CN100337689C - 聚亚烷基二醇酸加合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类新的用于偶联生物药物例如多肽、糖、蛋白质和治疗活性小分子以得到这些药物的生物活性偶联物的活化聚亚烷基二醇酸及其活化酯试剂和制备这些偶联物的方法。

Description

聚亚烷基二醇酸加合物
本发明涉及聚亚烷基二醇酸及其与治疗活性生物药物连接来制备与这些生物药物的治疗活性聚亚烷基二醇偶联物。
亲水性聚亚烷基二醇线性聚合物(称作PAG)与生物药物如蛋白质和肽的化学连接是公知的且广泛应用在生物工程中。最常见的聚亚烷基二醇分子是聚乙二醇聚合物(称作PEG)。
作为PAG的生物工程应用的一个实例，某些PAG的活性衍生物已经连接于具有有益效果的生物药物例如蛋白质和酶。由于PAG可溶于有机溶剂，和生物药物如酶或蛋白质相连的PAG可以生成在有机溶剂中可溶且具有活性的偶联物。与未改性蛋白质相比，PAG与蛋白质的连接可以降低PAG-蛋白质偶联物的免疫原性和肾脏清除率。此外PAG与生物药物如蛋白质的连接还可以大大提高这些PAG偶联物在血液循环中的生存期。
在制备与生物药物如蛋白质的PAG复合物中，特定生物药物的药代动力学将支配着药物的功效和效力持续时间。从生物药物、特别是蛋白质和多肽的免疫原性、水不溶性和体内半衰期短的角度看，降低这些生物药物的清除速率变得非常重要，由此可以达到延长的作用。这可以通过避免或抑制肾小球过滤实现，而肾小球过滤受蛋白质电荷及其分子大小两者的影响(Brenner等，(1978)Am.J.Physiol，234，F455)。通过增加分子体积和掩蔽潜在的表位，治疗性生物药物如多肽和蛋白质利用聚合物的改性已经被证实可有效降低生物药物尤其是蛋白质的清除速率和抗原性。降低的蛋白水解、增高的水溶性、降低的肾清除率和对受体介导的清除的位阻是多种作用机理，通过这些机理，PAG聚合物与生物药物如多肽和蛋白质的骨架的连接有利于提高药物的药代动力学性质。所以Davis等的美国专利4,129,337公开了偶联PEG与蛋白质如酶和胰岛素以便制备低免疫原性产物同时保持这种生物药物的大部分的生物活性。
已经开发了大量用于修饰生物药物如蛋白质的活性PAG，特别是PEG试剂(参见例如Zalipsky等，和Harris等：聚(乙二醇)化学：生物工程和生物医学应用；(J.M.Harris编辑)Pleum Press：纽约，1992；21和22章)，其中的大部分试剂需要在PEG和生物药物之间形成连接基团。一些此类试剂在含水介质中不同程度的不稳定，会发生偶联反应。此外，偶联过程常常导致体外生物活性的丧失，这是由于多种因素造成的，其中最主要的因素是与蛋白活性位点的空间相互作用。因此新试剂的理想性质应该是在含水介质中不易降解并且可以用来完成蛋白质的位点特异性修饰。
按照本发明，我们发现了一类新的用于与生物药物例如多肽、糖、蛋白质和治疗活性小分子偶联的活化聚亚烷基二醇酸及其活性酯试剂。这些试剂是那些具有任一下式的化合物：
Figure C0381750800091
其中R、R1和R2独立地是氢或低级烷基；X是-O-或-NH-；PAG是通过脱除其两个末端羟基得到的聚亚烷基二醇的二价残基，该残基具有1,000-50,000道尔顿的分子量；n是0-1的整数；m是4-8的整数；并且A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团；或者当A是氢时是其可水解的酯；
Figure C0381750800092
其中R、PAG、X和A如上所述；w是1-3的整数；并且R3和R4之一为低级烷基且另一个为氢或低级烷基；和
Figure C0381750800101
其中R、A和X如上所述，PAG1是通过脱除其两个末端羟基得到的聚亚烷基二醇的二价残基，该基团具有约500-25,000道尔顿的分子量，y是0-3的整数且v是1-3的整数；k是1-2的整数。
优选的上面定义的式I-A的化合物是那些式I-A1的化合物
Figure C0381750800102
其中A、R、PAG、R1、R2、m和n定义如上。
上述式I-A的其他优选化合物是那些下式I-A2的化合物
Figure C0381750800103
其中A、R、PAG、R1、R2、m和n定义如上。
优选的上述式I-B的化合物是那些式I-B1的化合物
Figure C0381750800104
其中A、R、PAG、R3、R4和w定义如上。
优选的上述式I-C的化合物是那些是I-C1的化合物
Figure C0381750800105
其中R、PAG1、A、v、y和k定义如上。
优选地，A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团或者其可水解酯，更优选A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团。
在上述化合物中，A优选是氢。还优选其中A是活化离去基团的定义如上的化合物。在上述定义的化合物中，特别是式I-C1的化合物中，当A是优选的活泼离去基团时，优选A是N-羟基琥珀酰亚胺基。
在另一优选实施方式中，R是甲基。优选定义如上的化合物，其中PAG为PEG，即通过脱除其两个末端羟基得到的二价聚乙二醇基团。优选地，PEG具有10,000-40,000的分子量，更优选20,000-35,000。在上述其中PAG1是PEG1的式I-C化合物中，优选PEG1具有500-15,000的分子量。
在一更优选的实施方式中，n是0且m是4。优选w是1。
在另一优选的实施方式中，本发明涉及一种制备下式的活化酯的方法：
Figure C0381750800111
其中R、R1和R2独立地是氢或低级烷基；X是-O-或-NH-；PAG是通过脱除其两个末端羟基得到的聚亚烷基二醇的二价残基，该残基的分子量为1,000-50,000道尔顿；n是0-1的整数；m是4-8的整数；并且A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团，
该方法包括，将下式化合物：
                          RO-PAG-V
其中R和PAG定义如上，并且V是-OH或-NH2，
与下式的化合物缩合
Figure C0381750800121
其中R5形成可水解的酯保护基并且Y是卤化物，且R1、R2和n定义如上，生成下式的酯
Figure C0381750800122
其中R、PAG、X、R1、R2、R5、m和n定义如上。
水解该酯生成下式的游离酸：
Figure C0381750800123
其中R、PAG、X、R1、R2、m和n定义如上，
使所述游离酸与活化离去基团的卤化物在偶联剂的存在下反应生成所述的活化酯。
在另一优选实施方式中，本发明涉及一种制备下式的活化酯的方法：
Figure C0381750800124
其中R是氢或低级烷基；X是-O-或-NH-；PAG是通过脱除其两个末端羟基得到的聚亚烷基二醇的二价残基，该残基的分子量为1,000-50,000道尔顿；w是1-3的整数；并且R3和R4之一为低级烷基且另一个为氢或低级烷基；且A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团该方法包括，将下式化合物：
Figure C0381750800131
其中w、R3、R4定义如上，Y是卤化物且R5形成可水解的酯保护基，
与下式化合物缩合
                       RO-PAG-V    V
其中R和PAG定义如上，V是-OH或-NH2，
生成下式的酯
Figure C0381750800132
其中w、R、PAG、X、R3、R4和R5定义如上。
水解该酯生成下式的游离酸：
Figure C0381750800133
其中w、R、PAG、X、R3、R4和R5定义如上，
使所述游离酸与活化离去基团的卤化物在偶联剂的存在下反应生成所述的活化酯。
在另一优选实施方式中，本发明涉及一种制备下式的活化酯的方法：
其中R是氢或低级烷基，X是-O-或-NH-，A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团，PAG1是通过脱除其两个末端羟基得到的聚亚烷基二醇的二价残基，该残基的分子量为约500-约25,000道尔顿，y是0-3的整数且v是1-3的整数；并且k是1-2的整数
该方法包括，将下式化合物：
Figure C0381750800141
其中y和v定义如上，Y是卤化物且R5形成可水解的酯保护基，
与下式化合物缩合
                RO-PAG1-O-(CH2)k-V       XXXVI
其中R、PAG1和k定义如上，V是-OH或-NH2，
生成下式的酯
Figure C0381750800142
其中R、PAG1、X、R5、k、v和y定义如上，
水解该酯生成下式的游离酸：
Figure C0381750800143
其中R、PAG1、X、k、v和y定义如上，
使所述游离酸与活化离去基团的卤化物在偶联剂的存在下反应生成所述的活化酯。
在上述方法中，所述的离去基团优选是N-羟基琥珀酰亚胺基。
本发明的另一优选实施方式涉及一种下式的偶联物
Figure C0381750800151
其中，P是其中的末端羟基被脱除了的具有末端羟基的生物药物的残基，R、R1和R2独立地是氢或低级烷基；X是-O-或-NH-；PAG是通过脱除其两个末端羟基得到的聚亚烷基二醇的二价残基，该残基具有1,000-50,000道尔顿的分子量；n为0-1的整数；m为4-8的整数。
在上述偶联物中，P优选是糖苷或AzT的残基。优选地，X是-O-。优选地PAG是分子量为10,000-15,000的聚乙二醇残基。优选地，R是甲基。
本发明的另一优选实施方式涉及下式的偶联物
其中，P是其中的末端羟基被脱除了的具有末端羟基的生物药物的残基，R、R1和R2独立地是氢或低级烷基；X是-O-或-NH-；PAG是通过脱除其两个末端羟基得到的聚亚烷基二醇的二价残基，该残基具有1,000-50,000道尔顿的分子量；n为0-1的整数；m为4-8的整数。
在上述偶联物中，P优选是蛋白质或多肽的残基，更优选其中P是具有SEQ ID NO：1中序列的多肽T-20。优选X是-O-。优选PAG是分子量为10,000-15,000的聚乙二醇残基。
这些化合物是与生物药物如多肽、糖、蛋白质和糖苷形成偶联物的有效试剂。当它们形成与生物药物如蛋白质、肽和糖苷的偶联物时，式I-A、I-B和I-C的化合物可提高它们的药代动力学和药效学性质。这些临床有用的性质包括体内循环半衰期更长、降低清除率并提高效价、改变生物分布导致功效潜在增强、降低免疫原性、减小毒性、物理和热稳定性更好、对蛋白水解降解的防护，等等。式I-A、I-B和I-C的化合物的稳定性使其易于偶联于生物药物从而降低变性的危险性。
式I-A、I-B和I-C的试剂可以与含氨基或羟基的生物药物的氨基或羟基偶联生成偶联物，该偶联物基本保持其所衍生的生物药物的生物活性。通常出于偶联目的，优选所述的含氨基或羟基生物药物包含末端氨基或羟基。本发明的试剂可以通过这样的末端氨基或羟基偶联得到本发明的偶联物。本发明的试剂在含水介质中不容易降解，因此它们可容易地与生物药物在含水介质中反应形成可用于治疗目的进行给药的偶联物。
术语聚亚烷基二醇代表聚(低级亚烷基)二醇基团，其中该亚烷基是含有2-7个碳原子的直链或支链基团。术语“低级亚烷基”代表含有2-7个碳原子的直链或支链二价亚烷基基团，例如聚亚乙基、聚亚正丙基、聚亚异丙基、聚亚正丁基和聚亚异丁基以及由混和亚烷基二醇形成的聚亚烷基二醇，例如含有聚亚乙基和聚亚丙基基团的混合物的聚合物和含有聚亚异丙基、聚亚乙基和聚亚异丁基基团的混合物的聚合物。根据亚烷基的直链中所含的碳原子数，支链亚烷基二醇基团提供给聚合物链中含2至4个碳原子的低级烷基，因此，构成聚亚烷基二醇取代基的任何亚烷基部分的碳原子总数为2至7个。术语“低级烷基”包括含有1至7个碳原子、优选1至4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基等，特别优选甲基。
按照本发明的优选实施方式，式I-A、I-B和I-C的化合物中的PAG是通过脱除两个末端羟基形成的聚乙二醇基团。按照本发明，式I-A和I-B的化合物中PAG基团具有约10,000-约50,000的分子量，最优选约20,000-约40,000，并且尤其优选约25,000-约35,000。在式I-C的化合物中，一般优选两个PAG1基团的总的分子量为约10,000-约50,000且优选约20,000-约40,000。首选为约25,000-约35,000。
式I-A、I-B和I-C的试剂可以偶联于任何含有游离羟基和氨基的常规生物药物。缩合可以用游离酸或者利用活化酯来完成。
按照本发明，式I-A、I-B和I-C的化合物可以与生物药物的游离羟基或游离氨基反应生成酯或酰胺偶联物，该生物药物可以是蛋白质、肽或小的有机部分。
按照本发明，所述的酯或酰胺偶联物可以由本发明的试剂经过以下反应路线制备。在酯偶联物的形成中，所述的试剂与含末端羟基的生物药物反应，如下所示
Figure C0381750800171
其中P是其中的末端羟基被脱除的具有末端羟基的生物药物的残基。
在该反应路线中，B是不具有末端反应性酸或活化酸离去基团的化合物I-A、I-B和I-C的组成部分。在该反应进行时，任何通过反应性酸基与醇反应形成酯的常规方法均可以用来制备酯偶联物。其中优选的方法是在偶联剂的存在下例如二环己基碳二亚胺的存在下利用偶联催化剂使酸和醇偶联。可以使用任何常规偶联催化剂例如1-羟基苯并三唑和(4-二甲基氨基)吡啶或其混合物。通常该反应在惰性有机溶剂介质中进行。该反应可以采用该酸的游离或活化酯衍生物来完成。如果使用活化酸衍生物，则不需要使用偶联催化剂和/或偶联剂。在进行该反应时温度和压力并不关键并且该反应可以在室温下进行。然而，如果需要，可以采用高温或低温。按照本发明，P可以是任何具有末端羟基的生物药物的残基。为了形成上述酯，具有末端羟基的优选生物药物是核苷例如AZT。此外，P可以是任何具有末端羟基的小分子生物药物。
在形成酰胺时，使用下列反应中的化合物：
Figure C0381750800172
其中P1是具有末端氨基但该末端氨基已经被脱除的生物药物的残基。
在上述反应中，路线B如上所述。根据该反应，P1可以是任何具有末端氨基的生物药物例如蛋白质或肽或者具有末端氨基的小分子生物药物的残基。其中优选的蛋白质和肽包括干扰素-α、干扰素-β、共有干扰素、GCSF、GM-CSF、白介素类、集落刺激因子以及免疫球蛋白例如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD及其片段。另一优选的氨基生物药物是那些美国专利5,464,933中给出的肽，尤其是T-20肽，其具有如下结构：Tyr Thr Ser Leu Ile His SerLeu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu LeuGlu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe(SEQ ID：1)。
生成酰胺的反应可以利用任何偶联酸或活化酸衍生物“OA”与酰胺形成肽键的常规方法。任何通过酸和胺形成酰胺的反应生成肽键的常规方法均可以用于形成偶联物。
按照本发明，OA可以是任何常规的酸活化离去基团。其中优选的酸活化离去基团是卤素例如氯和溴，N-琥珀酰亚胺基氧基，磺基-N-琥珀酰亚胺基氧基，1-苯并三唑基氧基，1-咪唑基，对硝基苯氧基，2，3，4-三氯苯氧基，五氯苯氧基，五氟苯氧基，N-邻苯二甲酰亚胺基氧基，N-四氢邻苯二甲酰亚胺，N-戊二酰胺，1-羟基哌啶，5-氯-8-羟基-喹啉，N-降冰片烯-2，3-二碳二亚胺和羟基-7-氮杂苯并三唑。
其中X为0的式I-A的化合物是：
Figure C0381750800181
其中A、R、PAG、R1、R2、m和n如上所述，
该化合物通过将下式的PAG羟基化合物
                       RO-PAG-OH  V
其中R和PAG如上定义
与下式的化合物
Figure C0381750800182
其中R5形成可水解的酯保护基且Y是卤化物，并且R1、R2、m和n如上所述，
经下列反应路线反应进行制备
其中R、PAG、m和n如上所定义且A1是当与其所连的氧原子合在一起时形成酯的活化离去基团。
式V的化合物当与式VI的化合物缩合时可生成式VIII的化合物。在该反应中，式V的化合物与式VI的化合物通过在有机溶剂中在碱金属氢化物例如氢化钠的存在下回流进行反应。任何醇和卤化物缩合中采用的常规方法均可以用于本反应。通常优选用芳烃溶剂例如苯和甲苯作为惰性有机溶剂。然而，任何常规惰性有机溶剂均可以用于实施该反应。在式VI的化合物中，R3可以是任何常规的酸可水解酯保护基。通常，那些可水解的酯保护基包括低级烷基酯保护基。式VIII的化合物通过常规方式水解为式IX的化合物，例如用碱例如碱金属氢氧化物在含水介质中碱性水解。式IX的酸此后例如通过与N-羟基琥珀酰亚胺反应经活化离去基团如N-羟基琥珀酰亚胺基转化为其活化形式，式X的化合物。然而，任何常规活化离去基团例如在此提及的那些离去基团均可以用在式X化合物的形成中。使羧酸转化为含活化离去基团例如N-羟基琥珀酰亚胺基的活化酯的任何常规方法均可以用来制备式X的化合物。
在通过将式V与式VI的化合物按照上述反应路线缩合来制备式I-A-1化合物(包括式IX和X的化合物)时，该反应路线可以以如下一般方式进一步说明：
将5g式V的PEG化合物(分子量1000-4000)在50-100mL的甲苯中通过回流1-3小时共沸干燥，随后除去20-30mL的甲苯。将所得混合物溶于20-30mL无水四氢呋喃，并在氩气流下滴加至在圆底烧瓶中的氢化钠(5-10倍摩尔过量)和无水四氢呋喃(20～30mL)中。将所得混合物回流过夜。用下列的式VI的卤代酸酯来制备式VIII的化合物：5-溴戊酸甲酯或(5-碘代戊酸乙酯；或，6-溴己酸乙酯，ω-氯代戊酸乙酯；或6-溴代己酸甲酯；或7-溴代庚酸甲酯；或7-溴代庚酸乙酯；或8-溴代辛酸甲酯；或8-溴代辛酸乙酯；或10-溴代癸酸乙酯；或10-溴代癸酸甲酯；或ω-溴代十一烷酸乙酯；或11-溴代十一烷酸甲酯；或溴代肉豆蔻酸甲酯；或15-溴代十五烷酸乙酯；或16-溴代-十六烷酸甲酯；或17-溴代十七烷酸甲酯；或3-氯代丁酸甲酯，3-溴代丁酸甲酯；或3-溴代丁酸乙酯，β-溴代戊酸乙酯；或β-溴代己酸乙酯)(5-10摩尔过量)，将其经注射器加入到反应中且使该反应回流过夜。此后通过旋转蒸发浓缩该反应溶液。通过加入2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀出含式VIII化合物的残余物。过滤沉淀的产物(式VIII的化合物)并真空干燥。
将式VIII的PEG酸酯(4g)溶于50-100mL的1N氢氧化钠中并将该溶液在室温下搅拌过夜。加入1至6N盐酸调整混合物的pH至2.5-3.0，并且用二氯甲烷萃取该混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并且在乙醚中沉淀。通过过滤收集式IX的PEG酸并在真空下干燥。
将式IX的PEG酸(2g)溶于无水二氯甲烷(10-20mL)，此后加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.05-2.0倍摩尔过量)和二环己基碳二亚胺(1.05-2.0倍摩尔过量)。氩气和室温下将该混合物搅拌过夜。过滤该反应混合物，浓缩，用2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。真空干燥该产物得到式Ia1的活化酯(式X的化合物)。
其中X为NH的式I-A的化合物具有下式：
Figure C0381750800211
其中A、R、PAG、R1、R2、m和n如上所述，
该化合物由下式的化合物制备：
                      RO-PAG-NH2   XII
首先通过式XII化合物与式VI化合物的反应生成下式的化合物：
Figure C0381750800212
其中R、R1、R2、R5、PAG、m和n如上所述。
制备式XIII化合物的反应通过式XII的胺与式VI化合物的卤化物缩合来完成。任何用于缩合胺和卤化物的常规方法均可以用来进行该反应。式XIII的化合物经过下式的中间体转化为其中A为离去基团的式I-A2的化合物
Figure C0381750800213
其中R、PAG、R1、R2、m和n如上所述。
形成式XIV化合物的转化反应通过本文所述的常规碱性水解来实现。按照与将式IX化合物转化为式X化合物相同的方式，将式XIV化合物转化为式1A2的化合物，其中A是当与其所连的氧原子合在一起时形成酯的活化离去基团。
通常，制备其中A是当与其所连的氧原子合在一起时形成酯的活化离去基团的式I-A2化合物的方法是首先将式XII的化合物与式VI的化合物反应生成式I-A2的化合物，该方法可以通过以下通用反应流程进一步说明：
第一步
将5g式XII的PEG胺(分子量为1000-40000)溶于25-50mL的绝对乙醇中。随后，将式VI的化合物加入到PEG溶液内，所述式VI的化合物可以为5-溴代戊酸甲酯或(5-碘代戊酸乙酯；或，6-溴代己酸乙酯，ω-氯代戊酸乙酯；或6-溴代己酸甲酯；或7-溴代庚酸甲酯；或7-溴代庚酸乙酯；或8-溴代辛酸甲酯；或8-溴代辛酸乙酯；或10-溴代癸酸乙酯；或10-溴代癸酸甲酯；或ω-溴代十一烷酸乙酯；或11-溴代十一烷酸甲酯；或溴代肉豆蔻酸甲酯；或15-溴代十五烷酸乙酯；或16-溴代-十六烷酸甲酯；或17-溴代十七烷酸甲酯；或3-氯代丁酸甲酯，3-溴代丁酸甲酯；或3-溴代丁酸乙酯，β-溴代戊酸乙酯；或β-溴代己酸乙酯)(5-10倍摩尔过量)。所得混合物在室温下搅拌过夜。此后通过旋转蒸发浓缩该反应溶液。通过加入2-丙醇和乙醚(1∶1)的化合物沉淀残余物。过滤沉淀的产物并真空干燥得到式XIII的化合物。
第二步
将式XIII的PEG酸酯(4g)溶于50-100mL的1N氢氧化钠中并将该溶液在室温下搅拌过夜。加入1至6N盐酸调整混合物的pH至2.5-3.0，并且用二氯甲烷萃取该混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并且在乙醚中沉淀。通过过滤收集式XIV的PEG酸并在真空下干燥。
将式XIV的PEG酸(2g)溶于无水二氯甲烷(10-20mL)，此后加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.05-2.0倍摩尔过量)和二环己基碳二亚胺(1.05-2.0倍摩尔过量)。氩气和室温下将该混合物搅拌过夜。过滤该反应混合物，浓缩，用2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。真空干燥该产物得到式I-A2的化合物，其中A是当与其所连的氧原子合在一起时形成酯的活化离去基团。
其中X是0的式I-B化合物具有下式I-B1
Figure C0381750800231
其中A、R、PAG、R3、R4、w和n如上所述，
该化合物通过将式V的化合物与下式的化合物反应来制备
Figure C0381750800232
其中w、Y、R3、R4和R5如上所述，
反应生成下式的化合物：
Figure C0381750800233
其中w，R、PAG、R3，R4和R5如上所述。
式XX化合物与式V化合物的生成式XXI化合物的反应采用与本文所述的式V和VI化合物反应生成式VII化合物的相同的方式进行。随后将式XXI化合物在本文所述的条件下进行碱性水解后生成下式的化合物
Figure C0381750800234
其中R、PAG、R3和R4如上所述。
然后将式XXII的化合物转化为其中A表示当与其所连的氧原子合在一起时形成酯的活化离去基团的式I-B1化合物。该转化反应按照与本文中所述由式IX化合物形成式X化合物的相同方式进行。
其中X为NH的式I-B化合物具有下式：
Figure C0381750800241
其中A、R、PAG、R3、R4和w如上所述，
该化合物通过将式XII化合物与式XX化合物反应来制备。该反应制得下式的化合物：
Figure C0381750800242
其中R、PAG、R3、R4和R5如上所述。
式XX化合物与式XII化合物的生成式XXV化合物的反应采用与本文中关于式XII化合物与式VI化合物反应制备式XIII化合物的相同的方式进行。随后将式XXV化合物在本文所述的条件下进行碱性水解生成下式的化合物
Figure C0381750800243
其中R、PAG、R3、R4和w如上所述。
通过式XX化合物和式III化合物的反应形成式I-B2化合物采用与本文所述的关于式I-A2化合物的相同的方式来进行，但除了用式XX的化合物代替式VI的化合物之外。
其中X为0的式I-C的化合物为下式的化合物
Figure C0381750800251
其中R、PAG1、A、v、y和k定义如上，
该化合物通过将下式的化合物
Figure C0381750800252
其中Y、R5、y和v定义如上
与下式的化合物反应来制备：
                RO-PAG1-O-(CH2)K-OH    XXXVI
其中R、PAG和k如上所述。
式I-C1的化合物的形成是经下列反应路线进行的：
Figure C0381750800261
其中A1、R、PAG1、n和v如上所述。
在化合物式I-C1的形成中，将2摩尔的式XXXVI化合物与1摩尔的式XXXV化合物反应。该反应在本文中关于式V和式VI化合物的反应所描述的相同条件下进行。以该方式制得式XXXVII的化合物。式XXXVII的化合物以与本文中关于将式VIII化合物水解为式IX化合物所描述的相同方式水解得到式XXXVIII的化合物。在最后的步骤中，将式XXXVIII的化合物以与本文中关于形成式IX化合物所描述的相同方式反应，使羧基转化为活化离去基团。通过这样的方式使式XXXVIII的化合物转化为其中A表示当与其所连的氧原子合在一起时形成酯的活化离去基团的式I-C1的化合物。
其中X为NH的式I-C化合物，即下式的化合物
Figure C0381750800271
其中A、R、PAG1、v、w和y如上所述，
该化合物通过将上式XXXV的化合物与下式化合物按照下列反应路线反应制成
                  RO-PAG1-O-(CH2)K-NH2   XLI
其中R、PAG1和k如上所述。
Figure C0381750800272
在该反应的第一步中，式XXXV化合物与式XLI化合物反应生成式XLII的化合物。该反应通过与本文所述的式XII化合物与式VI化合物反应制备式XIII化合物的相同方式进行。下一步骤中，将式XLII化合物按照与本文中关于水解式XIII化合物所描述的相同方式水解为式XLIII的化合物。随后将XLII的化合物进行反应使羧基转化为以上所述的活化离去基团，由此得到式I-C2的化合物，其中A表示当与其所连的氧原子合在一起时形成酯的活化离去基团。该反应按照与本文中关于将式XIV化合物转化为式I-A2化合物所描述的相同方式进行。
                           实施例
实施例1
PEG的α-甲氧基，ω-戊酸琥珀酰亚胺酯的制备
Figure C0381750800281
将其中R为甲基、PAG为分子量是10000的PEG的式V化合物(5.0g，0.5mmol)在50mL甲苯中通过回流2小时共沸干燥，此后除去40mL的甲苯。将所得混合物溶于30mL的无水四氢呋喃中，并在氩气流下滴加至存在于圆底烧瓶中的氢化钠(0.12g，5mmoL)和无水四氢呋喃(20mL)中。将所得混合物回流过夜。将5-溴代戊酸乙酯(0.79mL，5mmol)经注射器加入到该反应中且使该反应回流过夜。此后通过旋转蒸发浓缩该反应溶液。通过加入2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀出残余物。过滤所沉淀的产物并真空干燥。收率：4.5g的标题化合物，其中PEG的分子量为1,000(m-Peg戊酸乙酯)。
将m-PEG戊酸乙酯(4g)溶于100mL的1N氢氧化钠中，并将该溶液于室温下搅拌过夜。加入6N盐酸将该混合物的pH调节至2.5，并且用二氯甲烷(50mL，40mL和30mL)萃取该混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并且在乙醚中沉淀。通过过滤收集其中PEG的分子量为1,000的产物m-PEG戊酸并在真空下干燥。收率：3g。NMR(d6-DMSO)：1.50ppm(q，2H，-CH2CH2-COOH)；2.21ppm(t，2H，-CH2CH2-COOH)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)。
将m-PEG戊酸(2g，0.2mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL)，此后加入N-羟基琥珀酰亚胺(47mg，0.41mmol)和二环己基碳二亚胺(87mg，0.42mmol)。氩气和室温下将该混合物搅拌过夜。过滤该反应混合物，浓缩，并用2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。产物在真空中干燥过夜。收率：1.6g的标题化合物。NMR(d6-DMSO)：1.58-1.67ppm(m，4H，-CH2CH2CH2-COO-)；2.69ppm(t，2H，-CH2CH2CH2-COO-)；2.81ppm(s，4H，NHS)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)。
实施例2
PEG的α-甲氧基，ω-β丁酸琥珀酰亚胺酯的制备
Figure C0381750800291
将其中PAG为分子量是10000的PIG的式I的甲氧基化合物(5.0g，0.5mmol)在50mL甲苯中通过回流2小时共沸干燥，此后除去40mL的甲苯。将所得混合物溶于30mL的无水四氢呋喃中，并在氩气流下滴加至存在于圆底烧瓶中的氢化钠(0.12g，5mmoL)和无水四氢呋喃(20mL)中。将所得混合物回流过夜。将β-溴代丁酸乙酯(0.74mL，5mmol)经注射器加入到该反应中使该反应回流过夜。此后通过旋转蒸发浓缩该反应溶液。通过加入2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀出残余物，生成甲基PEG，其中β丁酸乙酯PEG的分子量为1,000。过滤所沉淀的产物并真空干燥。收率：4.5g。NMR(d6-DMSO)：0.83ppm(t，3H，-O-CH2-CH3)；1.05ppm(t，3H，-CH3)；1.57ppm(m，1H，-CHCH2CO-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)。
将m-PEG β丁酸乙酯(3g)溶于50mL的1N氢氧化钠中，且使该溶液在室温下搅拌过夜。加入6N盐酸将该混合物的pH调节至2.5，并且用二氯甲烷(25mL，20mL和20mL)萃取该混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并沉淀在乙醚中。通过过滤收集产物m-PEG戊酸并在真空下干燥。收率：2.4g。NMR(d6-DMSO)：0.88ppm(t，3H，-CH3)；1.61ppm(m，1H，-CHCH2CO-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)，生成甲氧基PEG丁酸，其中PEG的分子量为41,000。
将m-PEG10k-β丁酸(1g，0.1mmol)溶于无水二氯甲烷(5mL)，此后加入N-羟基琥珀酰亚胺(24mg，0.20mmol)和二环己基碳二亚胺(43mg，0.21mmol)。氩气和室温下将该混合物搅拌过夜。过滤该反应混合物，浓缩，并用2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。产物在真空中干燥过夜，得到6.6g的标题化合物，其中PEG的分子量为13000。
实施例3
PEG-AZT偶联物的制备
Figure C0381750800301
将实施例1中的m-PEG10K戊酸(0.2g，0.02mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(2mL)中，此后加入3’-叠氮基-3’-脱氧-胸苷(AZT)(10.7mg，0.04mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT)(9.8mg，0.04mmol)、(4-二甲氨基)吡啶(DMAP)(5.7mg，0.042mmol)和二环己基碳二亚胺(DCC)(9.5mg，0.046mmol)。氩气和室温下将该混合物搅拌过夜。过滤该反应混合物，浓缩，并用2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。产物在真空中干燥过夜。收率：0.17g。NMR(d6-DMSO)：1.18ppm(m，3H，H1)；1.51ppm(m，2H，H9)；2.23ppm(m，1H，H4)；2.37ppm(t，2H，H8)；3.21ppm(s，H12)；3.5ppm(s，H11)，4.2ppm(m，1H，H5)；6.12ppm(m，H3，H6)；7.45ppm(s，1H，H2)；11.35ppm(br，1H，H10)。
实施例4
通过mPEG10k-SVA对T-20的聚乙二醇化
将实施例1中制备的PEG 10kDa的α-甲氧基，ω-戊酸琥珀酰亚胺酯加入到20mg具有下述序列的T-20中：
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu LysAsn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn TrpPhe(SEQ ID：1)
该加入在1.0ml缓冲液(50mM硼酸盐pH8.0)中以2摩尔试剂/1摩尔T-20的摩尔比进行。该溶液在室温下搅拌4小时。使用离子交换色谱(QA)从反应混合物中纯化出聚乙二醇化的T-20。采用在20mM Tris，pH7.5中的盐浓度由100mM递增至1M NaCl的线性梯度分离聚乙二醇化的T-20和未经修饰的T-20。
实施例5
通过mPEG30K-β-SBA对EPO的聚乙二醇化
1.人EPO的发酵和纯化
注：人EPO的发酵和纯化方法与欧洲专利申请(EP 1 064 951 A2)中所述的方法完全相同。(参见第7-9页)
2.聚乙二醇化反应
向5mg的EPOsf(653μl的7.66mg/ml EPOsf储备液，0.274μmol)中加入347μl含有8.2mg的30kDa甲氧基-PEG- -SBA(0.274μmol)的100mM硼酸盐缓冲液，pH8.0，并在4℃下混和4小时。最终的蛋白质浓度为5mg/ml且蛋白质：PEG试剂的比例为1∶1。4小时后，用冰醋酸调节pH至4.5以中止该反应，并且储存于-20℃下，直至准备纯化。
3.纯化
将上步的反应混合物用10mM醋酸钠，pH4.5按1∶5稀释，并加样于装在18mm×143mm柱内的100ml SP-Sepharose FF(磺基丙基阳离子交换树脂)。该柱预先用同样的缓冲液平衡。用Gilson UV监测器在280nm下监测柱洗脱液并用Kipp和Zonen读数仪记录。柱子用100ml或1柱床体积的平衡缓冲液洗涤以除去过量的试剂、反应副产物和低聚PEG-EPO。此后用2柱床体积的100mM NaCl洗涤以除去二-PEG-EPO。此后用200mM NaCl洗脱出单-PEG-EPO。在单-PEG-EPO的洗脱期间，弃去首个50ml的蛋白质峰并按150ml的级分收集单-PEG-EPO。残留在柱子上的未经修饰的EPOsf用750mM NaCl洗脱。所有洗脱缓冲液均在平衡缓冲液中制备。洗脱的样本通过SDS-PAGE和MAIDI-TOF分析。然后将由150ml级分所得且未监测到未经修饰的EPOsf的单-PEG-EPO合并液浓缩至～5.0mg/ml，并渗滤到储备缓冲液，10mM磷酸钾，100mM NaCl，pH7.5中。室温下通过Millipore LabscaleTMTFF系统进行浓缩/渗滤，该系统带有5kDa截止Millipore Pellicon XL Biomax 50膜。将浓缩的单-PEG-EPO无菌过滤并冷冻储存在-20℃下。
实施例6
通过mPEG10K-SVA对EPO的聚乙二醇化
将不同等份试样的实施例5中所用的EPOsf与10kDa甲氧基-PEG-SVA反应。该反应以蛋白质：试剂比为1∶2进行，纯化技术按照实施例5所述。
实施例7
通过正常红细胞性贫血(normocythaemic)小鼠测定的聚乙二醇化EPO的体内活性
正常红细胞性贫血小鼠生物学测定是本领域中公知的(Pharm.EuropaSpec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))，并且该方法可参见Ph.Eur.BRP的红细胞生成素的专题论文。将样本用BSA-PBS稀释。对7-15周龄的正常健康小鼠皮下给予0.5ml的含得自实施例5或6的未聚乙二醇化EPO(40ng/小鼠)或单聚乙二醇化EPO(10或40ng/小鼠)的EPO-级分。在6天期间，通过尾静脉穿刺取血并稀释，由此使1μl血液存在于1ml的0.15mol吖啶橙染色溶液中。染色时间为3至10分钟。以绝对数字(每30,000个所分析的血细胞)给出网状细胞计数。对于所给出的数据，每组每天由5只小鼠组成，并且小鼠仅取血1次。结果证明，聚乙二醇化的EPO的活性增强且半衰期延长，这一点通过与40ng剂量未经修饰的EPO相比、每只小鼠使用相同剂量(10ng)所得的网状细胞的数量明显增加以及网状细胞计数最大值的迁移得以表明。
实施例8
甲氧基支链PEG-酸及其琥珀酰亚胺基酯的制备
Figure C0381750800331
40℃下将其中PAG为分子量是1,000的PEG的式VI化合物[分子量为10000的m-Peg胺](1.0g，0.1mmol)溶于5mL的无水乙醇中，此后加入3-溴-2-(溴甲基)丙酸乙酯(7.6μl，0.048mmol)，并将该混合物在40℃和氩气下搅拌过夜。反应溶液通过旋转蒸发浓缩。残余物通过加入2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。过滤出所沉淀的产物并真空干燥。收率：0.89g。
将该支链m-Peg酸酯(0.89g)溶于20mL的1N氢氧化钠中，并将该溶液在室温下搅拌过夜。该混合物的pH通过加入6N盐酸调至2.5，并且用二氯甲烷(10mL、5mL和5mL)萃取该混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并在乙醚中沉淀。通过过滤收集产物m-Peg戊酸并在真空下干燥。收率：0.64g。
将支链m-Peg酸(0.64g，0.032mmol)溶于无水二氯甲烷(5mL)中，随后加入N-羟基琥珀酰亚胺(11mg，0.098mmol)和二环己基碳二亚胺(20mg，0.099mmol)。该混合物在室温下于氩气中搅拌过夜。过滤反应混合物，浓缩，并用2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。产物在真空中干燥过夜。收率：0.58g。
实施例9
支链PEG-酸及其琥珀酰亚胺酯的制备
40℃下将其中PAG为分子量是2,000的PEG的式V的甲氧基PAG化合物[分子量为10000的m-Peg胺](1.0g，0.1mmol)溶于50mL的无水乙醇中，此后加入3-溴-2-(溴甲基)丙酸乙酯(7.6μl，0.048mmol)，并将该混合物在40℃和氩气下搅拌过夜。通过旋转蒸发浓缩反应溶液。残余物通过加入2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。过滤所沉淀的产物并真空干燥。收率：0.89g。
将该支链m-Peg酸酯(0.89g)溶于20mL的1N氢氧化钠中，并将该溶液在室温下搅拌过夜。加入6N盐酸将该混合物的pH调节至2.5，并且用二氯甲烷(10mL、5mL和5mL)萃取该混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并在乙醚中沉淀。通过过滤收集产物m-Peg戊酸并在真空下干燥。收率：0.64g。
将该支链m-Peg酸(0.64g，0.032mmol)溶于无水二氯甲烷(5mL)中，随后加入N-羟基琥珀酰亚胺(11mg，0.098mmol)和二环己基碳二亚胺(20mg，0.099mmol)。将该混合物在氩气和室温下搅拌过夜。过滤该反应混合物，浓缩，并用2-丙醇和乙醚(1∶1)的混合物沉淀。产物在真空中干燥过夜。收率：0.58g的标题化合物。
                                 序列表
<110>F.Hoffmann-La Roche AG
<120>聚亚烷基二醇酸加合物
<130>20917 US
<140>US 60/398,137
<141>2002-07-24
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工多肽/蛋白
<300>
<302>HIV传播的合成肽抑制剂
<309>
<310>5465933
<311>1993-06-07
<312>1995-11-07
<313>(1)..(36)
<400>1
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe
        35

Claims (15)

1.下式化合物或当A是氢时其可水解的酯
其中R是C1-7烷基，R1和R2独立地是氢；X是-O-，PAG是PEG，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基具有10,000-40,000道尔顿的分子量；n是0；m是4；并且A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团。
2.下式的化合物或当A是氢时其可水解的酯
其中R是C1-7烷基；X是-O-，PAG是PEG，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基具有10,000-40,000道尔顿的分子量；w是1；并且R3为C1-7烷基且R4为氢；并且A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团。
3.权利要求1或2的化合物，其中PEG的分子量为20,000至35,000道尔顿。
4.下式的化合物或当A是氢时其可水解的酯
Figure C038175080002C3
其中R是C1-7烷基；X是-NH-；A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团，PAG1是PEG1，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基具有约500-25,000道尔顿的分子量，y是1且v是1；k是2。
5.权利要求1、2或4任一项的化合物，其中R是甲基。
6.权利要求4的化合物，其中PAG1是PEG1，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基具有500-15,000道尔顿的分子量。
7.一种制备下式的活化酯的方法：
Figure C038175080003C1
其中R是C1-7烷基，R1和R2独立地是氢；X是-O-，PAG是PEG，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基具有10,000-40,000道尔顿的分子量；n是0；m是4；并且A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团，
该方法包括，将下式的化合物：
                 RO-PAG-V        V
其中R和PAG定义如上，V是-OH或-NH2，
与下式的化合物缩合，
Figure C038175080003C2
其中R5形成可水解的酯保护基且Y是卤化物，并且R1、R2、m和n定义如上，
生成下式的酯，
其中R、PAG、X、R1、R2、R5、m和n定义如上，
水解该酯生成下式的游离酸：
Figure C038175080004C1
其中R、PAG、X、R1、R2、m和n定义如上，
使所述游离酸与活化离去基团的卤化物在偶联剂的存在下反应生成所述的活化酯。
8.一种制备下式的活化酯的方法：
Figure C038175080004C2
其中R是C1-7烷基；X是-O，PAG是PEG，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基具有10,000-40,000道尔顿的分子量；w是1；并且R3为C1-7烷基且R4为氢；并且A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团，
该方法包括，将下式化合物：
Figure C038175080004C3
其中w、R3、R4定义如上，Y是卤化物且R5形成可水解的酯保护基，与下式化合物缩合
            RO-PAG-V                    V
其中R和PAG定义如上，V是-OH或-NH2，
生成下式的酯
Figure C038175080005C1
其中w、R、PAG、X、R3、R4和R5定义如上，
水解该酯生成下式的游离酸：
Figure C038175080005C2
其中w、R、PAG、X、R3、R4和R5定义如上，
使所述游离酸与活化离去基团的卤化物在偶联剂的存在下反应生成所述的活化酯。
9.一种制备下式的活化酯的方法：
Figure C038175080005C3
其中R是C1-7烷基，X是-NH-，A是氢或与其所连的氧原子合在一起形成酯的活化离去基团，PAG1是PEG1，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基的分子量为约500-约25,000道尔顿，y是1且v是1；k是2，
该方法包括，将下式化合物：
Figure C038175080005C4
其中y和v定义如上，Y是卤化物且R5形成可水解的酯保护基，与下式化合物缩合
            RO-PAG1-O-(CH2)k-V         XXXVI
其中R、PAG1和k定义如上，V是-OH或-NH2，
生成下式的酯
Figure C038175080006C1
其中R、PAG1、X、R5、k、v和y定义如上，
水解该酯生成下式的游离酸：
其中R、PAG1、X、k、v和y定义如上，
使所述游离酸与活化离去基团的卤化物在偶联剂的存在下反应生成所述的活化酯。
10.下式的偶联物
Figure C038175080006C3
其中，P是其中的末端羟基被脱除了的具有末端羟基的生物药物的残基，R是C1-7烷基，R1和R2独立地是氢；X是-O-，PAG是PEG，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基具有10,000-40,000道尔顿的分子量；n为0；m为4。
11.权利要求10所述的偶联物，其中R是甲基。
12.权利要求10或11任一项所述的偶联物，其中P是AZT的残基。
13.下式的偶联物
Figure C038175080007C1
其中，P是其中的末端羟基被脱除了的具有末端羟基的生物药物的残基，R是C1-7烷基，R1和R2独立地是氢；X是-O-，PAG是PEG，即通过脱除其两个末端羟基得到的聚乙二醇的二价残基，该残基具有10,000-40,000道尔顿的分子量；n为0；m为4。
14.权利要求13所述的偶联物，其中PAG是分子量为10,000-15,000道尔顿的聚乙二醇残基。
15.权利要求13至14任一项所述的偶联物，其中P是具有序列(SEQID NO：1)的多肽T-20。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
JP2005534647A (ja) 2002-06-07 2005-11-17 ダイアックス、コープ 失血の予防及び軽減
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
CA2492775C (en) * 2002-07-24 2011-06-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyalkylene glycol acid additives
WO2005021556A2 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Dyax Corp. Modified protease inhibitors
CA2536873C (en) * 2003-08-29 2019-09-10 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
CN101132812A (zh) * 2004-03-15 2008-02-27 阿拉巴马耐科塔医药公司 Hiv进入抑制剂的聚合物基组合物和结合物
EP1753805A4 (en) * 2004-05-17 2009-11-25 Univ Mcmaster AGAINST BIOLOGICAL MOLECULES REACTIVE HYDROPHILIC SILICONE SURFACE
ES2355642T3 (es) 2004-07-16 2011-03-29 Nektar Therapeutics Conjugados que comprenden una porcion de gm-csf y un polimero.
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
WO2007022780A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-01 Novo Nordisk A/S A method of modifying a macromolecular system
US8133707B2 (en) * 2006-01-17 2012-03-13 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing activated polymers having alpha nitrogen groups
AR067537A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
US20090075887A1 (en) * 2007-08-21 2009-03-19 Genzyme Corporation Treatment with Kallikrein Inhibitors
KR101671537B1 (ko) 2008-08-11 2016-11-01 넥타르 테라퓨틱스 다분지형 중합체 알카노에이트 컨쥬게이트
AU2010203712A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
SI2521568T1 (sl) 2010-01-06 2019-01-31 Dyax Corp. Proteini, ki vežejo plazemski kalikrein
US10040761B2 (en) * 2010-06-25 2018-08-07 Nof Corporation Branched hetero polyethylene glycol and intermediate
US20130331443A1 (en) 2010-12-22 2013-12-12 Nektar Therapeutics Multi-arm polymeric prodrug conjugates of taxane-based compounds
US10894087B2 (en) 2010-12-22 2021-01-19 Nektar Therapeutics Multi-arm polymeric prodrug conjugates of cabazitaxel-based compounds
CN103635489B (zh) 2011-01-06 2016-04-13 戴埃克斯有限公司 血浆前激肽释放酶结合蛋白
MX358784B (es) * 2012-04-03 2018-09-04 Sangart Inc Compuestos de nitroxilo activados con succinimida y metodos para el uso de los mismos para nitroxilacion de proteinas.
CN102816227A (zh) * 2012-08-30 2012-12-12 深圳赛保尔生物药业有限公司 回收促红细胞生成素的方法
BR112015023233A8 (pt) 2013-03-15 2019-12-03 Sangart Inc conjugados de hemoglobina, composição farmacêutica e uso de um conjugado de hemoglobina
CN106459210A (zh) 2014-03-27 2017-02-22 戴埃克斯有限公司 用于治疗糖尿病黄斑性水肿的组合物和方法
EA201891388A1 (ru) 2015-12-11 2018-11-30 Дайэкс Корп. Ингибиторы калликреина плазмы и их применение для лечения обострения наследственного ангионевротического отека
WO2020203583A1 (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 日油株式会社 末端カルボキシル基含有ポリエチレングリコールの製造方法および活性化ポリエチレングリコールの製造方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4670417A (en) * 1985-06-19 1987-06-02 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
WO1995013090A1 (en) * 1993-11-10 1995-05-18 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
CN1211578A (zh) * 1992-08-26 1999-03-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 聚乙二醇－干扰素结合物
WO2001046291A1 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5849450B2 (ja) * 1975-07-09 1983-11-04 株式会社日立製作所 スイリヨクシキカプセルユソウソウチノ ボウシクホウ
JP2531661B2 (ja) 1987-02-25 1996-09-04 味の素株式会社 酸素運搬剤
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
ES2204509T3 (es) 1999-01-29 2004-05-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de gcsf.
CA2299893A1 (en) 1999-03-02 2000-09-02 Carlos O. Stalgis Hiv therapy
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
CN1284603C (zh) 1999-10-08 2006-11-15 内科塔治疗亚拉巴马公司 杂双官能聚乙二醇衍生物和它们的制备方法
US20020065397A1 (en) 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
CA2492775C (en) * 2002-07-24 2011-06-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyalkylene glycol acid additives

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4670417A (en) * 1985-06-19 1987-06-02 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
CN1211578A (zh) * 1992-08-26 1999-03-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 聚乙二醇－干扰素结合物
WO1995013090A1 (en) * 1993-11-10 1995-05-18 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
WO2001046291A1 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)

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