JP2008525517A - ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を防止する方法 - Google Patents
ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を防止する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008525517A JP2008525517A JP2007548807A JP2007548807A JP2008525517A JP 2008525517 A JP2008525517 A JP 2008525517A JP 2007548807 A JP2007548807 A JP 2007548807A JP 2007548807 A JP2007548807 A JP 2007548807A JP 2008525517 A JP2008525517 A JP 2008525517A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- hgh
- growth hormone
- stripping
- gas
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims abstract description 32
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 64
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 64
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 63
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- -1 mercapto compound Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000001307 helium Substances 0.000 claims description 4
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 40
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 38
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 7
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 3
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L potassium sulfite Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])=O BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019252 potassium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- AOFUBOWZWQFQJU-SNOJBQEQSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolane-2,3,4-triol;(2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AOFUBOWZWQFQJU-SNOJBQEQSA-N 0.000 description 1
- PXJHVKRLFWZUNV-UHFFFAOYSA-N 1-n,4-n-dimethylbenzene-1,4-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.CNC1=CC=C(NC)C=C1 PXJHVKRLFWZUNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N Diammonium sulfite Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])=O PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 244000290594 Ficus sycomorus Species 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Natural products OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122853 Growth hormone antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101000653005 Homo sapiens Thromboxane-A synthase Proteins 0.000 description 1
- 101000809797 Homo sapiens Thymidylate synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010013127 Met-human growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001514 alkali metal chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001617 alkaline earth metal chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L calcium sulfite Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])=O GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010261 calcium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- VDQVEACBQKUUSU-UHFFFAOYSA-M disodium;sulfanide Chemical compound [Na+].[Na+].[SH-] VDQVEACBQKUUSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052743 krypton Inorganic materials 0.000 description 1
- DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N krypton atom Chemical compound [Kr] DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- QTWZICCBKBYHDM-UHFFFAOYSA-N leucomethylene blue Chemical compound C1=C(N(C)C)C=C2SC3=CC(N(C)C)=CC=C3NC2=C1 QTWZICCBKBYHDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 1
- JESHZQPNPCJVNG-UHFFFAOYSA-L magnesium;sulfite Chemical compound [Mg+2].[O-]S([O-])=O JESHZQPNPCJVNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- LNOPIUAQISRISI-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxy-2-propan-2-ylsulfonylethanimidamide Chemical compound CC(C)S(=O)(=O)CC(N)=NO LNOPIUAQISRISI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 1
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052756 noble gas Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002835 noble gases Chemical class 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000005501 phase interface Effects 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229940044476 poloxamer 407 Drugs 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical class [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008354 tissue degradation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000013022 venting Methods 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
【課題】ポリペプチドを含有する液体培地中での、ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を減少するか又は実質的に防止する方法であって、該液体培地をガスで、適切には窒素又はアルゴンのような化学的に非反応性のガスでストリッピングすることを含む方法。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
Description
本発明は、ポリペプチドの三硫化物誘導体の、液体培地中でのそれらの生産又は処理の間の形成を防止するための方法に関する。
特に、本発明は、三硫化物誘導体を実質的に含まないか又はその含まれる量が減少した、ヒト成長ホルモン、又それらの中間体、誘導体、類似体、変異体又は突然変異体の生産に関しする。
ジスルフィド結合を含むポリペプチドの多くが三硫化物誘導体を形成することが知られている。それらの中にはスーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキンムテイン（mutein）及び成長ホルモン（GH）がある。しかしながら、原理的には、ジスルフィド結合を含む他のポリペプチド、例えばインスリン、インターロイキン及びある種の凝固因子(VII因子のような)が、特異的な条件下で潜在的に三硫化物誘導体を形成し得る。
三硫化物誘導体を形成すると知られている最も研究されているポリペプチドは成長ホルモン(GH)、特にヒト成長ホルモンである。用語「ヒト成長ホルモン」(hGH；時に、特に「ソマトロピン」又は「ソマトトロピン」とも呼ばれる)は、一般に、２つのジスルフィド架橋によって架橋結合された、191アミノ酸残基の単鎖から成るタンパク質(ポリペプチド)ホルモンであって、それらの単量体形態が約22000 (22 kDa)の分子量を有するものを指すものと理解される。ヒトの下垂体から単離された成長ホルモン製剤は均質ではない。例えば、同じ遺伝子から生産されたより小さい(20 kDa)変異体が知られている。妊娠中の胎盤によって発現される「基本のhGH」変異体(hGH-V)は、別々の遺伝子の産物であるもう一つの類似体/変異体であり；22 kDa hGHポリペプチドのように、191アミノ酸残基から成るが、該配列の種々の位置において13アミノ酸残基が、22 kDa hGHにおけるものと異なる[例えば、Bewley et al., Adv. Enzymol. 42, 73-166 (1975)、及びFrankenne et al., J. Clin. Endocrin. and Metabol. 66, 1171-1180 (1988)を参照]。
hGH (即ち、22 kDaポリペプチド)において、４つのシステイン残基が存在し2つのジスルフィド架橋を生じている。第一のジスルフィド架橋は、Cys 53及びCys 165の間の大きいループを形成し、一方、第二のジスルフィド架橋は、Cys 182及びCys 189の間の小さいループを形成する。小さいループは、分子の表面に位置し、一方大きいループはhGH分子中に包埋している。三硫化物架橋形成は、小さいループと大きいループの両方において形成し得る。
ヒト成長ホルモンは、幼児期の間の縦方向の骨の成長及び正常な成長発達のために特に必須である。骨折の治癒、脂肪組織の分解及び活動後の疲労症候群の最小化の促進を含む、
hGHの他の多くの効果又は適用が知られている。
hGHの他の多くの効果又は適用が知られている。
工業的規模での、治療的に有用なポリペプチド、例えばhGHの製造は、現在では、通常、組換え技術の使用によって達成される。発達した組換え方法の中には、大腸菌のような、細菌宿主を使用するものもある。一方、他の方法は、酵母(例えば、セレビシア・サッカロミセス(Cerevisiae saccharomyces))のような真核生物の微生物を宿主として使用する。
生産(発酵)後、組換えポリペプチドを含む培地は、通常、さらに処理される。そのような処理の間に該ポリペプチドは、遠心分離、微細濾過及び／又は限外濾過のような、種々の抽出及び精製方法に供される。
ポリペプチドを生産するための従来の組換え製造方法を用いて遭遇する問題の一つは、ポリペプチド副産物の形成である。ジスルフィド結合を含むポリペプチドの生産において、誘導体、特に三硫化物誘導体の形成は問題である。
問題の三硫化物誘導体は、該ペプチド分子が、分子内で「三硫化物架橋」を形成する余分の（extra）硫黄原子を含むものである。そのような三硫化物誘導体は、成長ホルモンの生産の間に単離され、望ましくない副産物を構成する。
よって、WO 94/24157は、天然のhGHと比較して余分の硫黄原子を含むhGHの疎水性誘導体を検出する方法を開示している。hGHの疎水性誘導体の余分の硫黄原子は、「三硫化物架橋」を形成し、hGH三硫化物誘導体(TS-hGH)を生じる。さらなる開示は、該hGH三硫化物誘導体を、システイン、グルタチオン、2-メルカプトエタノール又はジチオスレイトールのようなメルカプト化合物で処理することによって、このhGH三硫化物誘導体をその天然のhGH形態に転換する方法である。
さらに、該hGHの三硫化物誘導体は、アンダーソンらの「Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli,」（Int. J. Peptide Protein Res. 47 (1996) pp. 311-321）、及びA.ジェスパーソンらの「Characterisation of a trisulfide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli」（Eur. J. Biochem. 219 (1994) pp. 365-373 (1994) ）に開示されており、また、三硫化物誘導体は、他のペプチド、即ち組換えスーパーオキシドジスムターゼ [Briggs et al., Biochem. Biophys. Acta, 537 (1978) pp. 100-109] 及びインターロイキンのムテイン [J. Breton et al., J. Chromatogr. A 709 (1) (1995) pp. 135-46] についても報告されている。
WO 96/02570は、hGH三硫化物誘導体を、該誘導体を亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム又は亜硫酸アンモニウムのような亜硫酸塩化合物で、又は亜硫酸マグネシウム又は亜硫酸カルシウムのような亜硫酸アルカリ土類金属塩で処置することによって、天然形態のhGHに転換する他の方法を開示している。
WO 00/02900は、特に、発酵工程の間又はその後の金属塩（例えば、カリウム塩又はナトリウム塩）の添加によって特徴付けられる、低い量の三硫化物を有する組換えペプチドを生産する方法を開示している。
WO 04/31213は、特に、遺伝的に改変された宿主細胞中の「成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド」の組換え生産において生産された三硫化物イソ型不純物の量を減少するための方法を開示しており、ここにおいて、該不純物は、「メルカプト化合物」(亜硫酸塩、グルタチオン、β-メルカプト-エタノール、ジチオスレイトール、システイン及びその他によって例証される)と接触される。該出願はまた、形成された三硫化物の量における減少を達成するためのキレート剤又は金属塩の使用を開示している。
驚くべきことに、液体培地中でのポリペプチドの生産及び／又は処理の間の、ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成が、例えば、問題のガスの気泡の流れを通過させることによる該培地のエアレーションによるような、該液体培地をガスでストリッピングするプロセスによって、最小にされるか又は防止されることができることが発見された。
上記したように、本発明の一つの側面は、ポリペプチドを含有する液体培地（典型的には水性培地）中におけるポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を減少させるか又は実質的に防止する方法に関し、該方法は、該液体培地をガスでストリッピングすることを含む。
ポリペプチド
関心のあるポリペプチドは、天然又は合成起源であってよく、本発明の方法は、従って、組換えポリペプチド又は制御された条件下で他の方法によって生産されたポリペプチドへの適用に限定されないが、潜在的に、任意の起源、例えば、植物又は動物から抽出されたポリペプチドに適用されることができる。
関心のあるポリペプチドは、天然又は合成起源であってよく、本発明の方法は、従って、組換えポリペプチド又は制御された条件下で他の方法によって生産されたポリペプチドへの適用に限定されないが、潜在的に、任意の起源、例えば、植物又は動物から抽出されたポリペプチドに適用されることができる。
既に記載したように、多くのポリペプチドが三硫化物誘導体を形成しやすいことが知られている。それらのポリペプチド、特に治療的ポリペプチドは、通常、一以上のジスルフィド結合を含み、それらの中にスーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキン ムテイン（mutein）及び成長ホルモン(GH)がある。原理的には、ジスルフィド結合を含む他のポリペプチド、例えばインスリンなども、適切な条件下で潜在的に三硫化物誘導体を形成できる。
TS誘導体不純物を形成すると知られている最も研究されたポリペプチドは、成長ホルモン(GH)であり、本発明の態様において、該関心のあるポリペプチドは、哺乳類の成長ホルモン（例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ又はネコのGH)、トリのGH、又はサケ、マス又はマグロ起源のGHのような成長ホルモンであり、特にヒト成長ホルモン(hGH)であり、とりわけ組換え的に生産されたhGH (rhGH)である。成長ホルモン(GH)という用語は、本発明の文脈において、以下のものをも包含する：切断型のGH、即ち、切断型の成長ホルモンであって、一以上のアミノ酸残基が欠失したもの；GH類似体であって、置換が抗原性又は活性の減少のような何らかの有害な効果をもたらさない限りは、天然分子における一以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で、特に天然のアミノ酸残基で置換されたもの；及びGH誘導体、例えば、脱アミドされたか又はスルホキシド化された形態の成長ホルモン、或いは、N-又はC-末端伸長(Met-hGH、Met-Glu-Ala-Glu-hGH又はAla-Glu-hGHのような)を有する形態のもの。他の関連するGH誘導体は、例えばGH活性の遅延性の持続時間を達成するために、GH (例えばhGH)が、アルブミン、例えばヒト血清アルブミンのような分子（例えば、WO 97/24445を参照)、又はポリエチレングリコール(PEG) (例えば、WO 03/044056を参照)のような水溶解性ポリマーと接合したものを含む。既に示したように、成長ホルモン自体の中で、ヒトの治療に関して好ましい成長ホルモンは、正常なhGH [即ち、天然のヒト成長ホルモン、特に、天然のホルモンと同じである、組換え的に生産されたヒト成長ホルモン(rhGH)]であり、後者のタイプのhGHの切断型、類似体及び誘導体が、本発明の内容に関連する。
ストリッピング（Stripping）
本願の文脈において、用語「ストリッピング」は、適切なガス(下記参照)による、適切な速度及び温度で、及び適切な持続時間での、液体培地のエアレーションによる、揮発性成分(例えば、環境条件下でその自然な状態がガスである、溶解した成分)の、該液体培地からの置換又は除去を指す。
本願の文脈において、用語「ストリッピング」は、適切なガス(下記参照)による、適切な速度及び温度で、及び適切な持続時間での、液体培地のエアレーションによる、揮発性成分(例えば、環境条件下でその自然な状態がガスである、溶解した成分)の、該液体培地からの置換又は除去を指す。
これは、例えば、問題のガスを液体培地中に、撹拌又は他の混合手段の下で或いは撹拌又は他の混合手段なしで、通過させることによって(例えば、ガスの気泡の流れを培地中に送ることによって)、或いは、相の間でガスの拡散が生じる大きい液相/気相界面を創造する他の方法によって行われる。この関連において、所望のストリッピング効果を達成するために調整され得るパラメーターには以下のものが含まれる：
ガス(ストリッピングガス)及び液体培地の間の接触時間；
ストリッピングガスの液体培地中への導入／通過の速度；
用いるストリッピングガスの容量；
気相と液相の接触表面積の大きさ；
撹拌/混合の活発さ；
液体培地のpH；及び
液体培地及び／又はストリッピングガスの温度。
ガス(ストリッピングガス)及び液体培地の間の接触時間；
ストリッピングガスの液体培地中への導入／通過の速度；
用いるストリッピングガスの容量；
気相と液相の接触表面積の大きさ；
撹拌/混合の活発さ；
液体培地のpH；及び
液体培地及び／又はストリッピングガスの温度。
硫化水素は、適切な硫黄含有源(例えば、ジスルフィド-架橋-含有ポリペプチド自体)の存在下において、液体培地中で適切な酸化還元条件下で形成され得、本発明に関して、硫化水素(H2S)及び／又はそれらの脱プロトン化形態(即ちHS- 及び／又はS2-)の存在が、ポリペプチドの三硫化物(TS)誘導体の形成に重要な役割を果たすと信じられている（下記参照）。
何らかの理論に結びつけられてはいないが、H2Sが、ジスルフィド架橋を含有するあるポリペプチド[例えば、ヒト成長ホルモン(hGH)のような成長ホルモン(GH)]のTS誘導体の形成を、図２に模式的に説明した2つの機構の一つ又は両方によって誘導し得るということが信じられている。提案された第一の機構において(図２の上部)、溶液中に存在する酸化剤(「Ox.」と示す)、例えば酸素(O2)は、H2SにおけるＳの酸化によって作用して、ポリペプチド中の三硫化物架橋の形成を伴う。提案された第二の機構において(図２の下部)、該ポリペプチド自体が酸化剤として作用し、H2Sの存在下において三硫化物架橋を形成する。
何らかの理論に結び付けられてはいないが、問題の液体培地からのH2Sの置換又は除去が、望ましくないTS誘導体の形成を減少又は排除する主要な役割を果たし得ると思われる。
硫化水素は、弱酸であり、水溶液中でそれぞれ陰イオン性の種HS-及びS2-で動的に平衡状態で存在する、適度に水溶性のガスである。溶液中のH2Sの割合が、約９以上のｐＨ値で極度に小さく、約４のｐＨで100%に近いということが、２０℃の水中におけるｐＨの関数として３つの種H2S、HS-及びS2-のそれぞれの分布を示す図１から明らかである（下記参照）。H2Sが環境条件下でガス状態で存在する問題の3つの種の１つのみで与えられ、液体培地中のH2Sの存在が、ポリペプチドのTS誘導体の形成に関して実際に極めて重要である場合、ガスによる液体培地のストリッピングが、pH≦9で、例えばpH≦8、例えばpH≦6の液体培地中で起こることが適切であると考えられる。しかしながら、溶液中の３つのスルフィド種(H2S、HS-及びS2-)の間の平衡が急速であるために、９を超えるｐＨでガスストリッピングを行うことが原理的に可能であるということは言わなければならない。
本発明の方法におけるガスストリッピングの間の液体培地のpHの選択は、もちろん、関心のあるポリペプチドの、それらの他の誘導体(例えば、ダイマー又はそれらの高オリゴマー、それらの脱アミド形態、それらのスルホキシド化形態など)の形成に対する安定性、沈殿の回避などのような他の要因によっても影響される。
ストリッピングガス
本発明の方法における液体培地のストリッピングに用いられるガスは、原理的には、関心のあるポリペプチド(又は液体培地中に含まれる他の中心的又は必須の成分)と著しく反応しないか、又は有害に影響しない任意のガスであってよい；従って、例えば、空気、酸素、窒素、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素又はそれらの組合せのようなガスが、本発明に従って潜在的に用いられ得る。しかしながら、液体培地中のH2Sの存在が、ポリペプチドTS誘導体の形成に関して中心的に重要であるという、本発明者らの確信（上記参照）が正しい場合、それに関連する使用に最も適切なそれらのガスは、実質的に化学的に不活性であり、特に、酸化、還元又は他の反応を引き起こすことに関して、及び／又は液体培地に適するpH条件に影響することに関して不活性であり、並びに、実質的に純粋な形態で、容認できるコストで容易に入手可能であるガスであると思われる。これに関して特に関連するガスは、窒素(N2)及びより大量の、容易に入手可能ないわゆる「貴ガス」[ヘリウム(He)、ネオン(Ne)、アルゴン(Ar)、クリプトン(Kr)及びキセノン(Xe)を含む]のメンバー、特にヘリウム及びアルゴン、とりわけアルゴンを含む。それらのガス(特にN2、He及びAr)は容易に、種々の容量のシリンダー中の圧縮形態で、高純度状態で(典型的には、N2について≧99.8 容量%、及びHe及びAr について≧99.9容量%以上) 商業的に入手可能である。
本発明の方法における液体培地のストリッピングに用いられるガスは、原理的には、関心のあるポリペプチド(又は液体培地中に含まれる他の中心的又は必須の成分)と著しく反応しないか、又は有害に影響しない任意のガスであってよい；従って、例えば、空気、酸素、窒素、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素又はそれらの組合せのようなガスが、本発明に従って潜在的に用いられ得る。しかしながら、液体培地中のH2Sの存在が、ポリペプチドTS誘導体の形成に関して中心的に重要であるという、本発明者らの確信（上記参照）が正しい場合、それに関連する使用に最も適切なそれらのガスは、実質的に化学的に不活性であり、特に、酸化、還元又は他の反応を引き起こすことに関して、及び／又は液体培地に適するpH条件に影響することに関して不活性であり、並びに、実質的に純粋な形態で、容認できるコストで容易に入手可能であるガスであると思われる。これに関して特に関連するガスは、窒素(N2)及びより大量の、容易に入手可能ないわゆる「貴ガス」[ヘリウム(He)、ネオン(Ne)、アルゴン(Ar)、クリプトン(Kr)及びキセノン(Xe)を含む]のメンバー、特にヘリウム及びアルゴン、とりわけアルゴンを含む。それらのガス(特にN2、He及びAr)は容易に、種々の容量のシリンダー中の圧縮形態で、高純度状態で(典型的には、N2について≧99.8 容量%、及びHe及びAr について≧99.9容量%以上) 商業的に入手可能である。
三硫化物誘導体は、原理的には、問題のタイプのポリペプチドの生産及び精製の間の任意の段階において形成し得る。しかしながら、生産後の精製工程の間、特に濾過工程の間の、TS誘導体の形成を回避することが非常に重要であるという徴候がある；よって、例えば、組換えヒト成長ホルモン(hGH)の場合、TS-hGHの実質的な形成は、特に生産自体に続く濾過の間に生じることが明らかになった。
本発明の方法は、特に、関心のあるポリペプチドの生産(例えば、ポリペプチドを発現する組換え的に改変された微生物を含む培地中での発酵による生産)に続く処理、例えば、濾過、微細濾過、限外濾過、カラム分離などのような下流の(生産後)分離及び／又は精製工程と組合せての処理によく適する。ヒト成長ホルモンに関して用いられる場合、該方法は、生産手順の後から最後の精製工程の前までの間に適切に適用される。
本発明の方法のさらなる態様において、所望のポリペプチドの安定性に影響するか、又はその望ましくない誘導体の形成を減少させる化合物は、生産後の処理工程と関連して液体培地に加えられてよい。よって、例えば、亜硫酸塩(例えば、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸カリウムのような亜硫酸アルカリ金属)又はメルカプト化合物(例えば、グルタチオン、β-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエチルアミン、システイン及びシスチンから成る群から選択される一以上の化合物)は、本発明の方法においてストリッピングに供される液体培地に加えられてよい。
本発明のさらなる側面は以下のものに関する：
本発明の方法によって得られたか又は得られる、TS誘導体を実質的に含まないポリペプチド(特に、TS-hGH誘導体を実質的に含まない組換えヒト成長ホルモン(rhGH))；
薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に、そのようなポリペプチドを含む(特に、そのようなrhGHを含む)薬学的組成物；
ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態を治療する方法であって、本発明の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの治療的有効量を、そのような状態を有する被験者に投与することを含む方法；及び
本発明の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの、ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態の治療のための薬剤の製造における使用。
本発明の方法によって得られたか又は得られる、TS誘導体を実質的に含まないポリペプチド(特に、TS-hGH誘導体を実質的に含まない組換えヒト成長ホルモン(rhGH))；
薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に、そのようなポリペプチドを含む(特に、そのようなrhGHを含む)薬学的組成物；
ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態を治療する方法であって、本発明の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの治療的有効量を、そのような状態を有する被験者に投与することを含む方法；及び
本発明の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの、ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態の治療のための薬剤の製造における使用。
医薬投与
本発明の薬学的組成物に関して、適切な担体又は希釈剤の例は、当該分野の通常の技術者には周知である。
本発明の薬学的組成物に関して、適切な担体又は希釈剤の例は、当該分野の通常の技術者には周知である。
特に、hGH/rhGHに関して、与えられた被験者/患者の、ここに記載された方法での成長ホルモンによる治療の措置は、当該分野の技術者によって決定され得る。投与される一日の用量は、医師によって決定されることができ、特に、投与の経路、被験者又は患者の年齢、体重及び状態に依存する。hGHの都合のよい一日の投与量は、典型的には、約0.001mg/体重kg 〜約2.0 mg/体重kgの範囲であり、しばしば約0.01 mg/体重kg 〜約1.0 mg/体重kgの範囲である。
成長ホルモン (例えばhGH)は、一日の間に単回の用量で又は繰り返される用量で投与されてよく、及び、治療される個体がそのような治療をもはや必要としなくなるまで、ここに記載された方法での投与が継続されてよい。投与経路は、注入（連続的又はパルス状）、注射、肺吸入によるか、或いは経口又は経鼻によるような、該ホルモンを適切な又は所望の作用部位に効率的に輸送する任意の経路であってよい。現在好ましい経路には、非経口経路（例えば、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射又は皮下注射を介して、又はインプラントによって)が含まれる。成長ホルモンは、それぞれの投与経路に適した剤形に処方されることができる。該組成物又は剤形は、都合のよい形態、例えばエアロゾル、溶液又は懸濁液であってよい。
GH（例えばhGH）組成物は、全身性の注射又は注入に適する形態であってよく、そのようなものとして、滅菌水又は等張性生理食塩水又はグルコース溶液のような、適した液体媒体により処方されてよい。該組成物は、当該分野で周知である従来の滅菌技術によって滅菌されてよい。得られた水溶液は、そのような使用のためにパッケージに入れられて良く、又は、それらは、無菌状態下で濾過され凍結乾燥されてよく、該凍結乾燥製剤は、投与の前に、適切な滅菌水性媒体と組み合わされる。該組成物は、緩衝剤、張度調整剤などのような、およその生理的条件に必要な薬学的に許容される補助的な物質を含んでよい。緩衝剤の非限定的な例には、クエン酸塩及びヒスチジンが含まれ；張度調整剤の非限定的な例にはスクロース及びマンニトールのような糖、及びアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩化物のような塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化カルシウムなどが含まれる。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン及び水である。水性液体製剤は、特に都合がよいことには、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート[ポリソルベート20（例えば、TweenTM 20）のような]又はポロキサマー[ポロキサマー188（例えば、PluronicTM F68）又はポロキサマー407（例えば、LutrolTM F127)のような]を含むことができ、また、ベンジルアルコール、フェノール又はクレゾール（例えば、m-クレゾール)のような保存剤がしばしば組み込まれる。
GH(例えばhGH)を持続性放出製剤の形態で提供することは有利であり得る。そういうものとして、該組成物は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又は乳酸/グリコール酸コポリマーのような、薬学的に許容される適切な生分解性のポリマー中に封入されたか又は分散された、成長ホルモンを含むマイクロカプセル又は微小粒子として処方されてよい。
経鼻投与のためのGH製剤は、エアロゾル施用のために、液体担体、特に水性担体に溶解されたか又は懸濁された成長ホルモンを含んでよい。該担体は、可溶化剤（例えば、プロピレングリコール）、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）又はシクロデキストリンのような吸収エンハンサー、又はパラベンのような保存剤のような添加剤を含んでよい。
成長ホルモン（例えばhGH）は、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995)」に開示されているような、医薬組成物を処方する確立された任意の方法によって処方されることができる。
実施例１：発酵ブロスからのH 2 Sのストリッピング
発酵ブロス、組換え微生物[組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をコードする遺伝子を含む発現カセットを含有する大腸菌]を含むサンプルを、hGH生産バッチから取り出した。該サンプルをホモジナイズし、6つのサブサンプル、それぞれ1500 mlを、2000 mlの測定シリンダーに入れ、磁力によって撹拌した。サブサンプルからのH2Sのストリッピングを、窒素ガス（例えば、エア・リキッド デンマークA/S、Ballerup, Denmarkから入手可能；純度≧99.8%)を、各サブサンプル（温度20℃）に、該測定シリンダーの底に伸ばされたシリコンチューブを介して15-20 l/hourの流速で通気することによって行った。サブサンプル１は、ストリッピングなし（コントロール）、サブサンプル２はストリッピングに2.5時間供され、一方、サブサンプル3、4、5及び6は、ストリッピングに20時間供された。
発酵ブロス、組換え微生物[組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をコードする遺伝子を含む発現カセットを含有する大腸菌]を含むサンプルを、hGH生産バッチから取り出した。該サンプルをホモジナイズし、6つのサブサンプル、それぞれ1500 mlを、2000 mlの測定シリンダーに入れ、磁力によって撹拌した。サブサンプルからのH2Sのストリッピングを、窒素ガス（例えば、エア・リキッド デンマークA/S、Ballerup, Denmarkから入手可能；純度≧99.8%)を、各サブサンプル（温度20℃）に、該測定シリンダーの底に伸ばされたシリコンチューブを介して15-20 l/hourの流速で通気することによって行った。サブサンプル１は、ストリッピングなし（コントロール）、サブサンプル２はストリッピングに2.5時間供され、一方、サブサンプル3、4、5及び6は、ストリッピングに20時間供された。
この方法でのガス-ストリッピング後、サブサンプルを、研究室スケールの微細濾過システム[改変されたポリエーテルスルホン(BIOMAXTM-1000)膜を用いるMillipore LabscaleTM TFFシステム]を用いて精製し、収集された浸透液中の極めて低いTS-hGH形成を得た。しかしながら、サブサンプル4、5及び6の場合、微細濾過の前に、ナトリウム硫化物（Na2S）が、それぞれ約5、10及び15 ppmの濃度で添加された。
hGHの測定
微細濾過されたサブサンプル中のhGHの量を、hGH配向ELISA方法を用いて測定した：この方法においては、ヒト成長ホルモンに対して作られたモルモットのポリクローナル抗体がマイクロテストプレートに結合される。この抗体（コーティング抗体）は、該サンプルからの成長ホルモンと反応する。hGHに対して作られた、ペルオキシダーゼ標識されたモルモットのポリクローナル抗体(検出抗体)は、次いで、固定された成長ホルモンと反応する。酵素基質(ペルオキシダーゼ基質)の添加の際、ペルオキシダーゼ標識された抗体におけるペルオキシダーゼ活性は、該サンプル中の成長ホルモンの濃度と比例する強度で色の発達をもたらす。該反応は、酸の添加によって停止され、その吸光度が光度計で、450 nmで、並びに620 nmの参照波長で読まれる。
微細濾過されたサブサンプル中のhGHの量を、hGH配向ELISA方法を用いて測定した：この方法においては、ヒト成長ホルモンに対して作られたモルモットのポリクローナル抗体がマイクロテストプレートに結合される。この抗体（コーティング抗体）は、該サンプルからの成長ホルモンと反応する。hGHに対して作られた、ペルオキシダーゼ標識されたモルモットのポリクローナル抗体(検出抗体)は、次いで、固定された成長ホルモンと反応する。酵素基質(ペルオキシダーゼ基質)の添加の際、ペルオキシダーゼ標識された抗体におけるペルオキシダーゼ活性は、該サンプル中の成長ホルモンの濃度と比例する強度で色の発達をもたらす。該反応は、酸の添加によって停止され、その吸光度が光度計で、450 nmで、並びに620 nmの参照波長で読まれる。
TS-hGHの測定
TS-hGHのレベルを、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって測定した：最適化された測定条件は、サンプル中のhGH濃度がおよそ0.71 g l-1で得られることが発見され、サンプルはそれ故、それらをこの特定のhGH濃度に調節するために希釈された。初期のhGH濃度は、下式に従って277 nmでの吸光度測定から決定される：
chGH ＝吸光度 (277 nm) × 0.82 (g l-1で）。
TS-hGHのレベルを、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって測定した：最適化された測定条件は、サンプル中のhGH濃度がおよそ0.71 g l-1で得られることが発見され、サンプルはそれ故、それらをこの特定のhGH濃度に調節するために希釈された。初期のhGH濃度は、下式に従って277 nmでの吸光度測定から決定される：
chGH ＝吸光度 (277 nm) × 0.82 (g l-1で）。
総容量15 μlの調整されたサンプルを、200 mm長で4.6 mm幅のカラムにアプライした。次いで、以下の二つの溶出液：
Ａ：1M (NH4)2SO4；0,1M Na2HPO4；pH 6.5
Ｂ：0,1M Na2HPO4；5% v/v CH3CN；pH 6.5
による勾配溶出を、以下の表にまとめたように行った：
他の条件は以下のとおり：
温度、調整されたサンプル：2℃〜8℃
温度、カラムヒーター：28℃±2℃
波長、UV検出：220 nm。
Ａ：1M (NH4)2SO4；0,1M Na2HPO4；pH 6.5
Ｂ：0,1M Na2HPO4；5% v/v CH3CN；pH 6.5
による勾配溶出を、以下の表にまとめたように行った：
温度、調整されたサンプル：2℃〜8℃
温度、カラムヒーター：28℃±2℃
波長、UV検出：220 nm。
次いで、調査されたサンプルにおけるTS-hGHの相対的な量(重量パーセント)を、以下の式から得た：
この方法において、調査されるサンプルに含まれるTS-hGHの定量化の限界（LOQ）は20 ngである。サンプルについて測定された結果を検証するために、各シリーズの最初と各シリーズの最後にも標準を測定する。
H 2 Sの測定
液体サンプル中の硫化水素濃度を、MERCK SpectroquantTM クイックテストを用いて測定した。この試験は、光度分析を用いて、水性サンプル中に溶解している全ての硫化物種を、0.03〜3.3 ppmに及ぶ範囲の濃度で測定するよう設計される。試験キットは、色反応を起こす３つの異なる試薬を含む：硫化水素は、N,N’-ジメチル-1,4-フェニレンジアンモニウムジクロリド(試薬2)と反応して、無色のロイコメチレンブルーを与え、これは次いで、硫酸第二鉄(試薬3)によって酸化されてメチレンブルーになる。スルファミド酸(試薬1)は、亜硝酸塩からの干渉を防止する。メチレンブルーを産生する色反応は、665 nmで最大の明白な吸収をもたらし、ブランクはこの波長でほとんど吸収を示さない。未濾過の発酵ブロスにおけるH2Sレベルの測定のために、３つの試薬を添加した後ブロスを遠心分離した(10分、5000 rpm)。既知の濃度のH2S標準溶液を較正のために用いた。
液体サンプル中の硫化水素濃度を、MERCK SpectroquantTM クイックテストを用いて測定した。この試験は、光度分析を用いて、水性サンプル中に溶解している全ての硫化物種を、0.03〜3.3 ppmに及ぶ範囲の濃度で測定するよう設計される。試験キットは、色反応を起こす３つの異なる試薬を含む：硫化水素は、N,N’-ジメチル-1,4-フェニレンジアンモニウムジクロリド(試薬2)と反応して、無色のロイコメチレンブルーを与え、これは次いで、硫酸第二鉄(試薬3)によって酸化されてメチレンブルーになる。スルファミド酸(試薬1)は、亜硝酸塩からの干渉を防止する。メチレンブルーを産生する色反応は、665 nmで最大の明白な吸収をもたらし、ブランクはこの波長でほとんど吸収を示さない。未濾過の発酵ブロスにおけるH2Sレベルの測定のために、３つの試薬を添加した後ブロスを遠心分離した(10分、5000 rpm)。既知の濃度のH2S標準溶液を較正のために用いた。
結果を下記表１に示す。
それらの実験は、H2SがTS-hGH形成に関与するということ、及び、ホモジナイズされた発酵ブロスからのH2Sのストリッピングが、微細濾過されたホモジネート中のTS-hGHの形成の減少（サブサンプル２）又はほとんどの排除（サブサンプル３）をもたらすということを示している。
実施例２：発酵槽におけるH 2 Sのストリッピング
発酵ブロス、組換え微生物[組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む大腸菌]を含むサンプルを、hGH生産バッチから取り出し、ホモジナイズした。5つの同じサブサンプルを、ホモジナイズされたバルクサンプルから取り出した。それらのサブサンプルの一つ（サブサンプル１）は、ストリッピングに供さなかった；残り４つのサブサンプルは、下記表２に詳述した条件を用いて、窒素ストリッピング[窒素通気された(泡立たせた)、撹拌された発酵槽容器（B. Braun BiostatTM CT；正常作動容量１リットル）において、制御されたpH及び温度で]に供した。実験２及び３は、ｐＨを制御せずに行い、表２に与えられたｐＨ値は初期値である。
発酵ブロス、組換え微生物[組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む大腸菌]を含むサンプルを、hGH生産バッチから取り出し、ホモジナイズした。5つの同じサブサンプルを、ホモジナイズされたバルクサンプルから取り出した。それらのサブサンプルの一つ（サブサンプル１）は、ストリッピングに供さなかった；残り４つのサブサンプルは、下記表２に詳述した条件を用いて、窒素ストリッピング[窒素通気された(泡立たせた)、撹拌された発酵槽容器（B. Braun BiostatTM CT；正常作動容量１リットル）において、制御されたpH及び温度で]に供した。実験２及び３は、ｐＨを制御せずに行い、表２に与えられたｐＨ値は初期値である。
該サンプルを次いで、実施例１で記載したような微細濾過に供した。hGH及びTS-hGHの含有量の分析は、実施例１で記載したのと同様に行った。結果を下記の表３に示す。
Claims (16)
- ポリペプチドを含む液体培地中における該ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を減少するか又は実質的に防止するための方法であって、該方法は、前記液体培地をガスでストリッピングすることを含む方法。
- 前記ポリペプチドが、一以上のジスルフィド結合を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、組換え的に生産されたポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、組換え的に生産されたhGH (rhGH)；それらの切断型；それらの類似体；及びそれらの誘導体から選択される、請求項３に記載の方法。
- 前記ストリッピングが、前記ポリペプチドの生産の間又は生産後の処理の間に行われる、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記ストリッピングが、前記ポリペプチドの生産後の処理の間に行われる、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記ガスが化学的に、実質的に不活性なガスである、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
- 前記ガスが、窒素(N2)、ヘリウム(He)及びアルゴン(Ar)から成る群から選択される、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、ストリッピング手順の後に一以上の精製工程に供される、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
- 少なくとも一つの濾過工程を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの生産後に前記液体培地に亜硫酸塩又はメルカプト化合物が添加される、請求項５〜１０の何れか一項に記載の方法。
- 請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法によって得られる、TS誘導体を実質的に含まないポリペプチド。
- 請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法によって得られる、TS-hGH誘導体を実質的に含まない組換えヒト成長ホルモン(rhGH)。
- 請求項１２に記載のポリペプチド又は請求項１３に記載のrhGHを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に含む薬学的組成物。
- ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態の治療方法であって、請求項１３に記載の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの治療的有効量を、そのような状態の被験者に投与することを含む方法。
- ヒト成長ホルモンの投与に反応する状態の治療のための薬剤の製造における、請求項13に記載の実質的にTS-hGHを含まないrhGHの使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200402022 | 2004-12-29 | ||
| DKPA200402022 | 2004-12-29 | ||
| PCT/EP2005/056976 WO2006069940A1 (en) | 2004-12-29 | 2005-12-20 | Method for preventing formation of trisulfide derivatives of polypeptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008525517A true JP2008525517A (ja) | 2008-07-17 |
| JP4865728B2 JP4865728B2 (ja) | 2012-02-01 |
Family
ID=35986616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007548807A Expired - Fee Related JP4865728B2 (ja) | 2004-12-29 | 2005-12-20 | ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を防止する方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20090131311A1 (ja) |
| EP (1) | EP1833841B1 (ja) |
| JP (1) | JP4865728B2 (ja) |
| AT (1) | ATE463503T1 (ja) |
| DE (1) | DE602005020505D1 (ja) |
| ES (1) | ES2344120T3 (ja) |
| WO (1) | WO2006069940A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017526652A (ja) * | 2014-07-24 | 2017-09-14 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 薬剤の少なくとも１つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分へのコンジュゲーション方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011041721A1 (en) | 2009-10-02 | 2011-04-07 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| WO2012158551A1 (en) | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| JP7088912B2 (ja) | 2016-09-15 | 2022-06-21 | シティ・オブ・ホープ | ジチオｅｔｐ誘導体 |
| US11230560B2 (en) | 2017-05-22 | 2022-01-25 | City Of Hope | Synthesis of ETP derivatives |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL97339C (ja) | 1956-03-02 | |||
| JPH0720980B2 (ja) | 1991-11-26 | 1995-03-08 | 株式会社島津製作所 | ペプチド合成装置 |
| JPH06220084A (ja) | 1993-01-23 | 1994-08-09 | Shimadzu Corp | ペプチド合成装置 |
| DK44593D0 (da) | 1993-04-20 | 1993-04-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af et polypeptid |
| ZA955789B (en) * | 1994-07-15 | 1996-03-11 | Novo Nordisk As | A method of converting a hydrophobic derivative of a polypeptide into the native form |
| US6299776B1 (en) * | 1997-12-23 | 2001-10-09 | General Signal Corporation | Biochemical oxidation system and process |
| SE9802454D0 (sv) * | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Pharmacia & Upjohn Ab | Production of peptides |
| US20040048315A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Pharmacia Corporation | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
-
2005
- 2005-12-20 AT AT05826671T patent/ATE463503T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-12-20 US US11/813,045 patent/US20090131311A1/en not_active Abandoned
- 2005-12-20 ES ES05826671T patent/ES2344120T3/es active Active
- 2005-12-20 EP EP05826671A patent/EP1833841B1/en not_active Not-in-force
- 2005-12-20 WO PCT/EP2005/056976 patent/WO2006069940A1/en active Application Filing
- 2005-12-20 DE DE602005020505T patent/DE602005020505D1/de active Active
- 2005-12-20 JP JP2007548807A patent/JP4865728B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-03-01 US US12/714,900 patent/US8530191B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017526652A (ja) * | 2014-07-24 | 2017-09-14 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 薬剤の少なくとも１つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分へのコンジュゲーション方法 |
| US11370838B2 (en) | 2014-07-24 | 2022-06-28 | Genentech, Inc. | Methods of conjugating an agent to a thiol moiety in a protein that contains at least one sulfide bond |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1833841A1 (en) | 2007-09-19 |
| ATE463503T1 (de) | 2010-04-15 |
| WO2006069940A1 (en) | 2006-07-06 |
| DE602005020505D1 (de) | 2010-05-20 |
| US8530191B2 (en) | 2013-09-10 |
| US20090131311A1 (en) | 2009-05-21 |
| US20100160236A1 (en) | 2010-06-24 |
| JP4865728B2 (ja) | 2012-02-01 |
| EP1833841B1 (en) | 2010-04-07 |
| ES2344120T3 (es) | 2010-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101196103B1 (ko) | 포유동물 세포용 무?혈청 세포 배양 배지 | |
| TW518219B (en) | Erythropoietin solution preparation | |
| JP4493334B2 (ja) | Ｈｓａ非含有組成物中のｎｅｓｐ／ｅｐｏの安定化剤としてのｌ−メチオニン | |
| EP0367590B1 (en) | Augmenting fetal hemoglobin by treatment with activin and/or inhibin | |
| JP5753692B2 (ja) | タンパク質製剤 | |
| JP6143827B2 (ja) | ｈＧＨとｒｈＩＧＦ−１の組合せのための配合物 | |
| US20030104981A1 (en) | Human insulin analogues | |
| JP4865728B2 (ja) | ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を防止する方法 | |
| BRPI0002276B1 (pt) | Conjugado, composição que compreende conjugados, composição farmacêutica, utilização de um conjugado ou composição e processso para a preparação de compostos | |
| EP0192629B2 (en) | Method of somatotropin solubilization and naturation | |
| US20070232792A1 (en) | Method for the Production of Recombinant Peptides with a Low Amount of Trisulfides | |
| Wang et al. | Stability and characterization of protein and peptide drugs: case histories | |
| Pearlman et al. | Stability and characterization of protein and peptide drugs: case histories | |
| WO1997014430A1 (en) | Use of thioethers as antioxidant for peptides and proteins and compositions containing the thioethers | |
| US20030212248A1 (en) | Process to increase protein stability | |
| AU2006201087A1 (en) | Protein formulations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081208 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110614 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110914 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111011 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111110 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141118 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141118 Year of fee payment: 3 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141118 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |