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EMI1.1
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11. Bildet keine Säure oder Gas aus Lactose.
12. Verflüssigt Gelatine.
13. Lackmusmilch : Leichte Ansäuerung nach 7 Tagen.
Zu Identifikationszwecken wurde das in"Methods of detection and identification of bacteria" von B. M. Mitruka und M. J. Bonner, Crc Press Inc. 1976 und in"Bergey Manual of Determinative Bacteriology"7. Auflage angegebene Verfahren angewendet.
Der erfindungsgemäss angewendete Stamm kann unter aeroben Bedingungen als Submerskultur in bewegten Fermentatoren gezüchtet werden.
Ein flüssiges Kulturmedium enthält eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Quelle für Stickstoff und Mineralsalze. Kohlenstoffquellen, die angewendet werden können, sind unter anderem Aminosäuren, Glucose, Ölsäure, Linolsäure, Cholesterinester und Natriumacetat. Stickstoffquellen, die angewendet werden können, sind unter anderem organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Triptan, Aminosäuren, hydrolysiertes Casein, Sojamehl, Nitrate und Ammoniumsalze.
Ein geeignetes Kulturmedium besitzt die folgende Zusammensetzung :
EMI2.1
EMI2.2
1 f Spuren7, 2. Der Temperaturbereich liegt zwischen 20 und 37 C, vorzugsweise zwischen 28 und 32 C.
Das Enzym wird gebildet durch Zugabe von Cholesteryloleat oder natürlichen pflanzlichen Ölen zu dem Kulturmedium vor dem Beimpfen. Die Hydrolyse dieser Ester in dem Kulturmedium erfolgt mit Hilfe von Cholesterase, die von Achromobacter delicatulus SM 1307 gebildet worden ist.
Die Induktionszeit kann von 24 bis 72 h, vorzugsweise 40 bis 48 h betragen.
Die während oder am Ende der Kultur gewonnene Fermentationsbrühe kann als solche angewendet werden.
Wahlweise kann die überstehende Flüssigkeit oder die abfiltrierte oder abzentrifugierte Kulturbrühe angewendet werden.
Eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung kann erreicht werden durch Immobilisieren des Enzyms oder eine Kombination mit makromolekularen Verbindungen unter Bildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder ionischer Bindungen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Es wurde eine Kulturbrühe der folgenden Zusammensetzung hergestellt
EMI2.3
<tb>
<tb> NaN03 <SEP> 2 <SEP> g/l
<tb> KHPO <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KCI <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgS04. <SEP> 7H <SEP> P <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Cholesteryloleat <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb>
durch Zugabe dieser Verbindung zu entionisiertem Wasser.
Der PH-Wert der Brühe wurde mit verdünnter HCI auf 7, 0 eingestellt. Das so hergestellte Medium wurde durch Einbringen von 50 ml in jeden Kolben in 250 ml Kolben verteilt. Diese wurden 30 min bei 116 C sterilisiert.
Sie wurden mit 1 ml einer Suspension des Achromobacter delicatulus SM-1307 beimpft, der erhalten worden war durch Waschen der "Patina" einer Kultur von 20 ml Nähr-Agar in 200. 20 mm
EMI2.4
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Die Kulturbrühe wurde 48 h nach dem Beimpfen gewonnen und auf die Enzymaktivität untersucht. 1 ml Kulturbrühe enthielt 0, 2 Enzymeinheiten.
Die Enzymaktivität wurde folgendermassen bestimmt :
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war, wurde zu 5 ml einer Lösung von Cholesteryloleat, enthaltend 0, 3 JlMol/ml in 0, 1 m Phosphatpuffer, PH 6, 7, enthaltend 0, 5% Isooctylphenoxy-polyäthoxy-äthanol, gegeben. Die Reaktion wurde 10 min bei 37 C in einem bewegten Wasserbad durchgeführt und durch 3 min langes Erhitzen der von dem Reaktionsgemisch abgezogenen Probe zum Sieden abgebrochen.
Die Konzentration des durch Hydrolyse von Cholesteryloleat entstandenen Cholesterins wurde kolorimetrisch bestimmt, wobei das freie Cholesterin mit Cholesterinoxydase zu Cholest-4-en-3-on oxydiert wurde unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Dieses reagiert oxydativ mit 4-Aminoantipyrin und Phenol in Gegenwart von Peroxydase unter Bildung eines Chromogens mit Absorptionsmaximum bei 500 nm.
Die optische Dichte der gefärbten Proben wurde in einem DB-GT Beckmann-Gitterspektrophotometer gemessen, bei dem die Küvette einen optischen Weg von 1 cm (0, 1 dm) bei einer Wellenlänge von 500 nm besass.
Wenn eine Einheit als die Menge an Enzym definiert wird, die 1 jimol Cholesterin/min unter den oben angegebenen Testbedingungen bildet, berechnen sich die Enzymeinheiten pro ml Kulturbrühe nach der folgenden Formel :
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in der Etc = optische Dichte der nach 10 min entnommenen Probe
Eo = optische Dichte der nach 0 min entnommenen Probe
5, 45 = optische Dichte einer Lösung, enthalten 1 (iMol Cholesterin pro ml und
D = die Enzymverdünnung bedeutet.
Beispiel 2
Es wurde eine Kulturbrühe der folgenden Zusammensetzung hergestellt
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<tb>
<tb> NaN03 <SEP> 2 <SEP> g/l
<tb> KHPOg <SEP> 2 <SEP> g/l
<tb> KM <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Olivenöl <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb>
durch Zugabe dieser Bestandteile zu entionisiertem Wasser und Einstellung des PH-Wertes mit Salzsäure auf 6, 7.
Kulturen von Achromobacter delicatulus SM-1307 in diesem Medium und entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wurden unter Orbitalschütteln (180 Umdr/min) bei 300C inkubiert.
Die Kulturbrühe wurde 72 h nach dem Beimpfen gesammelt und auf die Cholesterase-Aktivität untersucht. 1 ml der Kulturbrühe enthielt 0, 4 Enzymeinheiten.
Beispiel 3
Es wurde eine Kulturbrühe mit der in Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung hergestellt.
Kulturen von Achromobacter delicatulus SM-1307 in diesem Medium und entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wurden unter Orbitalschütteln (180 Umdr/min) bei 30 C inkubiert.
Die Kulturbrühe wurde 72 h nach dem Beimpfen gewonnen, zentrifugiert und die Cholesterase in der überstehenden Flüssigkeit angewendet zur Bestimmung des Gesamt-Cholesterins in einer Probe von menschlichem Blutserum.
Zu diesem Zweck wurde das folgende Reagens hergestellt :
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<tb>
<tb> Natriumcholat <SEP> 6 <SEP> mM
<tb> Isooctyl-phenoxy-poly-
<tb> äthoxy-äthanol <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Phenol <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> mM
<tb> 4-Aminoantipyrin <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> mM <SEP>
<tb> Peroxydase <SEP> 16400 <SEP> E <SEP> (Boehringer
<tb> Nr. <SEP> 127361 <SEP> im <SEP> Katalog)
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> m <SEP> Natriumphosphat-
<tb> - <SEP> Puffer <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
Das Cholesterin wurde auf folgende Weise bestimmt :
50 m menschliches Serum und 0, 25 ml des Kulturmediums wurden zu 2, 5 ml Reagens gegeben.
Die Reaktion fand direkt in der Glasküvette statt, die einen optischen Weg von 1 cm aufwies, und die Entwicklung des Chromogens wurde direkt in einem DB-GT Beckmann-Gitterspektrophotometer bei einer Wellenlänge von 500 nm beobachtet bis zur vollständigen Umwandlung des in dem Serum vorhandenen Cholesterins.
Unter diesen Bedingungen erhielt man am Ende eine optische Dichte von 0, 500, entsprechend 164 mg Gesamt-Cholesterin pro 100 ml der untersuchten Serumprobe.