DE69028396T2 - Acetylierte heterologe polypeptide - Google Patents
Acetylierte heterologe polypeptideInfo
- Publication number
- DE69028396T2 DE69028396T2 DE69028396T DE69028396T DE69028396T2 DE 69028396 T2 DE69028396 T2 DE 69028396T2 DE 69028396 T DE69028396 T DE 69028396T DE 69028396 T DE69028396 T DE 69028396T DE 69028396 T2 DE69028396 T2 DE 69028396T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- acetylated
- somatotropin
- rbst
- acetylation
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 12
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 29
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 12
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 150000002669 lysines Chemical group 0.000 claims 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 abstract 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 abstract 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 23
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035841 60S ribosomal protein L7 Human genes 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101000853617 Homo sapiens 60S ribosomal protein L7 Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000012751 Pyruvate Dehydrogenase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010090051 Pyruvate Dehydrogenase Complex Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000184 acid digestion Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000003977 lipoyl group Chemical group S1SC(C([H])([H])C(C(C(C(=O)[*])([H])[H])([H])[H])([H])[H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Mikrobiologie und Proteinchemie. Insbesondere betrifft diese Erfindung Fermentationsverfahren zur Herstellung rekombinanter heterologer Polypeptide, insbesondere von Rindersomatotropin (rbSt) und ein dabei produziertes neues rbSt.
- Synthetische und chemisch definierte Medien zum Züchten von Mikroorganismen sind allgemein bekannt. Übliche Nährmedien zum Züchten von Bakterien wurden (bereits) zum Wachsenlassen rekombinanter, heterologe Polypeptide produzierender Bakterien benutzt. Erwünscht ist eine Senkung der Menge an teuren Aminosäuren in den Wachstumsinedien unter gleichzeitiger Erhaltung der Expression qualitativ hochwertiger heterologer Polypetide in hoher Ausbeute. Während der Fermentationen in solchen Medien läßt sich die Produktion neuer acetylierter Analoga heterologer Polypeptide, beispielsweise rbSt, erreichen.
- Natürlich vorkommendes Rindersomatotropin (bSt) oder Wachstumshormon läßt sich aus den Hirnanhangdrüsen von Rindem als Gemisch heterologer Proteine gewinnen (A. C. Paladini und Mitarbeiter, 1983, "CRC Reviews in Biochem.", 15, 25-56). Werden native Rinderhirnanhangdrüsenextrakte durch Anionenaustauschchromatographie fraktioniert, ist eine nichtdefinierte elektrophoretische Heterogenität feststellbar (I. C. Hart und Mitarbeiter, 1984, "Biochem. J.", 218, 573-581). Hirnanhangdrüsen-Rindersomatotropin (pbSt) existiert in Isoformen, die sich im isoelektrischen Punkt (pI) unterscheiden. Die häufigste Form ist pI 8,2. bSt besitzt bekanntlich Stellen, die einer Entamidierung zugänglich sind. Dies führt zu einer Zunahme der Zahl niedrigerer pI-Formen, die bei der isoelektrischen Fokussierung bei pI 7,0, 6,0 bzw. 5,5 als Cluster eng beieinander liegender Banden sichtbar sind (U. J. Lewis und Mitarbeiter, 1970, "Biochem. Biophys. Acta.", 214, 498-508 und C. Secchi und Mitarbeiter, 1986, "Int. J. Peptide Res.", 28, 298-306).
- Die Acetylierung von Rindersomatotropin, insbesondere an den ε-Aminogruppen von Lysinresten, führt zu einer Verminderung der positiven Ladung des Proteins infolge der neutralen Natur der Acetyleinheit. Auf diese Weise entstehen bSt-Arten mit verringerten plen. Über Verfahren zur chemischen Acety lierung von bSt wurde (bereits) berichtet. Solche Maßnahmen führen jedoch aufgrund von Reaktionen mit verschiedenen anderen Aminosäuren neben Lysin zu zahlreichen Acetylierungsprodukten (A. Oikawa und Mitarbeiter, 1967, "Biochem. J.", 104, 947-952 und V. B. De Satz und J. A. Santome, 1981, "Int. J. Peptide Protein Res.", 18, 492-499).
- Die Acetylierung natürlich vorkommender Proteine ist bekannt. Als erstes durch Acetylierung modifiziertes Dipeptid erwies sich ein aus Tabakmosaikvirus stammendes Dipeptid (K. Narita, 1958, "Biochem. Biophys. Acta.", 28, 184-191). Danach wurde bei einer großen Zahl von Proteinen einschließlich Ovalbumin, Eialbumin, Hämoglobinen und Histonen gezeigt, daß sie acetylierte Aminosäuren enthalten (J. 1. Harns, 1959, "Biochem. J."; 71, 445-459; K. Narita, 1961, "Biochem. Biophys. Res. Comm.", 5, 160-164; W. A. Schroeder und Mitarbei ter, 1962, "Biochem. Biophys. Acta", 63, 532-534 und D. M. P. Phillips, 1963, "Biochem. J.", 87, 258-263). Eine Nα-Acetylierung von Proteinen ist unter eukaryotischen und prokaryotischen Organismen und Viren weit verbreitet (H. P. C. Driessen und Mitarbeiter, 1985, "CRC Crit. Rev. Biochem.", 18, 281-325). So wurde beispielsweise die Vermutung angestellt, daß 80% der löslichen Proteine von Ehrlich's Aszitis-Zellen Nα-acetyliert sind (J. L. Brown und W. K. Roberts, 1976, "J. Biol. Chem.", 251, 1009-1014). Eine Nα-Acetyierung dürfte ein nicht-willkürlicher Prozeß sein, da Alanin- und Serinre ste die Hauptziele sind, Methionin, Glycin und Asparaginsäure lediglich in einigen wenigen Proteinen modifiziert sind und es von einigen Aminosäuren nicht bekannt ist, daß sie Nα- acetyliert sind (F. Wold, 1981, "Ann. Rev. Biochem.", 50, 783-814).
- Eine Proteinseitenkettenacetylierung stellt eine andere w Klasse einer bekanntlich natürlich vorkommenden Proteinacetylierung dar. Diese ist allerdings weniger häufig als Nα-Acetylierungen. Die Nε-Acetylasen unterscheiden sich von den Nα- Acetylasen, da sie für die ε-Aminogruppe des Lysins spezifisch und im Kern oder Cytosol lokalisiert sind. Die Nα-Acetylasen scheinen dagegen ribosomassozuert zu sein (R. Sterner und Mitarbeiter, 1979 "J. Biol. Chem.", 254, 11577-11583; A. Pestana und H. C. Pitot, 1975, "Biochemistry", 14, 1397- 1403 und A. Pestana und H. C. Pitot, 1975, "Biochemistry", 14, 1404-1412). Beide Arten von Acetylasen katalysieren jedoch die Übertragung von Acetyl aus Acetyl-CoA auf Proteine (F. Wold, aaO).
- Bei den Histonen H3 und H4 wurde das erste Mal gezeigt, daß eine Nε-Acetylierung von Lysinresten stattfindet (V. G. Allfrey und Mitarbeiter, 1964, "Proc. Nat. Acad. Sci. USA", 51, 786-794). Neben den Histonen sind auch andere DNA-bindende Proteine, z.B. die Hochmobilitätsgruppen (HMG)-Proteine, Nε-acetyliert (R. Sterner und Mitarbeiter, aaO).
- Von einigen wenigen aus Escherichia coli-Stämmen gewon nen Proteinen wurde berichtet, daß sie acetyliert sind. Der E. coli-Pyruvatdehydrogenasekomplex wird dann an den an Nε- Aminogruppen von Lysinresten auf dem Protein gebundenen Lipoylresten acetyliert (Adamson und Mitarbeiter, 1986, "Biochem. Cell Biol.", 64, 250-255). Die meisten Berichte betreffend eine Proteinacetylierung von E. coli konzentrierten sich auf die Acetylierung von ribosomalen Proteinen. Nα-Acetylierungen von Serinresten auf E. coli-ribosomalem Protein L7 (zur Produktion von Protein L12) und Alaninresten auf den ribosomalen Proteinen SS und S18 wurden bereits beschrieben (Brot und Mitarbeiter, 1972, "Biochem. Biophys. Res. Comm." 49, 673-679; Wittmann-Liebold und Mitarbeiter, 1978, "FEBS Lett.", 95, 91-98 und Yaguchi, 1976, "FEBS Lett.", 59, 217- 220).
- Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein acetyliertes Somatotropin durch Wachsenlassen von mit einer DNA-Sequenz mit Codierung für das Somatotropin transformiertem E. coli auf einem Fermentationsmedium einer Konzentration an Aminosäuren, die während oder unmittelbar vor der Somatotropinbiosynthese zu gering ist, um die Biosynthese von Aminosäurebiosyntheseenzymen zu unterdrücken oder Aminosäurebiosyntheseenzyme durch Rückkopplung zu hemmen, produziert.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein neues acetyliertes Rindersomatotropin lediglich an Lysinresten acetyliert, wobei mindestens einer der Aminosäurereste den Lysinen in den Positionen 157, 167, 171 und 180 entspricht.
- Der Ausdruck "niedrige Konzentration an Aminosäuren" bedeutet hier und im folgenden eine Konzentration, die niedrig genug ist, um von einem darauf gezüchteten Mikroorganismus auf eine "minimale Konzentration von Aminosäuren" reduziert werden zu können. Letztere ist ihrerseits definiert als die Konzentration exogener Aminosäuren, die zu niedrig ist, um die Biosynthese von Aminosäurebiosyntheseenzymen zu unterdrücken oder deren Aktivitäten durch Rückkopplung wirksam zu hemmen. Eine solche Verminderung der "niedrigen Konzentration an Aminosäuren" auf eine "minimale Konzentration von Aminosäuren" erfolgt während oder unmittelbar vor der Biosynthese des heterologen Polypeptids. So liegt beispielsweise bei E. coli-Wirten und dem rbSt-Polypeptid der speziellen Beispiele die "niedrige Konzentration an Aminosäuren" jeweils unter etwa 0,50 mM (ermittelt aus einer 0,1% Hefeextraktergänzung). Die "niedrige Konzentration an Aminosäuren" wird auf eine jeweils unter etwa 0,05 mM liegende "Minimalkonzentration an Aminosäuren" gesenkt.
- Im Rahmen dieser Erfindung benutztes rekombinantes E. coli wird mittels dem Fachmann bekannten rekombinanten DNA- Techniken hergestellt. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise auf "Molecular doning" von T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) und "A Practical Guide to Molecular doning" von B. Perbal, John Wiley & Sons (1984) verwiesen.
- Das transformierte E. coli wird in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet. Das Medium enthält einen Überschuß an üblichen Nährstoffen, die den Zellwachstumserfordernissen von Mikroorganismen genügen und dabei den Mikroorganismus zum Wachsen und zur Vervielfältigung auf eine vorgegebene Zelldichte befähigen. Zu solchen Stoffen gehören Lieferanten für Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralstoffe, wie Schwefel, Phosphor, Magnesium, Kalium, Kupfer, Zink, Mangan und Eisen. Aminosäuren können in Form von Proteinhydrolysaten, die üblicherweise durch Säureaufschluß oder enzymatische Verdauung natürlich vorkommender eiweißartiger Materialien, wie Casein, Sojabohnenmehl, Lactalbumin, von tierischen Geweben, Hefezellen und Gelatine, gewonnen werden, zugesetzt werden. Es können auch Gemische reiner Aminosäuren zugesetzt werden.
- Dem Medium wird auch Sauerstoff zugeführt. Um maximale Kulturdichten zu erreichen, erfolgt die Züchtung üblicherweise derart, daß die Fläche der Sauerstoff/Flüssigkeits- Grenzflächen erhöht wird.
- Wichtige, die Züchtung beeinflussende Umgebungsfaktoren sind der pH-Wert und die Temperatur. Die Temperatur liegt in einem Bereich zwischen der Minimal- und Maximalwachstumstemperatur. Die meisten Bakterien zeigen ein maximales Wachstum in einem recht engen Temperaturbereich. Für mesophile Bakterien, wie E. coli, reicht der optimale Temperaturbereich von etwa 25ºC bis etwa 42ºC und liegt vorzugsweise bei etwa 37ºC. Die meisten Organismen tolerieren Wasserstoffionenkonzentrationen in einem Bereich von einigen pH-Einheiten. Für Bakterien, wie E. coli, liegt der tolerierbare pH-Wert im Bereich von etwa 6 - 8, vorzugsweise bei etwa 6,8.
- Wenn die Expression eines Gens mit Codierung für das acetylierte Somatotropin unter Kontrolle einer repressiblen Expressionkontrollsequenz steht, kann man speziell die Expression dieses Gens unterdrücken, bis durch die Zellkultur ein vorgegebener Wachstumsgrad oder -wert erreicht ist. Dies geschieht durch Zusatz eines geeigneten Repressors zu dem Medium (beispielsweise Tryptophan, wenn die Expression unter Kontrolle des Tryptophanpromotors und -operators steht).
- Nach der Ernte werden die Zellen zur Gewinnung des acetylierten Somatotropins bearbeitet. Dies geschieht normalerweise durch Aufbrechen der Zellen, Abtrennen von rohem acetyliertem Somatotropin von Bakterienproteinen durch eine oder mehrere Extraktionsstufe(n), Löslichmachen des Somatotropins (in Abhängigkeit von seiner Hydrophobizität), Oxidieren von Sulfhydrylen zur Bildung geeigneter Disulfidbindungen (wenn dienlich) und weiteres Reinigen des Somatotropins durch Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Hochleistungsflüssigchromatographie oder durch sonstige Proteinreinigungsmaßnahmen.
- Es wurden Fermentationen zur Produktion heterologer Polypeptide durch rekombinante Mikroorganismen, beispielsweise von rbSt in E. coli K-12-Stämmen, durchgeführt. Diese Fermentationen erfolgen in "schwachen Hefeextrakt" -Fermentationsmedien mit 0,1% Hefeextrakt und unterstützen eine Überexpression von Polypeptiden in rekombinanten Mikroorganismen auf wirkungsvolle Weise.
- Wegen der molekularen Heterogenität von Somatotropinen können die Positionszahlen von Aminosäureresten der verschiedenen Somatotropine unterschiedlich sein. Der Ausdruck "natives Säugetiersomatotropin" umfaßt diese natürlich vorkommenden Arten. Tafel 1 veranschaulicht die spezifische Aminosäuresequenz einer bSt-Art. Die Numerierung für andere Somatotropine kann bei Involvierung von Analogen unterschiedlich sein. Die Fachleute vermögen ohne wetteres entsprechende Aminosäuresequenzen bei alternativen nativen Säugetiersomatotropinen oder deren Analogen zu lokalisieren.
- pbSt existiert in Isoformen, die sich in ihren jeweiligen isoelektrischen Punkten unterscheiden. Die häufigste Form weist einen pI von 8,2 auf. Cluster eng beeinander liegender Banden erscheinen bei der isoelektrischen Fokussierung bei pl-Werten von 7,0, 6,0 und 5,5. Es hat sich gezeigt, daß rbSt auch einen geringeren pI aufweisende Arten in Clustern mit einem pI von 7,0, 6,0 und 5,5 enthalten. Die Inkubation von rbSt in einer wäßrigen Base, wie 0,1 Mol NH&sub4;CO&sub3; (pH-Wert: 10) führt zu einer stärkeren Verschiebung in Richtung auf Arten mit niedrigeren isoelektrischen Punkten. Umfassende Strukturanalysen zeigten, daß die Modifizierung nach der Basebehandlung zu einer Umwandlung des am Aminosäurerest 99 (Tafel 1) lokalisierten Asparagins in Isoasparagin- und Asparaginsäure führte (vgl. WO-A-9 008 164).
- Isoliertes rbSt, bei dem das am Aminosäurerest 99 (Asn99) lokalisierte Asparagin (Tafel 1) zur Vermeidung einer Bildung von Isoasparaginsäure durch Serin (Ser99) ersetzt war, enthielt ebenfalls rbSt-Arten mit pI-Werten von 7,0, 6, und 5,0. Die pI 7,0-Art von Ser99-rbSt machte etwa 30% des gesamten erhaltenen rbSt aus. Unabhängige Strukturanalysen unter Verwendung von gereinigtem pI 7,0-Material von nativem rbSt (Asn99) zeigte, daß mindestens 4 der pI 7,0-Arten durch Acetylierung der Lysinreste 157, 167, 171 und 180 entstanden waren (Tafel 1). Ohne solche einzelne Acetylierungen würde bei Ser99-rbSt ein nativer pI-Wert von 8,2 zu beobachten sein. Eine gleichzeitige Acetylierung mehrerer Lysinreste führt zu rbSt-Arten mit pI-Werten kleiner 7,0. Die Acetylierung sonstiger rbSt-Lysinreste (in den Positionen 30, 64, 70, 112, 114, 139 und 144, vgl. Tafel 1) wurde nicht festgestellt, sie kann jedoch stattfinden.
- Die absichtliche Acetylierung von Lysinresten während der Fermentation zur Proteinüberexpression ermöglicht die Synthese von Proteinen mit größerer Beständigkeit gegen proteolytischen Abbau durch Trypsin und trypsinartige Proteasen sowie lysinspezifische Modifizierungsreagentien. Weiterhin dürften solche Polypeptide erwartungsgemäß für eine Klärung durch die Nieren aus dem Kreislauf eines Säugetiers, dem das Polypeptid verabreicht wurde, weniger anfällig sein, da eine Acetylierung der Lysinreste an den ε-Aminogruppen zu einer Verringerung des Polypeptid-pI-Werts um eine Einheit pro Acetylierung führt. Durch den niedrigeren pI-Wert dürfte sich auch die Löslichkeit des rbSt unter den zur Isolierung und Formulierung verwendeten Bedingungen erhöhen.
- Die Acetylierung spezifischer Lysinreste während der Fermentation zur Überexpression von rbSt war unerwartet. Die Mechanismen einer solchen Acetylierung sind noch nicht bekannt. Vor dieser Erfindung gab es keine bekannten Fermentationsmaßnahmen zur Gewinnung von rbSt mit Acetylierung an Lysinresten. Weiterhin waren auch keine Maßnahmen zur Verhinderung der Acetylierung spezieller Lysinreste während der Überexpression von rbSt bekannt.
- Bakterienkulturen: Es wurde der E. coli-Stamm DU45 benutzt. Dieser Stamm wurde aus einem Wildtypstamm von E. coli K-12 (ATCC e23716) durch Entfemen der Lambda-Prophage und des F-Plasmids und durch Einführen des rpoH112-Allels gewonnen. Danach wurde dieser Stamm mit dem Plasmid PURA-99Ser-M4, einem temperaturempfindlichen Runaway-Replikationsvektor von dem Plasmid pURA-4 enthaltend ein Gen mit Codierung für bSt (PCT-Patentanmeldung PCT/US 88/00328, auf die hierin Bezug genommen wird), bei dem das Asparagin am Rest 99 (Tafel 1) durch Serin ersetzt ist (vgl. die ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung S.N. 07/299 107), transformiert.
- Kulturmedien: Die definierten Medien basieren auf dem Medium E von Vogel und Bonner (H. J. Vogel und D. M. Bonner, 1955, "J. Biol. Chem.", 218, 97-106). Die zusammensetzungen und Protokolle zur Zubereitung der Primärsaat- und Fermentationsmedien sind folgende: Primärsaatmedium
- Für Primärsaatkulturen wurden die genannten Komponenten mit Wasser (Umkehrosmosegrad, R.O.) auf 1000 ml aufgefüllt und vor der Sterilisation in 300 ml Volumina unterteilt. Das Saatmedium wurde 20 min bei 121ºC sterilisiert. Nach der Sterilisation ließ man das Saatmedium abkühlen. Dann wurde 0,5 ml steriles Ampicillin (25 gil in R.O.-Wasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 8,0 titriert und dann filtrationssterilisiert, 0,45 µm) zugegeben. Fermentationmedium
- Das Fermentationsmedium wurde durch Erhöhen der Mengen an den genannten Komponenten auf das 200-fache und Hydratisieren derselben in 165 Litern R.O.-Wasser in einem 250 1 fassenden Gärbottich zubereitet. Das Fermentationsmedium wurde dann 20 min bei 121ºC sterilisiert (während der Sten lisation kam es vermutlich infolge von Dampfkondensation zu einer Mediumvolumenzunahme von 20 1). Nach der Sterilisation wurde der pH-Wert des Mediums überprüft. Es zeigte sich, daß dieser 6,6 bis 6,9 betrug. Nach dem Abkühlen erfolgten zwei aseptische Zugaben zur Vervollständigung des Fermentations mediums. Die erste Zugabe bestand in einem 200 ml aliquoten Teil von Mikronährstoffen (Endkonzentrationen: (NH&sub4;)&sub6;(MO&sub7;)&sub2;&sub4; 4H&sub2;O, 12 µM; H&sub3;BO&sub3;, 1,6 mM; CoCl&sub2; 6H&sub2;O, 120 µM; CUSO&sub4;, 25,5 µM; MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 319,4 µM;ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 40,1 µM). Der Zusatz war filtrationssterilisiert worden (0,45 µm). Der zweite Zusatz bestand aus 15 1 Cerelose (8,24 kg Cerelose, aufgefüllt mit R.O.-Wasser auf 14 1 und mit H&sub2;SO&sub4; auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt). Das Fermentationsmedium wurde vor dem Beimpfen mit 25%iger NaOH auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt.
- Das Fermentationsmedium mit schwachem Hef eextrakt enthielt 0,1% Hefeextrakt für DU45-Kulturen.
- Produktion von acetyliertem rbSt im Laufe von Fermentationen in schwachem Hefeextrakt.
- Jede Primärsaatkultur wurde mit dem Inhalt einer Kulturampulle (etwa 1 ml) beimpft und bei 28ºC bis zu einer Kulturdichte von 0,7 bis 0,8 A&sub5;&sub5;&sub0; inkubiert. Nach der Inkubation wurde jede Primärsaatkultur vor der Verwendung zum Beimpfen der Gärbottiche auf Eis gestellt. Sämtliche Primärsaatkulturen wurden mit Ampicillin ergänzt, um Kulturen mit im wesentlichen sämtlichen plasmidtragenden Bakterien zu gewinnen. DU4S-Fermentationen wurden durch Beimpfen mit einem 600 ml Inoculat eingeleitet. Der Gärbottich-pH-Wert wurde mit wasserfreiem Ammoniak auf 7,2 bis 7,4 gebracht. Das Rühren des Gärbottichs und die Belüftungsraten wurden bei einem Rückdruck von 10 psig auf 320 U/min und 300 slm eingestellt. Die Kulturen wurden bei einer zulässigen Temperatur von 27ºC wachsengelassen. DU4S-Fermentationen blieben bei 27ºC durchgangig erhalten, da eine Plasmid-Runaway-Replikation und rbSt-Synthese spontan eingeleitet wurden (WO-A-8 806 186).
- Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden aus den Primärsaaten und dem Gärbottich aliquote Teile der Kultur entfernt und einer Reihe von analytischen Maßnahmen unterworfen, um die Kulturdichte (Absorption bei 550 nm), das Gesamttrockengewicht der Bakterien, die Gesamtkonzentration an rbSt, die Glucosekonzentration, die Konzentration an freiem Ammoniak und die Acetatkonzentration zu quantifizieren. Ferner wurden Einschlußkörper mikroskopisch identifiziert und quantifiziert.
- Gereinigte rbSt-Präparate wurden aus Fermentationskulturen des Stammes DU4S gewonnen und einer isoelektrischen Fokussierung (IEF) unterworfen, um die Mengen an acetyliertem rbSt (pl 7,0- gegen 8,2-Art von Ser99-rbSt) zu quantifizieren. Je größer die Menge an pI 7,0 rbSt ist, desto größer ist der Bruchteil des gesamten rbSt in der monoacetylierten Form. Die IEF erfolgte mit 1 mm dicken waagerechten tafelförmigen Gelen einer 5% T, 3% C-Zusammensetzung und in einem pH- Bereich von 3,5 bis 9,5 (LKB PAG-Platte 1804-101). Die Gele wurden in Abwesenheit von jeglichem Denaturierungsmittel bei maximal 1500 V und bei einer konstanten Leistung von 30W bei 10ºC "laufengelassen". Die Gele wurden 30 min bei Raumtemperatur in wäßriger 11,5%iger (g/v) Trichloressigsäure, 3,5%iger (g/v) Sulfosalicylsäure fixiert. Das Anfärben erfolgte während 10 min bei 60ºC mit 0,1%igem (giv) Coomassie Blau R250 in 25%igem Ethanol:8%iger Essigsäure. Die Gele wurden in 25%igem Ethanol:8%iger Essigsäure entfärbt. Die Quantifizierung der rbSt-Arten in den IEF-Gelen erfolgte mit Hilfe eines LKB-Laser-Densitometers.
- Fermentationsproben wurden im Laufe einer Fermentation in schwachem Hefeextrakt gewonnen. Die Mengen an monoacetyliertem rbSt (pl 7,0-Form von Ser99-rbSt) wurden durch IEF quantifiziert. Die Daten in Tabelle 1 zeigen, daß die Menge an monoacetylierter rbSt-Art in den rbSt-Präparaten von einem prozentualen Anteil von 24,9% bis 34,7% im Laufe der Fermen tation reicht. Weiterhin belegen diese Ergebnisse, daß die Menge an monoacetylierter rbSt-Art in frühen Fermentationsproben (beispielsweise 17 h nach dem Beimpfen) signifikant ist und während der Fermentationsdauer relativ konstant bleibt. Tabelle 1 Mengen an pI 8,2- und 7,0-rbSt-Arten bei der Fermentation in schwachem Hefeextrakt
- 1 Fermentationsdauer in h nach der Beimpfung. Die spontane Einleitung einer rbSt-Synthese erfolgt etwa 15 h nach der Beimpfung. Tafel 1: Aminosäuresequenz von Rindersomatotropin
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung eines acetylierten
Somatotropins durch Züchten von mit einer DNA-Sequenz mit Codierung
für das Somatotropin transformierten E. coli auf einem
Fermentationsmedium, das eine Aminosäurekonzentration aufweist,
die - während oder kurz vor der Somatotropinbiosynthese - für
eine Repression der Biosynthese von oder zur Rückkopplungs
hemmung von Aminosäurebiosyntheseenzymen zu gering ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem
Somatotropin um Rindersomatotropin handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die
Aminosäurekonzentration jeweils unter 0,5 Mmol liegt.
4. Rindersomatotropin, bei welchem mindestens einer der
Aminosäurereste, die den Lysinen in den Positionen 157, 167,
171 und 180 entsprechen, acetyliert ist und welches lediglich
an Lysin(positionen) acetyliert ist.
5. Rindersomatotropin nach Anspruch 4, das lediglich an
Position 157 acetyliert ist.
6. Rindersomatotropin nach Anspruch 4, das lediglich an
Position 167 acetyliert ist.
7. Rindersomatotropin nach Anspruch 4, das lediglich an
Position 171 acetyliert ist.
8. Rindersomatotropin nach Anspruch 4, das lediglich an
Position 180 acetyliert ist.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32390189A | 1989-03-15 | 1989-03-15 | |
| PCT/US1990/000326 WO1990010706A1 (en) | 1989-03-15 | 1990-01-23 | Acetylated heterologous polypeptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69028396D1 DE69028396D1 (de) | 1996-10-10 |
| DE69028396T2 true DE69028396T2 (de) | 1997-02-13 |
Family
ID=23261207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69028396T Expired - Fee Related DE69028396T2 (de) | 1989-03-15 | 1990-01-23 | Acetylierte heterologe polypeptide |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0719792A2 (de) |
| JP (1) | JPH04504060A (de) |
| KR (1) | KR920700292A (de) |
| AT (1) | ATE142270T1 (de) |
| AU (1) | AU629929B2 (de) |
| CA (1) | CA2045173A1 (de) |
| DE (1) | DE69028396T2 (de) |
| DK (1) | DK0463115T3 (de) |
| ES (1) | ES2091241T3 (de) |
| HU (1) | HUT58796A (de) |
| WO (1) | WO1990010706A1 (de) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6140071A (en) * | 1994-01-27 | 2000-10-31 | Somatogen, Inc. | Proteins with mutations to decrease N-terminal methylation |
| ES2328223T3 (es) | 2000-05-10 | 2009-11-11 | Asubio Pharma Co., Ltd. | Metodos para reducir la formacion de subproductos en la produccion de polipeptidos geneticamente modificados. |
-
1990
- 1990-01-23 ES ES90906035T patent/ES2091241T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-23 EP EP96101997A patent/EP0719792A2/de not_active Withdrawn
- 1990-01-23 KR KR1019900702445A patent/KR920700292A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-01-23 HU HU903721A patent/HUT58796A/hu unknown
- 1990-01-23 AU AU54060/90A patent/AU629929B2/en not_active Ceased
- 1990-01-23 JP JP2505682A patent/JPH04504060A/ja active Pending
- 1990-01-23 WO PCT/US1990/000326 patent/WO1990010706A1/en active IP Right Grant
- 1990-01-23 DE DE69028396T patent/DE69028396T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-23 CA CA002045173A patent/CA2045173A1/en not_active Abandoned
- 1990-01-23 EP EP90906035A patent/EP0463115B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-23 AT AT90906035T patent/ATE142270T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-23 DK DK90906035.2T patent/DK0463115T3/da active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69028396D1 (de) | 1996-10-10 |
| HUT58796A (en) | 1992-03-30 |
| EP0463115B1 (de) | 1996-09-04 |
| ATE142270T1 (de) | 1996-09-15 |
| AU629929B2 (en) | 1992-10-15 |
| AU5406090A (en) | 1990-10-09 |
| EP0463115A1 (de) | 1992-01-02 |
| WO1990010706A1 (en) | 1990-09-20 |
| KR920700292A (ko) | 1992-02-19 |
| CA2045173A1 (en) | 1990-09-16 |
| DK0463115T3 (de) | 1997-02-17 |
| EP0719792A2 (de) | 1996-07-03 |
| HU903721D0 (en) | 1991-12-30 |
| ES2091241T3 (es) | 1996-11-01 |
| JPH04504060A (ja) | 1992-07-23 |
| EP0719792A3 (de) | 1996-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0156355B2 (de) | Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute von heterologen Proteinen, produziert durch Züchtung von rekombinanten Bakterien | |
| DE3750906T2 (de) | Chemisch modifizierte Proteine und deren Herstellung. | |
| DE3586773T2 (de) | Verfahren zur beseitigung von n-endaminosaeureresten aus eukaryotpolypeptidanlagen und so erzeugte polypeptide. | |
| CH638241A5 (de) | Enzympraeparat mit l-alpha-aminoacylamidase-aktivitaet. | |
| DE2825245C2 (de) | ||
| EP0144064A2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Interferonen | |
| DE69220326T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Trans-L-Hydroxy-Prolin | |
| DE3873845T2 (de) | Antimikrobielles agens, fr 109 615 und seine herstellung. | |
| DE69028396T2 (de) | Acetylierte heterologe polypeptide | |
| DE69911024T2 (de) | Methoden zur herstellung von rekombinanten peptiden mit einer geringen menge von trisulfiden | |
| DE3686102T2 (de) | Mikrobiologische herstellung eines schweinewachstumshormons mit hoher ausbeute. | |
| US5622845A (en) | Fermentation method for producing norleucine | |
| DE2164170C3 (de) | Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Arginin | |
| EP0381958B1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Insulinvorläufers | |
| DE3878421T2 (de) | Verfahren zur herstellung von carnitin. | |
| DE68927997T2 (de) | Verfahren zum regeln des norleucingehalts in polypeptiden | |
| US6034224A (en) | Method for solubilization and naturation of somatotropins | |
| EP0321722B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden | |
| CH658670A5 (de) | Verfahren zur erzeugung von l-phenylalanin unter wiederverwendung von phenylalanin-ammoniumhydroxid-lyase. | |
| DE3787155T2 (de) | Enzymatische Herstellung von L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Alkylester. | |
| DE69126213T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch Fermentation | |
| DE19930676A1 (de) | Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen in komplexen Mischungen bei deren Lagerung in wäßrigen Lösungsmitteln | |
| EP0219839A2 (de) | Derivat des Interleukin-2, seine Herstellung und Verwendung | |
| DE3702384A1 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosaeuren | |
| DE69329451T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |