CN105188761B - 聚环氧烷戊酸酯血红蛋白缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及聚乙二醇(PEG)缀合血红蛋白，其通过使琥珀酰亚胺基戊酸酯活化的聚乙二醇与血红蛋白的伯胺和N‑末端缬氨酸缀合而制备。

Description

聚环氧烷戊酸酯血红蛋白缀合物
技术领域
本发明总体上涉及聚环氧烷(PAO)血红蛋白缀合物。更具体地说， 本发明涉及具有改善的稳定性的PAO血红蛋白缀合物、包含此类缀 合物的药物组合物以及合成和使用该缀合物的方法。
发明背景
早已将血红蛋白类氧载体(“HBOC”)与归因于血红素清除一氧化 氮(NO)的血管收缩联系起来。用作氧治疗剂(有时称为"携氧血浆扩容 剂")的氧载体例如稳定血红蛋白(Hb)已经被证实功效有限，这是因为 它们清除了一氧化氮，引起血管收缩和高血压。在动物和人类中，这 些携氧溶液引起血管收缩的倾向可以表现为高血压。虽然HBOC的 血管收缩效应的根本机制不是很清楚，但是已经表明血红素铁可以迅 速且不可逆地与内源性NO(一种强效的血管扩张剂)结合，从而引起 血管收缩。
部分由于这些血管收缩效应，虽然包含修饰型无细胞Hb的产品 已经是最有前景的，但是至今尚无氧载体完全成功地用作氧治疗剂 (OTA)。美国军方已经开发了α链与双-二溴水杨基-富马酸酯之间交 联的人Hb(ααHb)作为模型红细胞替代品，但是其在表现出肺部和全 身血管阻力严重增加后被放弃(Hess,J.等人,1991,Blood 78:356A)。这 种产品的商业形式在令人失望的III期临床试验后也被放弃(Winslow, R.M.,2000,Vox Sang 79:1-20)。
已经提出了两种分子方法来尝试克服Hb的NO结合活性。第一 种方法使用远端血红素口袋的定点诱变以试图产生NO结合亲和力 降低的重组血红蛋白(Eich,R.F.等人,1996,Biochem.35:6976–83)。第 二种方法使用化学修饰法，其中通过寡聚化增大Hb的尺寸，以试图 降低或可能完全抑制Hb从血管间隙外渗到胞间隙(Hess,J.R.等人,1 978,J.Appl.Physiol.74:1769-78；Muldoon,S.M.等人,1996,J.Lab.Clin.Med.128:579-83；Macdonald,V.W.等人,1994,Biotechnology 22:565-75；Furchgott,R.,1984,Ann.Rev.Pharmacol.24:175-97； 以及Kilbourne,R.等人,1994,Biochem.Biophys.Res.Commun.19 9:155-62)。
事实上，已经生成了在最大负载大鼠实验中血压不那么高且对 NO的缔合结合速率降低的重组Hb(Doherty,D.H.等人,1998,Nature Biotechnology 16:672-676以及Lemon,D.D.等人,1996,Biotech 24:378)。然而，研究表明NO结合可能不是Hb血管活性的唯一解释。 已经发现，某些大Hb分子例如被聚乙二醇(PEG)修饰的那些大Hb分 子实际上没有血管收缩，即使其NO缔合速率与严重高血压ααHb相 等(Rohlfs,R.J.等人,1998,JBiol.Chem.273:12128-12134)。此外，发 现当PEG-Hb在出血之前作为交换输血提供时，其对预防出血后果非 常有效(Winslow,R.M.等人,1998,J.Appl.Physiol.85:993-1003)。
PEG与Hb的缀合降低了其抗原性并且延长了其循环半衰期。然 而，已经报道了PEG缀合反应导致Hb四聚体解离成αβ-二聚体亚基， 导致在接受Hb单体单元的PEG缀合物的交换输血大鼠体内产生低于 40,000道尔顿("Da")的总血色蛋白尿(Iwashita and AjisakaOrgan-Directed Toxicity:Chem.Indicies Mech.,Proc.Symp.,Brown等 人1981年编辑，Pergamon,Oxford,England，第97-101页)。由Enzon， Inc.制备了分子量大于84,000道尔顿的聚环氧烷("PAO")缀合Hb(美 国专利号5,650,388)，其携带了约10个拷贝的PEG-5,000链，链接至 Hb的α和ε-氨基。这种取代度被描述为避免了哺乳动物中与血红蛋 白尿相关的临床显著肾毒性。然而，缀合反应产生了异质缀合物群体 并且含有必须通过柱色谱法去除的其它非期望的反应物。
PEG缀合通常通过活化PEG部分与生物分子表面上的官能团的 反应来进行。最常见的官能团为赖氨酸的氨基、组氨酸残基的咪唑基 和蛋白质的N末端；半胱氨酸残基的硫醇基；以及丝氨酸、苏氨酸 和酪氨酸残基的羟基和蛋白质的C末端。PEG通常通过将羟基末端 转化为能够在温和水性环境中与这些官能团反应的反应性部分而活 化。用于缀合治疗性生物药品的最常见的单官能PEG之一是甲氧基 -PEG(“mPEG-OH”)，其只有一个官能团(即羟基)，从而将与双官能 PEG相关的交联和聚集问题减到最少。然而，由于其生产工艺，mPEG-OH经常受范围可以高达10-15％的高分子量双官能PEG(即 “PEG二醇”)污染(DustJ.M.等人,1990,Macromolecule 23:3742-3746)。 这种双官能PEG二醇具有约为所需单官能PEG两倍的尺寸。随着 PEG分子量的增加，污染问题进一步加重。mPEG-OH的纯度对PEG 化生物治疗剂的生产尤为重要，因为FDA在最终药物产品的生产工 艺和质量方面要求有高水平的再现性。
已经在氧合和脱氧状态下进行了Hb与PAO的缀合。美国专利号 6,844,317描述了通过在缀合之前使Hb与大气平衡缀合呈氧合或"R" 状态的Hb，以增强所生成的PEG-Hb缀合物的氧亲和力。其他人描 述了在缀合之前用来减小氧亲和力并增加结构稳定性的脱氧步骤，这 使得Hb能够经受化学修饰、渗滤和/或无菌过滤和巴氏杀菌的物理应 力(美国专利号5,234,903)。对于Hb的分子内交联，提出为了使α-链 的赖氨酸99暴露于交联剂，可能需要在修饰前使Hb脱氧(美国专利 号5,234,903)。
Acharya等人研究了在与PEG缀合前用2-亚氨基硫杂环戊烷使 Hb硫醇化的动力学(美国专利号7,501,499)。观察到，使亚氨基硫杂 环戊烷的浓度从每个四聚体平均引入5个外来硫醇的10倍增加到30 倍几乎使Hb上的外来硫醇数量翻倍。然而，即使具有双倍数量的硫 醇，PEG缀合后所见的尺寸增加也只有少量。这表明在20倍摩尔过 量的马来酰亚胺基PEG-5000存在下的缀合反应用较少的反应性硫醇 覆盖Hb表面，导致抵抗用更多反应性硫醇进一步修饰Hb的立体干 扰。因此，为了实现修饰型Hb的所需缀合度(即6±1个PEG/Hb分子)，Acharya等人用8-15倍摩尔过量的亚氨基硫杂环戊烷使Hb硫 醇化，然后使硫醇化Hb与16-30倍摩尔过量的马来酰亚胺基 PEG-5000反应。然而，在大规模生产中，这些高摩尔过量的反应物 浓度明显增加了制备HBOC的成本并且增加了最终产物的异质性。 而且，这种高摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000还随着更多数量的 非所要副反应物的生成产生更异质的产品。
在先前研究中，观察到表面被修饰的血红蛋白的分子大小必须足 够大以免被肾脏清除并实现所需的循环半衰期。Blumenstein，J.等人 确定，这可以在84,000道尔顿("Da")的分子量或高于该分子量下实 现("Blood Substitutes and Plasma Expanders，”Alan R.Liss编辑，New York，N.Y.，第205-212页(1978))。在该研究中，作者使不同分子量的葡聚糖与Hb缀合。他们报道称，Hb(分子量为64,000Da)和葡聚糖 (分子量为20,000Da)的缀合物"被从循环中缓慢清除并且可以忽略通 过肾脏的清除"。另外，观察到增加分子量到高于84,000Da并未明显 改变这些清除曲线。分子内交联将四聚体血红蛋白单元的亚基化学结 合在一起以防止形成被肾脏过早排泄的二聚体(参见例如美国专利号 5,296,465)。
为了使聚环氧烷与血红蛋白结合，必须首先使聚合物的末端基团 “活化”(即，转化成反应性官能团)以形成“活化聚环氧烷”。过去，使 用PEG-OH来制备PEG-卤化物、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，然后通过 进行与氨水(霍夫曼反应(Hoffmann Reaction))、叠氮化钠或邻苯二甲 酰亚胺钾(加布里试剂(Gabriel Reagent))的亲核置换反应将其转化为 PEG-胺。PEG-卤化物与氨的反应直接形成PEG-胺(“PEG-NH2”)(参见 Zalipsky等人，Eur.Polym.J.1983,19:1177-1183)，其然后可用于与在 一些生物活性化合物上发现的-COOH基团缀合。
最近，PEG-NH2已经被用作中间物且可以进一步被官能化以与除 -COOH外的基团结合。例如，可以将PEG-NH2修饰为巯基活化基团 例如马来酰亚胺。在美国专利号6,828,401公开的反应中，通过使 mPEG-OH与对甲苯磺酰氯(甲苯磺酸化剂)和三乙烯胺(“TEA”，碱催化剂)在二氯甲烷(有机溶剂)中反应生成mPEG-甲苯磺酸酯 来制备mPEG-马来酰亚胺(即，已经加上马来酰亚胺的甲氧基-PEG或 mPEG)。然后使该化合物与28％氨水反应，接着与马来酸酐在N,N- 二甲基乙酰胺("DMAC")和N-环己基吡咯烷酮("CHP")的有机溶 剂混合物中反应，以生成马来酰胺酸化合物。然后使该化合物与三氟 乙酸五氟苯酯在碱催化剂例如二乙基苯胺(“DEA”)或二异丙基乙胺 (“DIEA”)的存在下，在二氯甲烷和二甲基甲酰胺(“DMF”)的有机溶剂 混合物中反应，以生成mPEG-马来酰亚胺。然而，这种用于获得活 化PEG的多步骤多试剂方法繁琐且耗时。
本文公开了用于制备PEG-血红蛋白缀合物的方法，该方法是使 用在特定条件下结合至血红蛋白的胺基的琥珀酰亚胺基戊酸酯活化 PEG(SVA-PEG)形成稳定均质的PEG-血红蛋白缀合物。
发明概要
本发明的一个方面涉及PAO血红蛋白缀合物，其具有在37℃和 pH 7.4下测量的介于约2至约30mmHg的P50。PAO经由血红蛋白 分子上的氨基酸侧链的氨基反应性部分共价连接。氨基反应性部分通 过–C(O)–(CH2)p–链接至PAO，其中p是1至约20的整数。血红蛋白 任选地分子内交联。
本发明的另一个方面涉及具有以下结构的PAO血红蛋白缀合物
Figure BDA0000802056640000051
其中Hb是血红蛋白，L是链接子–C(O)–(CH2)p–，N是血红蛋白 的氨基，X是端基，m是缀合至血红蛋白的活化PEG聚合物的平均 数目，n是平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧亚乙 基单元的平均数目，且p是1至20的整数。
本发明的又一个方面涉及通过包括使血红蛋白与至少一种PAO 聚合物反应的方法而制备的PAO血红蛋白缀合物。PAO聚合物具有 以下结构：
Figure BDA0000802056640000061
其中R是氨基反应性部分，L是链接子–C(O)–(CH2)p–，X是端 基，n是平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧亚乙基 单元的平均数目，且p是1至20的整数。
本发明的再一个方面涉及药物组合物，其包含任何上述血红蛋白 缀合物和药学上可接受的载体。该组合物可以用于治疗急性肝衰竭、 β-地中海贫血、烧伤、慢性临界性肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、 慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心力衰竭、缺氧、疟疾、器官缺血、 外周血管疾病、卟啉症、孕期先兆子痫、败血症、镰状细胞病、视网 膜疾病、眼内病状、睾丸扭转、创伤、休克、创伤性脑损伤、溃疡、 血管痉挛或其组合。该组合物还可以用作血管成形术的辅助物，用作 整形手术的辅助物或在植入心室辅助装置中用作辅助物；用作血液替 代品、保心药、冷冻保存剂、血液透析辅助物、肿瘤剂、器官保存剂、 性能增强剂、手术辅助物或伤口愈合剂；用于成像；用于改善肺功能； 或其组合。该组合物还可以用于兽医治疗由于损伤引起的失血、溶血 性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV断裂、脾机能亢进和脾肿 大、禽类出血性综合症、再生不良性贫血、再生障碍性贫血、特发性 免疫溶血性病状、缺铁、同族免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性 贫血、寄生病或由手术麻醉引起的脑损伤或其组合。
本发明的再一个方面涉及治疗方法，其包括向有需要的受试者施 用此类血红蛋白缀合物或药物组合物。该方法是用于治疗上述病状中 的任何一种或多种。
本发明的另一个方面涉及向组织输送氧、一氧化氮、一氧化碳或 其混合物并在微脉管系统中将亚硝酸盐还原成一氧化氮(NO)的方法。 该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的任何血红蛋白缀合物 或药物组合物。施用后，血红蛋白中的未配位血红素在微脉管系统中 将亚硝酸盐转化为一氧化氮。
本发明的又一个方面涉及制备血红蛋白缀合物的方法，其包括使 血红蛋白与具有以下结构的PAO聚合物反应：
Figure BDA0000802056640000071
其中R是氨基反应性部分，L是链接子–C(O)–(CH2)p–，X是端 基，n是平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧亚乙基 单元的平均数目，且p是1至20的整数。
其它目标和特征将在下文中部分显而易见并部分指出。
附图简述
图1描绘了使用甲氧基PEG琥珀酰亚胺基戊酸酯(mPEG-SVA) 作为起始物质来制备胺PEG化血红蛋白的示例性方法的流程图，其 中R1、R2和R3是血红蛋白主链的部分。
图2描绘了(1)对硝基苯基碳酸酯-PEG(NPC-PEG)、(2)琥珀酰亚 胺基碳酸酯-PEG(SC-PEG)、(3)马来酰亚胺-PEG(Mal-PEG)和(4)琥珀 酰亚胺基戊酸酯-PEG(SVA-PEG)的化学结构和键长，其中箭头示出了 PEG主链与活性基团的距离。
图3描绘了针对Mal-PEG(上)、SVA-PEG(中)和SC-PEG(下)的与 血红蛋白形成的键和PEG主链之间的距离。
图4是SVA-PEG-Hb(蓝色)相比于MP4(红色)和无基质血红蛋白 (SFH)(绿色)在非解离条件下的体积排阻色谱图(LC)。
图5是SVA-PEG-Hb(SP4CO，图5B)相比于MP4CO(图5A)在40℃ 的加速储存条件下储存多达1个月时在高盐解离条件(0.9M MgCl2)下 的体积排阻色谱图(LC)。
图6是SVA-PEG-Hb(SP4CO，图6B)相比NPC-PEG-Hb(NP4CO， 图6A)在32℃的加速储存条件下储存9天时在高盐解离条件下的LC。
在所有图式中，对应的参考符号指示对应的部分。
具体实施方式
本发明的聚环氧烷血红蛋白缀合物和其药物组合物相比于已知 的氧或非氧合血红蛋白治疗剂表现出增强的稳定性，具有抵抗形成通 过在解离条件下的LC观察到的高分子量成分或抵抗PAO与血红蛋 白分离的长期和短期储存稳定性。它们还比已知的氧或非氧合血红蛋 白治疗剂更均质。与制造已知血红蛋白治疗剂所需要的反应时间相 比，这些缀合物还可以经由在温和条件下的具有短反应时间的简单一 步式反应来制造。
不受任何特定理论的约束，据信血红蛋白与PAO之间的戊酸酯 链接子导致稳定性增强。由于戊酸酯链接子所产生的PAO与连接血 红蛋白分子的键之间的距离比由于其它常见链接子例如碳酸对硝基 苯酯-PEG(NPC-PEG)、琥珀酰亚胺基碳酸酯-PEG(SC-PEG)和马来酰 亚胺-PEG(MalPEG)所产生的距离大。血红蛋白键接至PAO的约8.8 埃的这种更大的间距似乎使PAO-血红蛋白键稳定。
本发明涉及PAO血红蛋白缀合物，其具有在37℃和pH 7.4下测 量的介于约2至约30mmHg之间的P50。PAO经由氨基反应性部分 共价连接至血红蛋白分子上的氨基酸侧链。该氨基反应性部分通过 –C(O)–(CH2)p–链接至PAO，其中p是1至约20的整数，优选为1至 约12，更优选为1至约8，2至约6，且最优选地，p为4。
血红蛋白任选地分子内交联。更具体地说，血红蛋白可以通过本 领域中已知的常规方法β,β-分子内交联或α,α-分子内交联。
当血红蛋白为β,β-分子内交联时，PAO血红蛋白缀合物的P50 优选为约2至15mmHg，更优选为约2至10mmHg，且最优选为约 7mmHg。
当血红蛋白为α,α-分子内交联时，PAO血红蛋白缀合物的P50 优选为约20至30mmHg。
更具体地说，PAO血红蛋白缀合物具有以下结构：
Figure BDA0000802056640000091
其中Hb是血红蛋白，N是血红蛋白的氨基，L是链接子 –C(O)–(CH2)p–，X是端基，m是缀合至血红蛋白的活化PEG聚合物 的平均数目，n是平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的 氧亚乙基单元的平均数目，且p是1至20的整数。优选地，该平均 分子量为约3,000至约10,000道尔顿，更优选为约4,000至约6,000 道尔顿，且最优选为约5,000道尔顿。优选地，缀合至血红蛋白的活 化PEG聚合物的数目m介于平均每个血红蛋白四聚体为约6至约10， 优选约7或8。链接子–C(O)–(CH2)p–中的亚乙基单元的数目p优选为 1至约12的整数，更优选为1至约8，2至约6，且最优选地，p为4。 优选的PAO血红蛋白缀合物具有以下结构：
Figure BDA0000802056640000101
其中Hb、N、X、m和n是如上所定义。
本发明的PAO血红蛋白缀合物可以通过包括使血红蛋白与至少 一个PAO聚合物反应的方法来制备。PAO聚合物具有以下结构：
Figure BDA0000802056640000102
其中R是氨基反应性部分，L是链接子–C(O)–(CH2)p–，X是端 基，n是平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧亚乙基 单元的平均数目，且p是1至20的整数。优选地，该平均分子量为 约3,000至约10,000道尔顿，更优选为约4,000至约6,000道尔顿， 且最优选为约5,000道尔顿。链接子–C(O)–(CH2)p–中的亚乙基单元的 数目p优选为1至约12的整数，更优选为1至约8，2至约6，且最 优选地，p为4。优选的PAO聚合物具有以下结构：
Figure BDA0000802056640000103
其中R、X和n是如上所定义。
X是PAO的端基，且可以是羟基、芳氧基例如苄氧基或C1-C20烷氧基，更优选为C1-C10烷氧基，且再更优选为C1-C5烷氧基例如甲 氧基或乙氧基。优选地，X是甲氧基。
R可以是将与血红蛋白的氨基残基反应的任何氨基反应性部分， 例如琥珀酰亚胺基或对硝基苯基。优选地，R是琥珀酰亚胺基。
本发明可以利用各种Hb。Hb可以从动物来源例如人、牛、猪或 马血红蛋白得到。优选人Hb。Hb可以从自然来源得到或可以是重组 的(例如，通过已知的重组方法生成)。
本发明的血红蛋白可以具有高氧亲和力，其介于约2至约20 mmHg之间，优选介于约2至约10mmHg之间，且更优选为7mmHg。
血红蛋白可以分子内交联以防止解离成二聚体且避免被肾脏清 除，从而延长循环半衰期。在本领域中已知用于分子内交联Hb的多 种方法。化学交联剂包括戊二醛(美国专利号7,005,414)、聚醛(美国 专利号4,857,636)、琥珀酰水杨酸(美国专利号4,529,719)、吡啶氧基 -5'-磷酸酯(美国专利号4,529,719)、均苯三甲酰三(磷酸甲酯)(美国专利号5,250,665)、二炔烃(用于和具有叠氮化物链接子的血红蛋白反 应)。见Foot等人，Chem.Commun.2009,7315-7317；Yang等人， Chem.Commun.2010,46:7557-7559)，且血红蛋白可以经由重组方法 交联。
可以如先前由Walder,Biochem,1979:第18卷(20):4265-70所 述，通过从压积红血球制备的无基质血红蛋白与双(3,5-二溴水杨基) 富马酸酯(DBBF)的反应来制备Β,β-DBBF交联Hb。例如，可以使硼 酸盐缓冲剂(pH～8.5)中的氧合SFH与两倍摩尔过量的DBBF在约 2-8℃下反应约16小时。
用于缀合本发明血红蛋白的聚环氧乙烷包括但不限于聚环氧乙 烷、聚环氧丙烷和聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物。PAO的分子量为 约2,000至约20,000道尔顿，优选约3,000至约10,000道尔顿，更 优选约4,000至约6,000道尔顿，且最优选约5,000道尔顿。目前用 于修饰Hb表面的最常见的PAO为PEG，这是由于其药学可接受性 和商业可用性。基于分子内环氧乙烷重复亚基(即-CH2CH2O-)的数目， 可以利用多种分子量的PEG，以基于缀合至Hb的PEG分子的数目 和大小实现所需分子量。
将PAO聚合物的一个或两个末端基团转化为反应性官能团("活 化的")。例如，已经使用PEG-OH来制备PEG-卤化物、甲磺酸酯或 甲苯磺酸酯，然后通过进行与氨水(Zalipsky,S.等人，1983,Eur.Polym. J.19:1177-1183)、叠氮化钠或邻苯二甲酰亚胺钾的亲核置换反应将其 转化为PEG-胺("PEG-NH2")。然后可以通过PEG胺基(-“NH2”)与血红 素蛋白的羧基(“-COOH”)的相互作用使活化PEG与该血红素蛋白缀 合。
许多含有官能团的分子可在商业上购得，以允许通过添加其它分 子来修饰蛋白质。这些分子例如聚乙二醇通常通过将一个或多个官能 团添加到其末端上而活化。如本文所使用，PAO是通过对其进行修饰 以包含琥珀酰亚胺基或“琥珀酰亚胺”而活化。琥珀酰亚胺具有式 C4H5NO2的环状酰亚胺，其可以与蛋白质序列中的赖氨酸和末端缬氨 酸中的游离胺反应。相比之下，马来酰亚胺是式H2C2(CO)2NH的环 状不饱和酰亚胺，其可以与半胱氨酸残基中的巯基反应且还可以与赖 氨酸和组氨酸残基中的游离胺在较小程度上反应。琥珀酰亚胺从活性 戊酸酯形成稳定的离去基团，而马来酰亚胺直接与巯基反应形成共价 键。
活化PAO包括将胺反应性部分连接至PAO的间隔臂。该间隔臂 优选为二价戊酸根离子。此类活化PAO可在商业上购得且包括例如 甲氧基聚(乙二醇)琥珀酰亚胺基戊酸酯(mPEG-SVA)((Laysan Bio,Inc., Arab,AL)。此类官能性PEG可以利用已知方法与血红蛋白的表面氨 基酸侧链例如赖氨酸残基或末端缬氨酸残基缀合。
下表1中呈现了可以利用胺反应化学进行修饰以与PAO缀合的 人类Hb的氨基酸残基侧链的非限制实例：
表1-胺反应化学和可能的修饰位点
Figure BDA0000802056640000121
Figure BDA0000802056640000131
可以通过缀合反应来调节PAO-Hb的分子量。提高用于缀合过程 的反应物的摩尔比通常增加与Hb结合的PEG分子的数目。优选地， 在缀合反应中使用超过Hb约8倍至约20倍摩尔过量的活化PAO。 更优选地，使用超过Hb为10倍摩尔过量的活化PAO例如 mPEG-SVA。
血红蛋白在其呈其氧合状态时与活化聚环氧烷缀合，以提高 Hb-PAO缀合物的氧亲和力。
血红蛋白还可以在其呈脱氧状态时与活化聚环氧烷缀合，以相对 于在氧合状态下缀合的血红蛋白降低氧亲和力。
可以使用具有相对短反应时间的一步式mPEG-SVA缀合反应来 制备SVA-PEG化血红蛋白。在一个实施方案中，使起始材料 mPEG-SVA和血红蛋白在约7至约8.5的pH和约5至约15℃的温度 下反应约1至约2小时。PAO聚合物以超过血红蛋白浓度约8倍至约 20倍摩尔过量，优选10倍摩尔过量的浓度存在。
当与使用mPEG-Mal使血红蛋白PEG化相比时，实现了以下优 点：1)不需要单独进行硫醇化反应来增加mPEG-Mal与血红蛋白的反 应位点的数目；2)所得缀合物更均质，据信这是由于酰胺键更稳定和 /或不含来自残留亚氨基硫杂环戊烷的杂质；3)反应更有效，从而减少 反应时间；4)保留了血红蛋白中的天然β93半胱氨酸部分，这反过来 增强血红素稳定性；以及5)戊酸酯键更稳定，据信这是由于琥珀酰亚 胺基与PEG聚合物之间的距离从3.5埃增加到8.8埃。
本发明的血红蛋白缀合物可以呈氧合或脱氧形式，可以与CO或 NO配位，或可以为包括这四种形式中的两种或更多种的混合物。通 过用空气、纯O2气或O2/氮气混合物使非氧合血红蛋白平衡来制备 HbO2。
可以通过本领域已知的任何方法进行脱氧。一种简单方法是将血 红蛋白溶液暴露于惰性气体，例如氮气、氩气或氦气。为了确保脱氧 相对均匀，使Hb溶液在这个过程中循环。可以通过使用Co-血氧计 682(Instrument Laboratories)进行监测脱氧以达到所需水平。如果需要 部分再氧合，可以将脱氧Hb暴露于氧气或含有氧气的气体混合物例 如空气。
可以通过气体渗透膜例如聚丙烯或醋酸纤维素膜实现气体交换， 以用另一种气体置换分子氧。参见例如公开的美国专利申请号 2006/0234915。利用这些膜的市售气体交换装置包括来自 Hoechst-Celanese(Dallas,TX)的CelgardTM聚丙烯微孔中空纤维装置 或来自American Laboratory(East Lyme，CT)的Cell-PharmTM中空纤维 氧合器。在Hoechst-Celanese CelgardTM装置中，通过使Hb水溶液以 10-100ml/min/ft2通过聚丙烯微孔中空过滤器使氧合Hb脱氧，同时在 5-20psi下用氮气吹洗系统。通常使Hb循环约5至30分钟以达到所 需的脱氧Hb百分比。产生脱氧Hb的另一种方法包括将Hb溶液暴 露于化学还原剂，例如抗坏血酸钠、连二硫酸钠和亚硫酸氢钠。通过 调节还原剂浓度、反应时间和温度使Hb部分脱氧。或者，还原剂可 以用于大体上使Hb脱氧，然后可以再引入氧气以形成部分脱氧产物。例如，可以在添加抗氧化剂之前使Hb暴露于100mM浓度的亚硫酸 氢钠下约1小时。
可以使用用于形成氧合血红蛋白的任何已知方法，仅用CO代替 O2，使Hb与CO配位。这通常涉及向血红蛋白溶液中引入CO源， 以使血红蛋白变成与CO配位，而不是O2(K.D.Vandegriff等人， Biochem.J.382:183-189(2004))。因为血红蛋白对CO的亲和力比对 氧气高，所以不必先使血红蛋白脱氧。因此，形成CO-Hb复合物的 最方便的方式是通过向血红蛋白溶液引入100％气态CO。
可以通过使脱氧血红蛋白与一氧化氮气体反应，或通过将CO-Hb 暴露于NO气体以使得NO交换CO，制备HbNO。还可以通过使脱 氧血红蛋白与NO供体小分子如PROLI NONOateTM(即，1-(羟基 -NNO-氧偶氮基)-L-脯氨酸二钠盐；Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan)反应来制取HbNO。
应当注意的是，NO自由基与球蛋白链中的氨基酸侧基结合的血 红蛋白并非本文所定义的NO-Hb，因为这类化合物在血红素口袋中 不含代替氧作为配体的二原子(非离子型)NO。例如，当将天然血红蛋 白在使NO供体与游离巯基结合的条件下暴露于该NO供体时，形成 亚硝酰基血红蛋白(美国专利号6,627,738)。这类亚硝酰基血红蛋白仍 携带有氧，而本发明的NO-Hb复合物没有。此外，当通过例如以上 所述针对巯基部分的反应形成经修饰的血红蛋白时，这些部分不再可 用于NO结合。
可以将本发明的PAO-Hb缀合物配制成在用于肠胃外施用的药 学上可接受的载体例如水性稀释剂中包含PAO-Hb缀合物的药物组 合物。载体中PAO-Hb缀合物的浓度可以根据应用而变化。优选地， PAO-Hb缀合物浓度的范围是从约0.l g/dl至约10g/dl，更优选从约 2.0g/dl至约8.0g/dl，且最优选约4.0至约6.0g/dl。适当的血红蛋白 浓度的选择取决于血红蛋白最终产物的胶体渗透(胶体渗透压)性质。 优选地，本发明的组合物与全血相比具正常胶体渗透压或与血浆相比 具高胶体渗透压。可以调节血红蛋白浓度以获得每种适应症的所需胶 体渗透压。
当将所述组合物配制成肠胃外制剂时，溶液通常包含与全血等渗 并且维持血红蛋白的可逆性携带和输送氧气、CO或NO的性质的生 理相容性电解质载体。
药学上可接受的载体可以是水性稀释剂。水性稀释剂可以包括胶 体水溶液或非携氧组分水溶液，例如蛋白质(例如白蛋白)水溶液、糖 蛋白水溶液、多糖水溶液或其组合。水性稀释剂可以包括无细胞水溶 液。
适合的水性稀释剂包括但不限于生理盐水、盐水-葡萄糖混合物、 林格氏溶液(Ringer's solution)、乳酸林格氏溶液、洛克-林格氏溶液 (Locke-Ringer's solution)、克雷布-林格氏溶液(Krebs-Ringer's solution)、哈特曼平衡盐水(Hartmann's balancedsaline)、肝素化柠檬 酸钠-柠檬酸-右旋糖溶液、醋酸盐溶液、多电解质溶液(例如，来自Baxter International，Deerfield，IL的Plasma
Figure BDA0000802056640000162
或Plasma
Figure BDA0000802056640000161
)、 乳糖酸盐溶液和聚合物血浆替代品(例如聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷 酮、聚乙烯醇、环氧乙烷-丙二醇缩合物)或其组合。
所述组合物可以另外包含药学上可接受的填料、盐和本领域中众 所周知的其它物质，其选择取决于剂型、被治疗的病状、根据本领域 一般技术人员的决定要达到的特定目的和此类添加剂的性质。例如， 所述组合物可以包括生理缓冲剂、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露 糖醇或山梨糖醇)、醇或多元醇、药学上可接受的盐(例如，氯化钠或 氯化钾)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)、抗氧化剂、抗菌剂、 胶体渗透压剂(例如，白蛋白或聚乙二醇)或还原剂(例如，抗坏血酸、 谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸)。
药物组合物的粘度为至少约2厘泊(cP)。更具体地说，粘度范围 是从约2至约5cP，特别是约2.5至约4.5cP。
为避免施用的复杂化，药物组合物具有高纯度，即没有基质、磷 脂和热原，如通过LAL(鲎变形细胞溶解物)试验所测量具有不超过 0.25EU/ml的内毒素水平，并且具有小于8％的高铁血红蛋白。
可以经肠胃外例如通过皮下、静脉内或肌肉内注射或作为大体积 肠胃外溶液施用药物组合物。该组合物还可以通过灌胃来施用。
血红蛋白缀合物作为治疗剂的典型剂量可以是约1至约15,000 毫克血红蛋白/千克患者体重。例如，当用作氧治疗剂时,剂量范围将 介于100至7500mg/kg患者体重之间，更优选为500至5000mg/kg 体重，且最优选为700至3000mg/kg体重。因此，用于人类患者的 典型剂量可以为1克至1000克以上。应该了解，每种剂型的个别剂 量中所含的活性成分的单位含量本身无需构成有效量，因为可以通过 施用许多个别剂量达到所需的有效量。剂量的选择取决于利用的剂 型、被治疗的病状和根据本领域技术人员的决定要达到的特定目的。
PAO-Hb缀合物和药物组合物可以用于向受试者输送氧气、CO 和/或NO。向组织输送氧气、一氧化氮、一氧化碳或其混合物和还原 亚硝酸盐以在微脉管系统中进一步生成内源性一氧化氮(NO)的方法 包括向有需要的受试者施用该血红蛋白缀合物或该组合物，其中在施 用之后，血红蛋白变成未配位并在微脉管系统中将亚硝酸盐转化为一 氧化氮。
本发明的血红蛋白缀合物和其组合物可以用于：治疗急性肝衰 竭、β-地中海贫血、烧伤、慢性临界性肢体缺血、二氧化碳或氰化物 中毒、慢性阻塞性肺病(COPD)(例如，急性加重)、充血性心力衰竭(例 如，急性心力衰竭、慢性心力衰竭)、缺氧(例如，高海拔地区使用， 包括用于肺水肿、减压病)、疟疾(例如，脑型疟疾(恶性疟原虫闭塞事 件))、器官缺血(例如，急性肠缺血(扭转)、急性肠缺血(栓塞)、心源 性休克、急性血管器官缺血、中风(CAT扫描前)、中风(CAT扫描后)、 心肌梗塞/重度心脏缺血)、外周血管疾病、卟啉症、孕期先兆子痫、 败血症、镰状细胞病(例如，中风/短暂性缺血发作、脾隔离症、肝隔 离症、阴茎持续勃起症)、视网膜疾病/眼内病状(例如，视网膜中央动 脉阻塞、中央静脉阻塞)、睾丸扭转、创伤/休克(例如，创伤性出血性 休克、非创伤性出血性休克、院前/现场使用(军用/急诊)、创伤性脑 损伤/爆炸)、溃疡或血管痉挛；用作血管成形术的辅助物，用作整形 手术的辅助物(皮瓣)(例如，急性治疗、慢性治疗)，或在植入心室辅 助装置中用作辅助物；用作血液替代品(例如，用于急性失血、难以 交叉匹配患者的耶和华见证人(Jehovah'sWitness)、稀有血型组、镰状 细胞再生障碍危象、镰状细胞贫血围手术期处理、急性溶血性贫血(自 身免疫性)、急性溶血性贫血(毒素)或其它难治性贫血)、保心药、冷 冻保存剂、血液透析辅助物、肿瘤剂(例如，放射疗法或化学疗法的 辅助物，实体瘤)、器官保存剂(例如，活体外、供体内、受者体内)、 性能增强剂(例如民用/运动员用、军用)、手术辅助物(例如，心肺分 流术(预充)、心肺分流术(调节)、肺缺血、手术前调节、破裂性主动 脉瘤、代替胸主动脉(夹层形成或动脉瘤))或伤口愈合剂；用于成像(x 射线或磁共振成像(MRI))；改善肺功能(例如，急性肺损伤、慢性肺 损伤、短暂性病毒性肺炎、新生儿窘迫综合症)；或其组合。此类用 法包括向有需要的受试者施用该缀合物或组合物。
另外，本发明的血红蛋白和组合物可以用于治疗非创伤性出血性 休克、院前环境创伤、创伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘 迫综合症、创伤性脑损伤、中风、实体瘤癌症、器官退化(离体)、器 官退化(受者体内)、重度败血症/败血性休克、心肌梗塞/心脏缺血、 心源性休克、急性心力衰竭、肺栓塞、各种因手术出现的病状(例如， 作为血管成形术的辅助物、胸主动脉修复的辅助物、心肺分流术的辅 助物、心肺分流术的预充液)或其组合。
其中本发明的血红蛋白和组合物有用的许多临床环境包括以下：
创伤。全血急性损失可以导致体液从胞间隙和细胞内间隙转移以 代替失去的血量，同时使血液分流远离包括皮肤和肠的低优先级器 官。血液分流远离器官降低且有时消除了这些器官中的O2水平并且 导致渐进性组织死亡。首要目标是氧合受影响的组织。这种创伤可以 处于院前环境或可以导致创伤性出血性休克或创伤性脑损伤。
缺血。所述缀合物和其组合物还可以用于向红血球或许多其它氧 治疗剂不能渗透的区域输送氧气、CO和/或NO。这些区域可以包括 位于红血球流动障碍物下游的任何组织区域，例如血栓、镰状细胞阻 塞、动脉阻塞、血管成形术球囊、手术器械的下游区域，以及遭受氧 气匮乏或缺氧的任何组织。所有类型的组织缺血均可以被治疗，包括 例如中风、新兴中风、短暂性缺血发作、心肌顿抑和冬眠、急性或不 稳定性心绞痛、新兴心绞痛、梗塞等。具体地说，导致缺血的病状包 括急性心力衰竭、心源性休克、心肌梗塞/心脏缺血、中风、肺栓塞、 非创伤性出血性休克或脑血管创伤。
血液稀释。在这种应用中，施用治疗剂以代替(或取代)取出的自 体血的O2水平。这样允许在手术期间和之后使用取出的自体血进行 必要的输血。这样一个需要术前除血的手术将为心肺分流术。
败血症/败血性休克。在败血症中，尽管有大量输液疗法和用血 管收缩剂治疗，但是一些患者可能变成高血压。在这种情况下，一氧 化氮(NO)过量产生导致血压降低。因此，血红蛋白是治疗这些患者的 理想试剂，因为血红蛋白以高亲和力结合NO。
低氧血症。当患者具有由肺炎或胰腺炎引起的急性肺损伤时，可 以观察到低氧血症并且可以通过提供本发明的血红蛋白或组合物以 氧合受影响的组织而减轻。
癌症。向实体瘤肿块的缺氧内核输送O2增加了其对放射疗法和 化学疗法的敏感性。因为肿瘤的微脉管系统与其它组织不同，所以通 过增加O2水平敏化需要O2在缺氧核内卸载。换言之，P50应该非常 低以防止O2早期卸载，增加O2水平以确保肿瘤对后续的放射和化学 疗法治疗的最佳敏化。
手术。在各种手术程序期间可以使用本发明的血红蛋白和组合 物。例如，它们可以用作血管成形术、胸主动脉修复、心肺分流术期 间的辅助物或作为心肺预充液。
器官灌注。在将器官离体保存或在器官捐赠受者体内期间，维持 O2含量有助于保持结构和细胞完整性并将梗塞形成减到最少。所述 血红蛋白和组合物可以维持此类器官的氧气需求。
所述血红蛋白和其组合物还可以用于非人类，例如家畜(例如， 牲畜和宠物如狗、猫、马、鸟、爬行动物)。预期本发明发现了在紧 急治疗遭受由于损伤引起的失血、溶血性贫血等的家畜和野生动物中 的实用性。兽用包括治疗由于损伤伤引起的失血、溶血性贫血、感染 性贫血、细菌感染、因子IV断裂、脾机能亢进和脾肿大、禽类出血 性综合症、再生不良性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血性病 状、缺铁、同族免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生病 或手术麻醉引起的脑损伤。
定义
当在本公开中使用术语"一"、"一个"或"一种"时，除非另外指出， 否则它们意指"至少一个"或"一个或多个"。
如本文所使用，"活化聚环氧烷"或"活化PAO"是指具有至少一个 官能团的PAO分子。官能团是与要和PAO缀合的分子上的游离胺、 巯基或羧基相互作用的反应性部分。例如，与游离巯基反应的一个此 类官能团为马来酰亚胺基。与游离胺反应的官能团为琥珀酰亚胺基。
"脱氧血红蛋白"或"非配位血红蛋白"意指没有外源配体与血红素 结合的任何血红蛋白。
"血红蛋白"或"Hb"通常是指运输氧的血红素蛋白。在人类中，每 个Hb分子有4个亚基(2个α-链亚基和2个β-链亚基)，它们呈四聚 体结构形式排列。每个亚基还含有一个血红素基团，其为亚铁(Fe2+) 中结合配体O2、NO或CO的含铁中心。因此，每个Hb分子可以结 合多达4个配体分子，分别生成HbO2、HbNO或HbCO配位化合物。 另外，血红蛋白可以与O2、NO和CO的混合物配位。
"血红蛋白类氧载体"(HBOC)是指携带氧，但是也可用于携带其 它分子气体例如一氧化碳和一氧化氮的血红蛋白。
"高氧亲和力"是指已经被修饰成表现出高于无基质血红蛋白 (SFH)的氧亲和力的血红蛋白。因此，“高氧亲和力”Hb的P50小于 SFH的，如在37℃和pH 7.4下所测量，其具有15mmHg的P50。
"配位血红蛋白"意指外源配体与血红素结合的血红蛋白。常见的 优选配体包括氧、一氧化碳和一氧化氮。
"MalPEG"是指马来酰亚胺基聚乙二醇，且包括经由链接子附接 至聚乙二醇的马来酰亚胺基部分。
"MalPEG-Hb"是指已经与马来酰亚胺基活化PEG缀合的Hb。通 过使MalPEG与Hb上的硫醇基(并且在较小程度上与氨基)反应形成 MalPEG-Hb进行缀合。在Hb氨基酸序列中存在的半胱氨酸残基中发 现硫醇基，例如位于βCys 93处的两个内在硫醇，并且还可以通过将 表面氨基修饰为含有硫醇基来引入。称为MP4(Sangart，Inc.)的示例 性MalPEG-Hb具有下式：
Figure BDA0000802056640000221
其中Hb为血红蛋白；S为血红蛋白上的硫醇基；n为5,000道尔 顿聚环氧烷聚合物的氧亚乙基单元的数目；且m为与血红蛋白缀合 的马来酰亚胺基活化聚环氧烷聚合物的平均数目且为7-8。
"高铁血红蛋白"或"metHb"是指含有呈高铁状态的铁的Hb氧化 形式。MetHb不起氧或CO载体的作用。如本文所使用，术语"高铁 血红蛋白％"是指氧化Hb占总Hb的百分比。
"甲氧基-PEG"或"mPEG-OH"是指其中羟基末端的氢被甲基 (-CH3)置换的PEG。
"经修饰的血红蛋白"或"经修饰的Hb"是指已经通过化学反应例 如分子内和分子间交联、聚合、缀合和/或重组技术发生改变的Hb， 这使得Hb不再呈其"天然"状态。除非另外指出，否则如本文所使用， 术语"血红蛋白"或"Hb"是指天然未经修饰的Hb和经修饰的Hb。
"亚硝酸盐还原酶活性"或"NRA"是血红蛋白或血红蛋白类蛋白 质将亚硝酸盐还原为一氧化氮的能力。"最高亚硝酸盐还原酶活性"是 血红蛋白或血红蛋白类蛋白质能够将亚硝酸盐还原为一氧化氮的最 大速率。"初始亚硝酸盐还原酶活性"是在向完全脱氧蛋白添加亚硝酸 盐时，血红蛋白或血红蛋白类蛋白质将亚硝酸盐还原为一氧化氮的初 速速率。
术语"非氧合"意指血红素蛋白或血红蛋白呈非配位、脱氧状态， 或其与除O2外的气体例如NO或CO配位。
"氧亲和力"是指氧载体例如Hb结合分子氧的亲和性。用将Hb 分子的氧饱和度(Y轴)与氧分压(X轴)联系起来的氧平衡曲线来定义 这种特性。用"P50"值表示该曲线的位置，P50值是氧载体受氧气半饱 和的氧分压并且与氧亲和力负相关。因此，P50越低，氧亲和力越高。 可以通过本领域已知的各种方法测量全血(和全血组分，例如红细球 和Hb)的氧亲和力(参见例如Winslow,R.M.等人，J.Biol.Chem.1977, 252:2331-37)。还可以使用市售的HEMOXTM分析仪(TCS Scientific Corporation，New Hope，PA)测定氧亲和力。(参见例如Vandegriff and Shrager in“Methods in Enzymology”(Everse等人编辑)232:460(1994))；和Vandegriff等人，Anal.Biochem.256(1):107-116(1998))。
如本文所使用，术语"氧治疗剂"是指能够结合并携带分子氧至有 需要的细胞/组织/器官的血红素蛋白。当以CO或NO配位血红素蛋 白形式施用时，CO或NO一旦从血红素部分释放，血红素基团就自 由结合并携带分子氧。
"聚乙二醇"或"PEG"是指化学通式H(OCH2CH2)nOH的聚合物， 其中"n"大于或等于4，优选约45至约500，更优选约70至约250， 且最优选约90至约140，或约115。该聚合物可以被取代或未被取代， 且末端羟基可以被不同的常规端基例如甲氧基或羧基置换。PEG可以从许多来源购得(例如，CarbowaxTM(Dow Chemical,Midland,MI)、
Figure BDA0000802056640000231
(ArchChemicals,Norwalk,CT)和Solbase)。
"聚乙二醇缀合血红蛋白"、"PEG-Hb缀合物"或"PEG-Hb"是指与 至少一个PEG共价连接的Hb。
"溶液"是指液体混合物且术语"水溶液"是指含有一些水的溶液并 且还可以含有一种或多种其它液体物质与水一起形成多组分溶液。
"无基质血红蛋白"或"SFH"是指已经从中去除了红血球膜的Hb。
"表面修饰血红蛋白"是指化学基团(通常为聚合物，例如葡聚糖或 聚环氧烷)已经与之连接的血红蛋白。术语"表面修饰氧合血红蛋白" 是指当其经表面修饰时呈"R"状态的Hb。
"末端活性"是被能够与血红素蛋白或血红蛋白的反应基反应的 部分官能化的PAO的百分比的表示。"100％末端活性"指示在所有 PAO均具有能够与血红素蛋白或血红蛋白的反应基反应的部分的基 础上表示缀合反应中所使用的PAO的摩尔过量。例如，如果可用 Mal-PEG具有80％末端活性以致80％的PEG被Mal官能化，并且使 用超过血红蛋白20倍摩尔过量的Mal-PEG，则可以基于100％末端 活性将这个摩尔比表示为Mal-PEG超过血红蛋白16倍摩尔过量。
"硫醇化"是指增加分子上巯基的数量的过程。例如，使蛋白质与 2-亚氨基硫杂环戊烷("2-IT")反应将蛋白质表面上的游离胺转化为巯 基。这些巯基然后可用于和硫醇反应性部分例如马来酰亚胺反应。
“非配位血红蛋白”是指包含未与分子气体例如氧气、一氧化碳或 一氧化氮配位的至少一个血红素部分的任何血红蛋白。正因如此，如 果仅有一个血红素部分未与分子气体配位，则将血红蛋白视为"非配 位"。
如本文所使用，术语“SVA-PEG-Hb”是指已经与mPEG-SVA缀合 的Hb。
虽然已经详细描述了本发明，但应该了解，修改和变化在不脱离 随附权利要求书中所限定的本发明的范围的情况下是可能的。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。
实施例1–SVA-PEG-Hb的制备
从商业来源，例如从地方血库、纽约血液中心(New York Blood Center)或美国红十字会(American Red Cross)获得压积红血球 (“RBC”)。从采集时起获得材料不超过45天。在使用前对所有单元进 行关于病毒感染的筛检并进行核酸测试。通过膜滤法对非白细胞耗尽 的汇集单元进行白细胞耗尽以去除白血球。将压积RBC汇集到无菌 容器中并且储存在2-15℃下直到进一步处理。标注体积并使用市售联 合血氧计或其它领域公认的方法测定Hb浓度。
使用0.45-μm切向流过滤法，用六体积的0.9％氯化钠冲洗RBC， 然后通过降低盐浓度使细胞溶解。使用相同膜进行Hb提取。通过用 于白蛋白的分光光度分析对细胞冲洗物进行分析，以检验血浆组分的 去除。在冷却条件下将溶解物处理通过0.16-μm膜以纯化Hb。将纯 化Hb汇集在无菌去热原容器中，然后超滤以去除病毒。可以进行额 外的病毒减少步骤，包括溶剂/洗涤剂处理、纳米过滤和阴离子Q膜 纯化。这个过程中的所有步骤均在2-15℃下进行。
使用30-kD膜，将Hb从溶解物交换到林格氏乳酸盐(“RL”)或磷 酸盐缓冲盐水(“PBS”，pH 7.4)中。将Hb浓缩至1.1-1.5mM(呈四聚体)。 使用10至12体积的RL或PBS进行溶剂交换。此过程在2-15℃下进 行。在硫醇化之前，将在RL或PBS中制备的溶液的pH调节至8.0。 通过0.45或0.2-μm一次性过滤囊无菌过滤Hb，并且在进行化学修饰 反应前储存在4±2℃下。
PEG缀合：使用基于100％末端活性超过起始四聚体Hb浓度10 倍摩尔过量的mPEG-SVA，使mPEG-SVA(Laysan Bio,Inc.,Arab,AL) 缀合至SFH。首先允许Hb与大气平衡，以氧合Hb。使含在RL(pH 7.0-8.5)、PBS或任何类似缓冲液中的约1mM Hb与含在相同缓冲液 中的10mM mPEG-SVA合并。在10±5℃下连续搅拌该混合物约2小 时。
将所得PEG-Hb缀合物处理通过70-kD膜(即，<10透析体积过滤) 以去除未反应的试剂。通过在540nm和217nm下的体积排阻液相色 谱法(“LC”)监测此过程。将浓度调节至4g/dl Hb，并将pH调节至6.0 至7.8或7.0±1.0的范围。
使用0.2-μm一次性无菌囊无菌过滤PEG-Hb缀合物并汇集到 4±2℃下的无菌去热原容器中。将PEG-Hb缀合物稀释在RL中达4.4 g/dL，并将pH调节至7.4±0.2，然后无菌过滤(0.2μm)并等分在不含 内毒素的无菌容器中。
最终PEG化血红蛋白缀合物(“SVA-PEG-Hb”或“SP4”)具有表1 中所示的性质：
表1：PEG-ββ-Hb的性质
性质 值
Hb浓度(g/dL) 4.4
pH 7.4
PEG化程度 8–9
COP(mmHg) 85
P50(mmHg) 7
希尔数(n值) 1.1
经由标准方法进一步确认了SVA-PEG-Hb的结构。
实施例2–SVA-PEG-Hb的稳定性测试
经由非解离排阻色谱法(LC)分析与MalPEG-Hb(称为MP4)和 SFH相比的实施例1的SVA-PEG-Hb。这些结果被描绘在图4中。该 图表明SVA-PEG-Hb是比MP4更均质的产物。
图5是与CO配位的SVA-PEG-Hb(SP4CO，图5B)相比于与CO 配位的MP4形式(MP4CO，图5A)在40℃的加速储存条件下储存多 达1个月时在高盐解离条件(0.9M MgCl2)下的LC分析。该色谱图显 示SP4CO在这种加速稳定性测试后比MP4CO保持更高的稳定性。
图6是与CO配位的SVA-PEG-Hb(SP4CO，图6B)相比于与CO 配位的NPC-PEG-Hb(NP4CO，图6A)在32℃的加速储存条件下储存9天时在高盐解离条件(0.9M MgCl2)下的LC分析。该色谱图显示 SP4CO在这种加速稳定性测试后比NP4CO保持更高的稳定性。示出 左移峰的色谱图说明通过在高盐解离条件下的LC观察到NP4CO相 比于SP4CO形成更高分子量的成分。
当介绍本发明或其优选实施方案的元件时，冠词"一"、"一个"、" 该"和"所述"意指有一个或多个这些元件。术语"包含"、"包括"和"具 有"旨在为包括性且意指可以有除列举的元件外的其它元件。
鉴于以上，应该看出实现了本发明的若干目标且获得了其它有利 结果。
因为在不脱离本发明的范围的情况下可以对上述组合物和方法 作出各种改变，所以希望包含在以上描述和示出在附图中的所有内容 应该被理解为说明性而非限制性。

Claims (62)

1.一种聚乙二醇血红蛋白四聚体缀合物，其具有在37℃和pH7.4下测量的2至10之间的P50，其中所述聚乙二醇血红蛋白四聚体缀合物具有以下结构
Figure FDA0002260643800000011
其中：
Hb是β,β-分子内交联的血红蛋白四聚体，
N是所述血红蛋白四聚体的氨基，
L是链接子–C(O)–(CH2)p–，
X是端基，
m是缀合至所述血红蛋白四聚体的活化聚乙二醇聚合物的平均数目，m平均为每个四聚体6至10个聚乙二醇分子，
n是平均分子量为4,000至6,000道尔顿的聚乙二醇的氧亚乙基单元的平均数目，且
p是4至6的整数。
2.根据权利要求1的聚乙二醇血红蛋白四聚体缀合物，其通过包括使血红蛋白与至少一种聚乙二醇聚合物反应的方法而制备，所述聚乙二醇聚合物具有以下结构：
Figure FDA0002260643800000021
其中R是氨基反应性部分。
3.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述氨基反应性部分通过–C(O)–(CH2)p–链接至所述聚乙二醇，其中p为4。
4.根据权利要求2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中R是琥珀酰亚胺基或对硝基苯基。
5.根据权利要求4所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中R是琥珀酰亚胺基。
6.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中X是羟基、芳氧基或C1-C20烷氧基。
7.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中X是甲氧基。
8.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中m平均为每个四聚体8至9个聚乙二醇分子。
9.根据权利要求2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中当所述血红蛋白呈氧合状态时，所述聚乙二醇经由所述氨基反应性部分共价连接至所述血红蛋白四聚体分子上的所述氨基酸侧链的所述氨基。
10.根据权利要求2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中当所述血红蛋白呈脱氧状态时，所述聚乙二醇经由所述氨基反应性部分共价连接至所述血红蛋白分子上的所述氨基酸侧链的所述氨基。
11.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中双(2,5-二溴水杨基)富马酸酯在所述血红蛋白分子的两个β82赖氨酸残基处交联。
12.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述P50为7mmHg。
13.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述血红蛋白四聚体缀合物的胶体渗透压为至少50mmHg。
14.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述血红蛋白四聚体缀合物与氧配位。
15.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述血红蛋白四聚体缀合物与一氧化碳配位。
16.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述血红蛋白四聚体缀合物与一氧化氮配位。
17.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述血红蛋白四聚体缀合物脱氧。
18.根据权利要求1所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述聚乙二醇具有5,000道尔顿的平均分子量。
19.根据权利要求1或18所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯。
20.根据权利要求1或18所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述聚乙二醇的所述氨基反应性部分与所述血红蛋白四聚体的氨基部分缀合，所述氨基部分选自所述血红蛋白四聚体的赖氨酸残基的ε-氨基部分、所述血红蛋白四聚体的末端缬氨酸残基的α-氨基部分或其组合。
21.根据权利要求20所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述聚乙二醇的所述氨基反应性部分与血红蛋白α-亚基或β-亚基的赖氨酸残基的ε-氨基部分缀合。
22.根据权利要求20所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述聚乙二醇的所述氨基反应性部分与血红蛋白α-亚基或β-亚基的末端缬氨酸残基的α-氨基部分缀合。
23.根据权利要求21所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述赖氨酸残基是人血红蛋白α-亚基的赖氨酸残基，其选自由赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139和其组合组成的组。
24.根据权利要求21所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述赖氨酸残基是人血红蛋白β-亚基的赖氨酸残基，其选自由赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨酸-144和其组合组成的组。
25.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中N-乙基马来酰亚胺与所述血红蛋白四聚体的β93半胱氨酸残基缀合。
26.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述血红蛋白四聚体缀合物与其中所述聚乙二醇聚合物经由所述血红蛋白四聚体的硫醇基或β93半胱氨酸残基缀合且具有以下结构的在其它方面相同的血红蛋白四聚体缀合物相比，当在-20℃下储存36个月或在环境温度下储存至少18个月时具有更高的稳定性：
Figure FDA0002260643800000051
其中X是端基。
27.根据权利要求26所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中X是羟基、芳氧基或C1-C20烷氧基。
28.根据权利要求27所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中所述血红蛋白是重组的。
29.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物和药学上可接受的载体。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述组合物与血液相比具有正常胶体渗透压。
31.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述组合物与血液相比具有高胶体渗透压。
32.根据权利要求29所述的药物组合物，其用于治疗急性肝衰竭、β-地中海贫血、烧伤、慢性临界性肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病、充血性心力衰竭、缺氧、疟疾、器官缺血、外周血管疾病、卟啉症、孕期先兆子痫、败血症、镰状细胞病、视网膜疾病、眼内病状、睾丸扭转、创伤、休克、创伤性脑损伤、溃疡、血管痉挛或其组合。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述器官缺血包括急性肠缺血、栓塞、心源性休克、急性血管器官缺血、中风、心肌梗塞或重度心脏缺血。
34.根据权利要求29所述的药物组合物，其用于治疗非创伤性出血性休克、院前环境创伤、创伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘迫综合症、创伤性脑损伤、中风、实体瘤癌症、器官退化、重度败血症、败血性休克、心肌梗塞、心脏缺血、心源性休克、急性心力衰竭、肺栓塞或其组合。
35.根据权利要求29所述的药物组合物，其用作血管成形术的辅助物，用作整形手术的辅助物或在植入心室辅助装置中用作辅助物；用作血液替代品、保心药、冷冻保存剂、血液透析辅助物、肿瘤剂、器官保存剂、性能增强剂、手术辅助物或伤口愈合剂；用于成像；用于改善肺功能；或其组合。
36.根据权利要求29所述的药物组合物，其用于兽医治疗由于损伤引起的失血、溶血性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV断裂、脾机能亢进和脾肿大、禽类出血性综合症、再生不良性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血性病状、缺铁、同族免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生病或由手术麻醉引起的脑损伤。
37.根据权利要求1或2所述的血红蛋白四聚体缀合物或根据权利要求29所述的药物组合物在制备用于治疗下述疾病的药物中的用途：
(a)所述疾病是急性肝衰竭、β-地中海贫血、烧伤、慢性临界性肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病、充血性心力衰竭、缺氧、疟疾、器官缺血、外周血管疾病、卟啉症、孕期先兆子痫、败血症、镰状细胞病、视网膜疾病、眼内病状、睾丸扭转、创伤、休克、创伤性脑损伤、溃疡、血管痉挛或其组合；或
(b)所述疾病是非创伤性出血性休克、院前环境创伤、创伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘迫综合症、创伤性脑损伤、中风、实体瘤癌症、器官退化、重度败血症、败血性休克、心肌梗塞、心脏缺血、心源性休克、急性心力衰竭、肺栓塞或其组合；或
(c)施用所述血红蛋白四聚体或药物组合物作为血管成形术的辅助物，作为整形手术的辅助物或在植入心室辅助装置中作为辅助物；作为血液替代品、保心药、冷冻保存剂、血液透析辅助物、肿瘤剂、器官保存剂、性能增强剂、手术辅助物或伤口愈合剂；用于成像；用于改善肺功能；或其组合；或
(d)施用所述血红蛋白四聚体或药物组合物作为血管成形术的辅助物、胸主动脉修复的辅助物、心肺分流术的辅助物或作为心肺分流术用预充液；或
(e)所述疾病是兽医治疗由于损伤引起的失血、溶血性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV断裂、脾机能亢进和脾肿大、禽类出血性综合症、再生不良性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血性病状、缺铁、同族免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生病或由手术麻醉引起的脑损伤。
38.根据权利要求37所述的用途，其中在(a)中所述器官缺血包括急性肠缺血、栓塞、心源性休克、急性血管器官缺血、中风、心肌梗塞或重度心脏缺血。
39.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的血红蛋白四聚体缀合物或根据权利要求29所述的药物组合物在制备用于向组织输送氧、一氧化氮、一氧化碳或其混合物和在微脉管系统中将亚硝酸盐还原成一氧化氮的药物中的用途。
40.一种制备根据权利要求1所述的血红蛋白四聚体缀合物的方法，所述方法包括使血红蛋白与具有以下结构的聚乙二醇聚合物反应：
Figure FDA0002260643800000071
其中R是氨基反应性部分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述氨基反应性部分通过–C(O)–(CH2)p–链接至所述聚乙二醇，其中p为4。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述聚乙二醇聚合物以超过所述血红蛋白浓度8倍至20倍摩尔过量的浓度存在。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述聚乙二醇聚合物以超过所述血红蛋白浓度10倍摩尔过量的浓度存在。
44.根据权利要求40所述的方法，其中所述反应在5至15℃下和6.5至8.5之间的pH下进行1至2小时。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述氨基反应性部分是琥珀酰亚胺基或对硝基苯基。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述氨基反应性部分是琥珀酰亚胺基。
47.根据权利要求40所述的方法，其中X是羟基、芳氧基或C1-C20烷氧基。
48.根据权利要求47所述的方法，其中X是甲氧基。
49.根据权利要求40所述的方法，其中所述血红蛋白四聚体与平均每个四聚体7至9个聚乙二醇分子缀合。
50.根据权利要求40所述的方法，其中当所述血红蛋白呈氧合状态时，所述聚乙二醇经由所述氨基反应性部分共价连接至所述血红蛋白分子上的所述氨基酸侧链的所述氨基。
51.根据权利要求40所述的方法，其中当所述血红蛋白呈脱氧状态时，所述聚乙二醇经由所述氨基反应性部分共价连接至所述血红蛋白分子上的所述氨基酸侧链的所述氨基。
52.根据权利要求40所述的血红蛋白四聚体缀合物，其中双(2,5-二溴水杨基)富马酸酯在所述血红蛋白分子的两个β82赖氨酸残基处交联。
53.根据权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其中所述血红蛋白四聚体缀合物的胶体渗透压为至少50mmHg。
54.根据权利要求40所述的方法，其中所述P50为7mmHg。
55.根据权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其进一步包括将所述血红蛋白四聚体缀合物暴露于氧以形成氧合血红蛋白。
56.根据权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其进一步包括将所述血红蛋白四聚体缀合物暴露于一氧化碳以形成一氧化碳-聚乙二醇-血红蛋白四聚体缀合物。
57.根据权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其进一步包括将一氧化碳血红蛋白暴露于一氧化氮以形成一氧化氮-聚乙二醇-血红蛋白四聚体缀合物。
58.根据权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其进一步包括使所述血红蛋白四聚体缀合物脱氧。
59.根据权利要求40所述的方法，其中所述聚乙二醇具有5,000道尔顿的平均分子量。
60.根据权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其中所述聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯。
61.根据权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其中所述聚乙二醇的所述氨基反应性部分与所述血红蛋白四聚体的氨基部分缀合，所述氨基部分选自所述血红蛋白四聚体的赖氨酸残基的ε-氨基部分、所述血红蛋白四聚体的末端缬氨酸残基的α-氨基部分或其组合。
62.根据权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其进一步包括使N-乙基马来酰亚胺与所述血红蛋白四聚体的β93半胱氨酸残基缀合。
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