MXPA05000796A - Aditivos de acidos polialquilenglicolicos. - Google Patents
Aditivos de acidos polialquilenglicolicos.Info
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Abstract
Una nueva clase de acidos polialquilenglicolicos y sus reactivos de ester activo para la conjugacion a biofarmacos tales como polipeptidos azucares, proteinas y pequenas moleculas terapeuticamente activas, para producir conjugados biologicamente activos de estos farmacos y metodos para producir estos conjugados.
Description
ADITIVOS DE ACIDOS POLIALQUILENGLICOLICOS
Descripción de la Invención La invención se refiere a ácidos polialguilenglicólicos y su unión a biofármacos terapéuticamente activos para preparar conjugados de polialquilenglicol terapéuticamente activos con estos biofármacos. La unión química de los polímeros hidrofílieos lineales de polialquilenglicol (conocidos como PAG) a biofármacos tales como proteínas y péptidos es bien conocida y comúnmente utilizada en biotecnología. La molécula de polialquilenglicol más común es el polímero de polietilenglicol (conocido como PEG) . Como ejemplo de aplicación biotécnica de los PAG, algunos derivados activos de PAG se han unido a biofármacos tales como proteínas y enzimas con resultados beneficiosos. Dado que un PAG es soluble en solventes orgánicos, un PAG unido a biofármacos tales como proteínas o enzimas puede producir conjugados resultantes que sean solubles y activos en solventes orgánicos. La unión de un PAG a una proteína puede reducir la inmunogenicidad y velocidad de eliminación renal del conjugado PAG-proteína comparado con la proteína no modificada. Además la unión de un PAG a biofármacos tales como una proteína puede aumentar también en forma dramática las vidas medias circulatorias de estos conjugados de PAG.
REF. : 161293
En la preparación de complejos de PAG con biofarmacos tales como proteínas, la farmacocinética de los biofármacos, particulares gobernará tanto la eficacia como la duración del efecto del fármaco. En vista de la inmunogenicidad, insolubilidad en agua y corta vida media in vivo de los biofármacos, particularmente proteínas y polipéptidos , se ha tornado de importancia capital reducir la velocidad de eliminación de estos biofármacos de modo de lograr una acción prolongada. Esto se puede lograr evitando o inhibiendo la filtración molecular, lo cual puede concretarse tanto a través de la carga de la proteína como de su tamaño molecular (Brenner et al., (1978) Am. J. Physiol . , 234, F455) . Aumentando el volumen molecular y enmascarando potenciales sitios de epítopo, se ha demostrado que la modificación de un biofármaco terapéutico tal como un polipéptido o una proteína con un polímero es eficaz en la reducción de la velocidad de eliminación como así también de la antigenicidad del biofármaco, en especial las proteínas. La proteólisis reducida, la solubilidad en agua aumentada, la eliminación renal reducida y el impedimento estérico a la eliminación mediada por receptores, son una cantidad de mecanismos por los cuales la unión de un polímero PAG a la cadena principal de biofármacos tales como polipéptidos y proteínas, resulta beneficiosa en el mejoramiento de las propiedades farmacocinéticas del fármaco. Así, Davis et al. Patente
Norteamericana No. 4,129,337, describe la conjugación del PEG a proteínas tales como enzimas e insulina para producir un producto menos inmunogénico al mismo tiempo que retiene una proporción sustancial de la actividad biológica de estos biofármacos . Existe una gran variedad de PAGs activos, particularmente el PEG, reactivos que se han desarrollado para la modificación de biofármacos tales como proteínas (ver, por ejemplo, Zalipsky, et al., y Harris et al., en: Poly (ethylene glycol) Chemisty: Biotechnical and Biomedical Applications; (J.M Harris ed.) Plenum Press :New York, 1992; Capítulos 21 y 22) , requiriendo la mayor parte de los cuales la formación de un grupo ligante entre el PEG y los biofármacos. Algunos de estos reactivos son inestables, en diversa medida, en el medio acuoso en el cual ocurre la reacción de conjugación. Además el proceso de conjugación da lugar a menudo a la pérdida de actividad biológica in vivo, lo cual se debe a diversos factores, siendo el principal una interacción estérica con el sitio activo de la proteína. Por ende, una propiedad deseada de un nuevo reactivo sería que no fuera susceptible a la degradación en un medio acuoso y que se pudiera emplear para afectar la modificación sitio-específica de una proteína. De conformidad con esta invención hemos descubierto un nuevo tipo de ácidos polialquilenglicólicos y sus esteres
reactivos activos para la conjugación a biofármacos tales como polipéptidos, azúcares, proteínas y pequeñas moléculas terapéuticamente activas. Estos reactivos son aquellos compuestos que tienen cualquiera de las siguientes fórmulas:
en la cual R, R1 y R2 son individualmente hidrógeno o alquilo inferior; X es -0- o -NH-; PAG es un residuo divalente de polialquilenglicol resultante de la eliminación de sus dos grupos hidroxilo terminales, residuo que tiene un peso molecular de entre 1,000 a 50,000 Daltones; n es un número entero de valor entre O y 1; m es un número entero de valor entre 4 a 8; y A es un hidrógeno o un grupo saliente activado que cuando se toma en forma conjunta con su átomo de oxígeno unido forma un éster, o ésteres hidrolizables de los mismos cuando A es hidrogéne¬
en la cual R, PAG, X y A son lo definido anteriormente; w es un número entero de valor entre 1 a 3; y uno de R3 y R4 es
alquilo inferior y el otro es hidrógeno o alquilo inferior; y
en la cual R, A y X son lo definido anteriormente; PAG1 es un residuo divalente de polialquilenglicol resultante de la eliminación de sus dos grupos hidroxilo terminales, teniendo dicho residuo un peso molecular de entre 500 a 25,000 Daltones; y es un número entero de valor entre O a 3 y v es un número entero de valor entre 1 a 3; y k es un número entero de valor entre 1 a 2. Los compuestos preferidos de fórmula I-A según se definieron anteriormente son aquellos de fórmula
en la cual A, R, PAG, R1, R2, m y n son lo definido anteriormente . Otros compuestos preferidos de fórmula I-A según se definieron anteriormente son aquellos de fórmula
en la cual A, R, PAG, R1 , R2 , m y n son lo def inido anteriormente . Compuestos preferidos de fórmula I -B según se definieron anteriormente son aquellos de fórmula
en la cual A, R, PAG . R3 , R4 y w son lo definido anteriormente . Compuestos preferidos de fórmula I-C según se definieron anteriormente son aquellos de fórmula
en la cual R, PAG1 , A, v y k son lo definido anteriormente .
De preferencia, A es hidrógeno o un grupo saliente activado que cuando se toma en forma conjunta con su átomo de oxigeno unido forma un éster, o ásteres hidrolizables de los mismos cuando A es un hidrógeno o un grupo saliente activado que cuando se toma en forma conj unta
con su átomo de oxigeno unido forma un éster. En los compuestos definidos anteriormente, A es de preferencia hidrógeno. También se prefieren los compuestos definidos anteriormente en los cuales A es un grupo saliente activado. En los compuestos definidos anteriormente, en particular compuestos de fórmula I-Cl, cuando A es un grupo saliente preferido, A es con preferencia N-hidroxisuccinimidilo . En otra modalidad preferida, R es metilo. También se prefieren los compuestos definidos anteriormente en los cuales PAG es PEG, un residuo divalente de polietilenglicol resultante de la eliminación de sus dos grupos hidroxilos terminales. Con preferencia, el PEG tiene un peso molecular de entre 10,000 a 40,000, con mayor preferencia de entre 20,000 a 35,000. En los compuestos de fórmula I-C descritos anteriormente, en los cuales PAG1 es PEG1, PEG1 tiene con preferencia un peso molecular de entre 500 a 15,000. En otra modalidad preferida, n es 0 y m es 4. Con preferencia es 1. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un proceso para producir un éster activado de fórmula:
en la cual R, R1 y R2 son individualmente hidrógeno o alquilo inferior; X es -0- o -NH-; PAG es un residuo divalente de polialquilenglicol resultante de la eliminación de sus dos grupos hidroxilo terminales, residuo que tiene un peso molecular de entre 1,000 a 50,000 Daltones; n es un número entero de valor entre 0 a 1; m es un número entero de valor entre 4 a 8; y A es un hidrógeno o un grupo saliente activado que cuando se toma en forma conjunta con su átomo de oxígeno unido forma un éster, que comprende condensar un compuesto de fórmula: RO—PAG-V V en la cual R y PAG son lo definido anteriormente y V es -OH o H2, con el compuesto de fórmula :
en la cual R5 forma un grupo protector de ásteres hidrolizable e Y es haluro y R1, R2, m y n son lo definido anteriormente, para producir un éster de fórmula
en la cual R, PAG, X, 1, R2, Rs, m y n son lo definido anteriormente, hidrolizar dicho éster para formar un ácido libre de fórmula:
en la cual R, PAG, X, R1, R2, m y n son lo definido anteriormente, y hacer reaccionar dicho ácido libre con un haluro de un grupo saliente activado en presencia de un agente de acoplamiento, para producir dicho éster activado.
En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un proceso para producir un éster activado de fórmula :
en la cual R es hidrógeno o alquilo inferior; X es -0- o -NH-; PAG es un residuo divalente de polialquilenglicol resultante de la eliminación de sus dos grupos hidroxilo terminales, residuo que tiene un peso molecular de entre 1,000 a 50,000 Daltones; w es un número entero de valor entre 1 a 3; y uno de R3 y R4 es alquilo inferior y el otro es hidrógeno o alquilo inferior; y A es un hidrógeno o un grupo saliente activado que cuando se toma en forma conjunta con su
átomo de oxígeno unido forma un éster, que comprende condensar un compuesto de fórmula:
en la cual w, R , R4 son lo definido anteriormente, Y es haluro y R5 forma un grupo protector de ésteres hidrolizable, con un compuesto de fórmula:
RO— PAG-V v en la cual R y PAG son lo detinido anteriormente, V es -OH o -NH2, para producir un éster de fórmula:
en la cual w, R, PAG, X, R3, R4 y R5 son lo definido anteriormente hidrolizar dicho éster para formar un ácido libre de fórmu.
en la cual w, R, PAG, X, R3, R4 y R5 son lo definido
anteriormente , y hacer reaccionar dicho ácido libre con un haluro de un grupo saliente en presencia de un agente de acoplamiento para producir dicho éster activado . En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un proceso para producir un éster activado de fórmula:
en la cual R es hidrógeno o alquilo inferior , X es -O- o -NH- , A es un hidrógeno o un grupo saliente act ivado que cuando se toma en forma conj unta con su átomo de oxigeno unido forma un éster , PAG1 es un residuo divalente de pol ialquilenglicol resultante de la eliminación de sus dos grupos hidroxilo terminales , teniendo dicho residuo un peso molecular de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 25, 000 Daltones; y es un número entero de valor entre 0 a 3 y v es un número entero de valor entre 1 a 3; y k es un número entero de valor entre 1 a 2, que comprende condensar un compuesto de fórmula:
en la cual y y v son lo def inido anteriormente , Y es haluro y
5 forma un grupo protector de ásteres hidrolizable, con un compuesto de fórmula
xxxvi
en la cual R, PAG1 y k son lo definido anteriormente, V es -OH o -NH2, para producir un éster de fórmula;
en la cual R, PAG1, X, R5, k, v e y son lo definido anteriormente, hidrolizar dicho éster para formar un ácido libre de fórmula:
XXVIII
en la cual R, PAG1, X, k, v e y son lo definido anteriormente, y hacer reaccionar dicho ácido libre con un haluro de un grupo saliente activado en presencia de un agente de acoplamiento para producir dicho éster activado.
En los procesos descritos anteriormente, dicho grupo saliente es con preferencia N-hidroxisuccinimidilo .
Una modalidad preferida adicional de la presente invención se refiere a un conjugado de fórmula
en la cual P es un residuo de un biofármaco que tiene un grupo hidroxilo terminal en el cual el grupo hidroxilo terminal se elimina, R, R1 y R2 son individualmente hidrógeno o alquilo inferior; X es -0- o -NH-; PAG es un residuo divalente de polialquilenglicol resultante de la eliminación de ambos grupos hidroxilos terminales, residuo que tiene un peso molecular de entre 1,000 a 50,000 Daltones; n es un número entero de valor entre 0 a 1: m es un número entero de valor entre 4 a 8. En el conjugado descrito anteriormente, P es con preferencia un glicósido o un residuo de AZT. Con preferencia, X es -0-. Con preferencia, PAG es un residuo de polietilenglicol que tiene un peso molecular de entre 10,000 a 15,000. Con preferencia, R es metilo. Otra modalidad preferida de la presente invención se refiere a un conjugado de fórmula
en la cual P es un residuo de un biofármaco que tiene un grupo hidroxilo terminal en el cual el grupo hidroxilo terminal se elimina, R, R1 y R2 son individualmente hidrógeno o alquilo inferior: X es -0- o -NH-; PAG es un residuo divalente de polialquilenglicol resultante de la eliminación de ambos grupos hidroxilos terminales, residuo que tiene un peso molecular de entre 1,000 y 50,000 Daltones; n es un número entero de valor entre 0 a 1; m es un número entero de valor entre 4 a 8. En el conjugado descrito anteriormente, P es con preferencia un residuo de una proteína o polipéptido con mayor preferencia en el cual P es un polipéptido T-20 que tiene una secuencia como la de SEC ID N0:1. Con preferencia, X es -O- . Con preferencia PAG es un residuo de polietilenglicol que tiene un peso molecular de entre 10,000 15, 000. Estos compuestos son reactivos útiles para formar conjugados con biofármacos tales como polipéptidos , azúcares, proteínas y glicósidos. Los compuestos de fórmula I-A, I-B y I-C, cuando forman conjugados con biofármacos tales como proteínas, péptidos y glicósidos, mejoran sus propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas . Estas propiedades útiles en clínica incluyen vida media circulante in vivo más prolongada, índice de depuración disminuido y potencia incrementada, cambios en la bio-distribución tendientes a
mejoras potenciales en la eficacia, inmunogenicidad reducida, toxicidad reducida, mejor estabilidad física y térmica, protección frente a la degradación proteolítica, entre otras. La estabilidad de los compuestos de fórmula I-A: I-B y I-C les permiten conjugarse fácilmente al biofármaco con el objeto de reducir el peligro de desnaturalización. Los reactivos de fórmula I-A, I-B y I-C pueden conjugarse al grupo amino o hidroxilo de un biofármaco que contiene grupos amino o hidroxilo, para producir conjugados que retienen una porción sustancial de la actividad biológica del biofármaco del que derivan. Por lo general a los fines de la conjugación, se prefiere que el biofármaco que contiene grupos amino o hidroxilo contenga un grupo amino o hidroxilo terminal . Es este grupo amino o hidroxilo terminal a través del cual los reactivos de esta invención se pueden conjugar para producir los conjugados de conformidad con la invención. Los reactivos de esta invención no son susceptibles a la degradación en un medio acuoso y, de este modo, pueden hacerse reaccionar fácilmente con el biofármaco para formar el conjugado que puede administrarse con fines terapéuticos en un medio acuoso. El término polialquilenglicol designa a radicales de polialquilen (inferior) glicol en donde el radical alquileno es un radical de cadena recta o ramificada que contiene entre 2 a 7 átomos de carbono. El término "alquileno inferior"
designa un radical alquileno divalente de cadena recta o ramificada que contiene entre 2 a 7 átomos de carbono, tal como polietileno, poli-n-propileno, poliisopropileno, poli-n-butileno y poliisobutileno, como así también polialquilenglicoles formados a partir de alquilenglicoles mixtos tales como polímeros que contienen una mezcla de radicales polietileno y polipropileno y polímeros que contienen una mezcla de radicales poliisopropileno, polietileno y poliisobutileno. Los radicales alquilenglicol de cadena ramificada proveen los grupos alquilo inferiores de la cadena del polímero de entre 2 a 4 átomos de carbono, dependiendo del número de átomos de carbono contenido en la cadena recta del grupo alquileno, de modo que el número total de átomos de carbono de cualquier resto alquileno que conforma el sustituyente polialquilenglicol está entre 2 a 7. El término "alquilo inferior" incluye a grupos alquilo inferiores que contienen entre 1 a 7 átomos de carbono, con preferencia entre 1 a 4 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, etc. prefiriéndose especialmente el metilo. De conformidad con la modalidad preferida de esta invención, el PAG del compuesto de las fórmulas I-A, I-B y I-C es un residuo de polietilenglicol formado por eliminación de los dos grupos hidroxilo terminales. Además, de conformidad con esta invención, los residuos de PAG del
compuesto de la fórmula I-A y I-B, tienen pesos moleculares de entre aproximadamente 10,000 a aproximadamente 50,000, sobre todo con preferencia entre aproximadamente 20,000 a aproximadamente 40,000, prefiriéndose especialmente entre aproximadamente 25,000 a aproximadamente 35,000. En el compuesto de fórmula I-C, se prefiere en general que los dos radicales PAG1 tengan un peso molecular combinado de entre aproximadamente 10,000 a aproximadamente 50,000, y con preferencia entre aproximadamente 20,000 a aproximadamente 40,000. Y sobre todo con preferencia entre aproximadamente 25,000 a aproximadamente 35,000. Los reactivos de fórmulas I-A, I-B y I-C pueden conjugarse con cualquier biofármaco convencional que contenga un grupo hidroxilo o amino libre. La condensación puede ser tanto a través del ácido libre como por medio de un éster activado. De conformidad con esta invención, los compuestos de fórmulas I-A, I-B y I-C pueden hacerse reaccionar con el grupo hidroxilo libre o el grupo amino libre de un biofármaco que tenga una proteína, péptido o resto orgánico pequeño para formar ya sea un éter o amida conjugados. De conformidad con esta invención, el éter o amida conjugados pueden prepararse a partir de los compuestos de los reactivos de esta invención mediante los siguientes esquemas de reacción. En la formación de los ésteres
conjugados, los reactivos se hacen reaccionar con un biofármaco que contiene un grupo hidroxilo terminal según se muestra a continuación: ESQUEMA DE REACCIÓN 1
o o B-C-OH + HO—P B-C-OP
en donde P es un residuo de un biofármaco que tiene un hidroxilo terminal, en donde el grupo hidroxilo terminal se elimina. En este esquema de reacción, B es un conjunto de compuestos I-A, I-B y I-C sin el grupo ácido reactivo terminal o grupo saliente activado. En la modalidad de esta reacción puede utilizarse cualquier método convencional de formación de ásteres haciendo reaccionar un grupo ácido reactivo con un alcohol para formar el éster conjugado. Entre los métodos preferidos se encuentra acoplar el ácido y el alcohol en presencia de un agente de acoplamiento tal como la diciclohexilcarbodiimida, utilizando un catalizador de acoplamiento. Puede utilizarse cualquier catalizador convencional de acoplamiento tal como el 1-hidroxibenzotriazol y la (4-dimetilamino) piridina o mezclas de los mismos. Por lo general esta reacción se lleva a cabo en un medio de solvente orgánico. Esta reacción puede efectuarse con el éster derivado de este ácido, libre o
activado. Si se utiliza el derivado del ácido activado, entonces no hay necesidad de utilizar el catalizador de acoplamiento y/o el agente de acoplamiento. Al realizar esta reacción la temperatura y presión no son criticas y esta reacción puede realizarse a temperatura ambiente. Sin embargo, si se desea, pueden utilizarse temperaturas más altas o más bajas. De conformidad con esta reacción, P puede ser el residuo de cualquier biofármaco que tenga un grupo hidroxilo terminal. Para formar los ásteres mencionados, entre los biofármacos preferidos que poseen un grupo hidroxilo terminal, se encuentran los nucleósidos tales como el AZT. Además P puede ser cualquier biofármaco de molécula pequeña tal que tenga un grupo hidroxilo terminal. En la formación de la amida, se utiliza el compuesto de la siguiente reacción: ESQUEMA DE REACCIÓN 2 O B-C-OH + NH 2-P1 - B-C-NHP1 6 en donde P1 es el residuo de un biofármaco que tiene un grupo amino terminal, en donde este grupo amino terminal se ha eliminado. En el esquema de reacción anterior, B es el descrito anteriormente. De conformidad con esta reacción, P1 puede ser el residuo de cualquier biofármaco que tenga un grupo amino
terminal tal como una proteína o péptido o biofármaco de molécula pequeña que tenga un grupo amino terminal . Entre las proteínas y péptidos preferidos se incluyen el interferón- , el interferón-ß, el interferón de consenso, GCSF, GM-CSF, interleuquinas, el factor estimulante de colonias, como así también inmunoglobulinas tales coma IgG, IgE, IgM, IgA e IgD y fragmentos de las mismas. Otros biofármacos con grupos amino preferidos son aquellos péptidos expuestos en la Patente Norteamericana 5,464,933, en especial el péptido T-20 que tiene la estructura Tyr Thr Ser Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe (SEC ID:1> . La reacción para producir la amida se lleva a cabo utilizando cualquier medio convencional para acoplar un ácido o un derivado de ácido activado "OA" con una amida para " formar un enlace peptídico. Puede utilizarse cualquier método convencional para obtener un enlace peptídico por reacción entre un ácido y una amina para formar una amida en la formación del conjugado. De conformidad con esta invención, OA puede ser cualquier grupo saliente activante de ácidos. Entre los grupos salientes activantes de ácidos preferidos se encuentran los halógenos tales como cloro y bromo, N- succinimidiloxi , sulfo-N-succinimidiloxi , 1- benzotriazoliloxi, 1-imidazolilo, p-nitrofeniloxi , 2,3,4-
triclorofeniloxi, pentaclorofeniloxi, pentafluoroleniloxi, N-ftalimidiloxi, N-tetrahidroftalimida, N-glutarimida, 1-hidroxipiperidina, 5-cloro-8-hidroxi-quinolina, N-norbornen-2 , 3-dicarboximida e hidroxi-7-azabenzotriazol . El compuesto de fórmula I-A en donde X es 0 es
I-Al
en el cual A, R, PAG, R1, R2, m y n son como se definen anteriormente, se prepara haciendo reaccionar el compuesto PAG con grupo hidroxilo de fórmula RO—PAG-OH v
en la cual R PAG son como se definen anteriormente, con un compuesto de rmula
en la cual R5 forma un grupo protector de ásteres hidrolizable e Y es haluro y R1, R2, m y n son como se definen anteriormente, a través del siguiente esquema de reacción:
ESQUEMA DE REACCIÓN 3
en el cual R, PAG, m y n son lo indicado anteriormente y A1 es un grupo saliente activado que cuando se toma en forma conjunta con su oxigeno unido forma un éster. El compuesto de fórmula V, cuando se condensa con el compuesto de fórmula VI produce el compuesto de fórmula VIII.
En esta reacción el compuesto de fórmula V se hace reaccionar con el compuesto de fórmula VI reflujando estos compuestos en un solvente orgánico en presencia de un hidruro de metal alcalino tal como hidruro de sodio para llevar a cabo esta reacción puede utilizarse cualquier método convencional usado en la condensación de un alcohol con un haluro. En general se prefiere utilizar como solvente orgánico inerte los solventes hidrocarbonados aromáticos tales compuesto benceno y tolueno. Sin embargo, puede utilizarse cualquier solvente orgánico inerte convencional para llevar a cabo esta reacción. En el compuesto de fórmula VI, R3 puede ser cualquier grupo protector de ésteres convencional hidrolizable . En general, esos grupos protectores de ésteres hidrolizables incluyen los grupos alquilo inferiores protectores de ésteres. El compuesto de fórmula VIII se hidroliza al compuesto de fórmula IX por medios convencionales tales como hidrólisis básica con una base tal como un hidróxido de metal alcalino en medio acuoso. El ácido de fórmula IX se convierte luego en su forma activada, el compuesto de fórmula X, a través del uso de un grupo saliente activado tal como un grupo N-hidroxisuccinimidilo con N-hidroxisuccinimida . Sin embargo, puede utilizarse cualquier grupo saliente convencional tal como los mencionados en la presente más arriba en la obtención de compuesto de fórmula X. Puede utilizarse cualquier método convencional de conversión de un ácido
carboxílico en un éster activado que contenga un grupo saliente activador tal como el grupo N-hidroxisuccinimidilo para producir el compuesto de fórmula X . En la preparación del compuesto de fórmula I-A-l, que incluye a los compuestos de fórmulas IX y X, por condensación de la fórmula V con el compuesto de fórmula VI por el esquema de reacción antes mencionado, este esquema de reacción puede ilustrarse adicionalmente de la siguiente manera general: Cinco gramos del compuesto PEG de fórmula V (peso molecular de 1000 a 40000) en 50 a 100 mi de tolueno se secaron en forma azeotrópica reflujando durante 1 a 3 horas, seguido de eliminación de 20 a 30 mi de tolueno La mezcla resultante se disolvió en 20 a 30 mi de tetrahidrofurano anhidro y se agregó gota a gota a hidruro de sodio (exceso de 5 a 10 veces en moles) y tetrahidrofurano anhidro (20~30 mi) ¦ en un balón bajo corriente de argón. La mezcla resultante se reflujo hasta el día siguiente. Se utilizaron los siguientes ésteres de halo ácidos de Fórmula VI para preparar el compuesto de Fórmula VIII: 5-bromovalerato de metilo o 5- iodovalerato de etilo; o 6-bromohexanoato de etilo u omega- clorovalerato de etilo; o metil éster del ácido 6-bromo hexanoico; o 7-bromoheptanoato de metilo; o 7-bromoheptanoato de etilo: u 8-bromooctanoato de metilo; u 8-bromooctanoato de etilo; o 10-bromodecanoato de metilo: o w-bromoundecanoato de etilo; u 11-bromoundecanoato de metilo, o bromomiristato de
metilo; o 15-bromopentadecanoato de etilo; o metil éster del ácido 16-bromo-hexadecancarboxílico; o metil estér del ácido 17-bromohpedecancarboxílico o 3 -clorobutirato de metilo; 3-bromobutirato de metilo: o 3-bromobutirato de etilo; beta-bromovalerato de etilo: o beta-bromocaproato de etilo (exceso de 5 a 10 veces en moles) se agregó a la reacción por medio de una jeringa y la reacción se reflujo hasta el día siguiente. La solución de reacción se condensó luego por evaporación rotatoria. El residuo que contenía el compuesto de fórmula VIII se precipitó por agregado a la mezcla de 2-propanol y dietiléter (1:1). El producto precipitado el compuesto de fórmula VIII, se filtró y secó al vacío. El éster del ácido polietilenglicólico de fórmula VIII (4 g) se disolvió en 50 a 100 mi de hidróxido de sodio 1N y la solución se agitó a temperatura ambiente hasta el día siguiente. El pH de la mezcla se ajustó entre 2.5 y 3.0 por agregado de ácido clorhídrico entre 1 y 6N y la mezcla se extrajo con diclorometano . La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, se concentró y se precipitó en dietiléter. El ácido polietilenglicólico de fórmula IX se recogió por filtración y se secó al vacío. El ácido polietilenglicólico de fórmula IX (2 g) se disolvió en diclorometano anhidro (10 a 20 mi) seguido del agregado de N-hidroxisuccinimida (exceso de 1.05 a 2.0 veces en moles) y diciclohexilcarbodiimida (exceso de 1.05 a 2.0
veces en moles) . La mezcla se agitó hasta el día siguiente a temperatura ambiente bajo corriente de argón. La mezcla de reacción se filtró, se concentró y se precipitó con una mezcla de 2-propano y dietiléter (1:1). El producto se secó al vacio hasta el día siguiente para producir el éster activado de fórmula Ial, el compuesto de fórmula X. El compuesto de fórmula I-A en donde X es NH tiene la fórmula I-A2
en la cual A, R, PAG, R1 R2, m y n son lo definido anteriormente, se prepara a partir del compuesto de fórmula
RO— PAG-NH2 XII
en la cual R y PAG son lo definido anteriormente, haciendo reaccionar primero el compuesto de fórmula XII con el compuesto de fórmula VI para producir un compuesto de fórmula
XIII
en la cual R, R1, R2, R5, PAG, m y n son como se definen anteriormente . La reacción para producir el compuesto de fórmula XIII se lleva a cabo condensando la amina de fórmula XII con el haluro del compuesto de fórmula VI. Puede utilizarse cualquier método convencional de condensación de una amina con un haluro para llevar a cabo esta reacción. El compuesto de fórmula XIII se convierte en el compuesto de fórmula I-A2 cuando A es un grupo saliente a través del intermediario
en la cual R, PAG, R1, R2, m y n son se definen anteriormente.
Esta conversión para formar el compuesto de fórmula XIV se realiza por hidrólisis básica convencional según se describió más arriba en la presente. El compuesto de fórmula XIV se convierte en el compuesto de fórmula 1A2, donde A es un grupo saliente activado que, cuando se toma en forma conjunta con su oxigeno unido, forma un éster de igual manera que la descrita en conexión con la conversión del compuesto de fórmula IX al compuesto de fórmula X. En general, el método de obtención del compuesto de fórmula I-A2, donde A es un grupo saliente activado que,
cuando se toma en forma conjunta con su oxígeno unido, forma un éster haciendo reaccionar primero el compuesto de fórmula XII con el compuesto de fórmula VI para producir el compuesto de fórmula 1-A2, puede ilustrarse adicionalmente mediante la siguiente secuencia general de reacciones: Etapa Uno Se disolvieron cinco gramos de la PEGamina de fórmula XII (peso molecular de 1000 a 40000) en 25 a 50 mi de etanol absoluto. Luego se agregó a la solución de PEG el compuesto de fórmula VI, que puede ser 5 -bromovalerato de metilo o
5 - iodoval erato de etilo, 6 - bromohexanoato de etilo u omegaclorovalerato de etilo, o metil éster del ácido
6- bromo hexanoico o 7 -bromoheptanoato de metilo; o 7-bromoheptanoato de etilo; u 8 -bromooctanoato de metilo, u 8 -bromooctanoato de etilo, o 10-bromodecanoato de metilo, o w-bromoundecanoato de etilo, u 11 -bromoundecanoato de metilo, o bromomiristato de metilo, o 15 -bromopentadecanoato de etilo, o metil éster del ácido 16-bromo-hexadecancarboxílico, o 3 -clorobutirato de metilo, o 3 -bromobut irato de metilo, a 3 -bromobutirato de etilo, o beta-bromovalerato de etilo, o beta-bromocaproato de etilo (exceso de 5 a 10 veces en moles) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente hasta el día siguiente. La solución de reacción se condensó luego por evaporación
rotativa. El residuo se precipitó por agregado a la mezcla de 2-propanol y dietil éter (1:1) . El producto precipitado se filtró y se secó al vacío para dar el compuesto de fórmula XIII . Etapa Dos El éster del PEG ácido XIII (4 g) se disolvió en 50 a 100 mi de idróxido de sodio 1N y la solución se agitó a temperatura ambiente hasta el día siguiente. El pH de la mezcla se ajustó entre 2.5 y 3.0 por agregado de ácido clorhídrico 1 a 6N y la mezcla se extrajo con diclorometano la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, concentró y precipitó en dietil éter. El producto PEG ácido de fórmula XIV se recogió por filtración y se secó al vacío. El PEG ácido de fórmula XIV (2 g) se disolvió en diclorometano anhidro (10 a 20 mi) , seguido del agregado de N-hidroxisuccinimida (exceso de 1.05 a 2.0 veces en moles) y diciclohexilcarbodiimida (exceso de 1.05 a 2.0 veces en moles) . La mezcla se agitó hasta el día siguiente a temperatura ambiente bajo argón. La mezcla de reacción se filtró, se concentró y precipitó con una mezcla de 2-propanol y dietil éter (1:1) El producto se secó al vacío hasta el día siguiente para dar el compuesto de fórmula 1-
A2 en el cual A es un grupo saliente activado que cuando se toma conjuntamente con su oxígeno unido forma un éster . El compuesto de fórmula I-B en el cual X es O que tiene la fórmula
en la cual A, R, PAG, R3, R4, w y n son como se definen anteriormente, se prepara haciendo reaccionar el compuesto de fórmula V con el compuesto de fórmula
en la cual w Y, R3, R4 y R5 son como se definen anteriormente, para dar un compuesto de fórmula: XXI
en la cual w, R, PAG, R3, R4 y R5 son como se definen anteriormente .
La reacción del compuesto de fórmula XX con el compuesto de fórmula V para dar el compuesto de fórmula XXI se lleva a cabo de igual manera que la descrita en conexión con la reacción del compuesto de fórmula V y VI para dar el compuesto de fórmula VII. El compuesto de fórmula XXI se somete luego a hidrólisis básica utilizando las condiciones descritas anteriormente para dar el compuesto de fórmula XXII
en la cual R, PAG, R3 y R4 son como se definen anteriormente.
El compuesto de fórmula XXII se convierte luego en el compuesto de fórmula I-Bl, en el cual A es un grupo saliente activado que cuando se toma conjuntamente con su oxigeno unido forma un éster. Esta conversión se lleva a cabo de igual manera que la descrita en conexión con la formación del compuesto de fórmula X a partir del compuesto de fórmula IX. El compuesto de fórmula I-B, en el cual X es NH, que tiene fórmula I-B2
en la cual A, R, PAG, R3 y R4 y w son como se definen anteriormente, se prepara haciendo reaccionar el compuesto de fórmula XII con el compuesto de fórmula XX. Esta reacción produce un compuesto de fórmula:
en la cual R, PAG, R3, R4 y R5 son como se definen anteriormente. La reacción del compuesto XX con el compuesto de fórmula XII para dar el compuesto de fórmula XXV se lleva a cabo de igual manera que la descrita en conexión con la reacción del compuesto de fórmula XII con el compuesto de fórmula VI para dar el compuesto de fórmula XIII. El compuesto de fórmula XXV se somete luego a hidrólisis básica utilizando las condiciones descritas en la presente anteriormente para dar el compuesto de fórmula
XXVI
en la cual R, PAG, R3, R4 y w son como se definen anteriormente .
La formación del compuesto de fórmula I-B2 por reacción del compuesto de fórmula XX y el compuesto de fórmula III se lleva a cabo de igual manera que la descrita en conexión con el compuesto de fórmula I-A2, excepto que el compuesto de fórmula VI es sustituido por el compuesto de fórmula XX. El compuesto de fórmula I-C en el cual X es 0 es el compuesto de fórmula I-Cl
PAG1-0(CH2)k-0-(CH2)y CH-C-OA I II
RO— PAG -0-(CH2)k-0-(CH2£
en la cual R, PAG1, A, v y y k son como se definen anteriormente, se prepara por reacción de un compuesto de fórmula
en la cual Y, R5 y v son como se definen anteriormente, con un compuesto de fórmula:
XXXVI
en la cual R, PAG y k son como se definen anteriormente. La formación del compuesto de fórmula I-Cl se lleva a cabo a través del siguiente esquema de reacción: ESQUEMA DE REACCIÓN 4
xxxv + xxxvi
-PAQ1-0-(CHs)k-0-(CH2)y ¿H_C_0R5 XXXVII -PAG1-0-(CH2)irO-(CH2)°
RO— PAG -0-(CH2)l<-0-(CH2)y CH-C-OH XXXVIII RO— PAG1-0-{CH2)K-0-(CH2)?
RO — PAG1— O— (CH2)R— O— (CH2)Y CH-C-OA1 XXXIX RO — PAG1— O- (??2)?t"0— (GH2)?
en el cual A1, R, PAG1, n y v son como se definen anteriormente . En la formación del compuesto de fórmula I-Cl, dos moles
del compuesto de fórmula XXXVI se hacen reaccionar con un mol del compuesto de fórmula XXXV. Esta reacción se l leva a cabo utili zando las mismas condiciones que las descritas en conexión con la reacción del compuesto de fórmula V y el de fórmula VI en la presente dada anteriormente . De esta manera , se obtiene el compuesto de fórmula XXXVII . El compuesto de fórmula XXXVII se hidroliza para formar el compuesto de fórmula XXXVIII de igual manera que la descrita en conexión con la hidrólisis de la fórmula VIII al compuesto de fórmula IX. En la última etapa, el compuesto de fórmula XXXVIII se hace reaccionar para convertir el grupo carboxi lo en un grupo saliente activado de igual manera que la descrita en conexión con la formación del compuesto de fórmula IX. Ce esta manera el compuesto de fórmula XXXVIII se convierte en el compuesto de fórmula I-Cl, el cual A es un grupo saliente activado que cuando se toma conjuntamente con su oxigeno unido forma un éster. El compuesto de fórmula I-C en el cual X es NH, es decir el compuesto de fórmula
RO -PAG1-0-(CH2)k-NH-( CH2)y CH-C-OA I " RO -PAG1 0-(CH2)k-NH-( CH2)? ra en la cual A, R, PAG1 , v, w e y son como se indican anteriormente , se prepara por reacción de un compuesto de fórmula XXXV indicado anteriormente con un compuesto de fórmula
RO— PAG1-0-(CH2)k-NH2 XLI en la cual R, PAG1 y k son como se indican anteriormente, por medio del siguiente esquema de reacción: ESQUEMA DE REACCIÓN 5 XXX + XLI
En la primer etapa de esta reacción, el compuesto de fórmula XXXV se hace reaccionar, con el compuesto de fórmula
XLI para producir el compuesto de fórmula XLII. Esta reacción se lleva a cabo de igual manera que la descrita en conexión con la reacción del compuesto de fórmula XII con el compuesto de fórmula VI para dar un compuesto de fórmula XIII. En la etapa siguiente, el compuesto de fórmula XLII se hidroliza a! compuesto de fórmula XLIII de igual manera que la descrita en conexión con la hidrólisis del compuesto de fórmula XIII. El compuesto de fórmula XLII se hace reaccionar luego para convertir el grupo carboxilo en un grupo saliente activado según se describió en la presente anteriormente para dar el compuesto de fórmula IC-2, en el cual A es un grupo saliente activado que cuando se toma conjuntamente con su oxigeno unido forma un éster. Esta reacción se lleva a cabo de igual manera que la descrita en conexión con la conversión del compuesto de fórmula XIV en el compuesto de fórmula I-A2. Ejemplos Ejemplo 1 Preparación del succinimidil éster del ácido alfa-metoxi-omega-PEG valérico
El compuesto de fórmula V en el cual R es metilo, PAG es PEG con un poco molecular de 10000 (5.0 g, 0.5 mmol) en 50 mi
de tolueno, se secó azeotrópicamente reflujando durante 2 horas, seguido de la eliminación de 40 mi de tolueno. La mezcla resultante se disolvió en 30 mi de tetrahidrofurano anhidro y se agregó gota a gota a hidruro de sodio (0.12 g, 5 mmol) y tetrahidrofurano anhidro (20 mi) en un balón bajo corriente de argón. La mezcla resultante se reflujo hasta el día siguiente. Se agregó 5-bromovalerato de etilo (0.79 mi, 5 mmol) a la reacción mediante una jeringa y la reacción se reflujo hasta el día siguiente. La solución de reacción se condensó luego por evaporación rotativa, El residuo se precipitó por agregado a la mezcla de 2-propanol y dietil éter (1:1) . El producto precipitado se filtró y se secó al vacío. Rendimiento: 4.5 g del compuesto del título en el cual el PEG tenía un peso molecular de 1,000 [etil éster del ácido m-PEG valérico] . Se disolvió el etil éster del ácido m-Peg valérico (4 g) en 100 mi de hidróxido de sodio 1 N y la solución se agitó a temperatura ambiente hasta el día siguiente. El pH de la mezcla se ajustó a 2.5 por agregado de ácido clorhídrico con y la mezcla se extrajo con diclorometano (50 mi, 40 mi y 30 mi) . La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, se concentró y precipitó de dietil éter. El producto ácido m-PEG valérico, en el cual el PEG tenía un peso molecular de 1, 000, se recogió por filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 3 g. RMN (ds-DMS0) : 1.50 ppm (q, 2H,
-CH2CH2-COOH) ; 2.21 ppm (t, 2H, -CH2CH2-COOH) ; 3.21 ppm (s, -OCH3); 3.5 ppm (s -O-CH2CH2-O-) . El ácido m-PEG valérico (2 g, 0.2 mmol) se disolvió en diclorometano anhidro (10 mi) seguido del agregado de N-hidroxisuccinimida (47 mg, 0.41 mmol) y diciclo-hexilcarbodiimida (87 mg, 0.42 mmol). La mezcla se agitó hasta el dia siguiente bajo argón. La mezcla de reacción se filtró, se concentró y precipitó con una mezclado 2-propano y dietil éter (1:1). El producto se secó al vacio hasta el dia siguiente. Rendimiento: 1.69 del compuesto del titulo. RMN (de-DMSO) : 1.58-1.67 ppm (m, 4H, -CH2CH2CH2-COO-) ; 2.69 ppm (t, 2H -CH2CH2CH2-COO-) ; 2.81 ppm (s, 4H, NHS) ; 3.21 ppm (s, OCH3) ; 3.5 ppm (s, -0-CH2CH2-0-) . Ejemplo 2 Preparación del succinimidil éster del ácido alfa-metoxi-omega-PEG-betabutanoico
El metoxi compuesto de fórmula I en el cual PAG era PEG con un peso molecular de 10000 (5.0 g, 0.5 mmol) en 50 mi de tolueno, se secó azeotrópicamente reflujando durante 2 horas, seguido de la eliminación de 40 mi de tolueno. La mezcla resultante se disolvió en 30 mi de tetrahidrofurano anhidro y
se agregó gota a gota a hidruro de sodio (0.12 g, 5 mmol) y tetrahidrofurano anhidro (20 mi) en un balón bajo corriente de argón. La mezcla resultante se reflujo hasta el día siguiente. Se agregó beta-bromobutirato de etilo (0.74 mi, 5 mmol) a la reacción mediante una jeringa y la reacción se reflujo hasta el día siguiente. La solución de reacción se condensó luego por evaporación rotativa. El residuo se precipitó por agregado a la mezclado 2-propanol y dietil éter (1:1) para dar el metil PEG en el cual el PEG etil éster betahidrato tiene un peso molecular de 1,000. El producto precipitado se filtró y se secó al vacío. Rendimiento: 4.5 g. RMN (d6-D SO) : 0.83 ppm (t, 3H, -OCH2CH3) ; 1.05 ppm (t, 3H, -CH3) ; 1.57 ppm (m, 1H, -CHCH2CO-); 3.21 ppm (s, -OCH3) ; 3.5 ppm (S -O- CH2CH2-O-) . Se disolvió el etil éster del ácido m-Peg betabutírico
(3 g) en 50 mi de hidróxido de sodio 1N y la solución se saltó a temperatura ambiente hasta el día siguiente. El pH de la mezcla se ajustó a 2. por agregado de ácido clorhídrico 6 N la mezcla se extrajo con diclorometano (25 mi, 20 mi y 20 mi) . La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, se concentró y precipitó de dietil éter. El producto ácido m-PEG valérico se recogió por filtración y se secó al vacío. Rendimiento. 2.4 g. RMM (d6-DMSO) : 0.88 ppm (t, 3H, -CH3) ; 1.61 ppm (m, 1H, -CH2CH2-C0- ) ; 3.21 ppm (s, -0CH3) ; 3.5 ppm (s, -O- CH2CH2-O- ) , para dar el ácido metoxi PEG butanoico
en el cual el PEG tenía un peso molecular de 41,000. El ácido m-PEGiok-betabutanoico (1 g, 0.1 mmol) se disolvió en diclorometano anhidro (5 mi), seguido del agregado de N-hidroxisuccinimida {24 mg, 0.20 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (43 mg, 0.21 mmol). La mezcla se agitó hasta el día siguiente a temperatura ambiente bajo argón. La mezcla de reacción se filtró, se concentró y precipitó con una mezcla de 2-propanol y dietil éter (1:1). El producto se secó al vacío hasta el día siguiente para dar 6.6 del compuesto del título en el cual el PEG tenía un peso molecular de 13,000. Ejemplo 3 Preparación del conjugado PEG-AZT
El ácido m- PEGioic valérico del Ejemplo 1 (0.2 g, 0.02 mmol) se disolvió en dimetilformamida anhidra (2 mi), seguido dei agregado de 3 ' -azido-3 ' -desoxitimidina (AZT ) (10.7 mg, 0.04 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) (9.8 mg, 0.04 mmol), (4-dimetilamino) piridina ( DMAP ) (5.7 mg, 0.042 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) (9.5 mg, 0.046 mmol). La mezcla se agitó hasta el día siguiente a temperatura ambiente
bajo argón La mezcla de reacción se filtró, se concentró y precipitó con una mezcla de 2-propanol y dietil éter (1:1). El producto se secó al vacío hasta el día siguiente. Rendimiento: 0.17 g. RMN (d6-DMS0) : 1.18 ppm (m, 3H, Hl) : 1.51 ppm (m, 2H H9) ; 2.23 ppm (m, 1H, H4) ; 2.37 ppm (t, 2H, H8) ; 3.21 ppm (s, H12) ; 3.5 ppm (s, Hll) ; 4.2 ppm (m, 1H, H5) ; 6.12 ppm (m, 3H, H6); 7.45 ppm (s, 1H, H2); 11.35 ppm (br, 1H, H10) . Ejemplo 4 Pegilación de T-20 con mPEGiokSVA El succinimidil éster del ácido alfa-metoxi -PEG-omega-valérico con PEG de 10 kDa, preparado de acuerdo al Ejemplo 1, se agregó a 20 mg de T-20, que tiene la secuencia: Tyr Thr Ser Leu lie His Ser Leu-Ile Glu Glu Ser Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe (SEQ:1) Esta adición se llevó a cabo en 1.0 mi de residuo (borato 50 mM, pH 8.0) en una relación molar de 2 moles de reactivo por mol de T-20. La solución se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente. El T-20 pegilado se purificó de la mezcla de reacción utilizando cromatografía de intercambio iónico (QA) . Se usó un gradiente lineal con concentraciones salinas crecientes desde NaCl 100 mM hasta 1 M en Tris 20 mM, a pH 7.5, para separar el T-20 pegilado y el T-20 no modificado.
Ejemplo 5 Pegilación de EPO (eritropoyetina) con mPEG30K-p-SBA 1. Fermentación y purificación de EPO humana Nota: Los métodos para la fermentación y purificación de la EPO humana fueron iguales que el descrito en la Solicitud de Patente Europea EP 1 064 951 A2 (Ver Páginas 7-9) . Reacción de pegilación A cinco miligramos de EPOst (eritropoyetina libre de suero) (653 µ? de una solución de reserva de 7.66 mg/ml de EPOsf, 0.274 µp???) se agregaron 347 µ? de residuo de borato 100 mM, de pH 8.0 que contenía 8.2 mg de metoxi-PEG-p-SBA de 30 kDa (0.274 µ?t???) y se mezclaron durante 4 horas a 4°C. La concentración final de proteína fue de 5 mg/ml y la relación proteína: reactivo de PEG fue de 1:1. Después de 4 horas la reacción se detuvo ajustando el pH a 4.5 con ácido acético glacial y se almacenó a -20°C, hasta estar lista para su purificación. 3. Purificación La mezcla de reacción de la etapa previa se diluyó 1:5 con acetato de sodio 10 mM de pH 4.5 y se aplicó a 100 mi de SP-Sefarosa FF (resina de intercambio catiónico sulfopropílica) que rellenaban una columna de 18 mm x 143 mm La columna se equilibró previamente con el mismo residuo. Los efluentes de la columna se monitorearon a 280 nm con un monitor de UV Gilson y se registraron con un registrador Kipp
and Zonen. La columna se lavó con 100 mi o 1 volumen de lecho de residuo de equilibración para eliminar el exceso de reactivos, subproductos de reacción y PEG-EPO oligoméricos . Se continuó lavando con 2 volúmenes de lecho de NaCl 100 mM para eliminar el di-REG-EPO. Luego se eluyó el mono-PEG-EPO con NaCl 200 mM. Durante la elución del mono-PEG-EPO, los primeros 50 mi del pico de la proteína se descartaron y se recogió el mono-PEG-EPO como fracción de 150 mi. La EPOsf no modificada remanente en la columna se eluyó con NaCl 750 mM. Todos los residuoes de elución se prepararon en residuo de equilibración. La muestra eluída se analizó por SDS-PACE y MALDI-TOF. El eluato combinado de mono-PEG-EPO obtenido de la fracción de 150 mi, que no tenía EPOsf no modificada detectable se concentró luego hasta -5.0 mg/ml y se diafiltró hacia el residuo de almacenamiento, formado por fosfato de potasio 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7.5. La concentración/diafiltración se realizó con un Sistema Millipore Labscale™ TFF ajustado con una membrana de corte de 5 kDa Millipore Pellicon XL Biomax 50 a temperatura ambiente. La mono-PEG-EPO concentrada se filtró para esterilizarla y se conservó congelada a -20°C. Ejemplo 6 Pegilación de EPO con mPECioK-SVA Una alícuota diferente de la EPOsf utilizada en el Ejemplo 5 se hizo reaccionar con metoxi-PEG-SVA de 10 kDa. La
reacción se efectuó con una relación proteína : reactivo de 1:2 y las técnicas de purificación estuvieron en concordancia con el Ejemplo 5. Ejemplo 7 Actividad in-vivo de la ERO pegilada determinada por el ensayo de ratones normocitémicos . El bioensayo de ratones normocitémicos es conocido en el arte (Pharm. Europa Spec . Issue Erythropoie in BRP Bio 1972(2)) y un método en la monografía de la eritropoyetina de Ph. Eur. BRP. Las muestras se diluyeron con BSA-PBS. A ratones sanos normales de 7-15 semanas de edad se administró s.c. 0.5 mi de la fracción de EPO que contenía EPO no pegilada (40 ng/ratón) o EPO mono-pegilada (10 ó 40 ng/ratón) del Ejemplo 5 ó 6. A lo largo de un período de 6 días, se extrajo sangre por punción de la vena caudal y se diluyó de modo que 1 µ? de sangre estuviera presente en 1 mi de una solución de tinción de naranja de acridina 0.15 molar. El tiempo de tinción fue de 3 a 10 minutos. Los recuentos de reticulocitos se dieron en términos de cifras absolutas (por cada 30,000 células sanguíneas analizadas). Para los datos presentados, cada grupo consistió en 5 ratones por día, y los ratones se sangraron sólo una vez. Los resultados muestran la actividad superior y la vida media prolongada de la especie EPO pegilada indicada por las cantidades de reticulocitos significativamente aumentadas y el cambio en el máximo
recuento de reticulocitos utilizando la misma dosis por ratón (10 ng) comparado con una dosis de 40 ng para la EPO no modificada. Ejemplo 8 Preparación el metoxi-PEG-ácido ramificado y su succinimidil éster
El compuesto de fórmula VI en el cual el PftG es PEG que posee un peso molecular de 1,000 [m-Peg amina de peso molecular 10,000] (1.0 g, 0.1 mmol) se disolvió en 5 mi de etanol absoluto a 40°C, seguido del agregado de 3-bromo-2-(bromometil) propionato de etilo (7.6 µ?, 0.048 mmol) y la mezcla se agitó hasta el día siguiente a 40°C bajó argón. La solución de reacción se condensó por evaporación rotativa. El residuo se precipitó por agregado a la mezcla de 2-propanol y dietil éter (1:1). El producto precipitado se filtró y se secó al vacío. Rendimiento: 0.89 g. El éster del m-Peg-ácido ramificado (0.89 g) se disolvió en 20 mi de hidróxido de sodio 1 N y la solución se agitó a temperatura ambiente hasta el día siguiente. El pH de la mezcla se ajustó a 2.5 por agregado de ácido clorhídrico 6N y la mezcla se extrajo con diclorometano (10 mi, 5 mi y 5 mi) . La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, se concentró y precipitó de dietil éter. El ácido m-PEG
valérico producido se recogió por filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 0.64 g. El ácido m-PEG ramificado (0.64 g, 0.032 mmol) se disolvió en diclorometano anhidro (5 mi) seguido del agregado de N-hidroxisuccinimida (11 mg. 0.098 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (20 mg, 0.099 mmol) . La mezcla se agitó hasta el día siguiente bajo argón. La mezcla de reacción se filtró, se concentró y precipitó con una mezcla de 2-propanol y dietil éter (1:1) . El producto se secó al vacío hasta el día siguiente. Rendimiento: 0.58 g. Ejemplo 9 Preparación del PEG- cido ramificado y su succinimidil éster
El metoxi PAG compuesto de fórmula V en el cual PAG es PEG que tiene un peso molecular de 2,000[m-Peg amina de peso molecular 10,000] (1.0 g, 0.1 mmol) se disolvió en 5 mi de etanol absoluto a 40°C, seguido del agregado de 3-bromo-2-(bromometil) propionato de etilo (7.6 µ?, 0.048 mmol) y la mezcla se agitó hasta el día siguiente a 40°C bajo argón. La solución de reacción se condensó por evaporación rotativa. El residuo se precipitó por agregado a la mezcla de 2-propano y dietil éter (1:1) . El producto precipitado se filtró y se secó al vacío. Rendimiento: 0.89 g. El éster del m-PEG-ácido ramificado (0.89 g) se disolvió en 20 mi de hidróxido de sodio 1N y la solución se agitó a temperatura ambiente hasta el día siguiente. El pH de la mezcla se ajustó a 2.5 por agregado de ácido clorhídrico 6N y
la mezcla se extrajo con diclorometano (10 mi, 5 mi y 5 mi) . La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, se concentró y precipitó de dietil éter. El ácido m-PEG valérico producido se recogió por filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 0.64 g. El ácido m-PEG ramificado (0.64 g, 0.032 mmol) se disolvió en diclorometano anhidro (5 mi) seguido del agregado de N-hidroxisuccinimida (11 mg, 0.098 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (20 mg, 0.099 mmol). La mezcla se agitó hasta el día siguiente bajo argón. La mezcla de reacción se filtró, se concentró y precipitó con una mezcla de 2-propanol y dietil éter (1:1). El producto se secó al vacío hasta el día siguiente. Rendimiento: 0.58 g del compuesto del título. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
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