화 반응이 일어나는 수성 매질중에서 매우 불안정하다. 또한, 콘쥬게이트화 과정은 단백질 활성 위치와 입체적으로 작용하는 주요한 몇몇의 요소 때문에 종종 시험관내에서 생물학적 활성의 손실을 초래한다. 따라서, 신규한 반응물질의 바람직한 특성은 수성 매질중 분해에 민감하지 않은 특성과 사용되어 단백질의 위치 특이적 개질에 영향을 주는 특성이다.
본 발명에 따라서, 본 발명자는 생물약제, 예컨대 폴리펩타이드, 당, 단백질 및 치료학적 활성의 저분자와의 콘쥬게이트화를 위한 신규한 부류의 활성화된 폴리알킬렌 글리콜산 및 이들의 활성 에스터 반응물질을 개시하고 있다. 이들 반응물질은 임의의 하나의 다음 화학식을 갖는 화합물, 또는 A가 수소인 경우 이의 가수분해성 에스터이다:
Figure 112005004136519-pct00001
[상기 식에서,
R, R1 및 R2는 각각 수소 또는 저급 알킬이고;
X는 -O- 또는 -NH-이고;
PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
n은 0 또는 1의 정수이고;
m은 4 내지 8의 정수이고;
A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다]
Figure 112005004136519-pct00002
[상기 식에서,
R, PAG, X 및 A는 상기와 같고;
w는 1 내지 3의 정수이고;
R3 및 R4중 하나는 저급 알킬이고 나머지는 수소 또는 저급 알킬이다]
Figure 112005004136519-pct00003
[상기 식에서,
R, A 및 X는 상기와 같고;
PAG1은 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 형성된 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 약 500 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖고;
y는 0 내지 3의 정수이고;
v는 1 내지 3의 정수이고;
k는 1 또는 2의 정수이다]
상기 정의된 바와 같은 화학식 I-A의 바람직한 화합물은 하기 화학식 I-A1이다
Figure 112005004136519-pct00004
상기 식에서,
A, R, PAG, R1, R2, m 및 n은 상기 정의된 바와 같다.
상기 정의된 바와 같은 화학식 I-A의 다른 바람직한 화합물은 하기 화학식 I-A2이다:
Figure 112005004136519-pct00005
상기 식에서,
A, R, PAG, R1, R2, m 및 n은 상기 정의된 바와 같다.
상기 정의된 바와 같은 화학식 I-B의 바람직한 화합물은 하기 화학식 I-B1이다:
Figure 112005004136519-pct00006
상기 식에서,
A, R, PAG, R3, R4, m 및 n은 상기 정의된 바와 같다.
상기 정의된 바와 같은 화학식 I-C의 바람직한 화합물은 하기 화학식 I-C1이다:
Figure 112005004136519-pct00007
상기 식에서,
R, PAG1, A, v, y 및 k는 상기 정의된 바와 같다.
바람직하게, A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터 또는 이의 가수분해성 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이고, 더욱 바람직하게 A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다.
상기 정의된 바와 같은 화합물에서, A는 바람직하게 수소이다. A가 활성화된 이탈기인 상기 정의된 화합물이 또한 바람직하다. 상기 정의된 화합물, 특히 A가 바람직하게 활성화된 이탈기인 화학식 I-C1의 화합물에서, A는 바람직하게 N-하이드록시석신이미딜이다.
또다른 바람직한 양태에서, R은 메틸이다. PAG가 PEG, 즉 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도된 2가 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 상술된 화합물이 또한 바람직하다. 바람직하게, PEG는 10,000 내지 40,000, 더욱 바람직하게 20,000 내지 35,000의 분자량을 갖는다. PAG1이 PEG1인 상기 정의된 화학식 I-C의 화합물에서 PEG1은 바람직하게 500 내지 15,000의 분자량을 갖는다.
추가의 바람직한 양태에서, n은 0이고 m은 4이다. 바람직하게, w는 1이다.
또다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 화학식 V의 화합물과 화학식 V1의 화합물을 축합하여 화학식 VIII의 에스터를 제조하는 단계,
상기 에스터를 가수분해하여 화학식 IX의 유리 산을 형성하는 단계, 및
커플링제의 존재하에 상기 유리산과 활성화된 이탈기의 할라이드를 반응시켜 화학식 I-A의 활성화된 에스터를 제조하는 단계를 포함하는, 화학식 I-A의 활성화된 에스터를 제조하는 방법에 관한 것이다:
화학식 I-A
Figure 112005004136519-pct00008
[상기 식에서,
R, R1 및 R2는 각각 수소 또는 저급 알킬이고;
X는 -O- 또는 -NH-이고;
PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
n은 0 또는 1의 정수이고;
m은 4 내지 8의 정수이고;
A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 수소 또는 활성화된 이탈기이다]
Figure 112005004136519-pct00009
[상기 식에서,
R 및 PAG는 상기 정의된 바와 같고;
V는 -OH 또는 -NH2이다]
Figure 112005004136519-pct00010
[상기 식에서,
R5는 가수분해성 에스터 보호기를 형성하고;
Y는 할라이드이고;
R1, R2, m 및 n은 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00011
[상기 식에서,
R, PAG, X, R1, R2, R5, m 및 n은 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00012
[상기 식에서,
R, PAG, X, R1, R2, m 및 n은 상기와 같다]
또다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 화학식 XX의 화합물과 화학식 V의 화합물을 축합하여 화학식 XXI의 에스터 화합물을 제조하는 단계,
상기 에스터를 가수분해하여 화학식 XXII의 유리 산을 형성하는 단계, 및
커플링제의 존재하에 상기 유리 산과 활성화된 이탈기의 할라이드를 반응시켜 화학식 I-B의 활성화된 에스터를 제조하는 단계를 포함하는, 화학식 I-B의 활성화된 에스터를 제조하는 방법에 관한 것이다:
화학식 I-B
Figure 112005004136519-pct00013
[상기 식에서,
R은 수소 또는 저급 알킬이고;
X는 -O- 또는 -NH-이고;
PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
w는 1 내지 3의 정수이고;
R3 및 R4중 하나는 저급 알킬이고 나머지는 수소 또는 저급 알킬이고;
A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다]
Figure 112005004136519-pct00014
[상기 식에서,
w, R3 및 R4는 상기와 같고;
Y는 할라이드이고;
R5는 가수분해성 에스터 보호기를 형성한다]
화학식 V
Figure 112005004136519-pct00015
[상기 식에서,
R 및 PAG는 상기와 같고;
V는 -OH 또는 -NH2이다]
Figure 112005004136519-pct00016
[상기 식에서,
w, R, PAG, X, R3, R4 및 R5는 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00017
[상기 식에서,
w, R, PAG, X, R3, R4 및 R5는 상기와 같다]
또다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 화학식 XXXV의 화합물과 화학식 XXXVI의 화합물을 축합하여 화학식 XXVII의 에스터를 제조하는 단계,
상기 에스터를 가수분해하여 화학식 XXVIII의 유리 산을 형성하는 단계, 및
커플링제의 존재하에 상기 유리 산과 활성화된 이탈기의 할라이드를 반응시켜 화학식 I-C의 활성화된 에스터를 제조하는 단계를 포함하는, 화학식 I-C의 활성화된 에스터를 제조하는 방법에 관한 것이다:
화학식 I-C
Figure 112005004136519-pct00018
[상기 식에서,
R은 수소 또는 저급 알킬이고;
X는 -O- 또는 -NH-이고;
A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이고;
PAG1은 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 약 500 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖고;
y는 0 내지 3의 정수이고;
v는 1 내지 3의 정수이고;
k는 1 또는 2의 정수이다]
Figure 112005004136519-pct00019
[상기 식에서,
y 및 v는 상기와 같고;
Y는 할라이드이고;
R5는 가수분해성 에스터 보호기를 형성한다]
Figure 112005004136519-pct00020
[상기 식에서,
R, PAG1 및 k는 상기와 같고;
V는 -OH 또는 -NH2이다]
Figure 112005004136519-pct00021
[상기 식에서,
R, PAG1, X, R5, k, v 및 y는 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00022
[상기 식에서,
R, PAG1, X, k, v 및 y는 상기와 같다]
상기 기술된 바와 같은 방법에서, 상기 이탈기는 N-하이드록시석신이미딜이 바람직하다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태는 화학식 I-A'의 콘쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112005004136519-pct00023
[상기 식에서,
P는 말단 하이드록시기를 갖는 생물약제의 잔기이고, 이때 상기 말단 하이드록시기는 제거되고;
R, R1 및 R2는 각각 수소 또는 저급 알킬이고;
X는 -O- 또는 -NH-이고;
PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
n은 0 또는 1의 정수이고;
m은 4 내지 8의 정수이다]
상기 정의된 콘쥬게이트에서, P는 바람직하게 글리코시드 또는 AzT의 잔기이다. 바람직하게, X는 -O-이다. 바람직하게, PAG는 10,000 내지 15,000의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 잔기이다. 바람직하게 R은 메틸이다.
본 발명의 또다른 바람직한 양태는 화학식 I-A"의 콘쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112005004136519-pct00024
[상기 식에서,
P는 말단 하이드록시기를 갖는 생물약제의 잔기이고, 이때 상기 말단 하이드록시기 는 제거되고;
R, R1 및 R2는 각각 수소 또는 저급 알킬이고;
X는 -O- 또는 -NH-이고;
PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
n은 0 또는 1의 정수이고;
m은 4 내지 8의 정수이다]
상기 정의된 콘쥬게이트에서, P는 바람직하게 단백질 또는 펩타이드의 잔기이고, 보다 바람직하게 P가 서열 번호 1과 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 T-20이다. 바람직하게 X는 -O-이다. 바람직하게, PAG는 10,000 내지 15,000의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 잔기이다.
이들 화합물은 생물약제, 예컨대 폴리펩타이드, 당, 단백질 및 글리코시드와 콘쥬게이트를 형성하기 위한 유용한 반응물질이다. 화학식 I-A, I-B 및 I-C의 화합물은 이들이 생물약제, 예컨대 폴리펩타이드, 당, 단백질, 글리코시드와 콘쥬게이트를 형성할 때 이들의 약학동력학 및 약물학 특성을 증강시킨다. 이들 임상적으로 유용한 특성은 보다 긴 생체내에서 순환 반감기, 감소된 제거 및 증강된 효능, 잠재적인 효율성 향상을 유도하는 생물 분포의 변화, 감소된 면역원성, 감소된 독성, 보다 우수한 물리적 및 열적 안정성, 단백분해에 대한 보호 등을 포함한다. 화학식 I-A, I-B 및 I-C의 화합물의 안정성은 이들을 생물약제에 용이하게 콘쥬게 이트화시켜 분해 위험을 감소시킨다.
화학식 I-A, I-B 및 I-C의 반응물질은 아미노 또는 하이드록시기 함유의 생물약제의 아미노기 또는 하이드록시기에 콘쥬게이트화되어 이들이 유도되는 생물약제의 생물학적 활성의 실질적인 부분을 유지하는 콘쥬게이트를 제조할 수 있다. 일반적으로 콘쥬게이트화의 목적으로, 아미노 또는 하이드록시 함유의 생물약제는 말단 아미노기 또는 하이드록시를 함유하는 것이 바람직하다. 이는 본 발명의 반응물질이 본 발명에 따라서 콘쥬게이트를 제조하도록 콘쥬게이트화할 수 있는 말단 아미노 또는 하이드록시기이다. 본 발명의 반응물질은 수성 매질중 분해에 민감하지 않고 따라서 이들은 용이하게 생물약제와 반응하여 수성 매질중 치료 목적을 위해 투여될 수 있는 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
용어 폴리알킬렌 글리콜은 폴리(저급 알킬렌)글리콜 잔기를 나타내고, 이때 알킬렌 라디칼은 탄소원자수 2 내지 7을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 라디칼이다. 용어 "저급 알킬렌"은 탄소원자수 2 내지 7을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 2가 알킬렌 라디칼, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리 n-프로필렌, 폴리 아이소프로필렌, 폴리 n-뷰틸렌 및 폴리아이소뷰틸렌 뿐만 아니라 혼합된 알킬렌 글리콜로부터 형성된 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 라디칼의 혼합물을 함유하는 중합체 및 폴리아이소프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리아이소뷰틸렌 라디칼의 혼합물을 함유하는 중합체를 나타낸다. 분지쇄 알킬렌 글리콜 라디칼은 알킬렌기의 직쇄중에 함유된 탄소원자수에 따라 탄소원자수 2 내지 4의 중합체 사슬중 저급 알킬기를 제공하고 따라서 폴리알킬렌 글리콜 치환체를 구성하는 임의의 알킬렌 잔기 일부의 총 탄소원자수는 2 내지 7이다. 용어 "저급 알킬"은 탄소원자수 1 내지 7, 바람직하게 1 내지 4를 함유하는 저급 알킬기를 포함하고, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필 등이고 특히 바람직하게 메틸이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 화학식 I-A, I-B 및 I-C의 화합물중 PAG는 2개의 말단 하이드록시기의 제거에 의해 형성되는 폴리에틸렌 글리콜 잔기이다. 또한, 본 발명에 따라서 화학식 I-A 및 I-B의 화합물중 PAG 잔기는 약 10,000 내지 약 50,000, 더욱 바람직하게 약 20,000 내지 약 40,000, 특히 바람직하게 약 25,000 내지 약 35,000의 분자량을 갖는다. 화학식 I-C의 화합물에서, 2개의 PAG1 잔기는 약 10,000 내지 약 50,000, 바람직하게 약 20,000 내지 약 40,000, 가장 바람직하게 약 25,000 내지 약 35,000의 합한 분자량을 갖는 것이 일반적으로 바람직하다.
화학식 I-A, I-B 및 I-C의 반응물질은 유리 하이드록시 또는 아미노기를 함유하는 임의의 통상적인 생물약제에 콘쥬게이트화될 수 있다. 유리 산을 통해서 또는 활성 에스터의 사용을 통해서 축합될 수 있다.
본 발명에 따라서, 화학식 I-A, I-B 및 I-C의 화합물은 에터 또는 아미드 콘쥬게이트를 형성하기 위해 단백질, 펩타이드 또는 저분자 유기 잔기를 갖는 생물약제의 유리 하이드록시기 또는 유리 아미노기와 반응할 수 있다.
본 발명에 따라서, 에터 또는 아미노 콘쥬게이트는 하기 반응식에 의해 본 발명의 반응물질의 화합물로부터 제조될 수 있다. 에스터 콘쥬게이트의 형성에서, 반응물질은 하기에 도시된 바와 같이 말단 하이드록시기를 함유하는 생물약제와 반응한다:
Figure 112005004136519-pct00025
상기 식에서,
P는 제거되는 말단 하이드록시기를 갖는 생물약제의 잔기이다.
상기 반응식 1에서, B는 말단 반응성 산 또는 활성 산 이탈기가 없는 화합물 I-A, I-B 및 I-C의 합성물이다. 이 반응의 실시에서, 반응성 산 기와 알콜을 반응시킴으로써 의해 에스터를 형성하는 임의의 통상적인 방법이 에스터 콘쥬게이트의 형성에 이용될 수 있다. 바람직한 방법은 예컨대 커플링 촉매를 이용하여 다이사이클로헥실카보다이이미드산와 같은 커플링제의 존재하에 산과 알콜을 커플링하는 것이다. 임의의 통상적인 커플링 촉매, 예컨대 1-하이드록시벤조트라이아졸 및 (4-다이메틸아미노)피리딘 또는 이들의 혼합물을 이용할 수 있다. 일반적으로 이 반응은 불활성 유기 용매 매질중에서 실시한다. 이 반응을 상기 산의 유리 또는 활성화 에스터 유도체와 함께 실시할 수 있다. 활성화된 산 유도체를 이용한다면, 이후 커플링 촉매 및/또는 커플링제를 이용할 필요가 없다. 이 반응 실시에서, 온도 및 압력은 중요하지 않고 이 반응을 실온에서 실시할 수 있다. 그러나, 필요하다면, 보다 높거나 보다 낮은 온도가 이용가능하다. 이 반응에 따라서, P는 말단 하이드록시기를 갖는 임의의 생물약제의 잔기일 수 있다. 상기 에스터 형성을 위 해, 말단 하이드록시기를 갖는 바람직한 생물약제는 뉴클레오시드, 예컨대 AZT이다. 또한 P는 말단 하이드록시기를 갖는 임의의 이러한 저분자 생물약제일 수 있다.
아미드 형성에서, 다음 반응을 사용한다:
Figure 112005004136519-pct00026
상기 식에서,
P1은 제거되는 말단 아미노기를 갖는 생물약제의 잔기이다.
상기 반응에서, 반응식 2는 다음에 기술된 바와 같다. 이 반응에 따라서, P1은 말단 아미노기를 갖는 임의의 생물약제의 잔기, 예컨대 단백질 또는 펩타이드 또는 말단 아미노기를 갖는 저분자 생물약제의 잔기일 수 있다. 바람직한 단백질 및 펩타이드중에는 인터페론-α, 인터페론-β, 컨센서스(consensus) 인터페론, GSCF, GM-CSF, 인터루킨, 대장 자극 인자 뿐만 아니라 면역글로불린, 예컨대 IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD 및 이들의 단편을 포함한다. 또다른 바람직한 아미노 생물약제는 미국 특허 제 5,464,933 호에 진술된 펩타이드, 특히 다음 서열 구조를 갖는 T-20 펩타이드이다: Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe(서열 번호: 1).
아미드를 제조하는 반응은 산 또는 활성화된 산 유도체 "OA"를 아미드와 커플링시켜 펩타이드 결합을 형성하는 임의의 통상적인 방법을 이용하여 실시된다. 산과 아미드를 형성하는 아민과의 반응으로 펩타이드 결합을 형성하는 임의의 통상적인 방법이 콘쥬게이트 형성에 이용될 수 있다.
본 발명에 따라서, OA는 임의의 통상적인 산 활성화 이탈기일 수 있다. 바람직한 산 활성화 이탈기는 할로겐, 예컨대 염소, 브롬, N-선신이미딜옥시, 설포-N-석신이미딜옥시, 1-벤조트라이아졸릴옥시, 1-이미다졸릴, p-니트로페닐옥시, 2,3,4-트라이클로로페닐옥시, 펜타클로로페닐옥시, 펜타플루오로페닐옥시, N-프탈이미딜옥시, N-테트라하이드로프탈이미드, N-글루타르이미드, 1-하이드록시피페리딘, 5-클로로-8-하이드록시-퀴놀린, N-노르보르넨-2,3-다이카복스이미드 및 하이드록시-7-아자벤조트라이아졸이다.
X가 0인 화학식 I-A의 화합물은 화학식 I-A를 갖고, 하기 반응식 3에 의해 화학식 V1의 화합물과 화학식 V의 PAG 하이드록시 화합물을 반응시켜 제조된다:
화학식 I-A1
Figure 112005004136519-pct00027
[상기 식에서,
A, R, PAG, R1, R2, m 및 n은 상기와 같다]
화학식 V
Figure 112005004136519-pct00028
[상기 식에서,
R 및 PAG는 상기와 같다]
화학식 V1
Figure 112005004136519-pct00029
[상기 식에서,
R5는 가수분해성 에스터 보호기를 형성하고;
Y는 할라이드이고;
R1, R2, m 및 n은 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00030
[상기 식에서, R, PAG, m 및 n은 상기와 같고;
A1은 이것에 결합된 산소와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다]
화학식 VI의 화합물과 축합될 때 화학식 V의 화합물은 화학식 VIII의 화합물을 제조한다. 이 반응에서, 화학식 V의 화합물은 알칼리 금속 수소화물, 예컨대 수소화 나트륨의 존재하에 유기 용매중 이들 화합물을 환류함에 의해 화학식 VI의 화합물과 반응한다. 할라이드와 알콜의 축합에 사용되는 임의의 통상적인 방법은 이 반응을 실시하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 불활성 유기 용매로서 방향족 탄화수소 용매, 예컨대 벤젠 및 톨루엔을 이용하는 것이 바람직하다. 그러나, 임 의의 통상적인 불활성 유기 용매는 이 반응을 실시하는데 이용될 수 있다. 화학식 VI의 화합물에서, R3은 임의의 통상적인 산 가수분해성 에스터 보호기일 수 있다. 일반적으로, 이들 가수분해성 에스터 보호기는 저급 알킬 에스터 보호기를 포함한다. 화학식 VIII의 화합물은 통상적인 방법, 예컨대 염기 수성 매질중에서 알칼리 금속 수산화물과 같은 염기로의 염기성 가수분해에 의해 화학식 IX의 화합물로 가수분해된다. 이어서, 화학식 IX의 산은 예컨대 N-하이드록시 석신이미드와의 반응에 의해 N-하이드록시 석신이미딜기와 같은 활성화 이탈기의 사용을 통해서 그것의 활성화 형태, 즉 화학식 X의 화합물로 전환된다. 그러나, 전술된 것과 같은 임의의 통상적인 활성화 이탈기가 화학식 X의 화합물을 형성하는데 이용될 수 있다. 카복실기를 활성화 이탈기(예컨대, N-하이드록시 석신이미딜기)를 함유하는 활성화된 에스터로 전환하는 임의의 통상적인 방법이 화학식 X의 화합물의 제조에 이용될 수 있다.
상기 반응식에 따라 화학식 V의 화합물과 화학식 VI의 화합물과 축합에 의해 화학식 IX 및 X의 화합물을 포함하는 화학식 I-A1의 화합물의 제조에서, 상기 반응식은 추가의 다음 일반적인 방법으로 설명될 수 있다:
톨루엔 50 내지 100㎖중 화학식 V(분자량 1000 내지 40000)의 PEG 화합물 5g을 1 내지 3시간동안 환류에 의해 공비적으로 건조한 후 톨루엔 20 내지 30㎖의 제거하였다. 생성된 혼합물을 무수 테트라하이드로퓨란 20 내지 30㎖중에 용해시키고 아르곤 유동하에 환저 플라스크중에서 수소화 나트륨(5 내지 10배 몰 초과) 및 무수 테트라하이드로퓨란(20 내지 30㎖)에 적가하였다. 생성된 혼합물을 밤새도록 환류하였다. 하기의 화학식 VI의 할로 산 에스터를 화학식 VIII의 화합물을 제조에 사용하였다: 메틸 5-브로모발레레이트 또는 (에틸 5-요오도발레레이트; 또는 에틸 6-브로모헥사노에이트, 에틸-오메가-클로로 발레레이트; 또는 6-브로모 헥사노산 메틸 에스터 또는 메틸 7-브로모헵타노에이트; 또는 에틸 7-브로모헵타노에이트; 또는 메틸 8-브로모옥타노에이트; 또는 에틸 8-브로모옥타노에이트; 또는 메틸 10-브로모데카노에이트; 또는 에틸 ω-브로모운데카노테이트; 또는 메틸 11-브로모운데카노에이트, 또는 메틸 브로모미리스테이트; 또는 에틸 15-브로모펜타데카노에이트; 또는 16-브로모-헤카데칸카복실산-메틸에스터; 또는 17-브로모-헵타데칸카복실산-메틸에스터; 또는 메틸-3-클로로뷰티레이트, 메틸 3-브로모뷰티레이트; 또는 에틸 3-브로모뷰티레이트, 에틸 베타-브로모발레레이트; 또는 에틸 베타-브로모카프로에이트)(5 내지 10몰 과량)를 주사기에 의해 반응물에 첨가하고 반응물을 밤새도록 환류하였다. 그후 반응 용액을 회전 증발에 의해 축합하였다. 화학식 VIII의 화합물을 함유하는 잔류물을 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물에 첨가하여 침전시켰다. 침전된 생성물인 화학식 VIII의 화합물을 여거하고, 진공 건조하였다.
화학식 VIII의 PEG 산 에스터(4g)를 1N 수산화 나트륨 50 내지 100㎖중에 용해시키고 실온에서 밤새도록 교반하였다. 혼합물의 pH를 1 내지 6N 염산을 첨가함에 의해 2.5 내지 3.0으로 조정하고, 혼합물을 다이크롤로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 황산 나트륨상에서 건조하고, 여과하고, 농축하고, 다이에틸 에터로 침 전시켰다. 화학식 IX의 PEG 산을 진공하에서 여과 및 건조하여 수집하였다.
화학식 IX의 PEG 산(2g)을 무수 다이클로로메테인(10 내지 20㎖)중에 용해한 후 N-하이드록시석신이미드(1.05 내지 2.0배 몰 과량) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(1.05 내지 2.0배 몰 과량)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새도록 실온에서 아르곤하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하고, 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. 생성물을 밤새도록 진공 건조하여 화학식 I-A1의 활성화된 에스터인 화학식 X의 화합물을 제조하였다.
X가 NH인 화학식 I-A의 화합물은 화학식 I-A2를 갖고, 먼저 화학식 XII의 화합물과 화학식 VI의 화합물을 반응시켜 화학식 XIII의 화합물을 생성함으로써 하기 화학식 XII의 화합물로부터 제조한다:
화학식 I-A2
Figure 112005004136519-pct00031
[상기 식에서,
A, R, PAG, R1, R2, m 및 n은 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00032
[상기 식에서,
R 및 PAG는 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00033
[상기 식에서,
R, R1, R2, R5, PAG, m 및 n은 상기와 같다]
화학식 XIII의 화합물을 제조하는 반응은 화학식 XII의 아민과 화학식 VI의 화합물의 할라이드를 축합하여 실시된다. 아민과 할라이드를 축합하는 임의의 통상적인 방법을 이 반응을 실시하는데 사용할 수 있다. 화학식 XIII의 화합물은 하기 화학식 XIV의 중간물질을 경유하여 A가 이탈기인 화학식 I-A2의 화합물로 전환된다:
Figure 112005004136519-pct00034
상기 식에서,
R, PAG, R1, R2, m 및 n은 상기와 같다.
화학식 XIV의 화합물을 형성하는 이 전환은 본원에서 상기 기술된 바와 같은 통상적인 염기성 가수분해에 의해 실시된다. 화학식 XIV의 화합물은 화학식 IX의 화합물을 화학식 X의 화합물로 전환하는 것과 관련하여 기술된 바와 동일한 방법으로 A가 이것에 결합된 산소와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기인 화학식 I-A2 의 화합물로 전환된다.
일반적으로, 먼저 화학식 XII의 화합물과 화학식 VI의 화합물을 반응시켜 화학식 I-A2의 화합물을 제조함으로써 A가 이것에 결합된 산소와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기인 화학식 1-A2의 화합물을 제조하는 방법은 다음 일반적 반응 순서에 의해 추가로 설명될 수 있다:
단계 1
화학식 XII의 PEG 아민(1000 내지 40,000의 분자량) 5g을 무수 에탄올 25 내지 50㎖중에 용해시켰다. 그후, 메틸 5-브로모발레레이트 또는 (에틸 5-요오도발레레이트, 에틸 6-브로모헥사노에이트, 에틸-오메가-클로로 발레레이트, 6-브로모 헥산산 메틸 에스터, 메틸 7-브로모헵타노에이트, 에틸 7-브로모헵타노에이트, 메틸 8-브로모옥타노에이트, 에틸 8-브로모옥타노에이트, 메틸 10-브로모데카노에이트, 에틸 ω-브로모운데카노에이트, 메틸 11-브로모운데카노에이트, 메틸 브로모미리스테이트, 에틸 15-브로모펜타데카노에이트, 16-브로모-헥사데칸카복실산-메틸에스터, 17-브로모-헵타데칸카복실산-메틸에스터, 메틸-3-클로로뷰티레이트, 메틸 3-브로모뷰티레이트, 에틸 3-브로모뷰티레이트, 에틸 베타-브로모발레레이트, 에틸 베타-브로모카프로에이트)(5 내지 10몰 초과)일 수 있는 화학식 VI의 화합물을 PEG 용액에 첨가하였다. 생성 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 그후, 반응 용액을 회전 증발에 의해 축합하였다. 잔류물을 2-프로판올 및 에틸 에터(1:1)의 혼합물을 첨가하여 침전시켰다. 침전된 생성물을 여거하고 진공 건조하여 화학식 XIII의 화합물을 제조하였다.
단계 2
화학식 XIII의 PEG 산 에스터(4g)를 1N 수산화 나트륨 50 내지 100㎖중에 용해시키고 용액을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 1 내지 6N 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 2.5 내지 3.0으로 조정하고, 혼합물을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 황산 나트륨상에서 건조하고, 여과하고, 농축하고, 다이에틸 에터로 침전시켰다. 화학식 XIV의 생성물 PEG 산을 여과로 수집하고 진공 건조하였다.
화학식 XIV의 PEG 산(2g)을 무수 다이클로로메테인(10 내지 20㎖)중에 용해시킨 후 N-하이드록시석신이미드(1.05 내지 2.0배 몰 과량) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(1.05 내지 2.0배 몰 과량)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새도록 실온에서 아르곤 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하고, 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. 생성물을 밤새도록 진공 건조하여 화학식 I-A2(여기서, A는 이것에 결합된 산소와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기임)의 화합물을 제조하였다.
X가 0이고 화학식 I-B1을 갖는 화학식 I-B의 화합물은 화학식 V의 화합물과 화학식 XX의 화합물을 반응시켜 화학식 XXI의 화합물을 생성함으로써 제조한다:
화학식 I-B1
Figure 112005004136519-pct00035
[상기 식에서,
A, R, PAG, R3, R4, w 및 n은 상기와 같다]
화학식 XX
Figure 112005004136519-pct00036
[상기 식에서,
w, Y, R3, R4 및 R5는 상기와 같다]
화학식 XXI
Figure 112005004136519-pct00037
[상기 식에서,
w, R, PAG, R3, R4 및 R5는 상기와 같다]
화학식 XX의 화합물과 화학식 V의 화합물의 반응으로 화학식 XXI의 화합물을 제조하는 것은 화학식 V 및 화학식 VI의 화합물의 반응으로 화학식 VII의 화합물을 제조하는 것과 관련하여 기술된 바와 동일한 방법으로 실시한다. 다음으로, 화학식 XXI의 화합물은 화학식 XXII의 화합물을 형성하기 전에 본원에서 기술된 조건을 이용하여 염기성 가수분해를 실시한다:
화학식 XXII
Figure 112005004136519-pct00038
상기 식에서, R, PAG, R3 및 R4는 상기와 같다.
다음으로, 화학식 XXII의 화합물을 화학식 I-B1(여기서, A는 이것에 결합된 산소와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다)의 화합물로 전환시킨다. 이 전환은 화학식 IX의 화합물로부터 화학식 X의 화합물의 형성과 관련하여 기술된 바와 동일한 방법으로 실시한다.
X가 NH이고 화학식 I-B2를 갖는 화학식 I-B의 화합물은 화학식 XII의 화합물과 화학식 XX의 화합물을 반응시켜 제조한다. 이 반응은 화학식 XXV의 화합물을 제조한다:
화학식 I-B2
Figure 112005004136519-pct00039
[상기 식에서,
A, R, PAG, R3 및 R4 및 w는 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00040
[상기 식에서,
R, PAG, R3, R4 및 R5는 상기와 같다]
화학식 XX의 화합물과 화학식 XII의 화합물의 반응으로 화학식 XXV의 화합물을 제조하는 것은 화학식 XII의 화합물과 화학식 VI의 화합물의 반응으로 화학식 XIII의 화합물을 제조하는 것과 관련하여 기술된 바와 동일한 방법으로 실시한다. 다음으로, 화학식 XXV의 화합물은 화학식 XXVI의 화합물을 형성하기 전에 본원에서 기술된 조건을 이용하여 염기성 가수분해를 실시한다:
Figure 112005004136519-pct00041
상기 식에서,
R, PAG, R3, R4 및 w는 상기와 같다.
화학식 XX의 화합물 및 화학식 III의 화합물의 반응으로 화학식 I-B2의 화합물을 형성하는 것은 화학식 XX의 화합물을 화학식 VI의 화합물로 치환하는 것을 제외하고는 화학식 I-A2의 화합물과 관련하여 기술된 바와 동일한 방법으로 실시한다.
X가 0인 화학식 I-C의 화합물은 화학식 I-C1의 화합물이고, 화학식 XXXV의 화합물과 화학식 XXXVI의 화합물의 반응에 의해 제조된다:
화학식 I-C1
Figure 112005004136519-pct00042
[상기 식에서,
R, PAG1, A, v, y 및 k는 상기와 같다]
화학식 XXXV
Figure 112005004136519-pct00043
[상기 식에서,
Y, R5, y 및 v은 상기와 같다]
화학식 XXXVI
RO-PAG1-O-(CH2)k-OH
[상기 식에서,
R, PAG 및 k는 상기와 같다]
화학식 I-C1의 화합물의 형성은 다음 반응식 4에 의해 실시된다:
Figure 112005004136519-pct00044
상기 식에서,
A1, R, PAG1, n 및 v는 상기와 같다.
화학식 I-C1의 화합물의 형성에서는, 화학식 XXXVI의 화합물 2몰을 화학식 XXXV의 화합물 1몰과 반응시킨다. 이 반응은 본원에서 화학식 V의 화합물과 화학식 VI의 화합물의 반응과 관련하여 상기 기술된 바와 동일한 방법으로 실시한다. 이 방법으로, 화학식 XXXVII의 화합물을 제조한다. 화학식 XXXVII의 화합물을 화학식 IX의 화합물로의 화학식 VIII의 가수분해와 관련하여 기술된 바와 동일한 방 법으로 가수분해하여 화학식 XXXVIII의 화합물을 형성한다. 최종 단계에서, 화학식 XXXVIII의 화합물을 화학식 IX의 화합물의 형성과 관련하여 기술된 바와 동일한 방법으로 반응시켜 카복실기를 활성화 이탈기로 전환시킨다. 이 방법으로, 화학식 XXXVIII의 화합물을 화학식 1-C1(여기서, A는 이것에 결합된 산소와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다)의 화합물로 전환시킨다.
X가 NH인 화학식 I-C의 화합물, 즉 화학식 I-C2의 화합물은 상기 화학식 XXXV의 화합물과 화학식 XLI의 화합물의 반응에 의해 다음 반응식 5에 의해 제조된다:
화학식 I-C2
Figure 112005004136519-pct00045
[상기 식에서,
A, R, PAG1, v, w 및 y는 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00046
[상기 식에서,
R, PAG1 및 k는 상기와 같다]
Figure 112005004136519-pct00047
이 반응의 첫 단계에서, 화학식 XXXV의 화합물을 화학식 XLI의 화합물과 반응시켜 화학식 XLII의 화합물을 제조한다. 이 반응은 화학식 XII의 화합물과 화학식 VI의 화합물을 반응시켜 화학식 XIII의 화합물을 제조하는 것과 관련하여 기술된 바와 동일한 방법으로 실시한다. 다음 단계에서, 화학식 XLII의 화합물을 화학식 XIII의 화합물의 가수분해와 관련하여 기술된 바와 동일한 방법을 화학식 XLIII의 화합물로 가수분해한다. 그후, 화학식 XLII의 화합물을 본원에서 상기 기술된 바와 같이 반응시켜 카복실기를 활성화 이탈기로 전환시킨 후, A가 이것에 결합된 산소와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기인 화학식 I-C2의 화합물을 제조한 다. 이 반응은 화학식 XIV의 화합물을 화학식 I-A2의 화합물로 전환시키는 것과 관련하여 기술된 바와 동일한 방법으로 실시한다.
실시예 1
PEG의 알파-메톡시, 오메가-발레르산 석신이미딜 에스터의 제조
Figure 112005004136519-pct00048
톨루엔 50㎖중 R이 메틸이고 PAG가 10,000의 분자량을 갖는 PEG인 화학식 V의 화합물(5.0g, 0.5mmol)을 공비적으로 2시간동안 환류 건조한 후 톨루엔 40㎖를 제거하였다. 생성된 혼합물을 무수 테트라하이드로퓨란 30㎖중에 용해시키고, 이를 아르곤 유동하에 환저 플라스크내의 수소화 나트륨(0.12g, 5mmol) 및 무수 테트라하이드로퓨란(20㎖)에 적가하였다. 생성된 혼합물을 밤새도록 환류하였다. 에틸-5-브로모발레레이트(0.79㎖, 5mmol)를 주사기에 의해 반응물에 첨가하고, 반응물을 밤새도록 환류하였다. 그후, 반응 용액을 회전 증발에 의해 축합하였다. 잔류물을 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물을 첨가하여 침전시켰다. 침전된 생성물을 여거하고 진공 건조하였다. 수율: 4.5g의 표제 화합물(PEG가 1,000의 분자량을 가짐[m-Peg 발레르산 에틸 에스터]).
m-PEG 발레르산 에틸 에스터(4g)를 1N 수산화 나트륨 100㎖중에 용해시키고, 용액을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 6N 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 2.5로 조정하고, 혼합물을 다이클로로메테인(50㎖, 40㎖ 및 30㎖)으로 추출하였다. 유기 층을 황산 나트륨상에서 건조하고, 여과하고, 진공하고, 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물 m-PEG 발레르산(PEG가 1,000의 분자량을 가짐)을 여과에 의해 수집하고 진공 건조하였다. 수율: 3g. NMR (d6-DMSO): 1.50ppm(q, 2H, -CH2CH2-COOH); 2.21ppm(t, 2H,-CH2CH2COOH); 3.21ppm(s, -OCH3); 3.5ppm(s,-0-CH2CH2-O-).
m-PEG 발레르산(2g, 0.2mmol)을 무수 다이클로로메테인(10㎖)중에 용해시킨 후, N-하이드록시석신이미드(47mg, 0.41mmol) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(87mg, 0.42mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 아르곤하에서 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하고, 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. 생성물을 밤새도록 진공 건조하였다. 수율: 표제 화합물 1.6g. NMR(d6-DMSO): 1.58-1.67ppm(m, 4H, -CH2CH2CH2-COO-); 2.69ppm(t, 2H, -CH2CH2CH2-COO-); 2.81ppm(s, 4H, NHS); 3.21ppm(s, -OCH3); 3.5ppm(s, -O-CH2CH2-O-).
실시예 2
PEG의 알파-메톡시, 오메가-베타 뷰테인산 석신이미딜 에스터의 제조
Figure 112005004136519-pct00049
톨루엔 50㎖중 PAG가 10,000의 분자량을 갖는 PIG인 화학식 I의 메톡시 화합물(5.0g, 0.5mmol)을 2시간동안 공비적으로 환류 건조한 후, 톨루엔 40㎖를 제거하였다. 생성된 혼합물을 무수 테트라하이드로퓨란 30㎖중에 용해시키고, 아르곤 유 동하에서 환저 플라스크내의 수소화 나트륨(0.12g, 5mmol) 및 무수 테트라하이드로퓨란(20㎖)에 적가하였다. 생성된 혼합물을 밤새도록 환류하였다. 에틸-베타-브로모뷰티레이트(0.74㎖, 5mmol)을 주사기에 의해 반응물에 첨가하고, 반응물을 밤새도록 환류하였다. 그후, 반응 용액을 회전 증발에 의해 축합하였다. 잔류물을 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물을 첨가하여 메틸 PEG를 제조하였고, 이때 베타하이드레이트 에틸 에스터 PEG는 1,000의 분자량을 가졌다. 침전된 생성물을 여거하고 진공 건조하였다. 수율: 4.5g. NMR(d6-DMSO): 0.83ppm(t, 3H, -O-CH2-CH3); 1.05ppm(t, 3H, -CH3); 1.57ppm(m, 1H, CHCH2CO-); 3.21ppm(s, -OCH3); 3.5ppm(s, -O-CH2CH2-O-).
m-PEG 에틸-베타 뷰티레이트(3g)를 1N 수산화 나트륨 50㎖중에 용해시키고, 용액을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 6N 염산의 첨가에 의해 혼합물의 pH를 2.5로 조정하고, 혼합물을 다이클로로메테인(25㎖, 20㎖ 및 20㎖)으로 추출하였다. 유기 층을 황산 나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하고, 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물 m-PEG 발레르산을 여과로 수집하고 진공 건조하여 PEG가 41,000의 분자량을 갖는 메톡시 PEG 뷰테인산을 제조하였다. 수율: 2.4g. NMR(d6-DMSO): 0.88ppm(t, 3H, -CH3), 1.61ppm(m, 1H,-CHCH2CO-); 3.21ppm(s, -OCH3); 3.5ppm(s,-O-CH2CH2-O-)
m-PEG10k-베타-뷰테인산(1g, 0.1mmol)을 무수 다이클로로메테인(5㎖)중에 용해시킨 후, N-하이드록시석신이미드(24mg, 0.20mmol) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(43mg, 0.21mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 아르곤하에서 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하고, 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. 생성물을 밤새도록 진공 건조하여 PEG가 13000의 분자량을 갖는 표제 화합물 6.6g을 수득하였다.
실시예 3
PEG-AZT 콘쥬게이트의 제조
Figure 112005004136519-pct00050
실시예 1에서의 m-PEG10K 발레르산(0.2g, 0.02mmol)을 무수 다이메틸포름아미드(2㎖)중에 용해시킨 후, 3'-아지도-3'-데옥시-싸이미딘(AZT)(10.7mg, 0.04mmol), 1-하이드록시벤조트라이아졸(HOBT)(9.8mg, 0.04mmol), (4-다이메틸아미노)피리미딘(DMAP)(5.7mg, 0.042mmol) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC)(9.5mg, 0.046mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤하에서 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하고, 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. 생성물을 밤새도록 진공 건조하였다. 수율: 0.17g. NMR (d6-DMSO): 1.18ppm(m, 3H, H1); 1.51ppm(m, 2H, H9); 2.23ppm(m, 1H, H4); 2.37ppm(t, 2H, H8); 3.21ppm(s, H12); 3.5ppm(s, H11). 4.2ppm(m, 1H, H5); 6.12ppm(m, H3, H6); 7.45ppm(s, 1H, H2); 11.35ppm(br, 1H, H10).
실시예 4
mPEG10k-SVA를 사용한 T-20의 페길레이션(pegylation)
실시예 1에 따라서 제조된 PEG10kDa의 알파-메톡시, 오메가-발레르산 석신이미딜 에스터를 다음 서열을 갖는 T-20 20mg에 첨가하였다;
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe (서열 번호: 1)
상기 첨가는 T-20 1몰당 반응물질 2몰의 몰비로 완충액(50mM 보레이트 pH 8.0) 1.0㎖중에서 실시하였다. 용액을 실온에서 4시간동안 교반하였다. 페길레이트된 T-20을 이온 교환 크로마토그래피(QA)를 사용하여 반응 혼합물로부터 정제하였다. 20mM 트리스, pH 7.5중 100mM 내지 1M NaCl의 증가하는 염 농도를 갖는 선형 구배를 페길레이트된 T-20 및 비개질된 T-20을 분리하는데 사용하였다.
실시예 5
mPEG30K-β-SBA를 사용한 EPO의 페길레이션
1. 인간 EPO의 발효 및 정제
주석: 인간 EPO의 발효 및 정제 방법은 유럽 특허 공개공보 제 EP 1 064 951 A2 호(7 내지 9쪽 참조)에 기술된 것과 정확하게 동일하였다.
페길레이션 반응
EPOsf(7.66mg/㎖ EPOsf 저장액 653ℓ, 0.274mol) 5mg에, 30kDa 메톡시-PEG-vs-SBA(0.274μmol) 8.2mg을 함유하는 100mM 보레이트 완충액(pH8.0) 347ccℓ를 첨가하고 4℃에서 4시간동안 혼합하였다. 최종 단백질 농도는 5mg/㎖이고 단백질:PEG 반응물질 비는 1:1이었다. 4시간 후, 빙초산으로 pH 4.5로 조정하여 반응을 중단하고, 정제가 준비될 때까지 -20℃에서 저장하였다.
3. 정제
이전 단계로부터의 반응 혼합물을 10mM 나트륨 아세테이트, pH 4.5로 1:5 희석하고 18mm x 143mm 칼럼으로 충진된 SP-세파로스 FF(설포프로필 양이온 교환 수지)에 적용하였다. 칼럼을 동일한 완충액으로 미리 평형을 유지하였다. 칼럼 용리액을 길슨(Gilson) 자외선 모니터로 280nm에서 모니터링하고 키프(Kipp) 및 조넨(Zonen) 기록기로 기록하였다. 칼럼을 평행 완충액 100㎖ 또는 1베드(bed) 부피로 세척하여 과잉의 반응물질, 반응 부산물 및 올리고머성 PEG-EPO를 제거하였다. 그후, 100mM NaCl의 2베드 부피로 세척하여 다이-PEG-EPO를 제거하였다. 그후, 모노-PEG-EPO를 200mM NaCl로 용리하였다. 모노-PEG-EPO의 용리 동안에, 단백질 피크의 첫 50㎖를 버리고, 모노-PEG-EPO를 150㎖ 분획으로 수집하였다. 칼럼상에 남아 있는 비개질된 EPOsf를 750mM NaCl로 용리하였다. 모든 용리 완충액을 평형 완충액으로 제조하였다. 용리된 시료를 SDS-PAGE 및 MALDI-TOF로 분석하였다. 그후, 비개질된 EPOsf를 검출할 수 없는, 상기 150㎖ 분획으로부터 수득된 모노-PEG-EPO 풀을 약 5.0mg/㎖로 농축한 후, 저장 완충액, 10mM 칼륨 포스페이트, 100mM NaCl, pH 7.5로 디아필터(diafilter)하였다. 농축/디아필터레이션을 상온에서 5kDa 컷 오프(cut off) 밀리포어 펠리콘 XL 바이오맥스 50 막이 장착된 밀리포어 랩스케일(Millipore Labscale, 상표명) TFF 시스템으로 수행하였다. 농축된 모노-PEG-EPO를 멸균 여과하고 -20℃에서 동결 저장하였다.
실시예 6
mPEG10K-SVA를 사용한 EPO의 페길레이션
실시예 5에 사용된 EPOsf의 상이한 분취액을 10kDa 메톡시-PEG-SVA와 반응시켰다. 단백질:반응물질 비 1:2에서 반응을 수행하였고, 정제 기술은 실시예 5에 따랐다.
실시예 7
노르모사이탬 마우스 분석으로 결정된 페길레이트된 EPO의 생체내 활성
노르모사이탬 마우스의 생물학적 분석은 당해분야(문헌[Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)])에 잘 공지되어 있고 상기 문헌[Ph. Eur. BRP.]의 에리트로포이에틴의 모노그래피 방법이다. 시료를 BSA-PBS로 희석하였다. 7 내지 15주령의 정상적인 건강한 마우스에게 실시예 5 내지 6으로부터의 비페길레이트된 EPO(40ng/마우스) 또는 모노-페길레이트된 EPO(10 또는 40ng/마우스)를 함유하는 EPO-분획 0.5㎖를 피하투여하였다. 6일의 기간 동안, 꼬리 정맥에 구멍을 뚫어 혈액을 꺼내고, 혈액 1㎕가 0.15mol 아크리딘 오렌지색 염색 용액 1㎖중에 존재하도록 희석하였다. 염색 시간은 3 내지 10분이었다. 망상적혈구 수를 절대 수(분석한 30,000개의 혈액 세포당)로 환산하여 나타내었다. 제시된 데이터에 있어서, 각각의 그룹은 1일당 마우스 5마리로 구성되고 마우스는 1회만 출혈하였다. 결과는 비개질된 EPO에 대한 40ng의 투여량에 비해 마우스당 동일한 투여량(10ng)을 사용하여 현저하게 증가된 양의 망상적혈구 및 망상적혈구 수 최대값의 이동으로 알 수 있는 페길화 EPO 종의 우수한 활성 및 연장된 반감기를 보여준다.
실시예 8
메톡시 분지된 PEG-산 및 이의 석신이미딜 에스터의 제조
Figure 112005004136519-pct00051
PAG가 1,000의 분자량을 갖는 PEG인 화학식 VI의 화합물[분자량 10000의 m-Peg 아민](1.0g, 0.1mmol)을 40℃에서 무수 에탄올 5㎖중에 용해시킨 후, 에틸-3-브로모-2-(브로모메틸)프로피오네이트(7.6μL, 0.048mmol)를 첨가하고, 혼합물을 아르곤하에서 40℃에서 밤새도록 교반하였다. 반응 용액을 회전 증발에 의해 축합하였다. 잔류물을 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물을 첨가하여 침전시켰다. 침전된 생성물을 여거하고 진공 건조하였다. 수율: 0.89g.
분지된 m-Peg 산 에스터(0.89g)을 1N 수산화 나트륨 20㎖중에 용해시키고, 용액을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 혼합물의 pH를 6N 염산을 첨가하여 2.5로 조정하고, 혼합물을 다이클로로메테인(10㎖, 5㎖ 및 5㎖)으로 추출하였다. 유기 층을 황산 나트륨상에서 건조하고, 여과하고, 농축하고, 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물 m-Peg 발레르산을 여과로 수집하고 진공 건조하였다. 수율: 0.64g.
분지된 m-Peg 산(0.64g, 0.032mmol)을 무수 다이클로로메테인(5㎖)중에 용해시킨 후, N-하이드록시석신이미드(11mg, 0.098mmol) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(20mg, 0.099mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤하에 실온에서 밤새 도록 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하고, 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. 생성물을 밤새도록 진공 건조하였다. 수율: 0.58g.
실시예 9
분지된 PEG-산 및 이의 석신이미딜 에스터의 제조
PAG가 2,000의 분자량을 갖는 PEG인 화학식 V의 메톡시 PAG 화합물[분자량 10,000 m-Peg 아민](1.0g, 0.1mmol)을 40℃에서 무수 에탄올 5㎖중에 용해시킨 후, 에틸-3-브로모-2-(브로모메틸)프로피오네이트(7.6μL, 0.048mmol)를 첨가하고, 혼합물을 40℃에서 밤새도록 교반하였다. 반응 용액을 회전 증발에 의해 축합하였다. 잔류물을 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물을 첨가하여 침전시켰다. 침전된 생성물을 여거하고 진공 건조하였다. 수율: 0.89g.
분지된 m-Peg 산 에스터(0.89g)을 1N 수산화 나트륨 20㎖중에 용해시키고, 용액을 밤새도록 실온에서 교반하였다. 혼합물의 pH를 6N 염산을 첨가하여 2.5로 조정하고, 혼합물을 다이클로로메테인(10㎖, 5㎖ 및 5㎖)으로 추출하였다. 유기 층을 황산 나트륨상에서 건조하고, 여과하고, 농축하고, 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물 m-Peg 발레르산을 여과로 수집하고 진공 건조하였다. 수율: 0.64g.
분지된 m-Peg 산(0.64g, 0.032mmol)을 무수 다이클로로메테인(5㎖)중에 용해한 후, N-하이드록시석신이미드(11mg, 0.098mmol) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(20mg, 0.099mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 아르곤하에 실온에서 밤새도록 교 반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하고, 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. 생성물을 밤새도록 진공 건조하였다. 수율: 표제 화합물 0.58g.
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Claims (26)

  1. 하기 화학식 I-A의 화합물, 또는 A가 수소인 경우 이의 가수분해성 에스터:
    화학식 I-A
    Figure 112005004136665-pct00052
    [상기 식에서,
    R, R1 및 R2는 각각 수소 또는 저급 알킬이고;
    X는 -O- 또는 -NH-이고;
    PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
    X가 -NH-이거나 또는 X가 -O-인 경우, PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 2가 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 PEG이고, 이때 상기 잔기는 10,000 내지 40,000달톤의 분자량을 갖고;
    n은 0 또는 1의 정수이고;
    m은 4 내지 8의 정수이고;
    A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다]
  2. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 I-A1을 갖는 화합물:
    화학식 I-A1
    Figure 112005004136519-pct00053
    [상기 식에서,
    A, R, PAG, R1, R2, m 및 n은 제 1 항에서 정의된 바와 같다]
  3. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 I-A2를 갖는 화합물:
    화학식 I-A2
    Figure 112005004136519-pct00054
    [상기 식에서,
    A, R, PAG, R1, R2, m 및 n은 제 1 항에서 정의된 바와 같다]
  4. 하기 화학식 I-B의 화합물, 또는 A가 수소인 경우 이의 가수분해성 에스터:
    화학식 I-B
    Figure 112005004136665-pct00055
    [상기 식에서,
    R은 수소 또는 저급 알킬이고;
    X는 -O- 또는 -NH-이고;
    PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
    X가 -O-인 경우, PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 2가 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 PEG이고, 이때 상기 잔기는 10,000 내지 40,000달톤의 분자량을 갖고;
    w는 1 내지 3의 정수이고;
    R3 및 R4중 하나는 저급 알킬이고 나머지는 수소 또는 저급 알킬이고;
    A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다]
  5. 제 4 항에 있어서,
    하기 화학식 I-B1을 갖는 화합물:
    화학식 I-B1
    Figure 112005004136519-pct00056
    [상기 식에서,
    A, R, PAG, R3, R4 및 w는 제 4 항에 정의된 바와 같다]
  6. 하기 화학식 I-C의 화합물, 또는 A가 수소인 경우 이의 가수분해성 에스터:
    화학식 I-C
    Figure 112005004136519-pct00057
    [상기 식에서,
    R은 수소 또는 저급 알킬이고;
    X는 -O- 또는 -NH-이고;
    A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이고;
    PAG1은 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 약 500 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖고;
    y는 0 내지 3의 정수이고;
    v는 1 내지 3의 정수이고;
    k는 1 또는 2의 정수이다]
  7. 제 6 항에 있어서,
    하기 화학식 I-C1을 갖는 화합물:
    화학식 I-C1
    Figure 112005004136519-pct00058
    [상기 식에서,
    R, PAG1, A, v, y 및 k는 제 6 항에 정의된 바와 같다]
  8. 화학식 V의 화합물과 화학식 V1의 화합물을 축합하여 화학식 VIII의 에스터를 제조하는 단계,
    상기 에스터를 가수분해하여 화학식 IX의 유리 산을 형성하는 단계, 및
    커플링제의 존재하에 상기 유리 산과 활성화된 이탈기의 할라이드를 반응시켜 화학식 I-A의 활성화된 에스터를 제조하는 단계
    를 포함하는, 화학식 I-A의 활성화된 에스터의 제조방법:
    화학식 I-A
    Figure 112005004136665-pct00059
    [상기 식에서,
    R, R1 및 R2는 각각 수소 또는 저급 알킬이고;
    X는 -O- 또는 -NH-이고;
    PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
    X가 -NH-이거나 또는 X가 -O-인 경우, PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 2가 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 PEG이고, 이때 상기 잔기는 10,000 내지 40,000달톤의 분자량을 갖고;
    n은 0 또는 1의 정수이고;
    m은 4 내지 8의 정수이고;
    A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다]
    화학식 V
    Figure 112005004136665-pct00060
    [상기 식에서,
    R 및 PAG는 상기와 같고;
    V는 -OH 또는 -NH2이다]
    화학식 V1
    Figure 112005004136665-pct00061
    [상기 식에서,
    R5는 가수분해성 에스터 보호기를 형성하고;
    Y는 할라이드이고;
    R1, R2, m 및 n은 상기와 같다]
    화학식 VIII
    Figure 112005004136665-pct00062
    [상기 식에서,
    R, PAG, X, R1, R2, R5, m 및 n은 상기와 같다]
    화학식 IX
    Figure 112005004136665-pct00063
    [상기 식에서,
    R, PAG, X, R1, R2, m 및 n은 상기와 같다]
  9. 화학식 XX의 화합물과 화학식 V의 화합물을 축합하여 화학식 XXI의 화합물을 제조하는 단계,
    상기 에스터를 가수분해하여 화학식 XXII의 유리 산을 형성하는 단계, 및
    커플링제의 존재하에 상기 유리 산과 활성화된 이탈기의 할라이드를 반응시켜 화학식 I-B의 활성화된 에스터를 제조하는 단계
    를 포함하는, 화학식 I-B의 활성화된 에스터의 제조방법:
    화학식 I-B
    Figure 112005004136665-pct00064
    [상기 식에서,
    R은 수소 또는 저급 알킬이고;
    X는 -O- 또는 -NH-이고;
    PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
    X가 -NH-이거나 또는 X가 -O-인 경우, PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 2가 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 PEG이고, 이때 상기 잔기는 10,000 내지 40,000달톤의 분자량을 갖고;
    w는 1 내지 3의 정수이고;
    R3 및 R4중 하나는 저급 알킬이고 나머지는 수소 또는 저급 알킬이고;
    A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이다]
    화학식 XX
    Figure 112005004136665-pct00065
    [상기 식에서,
    w, R3 및 R4는 상기와 같고;
    Y는 할라이드이고;
    R5는 가수분해성 에스터 보호기를 형성한다]
    화학식 V
    Figure 112005004136665-pct00066
    [상기 식에서,
    R 및 PAG는 상기와 같고;
    V는 -OH 또는 -NH2이다]
    화학식 XXI
    Figure 112005004136665-pct00067
    [상기 식에서,
    w, R, PAG, X, R3, R4 및 R5는 상기와 같다]
    화학식 XXII
    Figure 112005004136665-pct00068
    [상기 식에서,
    w, R, PAG, X, R3, R4 및 R5는 상기와 같다]
  10. 화학식 XXXV의 화합물과 화학식 XXXVI의 화합물을 축합하여 화학식 XXVII의 에스터를 제조하는 단계,
    상기 에스터를 가수분해하여 화학식 XXVIII의 유리 산을 형성하는 단계, 및
    커플링제의 존재하에 상기 유리 산과 활성화된 이탈기의 할라이드를 반응시켜 화학식 I-C의 활성화된 에스터를 제조하는 단계
    를 포함하는, 화학식 I-C의 활성화된 에스터의 제조방법:
    화학식 I-C
    Figure 112005004136519-pct00069
    [상기 식에서,
    R은 수소 또는 저급 알킬이고;
    X는 -O- 또는 -NH-이고;
    A는 수소, 또는 이것에 결합된 산소 원자와 함께 에스터를 형성하는 활성화된 이탈기이고;
    PAG1은 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 약 500 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖고;
    y는 0 내지 3의 정수이고;
    v는 1 내지 3의 정수이고;
    k는 1 또는 2의 정수이다]
    화학식 XXXV
    Figure 112005004136519-pct00070
    [상기 식에서,
    y 및 v는 상기와 같고;
    Y는 할라이드이고;
    R5는 가수분해성 에스터 보호기를 형성한다]
    화학식 XXXVI
    Figure 112005004136519-pct00071
    [상기 식에서,
    R, PAG1 및 k는 상기와 같고;
    V는 -OH 또는 -NH2이다]
    화학식 XXVII
    Figure 112005004136519-pct00072
    [상기 식에서,
    R, PAG1, X, R5, k, v 및 y는 상기와 같다]
    화학식 XXVIII
    Figure 112005004136519-pct00073
    [상기 식에서,
    R, PAG1, X, k, v 및 y는 상기와 같다]
  11. 화학식 I-A'의 콘쥬게이트:
    화학식 I-A'
    Figure 112005004136665-pct00074
    [상기 식에서,
    P는 말단 하이드록시기를 갖는 생물약제의 잔기이고, 이때 상기 말단 하이드록시기는 제거되고;
    R, R1 및 R2는 각각 수소 또는 저급 알킬이고;
    X는 -O- 또는 -NH-이고;
    PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
    X가 -NH-이거나 또는 X가 -O-인 경우, PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 2가 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 PEG이고, 이때 상기 잔기는 10,000 내지 40,000달톤의 분자량을 갖고;
    n은 0 또는 1의 정수이고;
    m은 4 내지 8의 정수이다]
  12. 제 11 항에 있어서,
    X가 -O-인 콘쥬게이트.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    PAG가 10,000 내지 15,000달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 콘쥬게이트.
  14. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    R이 메틸인 콘쥬게이트.
  15. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    P가 AzT의 잔기인 콘쥬게이트.
  16. 하기 화학식 I-A"의 콘쥬게이트:
    하기 화학식 I-A"
    Figure 112005004136665-pct00075
    [상기 식에서,
    P는 말단 하이드록시기를 갖는 생물약제의 잔기이고, 이때 상기 말단 하이드록시기는 제거되고;
    R, R1 및 R2는 각각 수소 또는 저급 알킬이고;
    X는 -O- 또는 -NH-이고;
    PAG는 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 폴리알킬렌 글리콜의 2가 잔기이고, 이때 상기 잔기는 1,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖고;
    n은 0 또는 1의 정수이고;
    m은 4 내지 8의 정수이다]
  17. 제 16 항에 있어서,
    X가 -O-인 콘쥬게이트.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
    PAG가 10,000 내지 15,000달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 콘쥬게이트.
  19. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
    P는 서열(서열 번호 1)을 갖는 폴리펩타이드 T-20인 콘쥬게이트.
  20. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,
    R이 메틸인 화합물.
  21. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    PAG가 10,000 내지 40,000달톤의 분자량을 갖는, 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 2가 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 PEG인 화합물.
  22. 제 21 항에 있어서,
    PEG가 20,000 내지 35,000달톤의 분자량을 갖는 화합물.
  23. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    PAG1이 500 내지 15,000달톤의 분자량을 갖는, 말단 하이드록시기 둘다의 제거로부터 유도되는 2가 폴리에틸렌 글리콜 잔기인 PEG1인 화합물.
  24. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
    n이 0이고 m이 4인 화합물.
  25. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    w가 1인 화합물.
  26. 삭제
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