DE3686102T2

DE3686102T2 - Mikrobiologische herstellung eines schweinewachstumshormons mit hoher ausbeute.

Info

Publication number: DE3686102T2
Application number: DE8686305052T
Authority: DE
Inventors: James R Mcmullen
Original assignee: International Minerals and Chemical Corp
Current assignee: International Minerals and Chemical Corp
Priority date: 1985-06-28
Filing date: 1986-06-27
Publication date: 1993-01-07
Anticipated expiration: 2006-06-28
Also published as: DK303586A; US4788144A; DK303586D0; IL79271A0; PT82860B; MX165881B; PT82860A; EP0208489A2; CA1262533C; CA1262533A; EP0208489B1; BR8602996A; ES2025383A6; DE3686102D1; IE60142B1; EP0208489A3; ATE78512T1; IE861730L; ZA864800B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Produktion von Schweinewachstumshormon in großen Mengen durch rekombinante DNA-Technologie. Diese Produktion großer Mengen erreicht man durch Fermentation von transformierten E. coli-Zellen, welche ein für Schweinewachstumshormon codierendes Gen enthalten, bei hoher Dichte.
Schweinewachstumshormon (SGH) ist ein Protein mit 190 Aminosäuren, welches zunächst als Prekursor oder "Prä-Wachstumshormon" mit 26 zusätzlichen Aminosäuren am N-Terminus in der vorderen Hirnanhangdrüse synthetisiert wird. Diese 26- Aminosäuren lange Signalsequenz wird während der Sekretion aus den Hirnanhangdrüsen-Zellen unter Ausbildung des reifen Hormons abgespalten. Es konnte gezeigt werden, daß die Verabreichung von aus Hirnanhangdrüsen isoliertem SGH an Schweine zu erhöhten Wachstumsgeschwindigkeiten,verbesserter Nahrungs-Tiergewichtkonversion, verbesserter Fleischqualität in bezug auf den Nährwert und verbesserter Qualität in bezug auf größere Lange und geringerem Fettgehalt dem Tierkörpers führt. (Siehe z.B. europäische Patentanmneldung Publikations-Nr. 0 104 920). Der potentielle wirtschaftliche Wert dieses Hormons erweckte Interesse an der Bereitstellung von SGH in kommerziellen Mengen zu vernünftigen Kosten.
Deshalb waren in den letzten Jahren viele Anstrengungen auf die mikrobielle Synthese dieses wirtschaftlich wertvollen Hormons mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechnologie gerichtet. Man verwendete Genklonierungs- und Manipulationstechniken, welche aus dem Stand der Technik bekannt waren, um rekombinante Expressionsvektoren zu produzieren, die eine für SGH kodierende cDNA enthielten, welche mit regulatorischen Bereichen fusioniert war, die die Synthese von SGH in den gewünschten Wirtzellen steuern konnten. Es konnte gezeigt werden, daß Mikroorganismen, welche mit diesen Expressionsvektoren transformiert wurden, das gewünschte Hormon produzierten Beispielsweise ist die Klonierung von SGH-spezifischer cDNA und die Konstruktion von Expressionsvektoren davon in der europäischen Patentanmeldung, Publikations-Nr. 0 104 920 (im folgenden bezeichnet als EPO 0 104 920) beschrieben. Die höchste, in dieser Publikation beschriebene SGH-Ausbeute, 32 mg/l, wurde in kleinem Maßstab in Kulturen von E. coli- Zellen erreicht, welche sowohl mit einem Expressionsvektor, der für Δ-7 SGH (einem SGH-Polypeptid, dem die ersten sieben aminoterminalen Aminosäuren des reifen Hormons fehlen) als auch mit einem Plasmid transformiert wurden, das ein für einen temperatursensitiven Repressor codierendes Gen zur Kontrolle der SGH-Synthese trug. Die Fermentation von irgendeinem der transförmierten Stämme in großem Maßstab wird nicht beschrieben. Seeburg et al., (DNA, 2:37-45 (1983)) beschreibt die Klonierung von Rinder- und Schweinewachstumshormon-cDNA und die Konstruktion von Expressionsvektoren, welche für die vollständigen,reifen Hormone codieren (d.h. die "Prä"- oder Signalsequenz wird in vitro während der Vektorkonstruktion entfernt). E. coli-Zellen werden mit dem SGH-Expressionsvektor transformiert und die SGH-Synthese wird durch die plasmidgebundene E. coli trp-Regulatorregion reguliert. Es wird beschrieben, daß die Fermentation der transformierten E. coli-Zellen bei hoher Dichte etwa 1,5 g/l SGH ergibt, eine Beschreibung der Fermentationsbedingungen ist jedoch nicht angegeben.
Um maximale exprimierte Mengen der Proteinprodukte aus klonierten Genen zu erhalten, sind häufig viele Versuche erforderlich. Die Gene können mit mehreren verschiedenen Regulatorregionen fusioniert werden und/oder in mehrere Wirtszell-Stämme zur Durchführung von Vergleichsanalysen transformiert werden, um denjenigen transformierten Stamm herauszufinden, der die höchste Produktivität für das gewünschte Protein zeigt. Bis jetzt waren die Anstrengungen zur Verbesserung der Ausbeute von mikrobiell hergestellten Wachstumshormonen überwiegend auf den Bereich genetischer Manipulationen gerichtet, um die zelluläre Expression zu erhöhen. Es besteht das Bedürfnis an der Entwicklung von Fermentationsprozessen im kommerziellen Maßstab, mit denen Wachstumshormone in höchstmöglichen Ausbeuten produziert werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion eines Proteins mit SGH-Aktivität in großen Mengen durch Fermentation von E. coli-Zellen bereit, welche ein Gen für das Protein enthalten, wie z.B. E. coli-Zellen, welche mit einem rekombinanten Vektor, der ein für SGH codierendes Gen enthält, transformiert sind. Die SGH-Expression wird durch den temperatursensitiven Repressor λcI857 reguliert, der ebenfalls von einem Plasmid codiert wird, mit welchem der E. coli-Wirtsstamm transformiert wurde. Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man durch Fermentationen bei hoher Dichte ein Protein mit SGH-Aktivität in Mengen von 7,2 bis 10,7 g/l.
Dieses Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit SGH-Aktivität umfaßt die folgenden Schritte:
(i) Man inokuliert ein wäßriges Fermentationsmedium mit einer Kultur eines transformierten E. coli-Stammes, der ein Gen, das die Expression des Proteins unter der Kontrolle des Lambda-Phagenpromotor-Operators und ein Gen, welches die Expression des temperatursensitiven Repressorproteins λcI857 steuert, enthält, wobei die Gene z.B. in zwei verschiedenen Expressionsvektoren vorliegen;
(ii) man züchtet den transformierten Stamm in dem Fermentationsmedium während einer anfänglichen Wachstumsperiode, während der der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Medium bei etwa 20% bis 60% der Sättigung gehalten und die Temperatur des Mediums bei einer Temperatur gehalten wird, bei welcher das Repressorprotein λcI857 aktiv ist, z.B. bei etwa 26ºC bis 30ºC;
(iii) man gibt, wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums 20-60 erreicht, Nährstoffe zu dem Fermentationsmedium hinzu und erhöht die Temperatur des Fermentationsmediums auf wenigstens etwa 42ºC, so daß das temperatursensitive Repressorprotein λcI857 inaktiviert wird, wodurch die Induktionsperiode eingeleitet wird, während der das Protein produziert wird; anschließend
(iv) vermindert man die Temperatur auf etwa 38ºC bis 41ºC, vorzugsweise etwa 40ºC und setzt die Züchtung des transformierten Stammes während der verbleibenden Induktionsperiode fort, wobei man den Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Medium bei etwa 10% bis 40% der Sättigung hält; während dieser Zeit gibt man weitere Nährstoffe zu dem Fermentationsmedium hinzu; und
(v) man isoliert das auf diese Weise produzierte Protein aus den transformierten Zellen.
Durch Verminderung der Temperatur des Fermentationsmediums auf etwa 38ºC bis 41ºC nach Inaktivierung des Repressorproteins λcI857, welches während der anfänglichen Wachstumsperiode synthetisiert worden war, wird das Zellwachstums optimiert, während eine substantielle Produktion von aktivem Repressorprotein λcI857 verhindert wird und dadurch die Ausbeute an gewünschtem Protein mit Schweinewachstumshormonaktivität verbessert wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt die wesentlichen Merkmale des Plasmids PL-mu- 7 SGH, einem SGH-Expressionsvektor, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann.
Figur 2 zeigt die wesentlichen Merkmale des Plasmids pcI857, welches für den temperatursensitiven Repressor λcI857 codiert und zur Kontrolle der SGH-Produktion in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Für den Fall, daß keine anderen Angaben gemacht werden, stehen im folgenden die Ausdrücke "SGH" und "Schweinewachstumshormon" für ein Protein mit Schweinewachstumshormon- Aktivität.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren, in welchem man einen transformierten E. coli-Stamm verwendet, der ein für SGH codierendes Plasmid verwendet, kann als die SGH-Expression steuerndes Plasmid jedes geeignete, für SGH codierende Plasmid verwendet werden, in dem die SGH-Expression von einer regulatorischen Region gesteuert wird, die eine Promotor- Operator-Region aus dem Bakteriophagen λ, vorzugsweise die λPL-Promotor-Operator-Region, enthält. Die regulatorische Region enthält außerdem eine Shine-Dalgarno (Ribosomenbindungs-)Region, welche vorzugsweise vom Bakteriophagen mu abgeleitet ist. Die für SGH codierende Sequenz, welche mit der regulatorischen Region operabel verbunden ist, umfaßt eine DNA-Sequenz, welche für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SGH oder ein biologisch aktives Fragment oder Analogon davon, codiert. Die hierin verwendeten Begriffe "Schweinewachstumshormon" und "SGH" umfassen somit biologisch aktive Fragmente des Hormons, in welchen, z.B. verschiedene Teile des aminoterminalen Endes des Hormons deletiert sind, oder analoge Verbindungen, mit einer oder mehreren Substitutionen und/oder Modifikationen in der SGH-Sequenz, welche die biologische Aktivität des Polypeptids nicht zerstören. Für SGH-Polypeptide, denen unterschiedliche Abschnitte des aminoterminalen Endes des Hormons fehlen, konnte gezeigt werden, daß sie ihre biologische Aktivität beibehalten (s. z.B. europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 0 104 920). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert das für SGH-codierende Plasmid für Δ7 SGH, d.h. für ein Polypeptid, das der Aminosäuresequenz von reifem SGH ohne den ersten sieben aminoterminalen Aminosäuren entspricht.
Vorteilhafterweise trägt das Plasmid außerdem ein Gen, welches für einen selektierbaren Marker, z.B. für ein Antibiotika-Resistenzgen codiert, zur Selektion der durch das Plasmid transformierten Zellen.
Der verwendete transformierte Stamm in dem erfindungsgemäßen Verfahren enthält außerdem ein λcI857-Repressorgen. Das Repressorprotein, für das dieses Gen einer temperatursensitiven Mutante codiert, wechselwirkt bekanntlich mit den Operatoren der regulatorischen Regionen des λ-Phagen- Gens (einschließlich dem PL-Operator) und verhindert die Transcription von auf den Promotor in der regulatorischen Region folgenden Genen.
Dieses Repressorprotein wurde bereits zur Regulation der Synthese von gewünschten Proteinen verwendet, für die rekombinante Vektoren in verschiedenen transformierten Stämmen codierten. Zum Beispiel beschreiben C. Queen (J. of Molec. and Appl. Genetics, 2:1 (1983), H. Kupper (Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 0 076 037) und G. Buell (Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 0 103 395) die Verwendung des λcI857-Repressors zur Regulation der Synthese eines rekombinanten,Vektor-codierten, gewünschten Proteins. Das λcI857-Gen wird entweder von dem Vektor getragen, der das Gen für das gewünschte Protein trägt (und die λ-Promotor-Operator-Region, welche dessen Expression steuert) oder befindet sich auf einem separaten Plasmid, welches in die Wirtszellen transformiert wurde. Die Synthese des gewünschten Proteins wird dadurch unterdrückt, daß man die transformierten Wirtszellen bei Temperaturen unterhalb von 32ºC kultiviert, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist. Diese Forscher inaktivierten anschließend den λcI857-Repressor (wodurch die Synthese des gewünschten Proteins induziert wurde) durch Erhöhung der Temperatur auf 42 - 43ºC während des verbleibenden Kultivierungszeitraums.
Das λcI857-Gen wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Kontrolle der SGH-Synthese verwendet und kann von dem Wirtszell-Chromosom, von dem für SGH-codierenden Plasmid oder von einem zweiten Plasmid getragen werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein zweites Plasmid, welches die Expression des λcI857- Repressorproteins steuert, in den Wirtsstamm transformiert werden, und zwar zusammen mit dem für SGH-codierenden Plasmid. Der λcI857-Repressor wechselwirkt mit dem λPL-Promotor-Operator und kann in gewissem Umfang bei Temperaturen um 37ºC inaktiviert werden. Die besten Ergebnisse erreicht man jedoch durch Inaktivierung des λcI857-Repressors durch 1-stündige Erhöhung der Temperatur auf 42ºC und durch anschließende Verringerung auf 40ºC während der verbleibenden Fermentationszeit.
Als Wirtszellen können alle transformierbaren E. coli- Stämme verwendet werden, welche für eine Fermentation bei hoher Dichte geeignet sind und in denen die zur Transformation der Zellen verwendeten Expressionsvektoren stabil gehalten werden können. Viele solcher Stämme sind aus dem Stand der Technik bekannt, wobei ein geeigneter Stamm E. coli HB101 (Leu Lac pro thi hrs hsm supE recA smr) ist.
Ein bevorzugter transformierter Stamm zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der E. coli HB101-Stamm, der mit den Plasmiden PL-mu-Δ7 SGH und pcI857 transformiert wurde. Der transformierte Stamm mit der Bezeichnung E. coli IMC No.2 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 53031 hinterlegt. Das Plasmid PL-mu Δ7 SGH entspricht dem Plasmid pSGH-Δ7, welches in der europäischen Patentanmeldung, Publikations-Nr. 0 104 920 beschrieben wurde und im folgenden als EPO 0 104 920 bezeichnet wird, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird.
Das in Fig. 1 gezeigte Plasmid PL-mu-Δ7 SGH codiert für ein SGH-Polypeptid, dem die ersten sieben aminoterminalen Aminosäuren des reifen Hormons fehlen. Die Expression der für SGH codierenden Sequenz wird durch eine Regulatorregion kontrolliert, welche den λ-Phagen-PL-Promotor-Operator und eine Shine-Dalgarno-Region, abgeleitet aus dem Bakteriophagen mu, umfaßt, wobei ein Startcodon (ATG) benachbart (und am 5'-Ende) zur SGH-Sequenz zu finden ist. Das Plasmid trägt außerdem ein Gen für die Ampicillinresistenz.
Das in Fig. 2 gezeigte Plasmid pcI857 ist ein Multicopy- Plasmid, welches für den temperatursensitiven Repressor λcI857 codiert, und außerdem ein Kanamycin-Resistenzgen trägt. E. coli HB101-Zellen, welche mit beiden Plasmiden transformiert werden, selektiert man durch Wachstum in einer Luria- Brühe, welche sowohl mit Ampicillin als auch mit Kanamycin ergänzt wird und wobei man ein Verfahren anwendet, das vergleichbar ist mit dem in EPO 0 104 920 beschriebenen Verfahren.
Den transformierten Stamm verwendet man zum Animpfen eines in einem Fermenter enthaltenen wäßrigen Mediums. Als wäßriges Fermentationsmedium kann jedes Medium verwendet werden, welches für ein Wachstum von E. coli bei hoher Dichte geeignet ist. Das Medium enthält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Salze und andere für das Zellwachstum erforderliche Nährstoffe. Geeignete Kohlenstoffquellen sind z.B. Glyzerin und hydrierte Glucose (käuflich erhältlich als Cerelose ). Geeignete Stickstoffquellen sind z.B. Säurehydrolysate von Casein (käuflich erhältlich als HyCase Amino und Casamino Acids); enzymatische Caseinhydrolysate (käuflich erhältlich als NZ Amine A, Casatone, Marcor Casein Pepton M und Trypton), pflanzliche hydrolysierte Proteine (wie Sojabohnenpeptone, hydrolysiertes Maisgluten und Baumwollsamenpepton); Fleischpeptone; und Hefeextrakte. Andere geeignete Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sind dem Fachmann bekannt und ebenfalls anwendbar. Sämtliche Komponenten, welche zur Retention von Plasmiden durch die Wirtszellen erforderlich sind, werden dem Medium zugegeben. Zum Beispiel gibt man die Antibiotika Ampicillin und Kanamycin hinzu, wenn der transformierte Stamm E. coli IMC No.2 im Fermentor gezüchtet wird.
Jede beliebige Fermentationsausrüstung, die aus dem Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, mit der Maßgabe, daß Vorrichtungen zur Kontrolle der Medientemperatur, zum Rühren und zum Belüften des Mediums und zur Zugabe von Sauerstoff zur Luftzufuhr vorgesehen sind.
Den Fermenter impft man mit einer Kultur des transformierten Stammes an. Vorteilhafterweise wird die Kultur vorher 8 - 24 h bei 30ºC, vorzugsweise 16 - 20 h (oder bis die A&sub5;&sub5;&sub0;, d.h. die Extinktion bei 550 nm der Kultur zwischen 2 und 42, vorzugsweise oberhalb von 30 liegt) unter Rühren bei etwa 300 Upm inkubiert. Die Kultur kann in jedem geeigneten Medium gezüchtet werden, wie z.B. in den im folgenden beschriebenen ESM-1- und ESM-2-Medien oder in Luria- Brühe, wobei ESM-2-Medien bevorzugt sind. Das Volumen der zum Animpfen des Fermenters verwendeten Kultur beträgt 1/500stel bis 1/25stel, vorzugsweise etwa 1/50stel des im Fermentor enthaltenen Volumens.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Fermentation in zwei Phasen durchgeführt. Nach dem Animpfen des Fermentationsmediums mit dem transformierten Stamm folgt eine anfängliche Wachstumsperiode, während welcher der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Medium bei etwa 20% bis 60% der Sättigung gehalten wird. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff nimmt ab, sobald die Zelldichte stark anzuwachsen beginnt. Der Gehalt wird vorzugsweise oberhalb von 20% Sättigung gehalten. Dies kann man dadurch erreichen, daß man Umgebungsluft in den Fermenter mit einer Geschwindigkeit einleitet, die ausreicht, um die Konzentration von gelöstem Sauerstoff auf dem gewünschten Niveau zu halten, während man das Fermentationsmedium mit geeigneten mechanischen Mitteln rührt. Die Einleitung von Umgebungsluft mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,8 bis 1,2, vorzugsweise 1,0 Volumina Luft (STP) je Volumen Flüssigkeit pro Minute bei Rühren mit 800 - 1200 Upm, vorzugsweise etwa 1000 Upm, ist geeignet. Der Rührer wird von einem Motor angetrieben, der vorzugsweise eine Leistungsaufnahme von etwa 0,5 - 1,5 Horsepower/100 Gallonen Fermentationsmedium aufweist. Die Temperatur des Mediums während der anfänglichen Wachstumsperiode entspricht einer Temperatur, bei der das Wachstum von E. coli erfolgt, während das λcI857-Repressorprotein aktiv ist und die SGH-Expression in dem transformierten Stamm daher unterdrückt. Für den Stamm E. coli IMC No.2 hält man die Temperatur zwischen 26ºC und 30ºC, vorzugsweise bei etwa 28 - 30ºC.
Die Temperatur kann aber auch erst bei 28ºC bis 30ºC während eines Teils der anfänglichen Wachstumsperiode, z.B. während der ersten 13 Stunden, gehalten werden und kann dann allmählich auf etwa 35ºC während der restlichen anfänglichen Wachstumsperiode erhöht werden.
Die anfängliche Wachstumsperiode wird fortgesetzt, bis die Zelldichte (bestimmt durch die A&sub5;&sub5;&sub0; einer Kulturprobe aus dem Fermenter) etwa 20 bis 40 erreicht, was üblicherweise nach etwa 16 - 24 h nach Animpfen des Fermentationsmediums der Fall ist. Gute Ergebnisse kann man auch dadurch erhalten, daß man die anfängliche Wachstumsperiode fortsetzt, bis die A&sub5;&sub5;&sub0; etwa 60 erreicht. Während dieser verlängerten Wachstumsperiode kann die Temperatur allmählich auf 35ºC, wie im folgenden beschrieben, erhöht werden, oder es können, wie im folgenden beschrieben, Nährstoffe hinzugesetzt werden. Die Zugabe von Nährstoffen kann die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen erhöhen, so daß eine A&sub5;&sub5;&sub0; von etwa 60 in etwa 16 h erreicht werden kann.
Zu diesem Zeitpunkt beginnt die zweite Fermentationsphase, und zwar eine Induktionsphase. Die Temperatur des Fermentationsmediums erhöht man auf wenigstens etwa 42ºC (bevorzugt 42ºC) und hält diesen Wert etwa 1 h, wodurch das λcI857-Repressorprotein inaktiviert und die Produktion von SGH in dem Fermentationsstamm induziert wird. Die Temperatur wird anschließend auf etwa 38ºC bis 41ºC, vorzugsweise auf etwa 40ºC, vermindert. Bei dieser Temperatur ist das λcI857-Repressorprotein inaktiv, jedoch sind die Wachstumsbedingungen für E. coli günstiger als bei 42ºC.
Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Medium wird bei etwa 10 - 40%, vorzugsweise oberhalb etwa 20%, der Sättigung während der Induktionsperiode gehalten. Zur Begasung und zum Rühren können beliebige geeignete Mittel verwendet werden, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff aufrechtzuhalten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Umgebungsluft mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,8 - 1,2, vorzugsweise mit etwa 1,0 Volumina Luft (STP) pro Volumen Flüssigkeit pro Minute eingeleitet und das Medium wird mit etwa 800 - 1200 Upm, vorzugsweise etwa 1200 Upm, gerührt. Der Rührer wird von einem Motor angetrieben, der vorzugsweise eine Leistungsaufnahme von etwa 0,99 bis 2,97 Watt/l (0,5 bis 1,5 Horsepower/100 Gallonen) Fermentationsmedium aufweist. Da die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs während der Induktionsphase erhöht ist, ergänzt man vorzugsweise den in der Umgebungsluft enthaltenen Sauerstoff durch Einleitung von Sauerstoff in den Fermenter, um den gewünschten Gehalt an gelöstem Sauerstoff aufrechtzuerhalten. Die Versorgung des Fermentationsmediums mit Sauerstoff kann mit beliebigen herkömmlichen Mitteln erfolgen. Zum Beispiel kann ein Einblasrohr, welches mit einer Sauerstoffquelle verbunden ist, direkt in das Medium eingeführt werden oder Sauerstoff kann der in den Fermenter eingeleiteten Umgebungsluft zugesetzt werden.
Die Induktionsperiode wird im allgemeinen fortgesetzt, bis die A&sub5;&sub5;&sub0; einen Wert von etwa 80 bis 155, vorzugsweise von 118 bis 153, erreicht. Diese Zelldichten erreicht man üblicherweise nach etwa 8 - 12 h nach dem Start der Induktionsperiode (d.h. nach Erhöhung der Temperatur auf 42ºC oder darüber). Die Fermentations-Parameter, welche anzeigen, daß die SGH-Synthese und das Zellwachstum beendet sind, umfassen:
(1) eine signifikante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs,
(2) keine weitere Zunahme der Zelldichte (A&sub5;&sub5;&sub0;-Werte) und
(3) einen Stop des NaOH-Verbrauchs (zur pH-Kontrolle).
Nährstoffe, welche sich während des Zellwachstums im Fermentationsmedium erschöpfen, werden mit Hilfe aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren ergänzt. Nährstoffe können kontinuierlich oder portionsweise während der Fermentation zugegeben werden. Vorzugsweise gibt man Nährstoffe in Portionen bei Bedarf hinzu.
Eine Nährstoffportion kann zum Zeitpunkt der Induktion der SGH-Synthese (d.h. wenn die Temperatur auf 42ºC oder darüber erhöht wird) und wenigstens einmal, vorzugsweise zweimal, während der Induktionsperiode hinzugegeben werden. Wird z.B. die Induktion bei einem A&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von etwa 20 bis 40 durchgeführt, so kann eine erste Nährstoffportion zum Zeitpunkt der Induktion und eine zweite Nährstoffportion etwa 5 h nach der Induktion (wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; bei etwa 80 bis 90 liegt) hinzugegeben wird. Eine erste Nährstoffportion kann aber auch zum Zeitpunkt der Induktion (wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; bei etwa 20 bis 40 liegt) hinzugegeben werden, eine zweite Nährstoffportion kann etwa 4 h nach der Induktion (wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; zwischen etwa 70 und 80 liegt) hinzugegeben werden und eine dritte Nährstoff kann etwa 6 h nach der Induktion (wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; bei etwa 90 bis 100 liegt) hinzugegeben werden.
Ausgezeichnete Ergebnisse erhält man auch durch Zugabe einer ersten Nährstoffportion während der anfänglichen Wachstumsperiode, z.B. bei einer A&sub5;&sub5;&sub0; von etwa 30 (oder etwa 13 h nach dem Animpfen) und durch Fortsetzung der anfänglichen Wachstumsperiode bis die A&sub5;&sub5;&sub0; etwa 60 erreicht. Eine zweite Nährstoff-Portion wird zum Zeitpunkt der Induktion (wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; etwa 60 erreicht, was etwa 16 h nach dem Animpfen erreicht sein kann) hinzugegeben. Die Nährstoffe können portionsweise einmal oder vorzugsweise zweimal im Verlauf der Induktionsperiode, wie oben beschrieben, zugegeben werden.
Die Art der zuzusetzenden Nährstoffe hängt von der Zusammensetzung des gewählten Fermentationsmediums ab. Im allgemeinen umfassen die zuzusetzenden Nährstoffe die Kohlenstoffquelle (Kohlenstoffquellen) und die Stickstoffquelle (Stickstoffquellen), welche in dem Fermentationsmedium vorliegen, das mit dem transformierten Stamm angeimpft wurde. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als Nährstoffe NZ Amin A und Glyzerin portionsweise hinzugegeben. Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der das Fermentationsmedium Maisgluten- Hydrolysat ist, umfassen die portionsweise zugesetzten Nährstoffe NZ Amin A, Glyzerin und Maisgluten-Hydrolysat, wie im folgenden beschrieben.
Das vom transformierten Stamm produzierte SGH kann mit geeigneten Mitteln gemäß Stand der Technik isoliert werden. Man kann die Zellen aus dem Fermentationsmedium beispielsweise durch Zentrifugation abernten. Die Zellen werden dann durch enzymatische, chemische oder mechanische Hilfsmittel, wie z.B. durch Beschallen, mit einer French-Press, einem Homogenisator oder durch Behandlung mit Substanzen, wie Lysozym und Detergentien, wie Triton-X- 100, lysiert. SGH kann mit Hilfe geeigneter Verfahren zur Proteinreinigung, einschließlich Affinitätschromatographie, selektive Ausfällung aus einer Lösung eines Salzes, wie z.B. Ammoniumsulfat, Ionenaustauschchromatographie, isoelektrischen Fokussierung, oder eine beliebige Kombination von Methoden, abgetrennt werden.
Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Fermentationsverfahrens erhält man Ausbeuten von 7,2 - 10,7 g/l Δ7 SGH bei Fermentationen mit hoher Dichte. Von Forschern, welche früher mit E. coli-Stämmen arbeiteten, die mit PL-mu-Δ7 SGH und pcI857 transformiert waren, wurden Ausbeuten von 32 mg/l Δ7 SGH oder weniger aus kleinen Kulturen berichtet, wobei die Bestimmung mit Hilfe des Radioimmunoassays erfolgte (vgl. EPO 0 104 920, worin PL-mu-Δ7 SGH als pSGH-Δ7 bezeichnet wurde). Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Anwendung eines auf diese Weise transformierten Stammes konnte die SGH-Produktion erfolgreich erhöht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den folgenden Beispielen detaillierter beschrieben. Die Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens, ohne den Schutzbereich der Erfindung einzuschränken.

Beispiel I

Bedingungen für eine erhöhte mikrobielle Produktion von Schweinewachstumshormon

Proben von E. coli IMC No.2-Zellen, denen 10% (v/v) Glyzerin zugesetzt wurde, werden bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff oder bei -85ºC aufbewahrt.

A. Inokulation

Das Inokulum für eine 9 l-Fermentercharge erhält man durch Zugabe der Zellen zu 200 ml entweder eines ESM-1- oder eines ESM-2-Mediums, das in einem 500 ml-Kolben enthalten ist. Den pH des Mediums stellt man auf einen Wert von 6,8 bis 7,0 ein. Das Medium enthält jeweils etwa 25 ug/ml von Ampicillin und Kanamycin. Die Kolben verschließt man mit zwei Milchfiltern, so daß eine geringfügige Begasung des Mediums erfolgen kann, während man den Kolben bei 300 Upm 16 - 20 h und 30ºC in einem New Brunswick-Schüttelrotor schüttelt. Bestandteile NZ Amin A Glyzerin Na-Citrat Spurenelementlösung*

B. Fermenter

Es wurde ein New Brunswick Microgen-Fermenter mit einem Gesamtvolumen von 16 l verwendet. Der Fermenter wird anfänglich mit 9 l des Flüssigmediums plus 180 ml Inokulum beschickt.

C. Fermentationsmedium

Die Zusammensetzung des ursprünglichen 9 l-Mediums ist im folgenden angegeben: Produkt Konzentration (Gramm pro 9 Liter) NZ Amin A-Sheffield Glyzerin Na-Citrat Hodag K-67 Antischaum EDTA (Dinatriumsalz)
Das Medium sterilisiert man 20 min bei 121ºC und stellt den pH mit NaOH auf 6,8 ein. Den pH hält man durch Zugaben von NaOH, falls erforderlich, während der Fermentation aufrecht.
Dem Medium gibt man jeweils 250 mg Ampicillin und Kanamycin hinzu. Die Antibiotika-Lösung wird steril filtriert.
Die Konzentration von gelöstem Sauerstoff (DO) wird gleichmäßig während der Fermentation mit einer galvanischen Sonde aufgezeichnet, welche mit einem Papierschreiber verbunden ist. Während der Induktion wird DO bei etwa 10 - 40% Sättigung (1 - 4 ppm) durch Anreicherung der Zuluft mit Sauerstoffgas gehalten. Eine Gasflasche, ausgerüstet mit einem Sauerstoffregelventil, dient zur Kontrolle des Sauerstoffflusses in die Zuluft. Nach dem Mischen der Gase filtriert man die mit Sauerstoff angereicherte Luft und leitet diese in das Fermentergefäß über ein Einblasrohr ein.

D. Nährstoffzugaben

Zum Zeitpunkt der Induktion (A&sub5;&sub5;&sub0;=37), d.h. wenn die Temperatur auf 42ºC erhöht wird, gibt man Nährstoffe zum Fermentationsmedium hinzu. Man gibt 250 g NZ Amin A und 200 g Glyzerin in etwa 1 l Wasser hinzu. Eine weitere Zugabe von 100 g NZ Amin A und 200 g Glyzerin erfolgt 5 h nach der Induktion (A&sub5;&sub5;&sub0; = 84).

E. Fermenterbetrieb

Die Betriebsbedingungen, welche zu den besten Ergebnissen führten, sind in diesem Abschnitt wiedergegeben.

1. Wachstumsperiode 16 - 24 h

a. Temperatur des Mediums = 28 - 30ºC.
b. Rührgeschwindigkeit: 1000 Upm.
c. Energieaufnahme durch den Rührer: 0,99 - 2,97 Watt/l (0,5 - 1,5 Horsepower/100 Gallonen).
d. Begasungsgeschwindigkeit: 10 l (STP)/min.
e. Gegendruck 34,45 kpa(5 lbs pro in²).
f. Gelöster Sauerstoff: über 20% des Sättigungswertes.
g. Lichtextinktion bei einer Wellenlänge von 550 nm (A&sub5;&sub5;&sub0;) einer Probe des Fermentationsmediums: 20 - 40 am Ende der anfänglichen Wachstumsperiode.

2. Induktionsperiode

a. Temperatur des Mediums:
(1) 42ºC während der ersten Stunde der Induktion.
(2) 40ºC während der restlichen Induktionsperiode.
b. Rührgeschwindigkeit: 1200 Upm.
c. Energieaufnahme durch Rührer: 0,99 - 2,97 Watt/l (0,5 - 1,5 Horsepower/100 Gallonen).
d. Begasungsgeschwindigkeit: 10 l (STP)/min.
e. Gegendruck: 20,67 - 41,34 kpa (3-6 lbs pro in²).
f. Gelöster Sauerstoff: Vorzugsweise über 20% der Sättigung. Um diesen Wert zu erhalten, wird die Zuluft mit Sauerstoff angereichert.
g. End-Extinktion: A&sub5;&sub5;&sub0; = 118 - 153.

F. Ergebnisse

Zur HPLC-Analyse entnimmt man Proben der Fermentationsbrühe und zentrifugiert diese (10 - 15 000 x g, 15 min) und resuspendiert die Bakterien in 4 - 5 Volumina gepuffertem Guanidin (8M Guanidin-HCl, 100 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH 9,8, 5 mM reduziertes Glutathion). Die Suspension läßt man 20 bis 30 min absetzen und homogenisiert dann 15 - 20 s mit einem Tek-Mar tissue mizer, Modell SDT-1810. Unlöslichen Rückstand entfernt man durch Zentrifugation, wie oben beschrieben, und analysiert den klaren SGH-Extrakt durch HPLC. Einige Extrakte verdünnt man 1:2 mit Guanidinpuffer vor Durchführung der HPLC- Analyse. Abschließende Analyse des Fermentationsmediums auf Δ7 SGH. Analysenmethode: Hochdruckflüssigkeitschromatographie Lauf Nr. Gegendruck kpa (lbs./in²) End-Extinktion A&sub5;&sub5;&sub0; nm Zellzahl pro ml (Endwert) Schweinewachstumshormon g/l (HPLC)

Beispiel II

Alternative Fermentationsbedingungen für eine gesteigerte mikrobielle Produktion von Schweinewachstumshormon

Die Verfahren gemäß Beispiel 1 werden mit Ausnahme der Stufen C und D befolgt. Die alternativen Verfahrensweisen für die Stufen C und D und die entsprechenden Ergebnisse sind im folgenden angegeben: C. Fermentationsmedium Produkt Konzentration (Gramm/9 Liter) Mais-Gluten-Hydrolysat* 975 ml NZ Amin A Glyzerin Na-Citrat Hodag K-57 Antischaum Ampicillin Kanamycin (entspricht 250 g Maisglutenmehl vor Hydrolyse) steril filtriert
*Mais-Gluten-Hydrolysat stellt man her, indem man 1500 g Maisglutenmehl (Grain Processing Corporation - 61% proT) und 75 ml Alcalase 2.5 (Novo Laboratories) in 5 l destilliertem Wasser rührt. Die Temperatur stellt man auf 50ºC ein und den pH mit NaOH auf 8,5. Die Hydrolyse erfolgt über Nacht (16 h). Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert; Endvolumen = 5850 ml.

D. Nährstoffzugaben

Bei Induktion gibt man (A&sub5;&sub5;&sub0; = 30), 125 g NZ Amin A, 975 ml Mais-Gluten-Hydrolysat und 200 g Glyzerin hinzu. Weitere Zugaben von 50 g NH Amin A, 390 ml Mais-Gluten-Hydrolysat und 100 g Glyzerin erfolgen 4 h (A&sub5;&sub5;&sub0; = 74) und 6 h (A&sub5;&sub5;&sub0; = 95) nach Induktion. E. Ergebnisse Abschließende Analyse des Fermentationsmediums auf Δ7 SGH. Analysenmethode: Hochdruckflüssigkeitschromatographie Lauf Nr. Gegendruck kpa (lbs./in²) End-Extinktion A&sub5;&sub5;&sub0; nm Zellzahl pro ml (Endwert) geschätzt Schweinewachstumshormon g/l (HPLC)

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Schweine- Wachstumshormon-Aktivität, wobei man:

(i) ein wäßriges Fermentationsmedium mit einer Kultur eines transformierten E. coli-Stammes inokuliert, der ein Gen, welches die Expression des Proteins unter der Kontrolle eines Lambda-Phagen-Promotor- Operators steuert und ein Gen, welches die Expression des temperatursensitiven Repressorproteins λc1857 steuert, enthält;

(ii) den transformierten Stamm in dem Fermentationsmedium während einer anfänglichen Wachstumsphase züchtet, wobei der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Medium bei etwa 20%iger bis 60%iger Sättigung und die Temperatur des Mediums bei einer Temperatur gehalten wird, bei der das Repressorprotein λc1857 aktiv ist;

(iii) wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums 20 bis 60 erreicht, Nährstoffe dem Fermentationsmedium hinzugibt und die Temperatur des Fermentationsmediums auf wenigstens etwa 42ºC erhöht, so daß das temperatursensitive Repressorprotein λc1857 inaktiviert wird, wodurch eine Induktionsperiode eingeleitet wird, während welcher das Protein produziert wird; anschließend

(iv) die Temperatur auf etwa 38ºC bis 41ºC vermindert und das Wachstum des transformierten Stammes während der verbleibenden Induktionsperiode fortsetzt, wobei der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Medium bei etwa 10%iger bis 40%iger Sättigung gehalten wird und wobei während dieser Zeit weitere Nährstoffe dem Fermentationsmedium zugegeben werden; und

(v) das auf diese Weise produzierte Protein aus den transformierten Zellen isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Temperatur auf wenigstens etwa 42ºC erhöht wird, um das temperatursensitive Repressorprotein zu inaktivieren, wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums etwa 20 bis 40 erreicht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Temperatur auf wenigstens etwa 42ºC erhöht wird, um das temperatursensitive Repressorprotein zu inaktivieren, wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums etwa 60 erreicht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Nährstoffe dem Fermentationsmedium portionsweise zugegeben werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4, worin eine erste Nährstoff-Portion dem Fermentationsmedium zum Zeitpunkt der Induktion der Synthese von Schweine- Wachstumshormon zugegeben wird, wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums etwa 20 bis 40 beträgt, eine zweite Nährstoffportion hinzugegeben wird, wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums etwa 70 bis 80 beträgt und eine dritte Nährstoffportion hinzugegeben wird, wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums etwa 90 bis 100 beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, worin eine Nährstoffportion dem Fermentationsmedium zu Beginn der Induktionsperiode zugegeben wird, eine weitere Nährstoffportion dem Fermentationsmedium etwa 4 Stunden nach dem Beginn der Induktionsperiode zugegeben wird und eine weitere Nährstoffportion dem Fermentationsmedium etwa 6 Stunden nach dem Beginn der Induktionsperiode zugegeben wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, worin eine erste Nährstoffportion zur Fermentation hinzugegeben wird, wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums etwa 20 bis 40 beträgt und eine zweite Nährstoffportion hinzugegeben wird, wenn die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums etwa 80 bis 90 erreicht.

8. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 7, worin die Nährstoffe zu dem Fermentationsmedium portionsweise zu Beginn der Induktionsperiode und etwa 5 Stunden nach dem Start der Induktionsperiode hinzugegeben werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Gen unter der Kontrolle des Lambda-Phagen-Promotor- Operators und das Gen, welches die Expression des temperatursensitiven Repressorproteins λc1857 steuert, in zwei verschiedenen Expressionsvektoren enthalten sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die anfängliche Wachstumsperiode etwa 16 Stunden bis 24 Stunden dauert.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Temperatur während der anfänglichen Wachstumsperiode bei etwa 28ºC bis 30ºC gehalten wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin im Anschluß an die Inaktivierung des Repressorproteins die Temperatur auf etwa 40ºC während der verbleibenden Induktionsperiode verringert wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Gen unter der Kontrolle des Lambda-Phagen-Promotor- Operators die Expression eines biologisch aktiven Fragmentes von Schweine-Wachstumshormon steuert, in welchem die ersten sieben aminoterminalen Aminosäuren des reifen Proteins deletiert sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Induktionsperiode etwa 8 - 12 Stunden dauert.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die Induktionsperiode aufrechterhalten wird, bis die A&sub5;&sub5;&sub0; des Fermentationsmediums etwa 80 bis 155 erreicht.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin als transformierter Stamm E. coli IMC Nr. 2 (hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. mit der Hinterlegungsnummer ATCC 53031) oder eine Mutante davon verwendet wird, der ein Gen, welches für ein biologisch aktives Fragment von Schweine- Wachstumshormon codiert, sowie ein Gen, welches für das Repressorprotein λc1857 codiert, enthält.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium während der Induktionsperiode oberhalb etwa 20%iger Sättigung gehalten wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium während der anfänglichen Wachstumsperiode durch Einleitung von Umgebungsluft in den Fermentor mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,8 - 1,2 Volumina Luft pro Volumen Flüssigkeit pro Minute und durch mechanisches Rühren des Fermentationsmediums mit einem Rührer mit einer Leistungsaufnahme von etwa 0,99 - 2,97 Watt/l (0,5 - 1,5 Horsepower/100 Gallonen) des Fermentationsmediums aufrechterhalten wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die Umgebungsluft in den Fermentor mit einer Geschwindigkeit von etwa 1,0 Volumen Luft pro Volumen Flüssigkeit pro Minute eingeleitet wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, worin der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium während der Induktionsperiode durch Einleiten von Umgebungsluft in den Fermentor mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,8 - 1,2 Volumina Luft pro Volumen Flüssigkeit pro Minute und durch mechanisches Rühren des Fermentationsmediums mit einem Rührer mit einer Leistungsaufnahme von etwa 0,99 - 2,97 Watt/l (0,5 - 1,5 Horsepower/100 Gallonen) des Fermentionsmediums und unter gleichzeitigem Einleiten von Sauerstoff in das Fermentationsmedium aufrechterhalten wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Umgebungsluft in den Fermentor während der Induktionsperiode mit einer Geschwindigkeit von etwa 1,0 Volumen Luft pro Volumen Flüssigkeit Pro Minute eingeleitet wird.