DE3430895C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen, eine gemischte, anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation enthaltenden Inokulums für die Erzeugung des Coenzyms B₁₂ durch diskontinuierliche, halbkontinuierliche oder kontinuierliche anaerobe Fermentation unter septischen Bedingungen.

Der Einfachheit halber wird im folgenden immer das Coenzym B₁₂ genannt; im Rahmen dieser Erfindung werden unter diesem Ausdruck jedoch auch die sonstigen biologisch aktiven Corrinoide (z. B. der Faktor III) verstanden (Barker et al., Biol. Chem. 235, 480 (1960)).

Das Inokulum kann ein zum "Anlegen neuer, steriler Kulturen verwendeter Virus, Mikroorganismus, eine Zellsuspension oder ein pflanzliches Organ, ein Gewebe oder eine Zelle sein" (Straub, F. B.: Biológiai Lexikon, II. unveränderter Nachdruck S. 287, Akadmiai Kiad Budapest, 1978). Das erfindungsgemäß herzustellende Inokulum enthält eine anaerobe, septische, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation.

Präkursoren (Vorstufen) sind Ausgangsverbindungen, aus denen im Laufe der biologischen Reaktionen das Endprodukt entsteht (s. ebenda III, S. 437, zum Beispiel 5,6-Dimethylbenzimidazol, Cobaltchlorid usw.).

Der Nährboden ist das zur Zucht der Mikroorganismen bereitete Nährmedium. Der Nährboden enthält in aufnehmbarem Zustand alle diejenigen Nährstoffe, die der Mikroorganismus während der Kultivierung braucht (s. ebenda IV, S. 249, z. B. Methanol, Ammoniumhydrogencarbonat, Magnesiumchlorid usw.). In der vorliegenden Beschreibung soll unter dem Ausdruck Nährmedium das die Nährstoffe und mit diesen zusammen die Präkursoren enthaltende Medium verstanden werden.

Nährstoffe sind die für die Mikropopulation lebenswichtigen chemischen Substanzen (zum Beispiel die Kohlenstoff- und die Stickstoffquelle). Das Methanol hat in der vorliegenden Erfindung eine doppelte Funktion: es ist einesteils die Kohlenstoffquelle der Biosynthese und liefert darüber hinaus die zur Entstehung der gemischten Mikropopulation erforderliche Energie.

Es ist bekannt, daß vor etwa zwei Jahrzehnten das Coenzym B₁₂ aus den im Abwasserschlamm enthaltenden Nährstoffen mit Hilfe der ebenfalls dort enthaltenen Mikroorganismen durch Fermentation hergestellt wurde. Gegebenenfalls wurde der Abwasserschlamm durch unterschiedliche weitere Nährstoffe ergänzt. Das Verfahren hat den großen Vorteil, daß es unter septischen Bedingungen vorgenommen werden kann. Nachteilig ist jedoch, daß für Fermentierung eine große Menge Abwasserschlamm von der Abwasserreinigungsstation zu dem Fermentierbetrieb transportiert werden mußte. Die Zusammensetzung des Abwasserschlammes, seine Bakterienpopulation schwankte, und nicht zuletzt konnten auch "Feldstämme" in den Abwasserschlamm gelangen, die die gezielte Herausbildung einer stabilen Bakterienpopulation unmöglich machten.

In der ungarischen Patentschrift Nr. 1 53 740 wird ein neues Verfahren zur Herstellung des Coenzyms B₁₂ auf anaerobem, septischem Wege vorgeschlagen. Gemäß diesem Verfahren wird dem die entsprechenden Nährstoffe enthaltenden Nährmedium nur ein einziges Mal Abwasserschlamm zugesetzt, und nach wenigstens fünfmaligem Weiterimpfen reichert sich eine gemischte Population an, die bereits an sich fähig ist, die Funktion des Inokulums zu übernehmen und Coenzym B₁₂ in einer Menge von 6-6,2 mg/l Fermentbrühe zu produzieren. Bei diesem sog. "abwasserschlammfreien" Verfahren muß jedoch wenigstens fünfmal weitergeimpft werden, d. h., die Adaptierung der im Abwasserschlamm vorhandenen Mikroorganismen an die Produktion von B₁₂ ist zeitraubend, die Mikroorganismen produzieren wenig Coenzym B₁₂ und brauchen viele verschiedene Nährstoffe; deshalb ist das Verfahren teuer.

Zur Herstellung des Coenzyms B₁₂ und zur Erhöhung der Ausbeute sind zahlreiche weitere Methoden bekannt (z. B. US-PS 39 54 971 und 39 79 259); diese wurden alle zu dem alleinigen Zweck ausgearbeitet, das obenerwähnte "abwasserschlammfreie" Verfahren zu intensivieren.

Eine mesophile, methanproduzierende gemischte Mikropopulation wurde zum ersten Mal in der ungarischen Patentschrift Nr. 1 67 658 beschrieben. Sie besteht aus den im Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen (OKI) unter den Nummern 00 076, 00 077, 00 078 und 00 079 hinterlegten folgenden Stämmen: Corynebacterium sp. (Bezeichnung 24A1), Corynebacterium sp. (Bezeichnung 62B9), Lactobacillus sp. (Bezeichnung 244B/C1) und Propionibacterium sp. (Bezeichnung 239A1/6). An Nährböden, die von den üblichen abweichende Nährstoffe enthalten, läßt sich diese anaerobe, mesophile, methanproduzierende, gemischte Population jedoch nur schwer adaptieren, es muß 6-7mal weitergeimpft werden, und ein Weiterimpfungszyklus dauert etwa sieben Tage. Um eine Fermentation in industriellem Maßstab auf diese gemischte Mikropopulation umzustellen, sind demnach 40-50 Tage erforderlich, d. h. das Ganze ist zeit- und kostenaufwendig.

Ziel der Erfindung war die Beseitigung des oben genannten Nachteils. Zur Erreichung dieses Ziels wurde nicht der Weg beschritten, die oben definierte, bereits vorhandene anaerobe, mesophile, methanproduzierende, gemischte Mikropopulation an einen neuen Nährboden zu adaptieren, sondern es wurde auf den Abwasserschlamm zurückgegriffen. Aus der in diesem vorliegenden Mikropopulation wurde auf einem neuartig zusammengesetzten, jedoch im übrigen mit den üblichen Nährmedien identischen Nährboden eine neue, anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation gemischter Zusammensetzung gezüchtet. Unter den üblichen Nährböden werden hier Nährböden wie der zum Beispiel in der US-PS 39 54 973 beschriebene verstanden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines neuen Inokulums gelingt es, die neue gemischte Mikropopulation wesentlich schneller, durch einmaliges Weiterimpfen in reproduzierbarer Weise herzustellen.

Durch Fortlassen des an Nährstoffen reichen Nährbodens und die Wärmebehandlung (Hydrolyse) des Maisquellwassers sind bereits zu Beginn wesentlich weniger mit dem Nährboden eingebrachte lebende Bakterien vorhanden, wodurch die Bakterien des zum Überimpfen verwendeten Schlammes in der Mehrheit sind. Der wenig organische Substanzen und unter diesen vor allem Methanol enthaltende Nährboden ist unter den eingebrachten Bakterien den Methanol zersetzenden, methanproduzierenden Bakterien günstig.

Das Verfahren bietet für die anaerobe, mesophile, methanproduzierende, septische Fermentation große Sicherheit, weil die gewünschte Mikropopulation jederzeit, mit geringen Kosten und schnell wieder hergestellt und die Produktion des Coenzyms B₁₂ fortgesetzt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines neuen, eine gemischte, anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation enthaltenden Inokulums für die Erzeugung des Coenzyms B₁₂ durch diskontinuierliche, halbkontinuierliche oder kontinuierliche anaerobe Fermentation unter septischen Bedingungen. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist kennzeichnend, daß man

• - 75-85 Vol.-% eines aus Methanol, Hydrolysat des Maisquellwassers, Ammoniumhydrogencarbonat, Magnesiumchlorid, Kobaltchlorid, 5,6-Dimethylbenzimidazol, Natriumhydrogensulfit und Leitungswasser bestehenden Nährbodens mit 15-25 Vol.-% anaerobem, verrottetem Abwasserschlamm vermischt,
• - das Gemisch eine Woche lang unter Zusatz von täglich 0,3-0,5 Vol.-% Methanol anaerob, mesophil und septisch fermentiert,
• - die erhaltene Fermentbrühe (1. Generation) oder einen Teil davon zu einem mehrfachen, vorzugsweise 4-6fachen Volumen Nährboden der gleichen Zusammensetzung gibt und die Fermentierung unter den gleichen Bedingungen bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 5-5,5 fortsetzt.
• - einen Teil der dabei erhaltenen Fermentbrühe (2. Generation), vorzugsweise 5-15 Vol.-%, abzieht und durch das gleiche Volumen eines die gleichen Nährstoffe enthaltenden, jedoch an Präkursoren reicheren Nährbodens ersetzt und
• - gewünschtenfalls die Fermentierung noch ein bis zwei Tage fortsetzt.

Auf diese Weise wird eine anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation erhalten, die als Inokulum für die fermentative Herstellung des Coenzyms B₁₂ geeignet ist.

Zur Bereitung des Nährbodens wird im erfindungsgemäßen Verfahren statt des als Nährbodenkomponente üblichen und im Handel erhältlichen Maisquellwassers wärmebehandeltes Maisquellwasser (Hydrolysat) oder Maisschlempe verwendet. (Maisschlempe ist ein bei der Alkoholherstellung anfallender Abfallstoff, der dadurch entsteht, daß das zum Einweichen des Maises verwendete Wasser zusammen mit dem Kesselrücksand der Alkoholherstellung eingedampft wird.)

Vor der Wärmebehandlung wird das Maisquellwasser mikrobiologisch untersucht. Zur Herstellung des Hydrolysats wird nur den Anforderungen entsprechendes Maisquellwasser verwendet. Die mikrobiologische Untersuchung ist im wesentlichen ein Fermentationsprozeß, der in Beispiel 1 ausführlich beschrieben wird. Wenn am vierten Tag der Untersuchung die Produktion an Biogas 0,3-0,6 l/l Fermentbrühe und Tag beträgt, ist das Maisquellwasser zur Herstellung des neuen Inokulums geeignet. Das Maisquellwasser wird mit der gleichen Menge Wasser versetzt und 15 Minuten lang gekocht. Auf diese Weise wird das wärmebehandelte Hydrolysat des Maisquellwassers (beziehungsweise der Maisschlempe) hergestellt.

Der zur Herstellung des neuen Inokulums erforderliche Nährboden wird in an sich bekannter Weise bereitet (Beispiel 1).

Der erfindungsgemäße Nährboden unterscheidet sich in den folgenden Punkten von den bisher verwendeten Nährböden:

• - er enthält weniger organische Substanzen, charakteristisch ist der Methanolgehalt;
• - statt des im Handel befindlichen Maisquellwassers enthält der Nährboden die wärmebehandelte (hydrolysierte) Lösung des Maisquellwassers beziehungsweise der Maisschlempe.

Infolge der neuartigen Zusammensetzung des Nährbodens verändern sich Zusammensetzung und Produktionseigenschaften der sich während der Herstellung des Inokulums anreichernden gemischten Population. Statt der bisher erforderlichen 6-7fachen Weiterimpfung sind nur eine einmalige Weiterimpfung und einige Tage (1-2 Tage) Fermentierung erforderlich.

Zu dem neuen Nährboden, der

Methanol,
Hydrolysat des Maisquellwassers,
Ammoniumhydrogencarbonat,
Magnesiumchlorid,
Kobaltchlorid,
5,6-Dimethylbenzimidazol und
Natriumhydrogensulfit

enthält, gibt man 15-25 Vol.-% verrotteten Abwasserschlamm. Dieser wird zweckmäßig der anaeroben Nachverrottung des städtischen Abwasserschlammes jeweils frisch entnommen. Nach gründlichem Homogenisieren wird bei 30-32°C mit der Fermentierung begonnen. Einmal täglich wird Methanol zugesetzt. Die Fermentierung wird etwa eine Woche lang, bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 5-5,5 fortgesetzt. Täglich wird eine Probe genommen, an dieser werden der pH-Wert, der Methanolgehalt und die Geschwindigkeit der Biogasbildung bestimmt. Diese Informationen geben wichtige Aufschlüsse über den Verlauf der Fermentation. Für die Herausbildung der anaeroben, mesophilen, gemischten Mikropopulation ist ein schwach saurer pH-Wert (5-6) günstig. Die Methanolkonzentration der Fermentationsbrühe ist von besonderer Wichtigkeit, weil zu viel oder zu wenig Methanol die Adaption verlangsamt. Aus der Biogasproduktion kann auf die Geschwindigkeit der Methanolassimilation geschlossen werden, was jeweils die Einhaltung der optimalen Konzentration ermöglicht.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die beschriebene Fermentierung eine Woche lang fortgesetzt. Die erhaltene Fermentationsbrühe (im folgenden als 1. Generation bezeichnet) oder ein Teil davon wird - gegebenenfalls unter Vergrößerung des Maßstabes - auf ein mehrfaches Volumen Nährboden weitergeimpft. Dieser Nährboden hat die gleiche Zusammensetzung wie der der 1. Generation. Die Fermentierung wird unter den gleichen Bedingungen etwa eine Woche lang fortgesetzt. (Die dabei erhaltene Fermentationsbrühe wird als 2. Generation bezeichnet.) Von der Fermentationsbrühe der 2. Generation werden etwa 10 Vol.-% entnommen und durch das gleiche Volumen eines Nährbodens ersetzt, der sich von dem vorhergehenden nur dadurch unterscheidet, daß mit Ausnahme des Methanols, des 5,6-Dimethylbenzimidazols und des Kobaltchlorids die Konzentration der Nährbodenkomponenten nur den 10. Teil der ursprünglichen Konzentration beträgt. Die auf diese Weise ergänzte Fermentationsbrühe wird bei 33-34°C noch ein bis zwei Tage lang fermentiert.

Das erhaltene Inokulum enthält eine neue anaerobe, mesophile, methanproduzierende gemischte Population und ist zur fermentativen Herstellung des Coenzyms B₁₂ geeignet. Die Verwendung des neuen, erfindungsgemäß hergestellten Inokulums zur fermentativen Herstellung des Coenzyms B₁₂ ist in der parallel, am gleichen Tage eingereichten deutschen Patentanmeldung P 34 30 908.8-41 der Anmelderin mit der Priorität der ungarischen Patentanmeldung Nr. 3210/83 beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden an Hand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben.

Beispiel 1

In einen Laborglasfermentor von 10 l Nutzvolumen werden 6000 ml auf 30-32°C vorgewärmtes Leitungswasser gefüllt. Die folgenden, entsprechend vorbereiteten Nährstoffe werden zugesetzt:

35 ml Methanol
100 ml Hydrolysat aus 50 g Maisquellwasser
30 g Ammoniumhydrogencarbonat
1,0 g Magnesiumchlorid
0,05 g Kobaltchlorid
0,03 g 5,6-Dimethylbenzimidazol
0,30 g Natriumhydrogensulfit.

Nach Zusatz der Komponenten wird das Nährmedium gründlich homogenisiert und dann mit Leitungswasser der genannten Temperatur auf 8000 ml aufgefüllt. Dann werden dem Nährboden 2000 ml nachverrotteter Abwasserschlamm zugesetzt, der der anaeroben Nachverrottung der städtischen Abwasserreinigungsstation frisch entnommen wurde. Das Gemisch wird verrührt, der Glasfermentor durch eine Gummiplatte verschlossen und dann in einen Thermostat von 32-34°C Temperatur gestellt.

Im folgenden wird jeden Tag (nach vorherigem Homogenisieren) eine Probe von 50 ml Volumen genommen. Dann werden 35 ml Methanol zugesetzt, eine weitere Probe von 200 ml Volumen wird genommen und die Fermentation nach Verschließen des Fermentors fortgesetzt.

Nach siebentägiger Vermentierung bei konstanter Temperatur erhält man die Fermentbrühe der 1. Generation.

Aus der vor dem Zusatz des Methanols genommenen Probe werden der pH-Wert und die Methanolkonzentration der Fermentbrühe bestimmt. Die nach dem Methanolzusatz genommene Probe von 200 ml wird in ein bei 32-34°C thermostatisiertes Gasometer gefüllt.

An der Probe wird die Geschwindigkeit der Biogasentwicklung gemessen. Bei Zusatz der nächsten Portion Methanol wird die Probe wieder in den Fermentor gegossen. An dem siebenten Tag der Fermentierung wird eine Maßstabsvergrößerung 1 : 5 vorgenommen: Ein Fermentor des Nutzvolumens von 50 l wird mit 30 Liter auf 30-32°C vorgewärmtem Wasser aufgefüllt. Dazu werden die folgenden auf die bereits angegebene Weise vorbereiteten Nährstoffe gegeben:

175 ml Methanol
500 ml Hydrolysat aus 250 g Maisquellwasser
150 g Ammoniumhydrogencarbonat
5 g Magnesiumchlorid
0,25 g Kobaltchlorid
0,15 g 5,6-Dimethylbenzimidazol
1,5 g Natriumhydrogensulfit.

Nach dem Zusatz der Nährstoffe wird der Nährboden mit Wasser der gleichen Temperatur wie oben auf 40 l aufgefüllt.

Nun wird die gesamte Menge der siebentägigen Fermentationsbrühe (10 l) zu dem frischen Nährmedium gegeben. Nach intensivem Homogenisieren wird der Fermentor verschlossen. Bei 32-34°C wird weitere sieben Tage lang anaerob fermentiert. Auch in diesem Zeitabschnitt werden jeden Tag 50 ml als Probe abgezogen und danach 175 ml Methanol in den Fermentor gegeben. Danach wird die Probe von 200 ml für die Messung der Geschwindigkeit der Biogasentwicklung genommen. Die Bestimmung der Parameter erfolgt wie bereits beschrieben.

Die nach den zweiten sieben Tagen erhaltene Fermentationsbrühe ist die sog. 2. Generation. Nach dem Homogenisieren werden davon 10 Vol.-% (5,0 l) entnommen und durch das gleiche Volumen Nährmedium der folgenden Zusammensetzung ersetzt:

500 ml Leitungswasser der Temperatur von 30-32°C
175 ml Methanol
50 ml Hydrolysat aus 25 g Maisquellwasser
15 g Ammoniumhydrogencarbonat
0,5 g Magnesiumchlorid
0,25 g Kobaltchlorid
0,15 g 5,6-Dimethylbenzimidazol
0,10 g Natriumhydrogensulfit.

Nach dem Zusatz des Nährmediums wird der Fermentor nach dem Homogenisieren verschlossen. Die Fermentierung wird bei 32-34°C noch einen Tag fortgesetzt.

Auf die beschriebene Weise entsteht die neue, anaerobe, mesophile, methanproduzierende gemischte Mikropopulation. Das Inokulum hat einen pH-Wert von 5,4-5,8 und entwickelt Biogas in einer Menge von 0,5-0,8 Liter/Liter Fermentbrühe und Tag.

Im folgenden ist das Inokulum bereits zur Produktion des Coenzyms B₁₂ geeignet. Am ersten Tag der halbkontinuierlichen Fermentierung wurde eine Probe genommen, deren gemäß der ungarischen Patentschrift Nr. 1 67 658 bestimmter Wirkstoffgehalt 7,3 mg/l betrug.

Die Nährstoffe werden auf folgende Weise vorbereitet. Zur Wärmebehandlung des Maisquellwassers wird Maisquellwasser mit einem Trockensubstanzgehalt von etwa 45 Gew.-% mit der gleichen Menge Leitungswasser verdünnt, bis zum Sieden erhitzt und 15 Minuten lang gekocht. Nach dem Abkühlen wird die Lösung auf ihr ursprüngliches Volumen aufgefüllt. Die auf diese Weise bereitete frische Lösung ist das Maisquellwasserhydrolysat.

Das zur Herstellung des Inokulums vorgesehene Maisquellwasser wird vor der Verwendung auf seine mikrobiologische Eignung geprüft. Dazu werden in einem Laborglasfermentor von 10 Liter Nutzvolumen zu 9 Liter Wasser der Temperatur von 30-32°C die folgenden Nährstoffe gegeben:

50 ml Methanol
50 g des zu untersuchenden Maisquellwassers (unhydrolysiert, ohne Wärmebehandlung) mit etwa 45% Trockensubstanzgehalt
30 g Ammoniumhydrogencarbonat
1 g Magnesiumchlorid
0,05 g Kobaltchlorid
0,03 g 5,6-Dimethylbenzimidazol
0,20 g Natriumhydrogensulfit.

Nach dem Vermischen werden aus dem B₁₂-Fermentor 300 ml Fermentationsbrühe zugegeben, das Volumen wird mit auf 30-32°C vorgewärmtem Leitungswasser auf 10 Liter aufgefüllt. Die Öffnung des Fermentors wird mit einer Gummiplatte verschlossen und der Fermentor bei 32-34°C thermostatisiert. Täglich wird aufgerührt, mit 50 ml Methanol versetzt und eine Probe von 200 ml Volumen entnommen, an der die Geschwindigkeit der Biogasbildung gemessen wird. Wenn am 4. Tag der Fermentierung die Biogasbildung wenigstens 0,3-0,6 l Gas/l Fermentbrühe und Tag ausmacht, ist das Maisquellwasser nach der beschriebenen Wärmebehandlung zur Herstellung des Inokulums geeignet.

Das 5,6-Dimethylbenzimidazol wird in der vorgeschriebenen Menge Methanol gelöst zu dem Nährmedium gegeben. Die übrigen Nährstoffe werden unmittelbar zugesetzt.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird die ohne Vergrößerung des Maßstabes vorgenommene Herstellung des Inokulums beschrieben. Diese Verfahrensweise kommt dann in Betracht, wenn nur eine kleine Menge Inokulum gebraucht wird.

Die 1. Generation des Inokulums wird auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in einem Glasfermentor von 10 l Nutzvolumen hergestellt.

Am siebenten Tag der ersten Generation wird eine Weiterimpfung vorgenommen. Dazu werden von der gründlich aufgerührten Fermentbrühe 2 Liter entnommen und in einen sauberen Glasfermentor des Nutzvolumens von 10 Liter eingefüllt. Nach Zusatz von 6 Liter Trinkwasser der Temperatur von 30-32°C werden folgende Nährstoffe zugesetzt:

35 ml Methanol
100 ml Hydrolysat aus 50 g Maisquellwasser
30 g Ammoniumhydrogencarbonat
1 g Magnesiumchlorid
0,05 g Kobaltchlorid
0,03 g 5,6-Dimethylbenzimidazol
0,30 g Natriumhydrogensulfit.

Nach Zusatz der einzelnen Komponenten wird die Flüssigkeit gründlich homogenisiert und dann mit Trinkwasser der Temperatur von 30-32°C auf 10 Liter aufgefüllt. Nach erneutem Homogenisieren wird der Fermentor mit Gummiplatte verschlossen und bei 32-34°C thermostatisiert.

Täglich wird eine Probe von 50 ml Volumen genommen. Nach der Probenahme werden 35 ml Methanol zugesetzt und dann weitere 200 ml entnommen. Der Fermentor wird erneut verschlossen. Die anaerobe Fermentierung wird bei der angegebenen Temperatur sieben Tage lang fortgesetzt. Die erhaltene Fermentbrühe ist die 2. Generation.

Die 2. Generation wird gründlich homogenisiert, dann werden 10 Vol.-% entnommen und durch das gleiche Volumen Nährmedium der folgenden Zusammensetzung ersetzt:

1,0 Liter Trinkwasser (30-32°C)
35 ml Methanol
10 ml Hydrolysat aus 5,0 g Maisquellwasser
3,0 g Ammoniumhydrogencarbonat
0,1 g Magnesiumchlorid
0,05 g Kobaltchlorid
0,03 g 5,6-Dimethylbenzimidazol
0,02 g Natriumhydrogensulfit.

Nach Zugabe der Nährstoffe wird die Fermentbrühe gründlich homogenisiert, der Fermentor wird verschlossen und die Fermentierung bei 32-34°C weitere 24 Stunden lang fortgesetzt. Danach ist die Herstellung des Inokulums beendet. Die Fermentbrühe ist zur Produktion des Coenzyms B₁₂ geeignet.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung des Inokulums im Maßstab eines Kleinbetriebes.

In einen Versuchsfermentor von 2,0 m³ Nutzvolumen werden 1000 Liter auf 30-32°C vorgewärmtes Trinkwasser eingepumpt. Dann werden die folgenden, auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise vorbereiteten Nährstoffe zugegeben:

7,0 l Methanol
20,0 l Hydrolysat aus 10 kg Maisquellwasser
6,0 kg Ammoniumhydrogencarbonat
0,2 kg Magnesiumchlorid
0,01 kg Kobaltchlorid
0,006 kg 5,6-Dimethylbenzimidazol
0,06 kg Natriumhydrogensulfit.

Das die genannten Stoffe enthaltende Nährmedium wird gründlich homogenisiert. Dann werden 400 l anaerober Abwasserschlamm gemäß Beispiel 1 zugesetzt. Das Volumen wird mit Trinkwasser der Temperatur von 30-32°C auf 2 m³ aufgefüllt. Nach dem Homogenisieren wird die Arbeitsöffnung des Fermentors verschlossen und mit der anaeroben Fermentierung bei 32-34°C begonnen.

Der Inhalt des Fermentors wird einmal täglich 20 Minuten lang gerührt, dann wird eine Probe genommen, nach Zusatz von 7,0 Liter Methanol erneut 20 Minuten lang gerührt, eine weitere Probe genommen und dann weitere 24 Stunden lang fermentiert. An der vor dem Methanolzusatz genommenen Probe werden der pH-Wert und die Methanolkonzentration gemessen, die nach dem Methanolzusatz genommene Probe dient zur Bestimmung der Geschwindigkeit der Biogasentwicklung.

Am siebenten Tag der Fermentierung wird die Kultur (die 1. Generation) auf ein frisches Nährmedium weitergeimpft. Dabei wird der Maßstab im Verhältnis 1 : 5 vergrößert. In einen Fermentor von 10 m³ Nutzvolumen werden 6 m³ auf 30-32°C vorgewärmtes Trinkwasser gepumpt. Dazu werden folgende, auf die beschriebene Weise vorbereitete Nährstoffe gegeben:

35,0 l Methanol
100,0 l Hydrolysat aus 50 kg Maisquellwasser
30,0 kg Ammoniumhydrogencarbonat
1,0 kg Magnesiumchlorid
0,05 kg Kobaltchlorid
0,03 kg 5,6-Dimethylbenzimidazol
0,30 kg Natriumhydrogensulfit.

Nach gründlichem Vermischen werden die 2 m³ Fermentbrühe der 1. Generation eingepumpt. Das Volumen wird mit auf 30-32°C vorgewärmtem Trinkwasser auf 10 m³ aufgefüllt. Nach gründlichem Rühren wird die Fermentierung bei 30-32°C begonnen.

Der Inhalt des Fermentors wird jeden Tag 30 Minuten lang aufgerührt, dann wird eine Probe genommen, nach Zusatz von 35 l Methanol wird erneut 30 Minuten lang gerührt und dann eine weitere Probe genommen. An den Proben werden die bereits erwähnten Parameter jeden Tag gemessen.

Von der Fermentbrühe der 2. Generation werden nach 40minütigem Rühren 10 Vol.-% (1 m³) entnommen und durch das gleiche Volumen Nährboden der folgenden Zusammensetzung ersetzt:

35,0 l Methanol
10,0 l Hydrolysat aus 5,0 kg Maisquellwasser
3,0 kg Ammoniumhydrogencarbonat
0,1 kg Magnesiumchlorid
0,05 kg Kobaltchlorid
0,03 kg 5,6-Dimethylbenzimidazol
0,02 kg Natriumhydrogensulfit

werden in 0,5 m³ auf 30-32°C vorgewärmtem Leitungswasser gelöst. Die Lösung wird in den Fermentor eingespeist. Dann wird das Volumen mit auf 30-32°C vorgewärmtem Leitungswasser auf 10 m³ aufgefüllt. Es wird noch 30 Minuten lang gerührt und dann weitere 24 Stunden lang anaerob fermentiert. Danach ist die Herstellung des Inokulums beendet. Das Inokulum hat einen pH-Wert von 5,4-5,8, die Biogasproduktion beträgt 0,5-0,8 l/l Fermentationsbrühe und Tag, der Wirkstoffgehalt ist 8,3 mg/l. Die Fermentationsbrühe ist zur fermentativen Produktion des Coenzyms B₁₂ geeignet. Die Vorbereitung der Nährstoffe und die Qualitätsuntersuchung des Maisquellwassers werden auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise vorgenommen.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung eines neuen - eine gemischte, anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation enthaltenden - Inokulums für die Erzeugung des Coenzyms B₁₂ (Cobamid) durch diskontinuierliche, halbkontinuierliche oder kontinuierliche anaerobe Fermentation unter septischen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man

• - 75-85 Vol.-% eines aus Methanol, Hydrolysat des Maisquellwassers, Ammoniumhydrogencarbonat, Magnesiumchlorid, Kobaltchlorid, 5,6-Dimethylbenzimidazol, Natriumhydrogensulfit und Leitungswasser bestehenden Nährbodens mit 15-25 Vol.-% anaerobem, verrottetem Abwasserschlamm vermischt,
• - das Gemisch eine Woche lang unter Zusatz von täglich 0,3-0,5 Vol.-% Methanol anaerob, mesophil und septisch fermentiert,
• - die erhaltene Fermentbrühe (1. Generation) oder einen Teil davon zu einem mehrfachen, vorzugsweise 4-6fachen Volumen Nährboden der gleichen Zusammensetzung gibt und die Fermentierung unter den gleichen Bedingungen bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 5-5,5 fortsetzt,
• - einen Teil der dabei erhaltenen Fermentbrühe (2. Generation), vorzugsweise 5-15 Vol.-%, fortnimmt und durch das gleiche Volumen eines die gleichen Nährstoffe enthaltenden, jedoch an Präkursoren reicheren Nährbodens ersetzt und
• - gewünschtenfalls die Fermentierung noch ein bis zwei Tage fortsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem Nährmedium 15-25 Vol.-% anaeroben, verrotteten Abwasserschlamm aus der städtischen Abwasserreinigung gibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Abwasserschlamm den frisch aus dem Nachverrotter der städtischen Abwasserreinigung entnommenen Abwasserschlamm verwendet.