DE3230197C2

DE3230197C2 - Methangärverfahren

Info

Publication number: DE3230197C2
Application number: DE3230197A
Authority: DE
Inventors: Syunji Minou Osaka Namikawa; Yasuyuki Sennan Osaka Nukina; Susumu Suita Osaka Oi; Toshikazu Ibaragi Osaka Tomioka; Takehiko Izumi Osaka Yamamoto
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1981-08-13
Filing date: 1982-08-13
Publication date: 1984-12-20
Also published as: PH15950A; US4540666A; GB2107735A; DE3230197A1; GB2107735B

Abstract

Es wird ein Methangärungsverfahren beschrieben, in dem ein zu der Gattung Methanobacterium gehörender Bakterienstamm in einem Fermenter, der mindestens eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und eine Mikroflora für die Methangärung enthält, bei einer bestimmten Temperatur kultiviert wird. Der Stamm hat in der stationären Wachstumsphase eine Methanbildungsaktivität von mehr als 8,7 · 10 ↑- ↑8 ml/(Zelle Tag), zeigt sogar bei einem Sauerstoff-Partialdruck von 33,8 mbar (1/30 atm) die Methanbildungsaktivität und ist unter einem Sauerstoff-Partialdruck von bis zu 203 mbar (1/5 atm) lebensfähig. Das Inokulum bzw. die Impfkultur des Stammes wird erhalten, indem man den Stamm in einem Nährmedium, das mindestens Stickstoffquellen, anorganische Salze und Reduktionsmittel enthält, in einem mesophilen Bereich von 25 bis 45 ° C unter Verwendung eines Substrats wie einer Gasmischung von Wasserstoff und Kohlendioxid, eines Formiats oder eines Acetats unter anaeroben Bedingungen kultiviert. Das Wachstum des Stammes wird gefördert bzw. erleichtert, wenn der Stamm zusammen mit einem zu der Gattung Clostridium gehörenden Stamm kultiviert wird.

Description

15

Es ist eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Methangas durch Gärung bzw. Fermentation bekannt. Typisch für mit hoher Geschwindigkeit ablaufende Methangärverfahren ist ein Verfahren, das beispielsweise in der Collection of Prearranged Manuscripts of the Agricultural Chemical Society of Japan, S. 82,1981, beschrieben wird. Bei diesem bekannten Verfahren wird unter Anwendung eines 0,5 m³ fassenden Verflüssigungsbehälters und eines 1,5 m³ fassenden Vergasungsbehälters und unter den Bedingungen einer Gesamt-Verweilzeit von 8 Tagen und einer Verarbeitung von 15 kg organischem Material/(m³ · Tag) ein kontinuierlicher Fermentationsbetrieb durchgeführt, wobei pro kg des organischen Materials 3001 eines Gär- bzw. Faulgases mit einer Methankonzentration von 70 VoL-⁰Zo erhalten werden. In diesem Fall werden die Temperaturbedingungen des thermophilen Bereichs (6O⁰C) gewählt, in dem ein hoher Wirkungsgrad der Gärung erzielt wird. Die Menge des erzeugten Methangases beträgt 6,3 mVTag, und die Verweilzeiten, die für die Vergasung und die Verflüssigung erforderlich sind, betragen 6 bzw. 2 Tage. Der Prozeß der Methangasbildung in dem Vergasungsbehälter ist der Schritt, der die Geschwindigkeit des gesamten Gärungsverfahrens begrenzt bzw. bestimmt. Mit anderen Worten, der Prozeß der Methanbildung, an dem Methan bildende Bakterien beteiligt sind, sollte mit einem hohen Wirkungsgrad ablaufen, um den Wirkungsgrad der Gärung bzw. Fermentierung zu erhöhen. Die Methanbildungsaktivität der Bakterien ist deshalb einer der wichtigsten Faktoren, die den Wirkungsgrad des gesamten Gärungsverfahrens regulieren. Bei dem vorstehend beschriebenen Fall handelt es sich um ein kontinuierliches Gärverfahren, bei dem die Konzentration der Methan bildenden Bakterien in dem Vergasungsbehälter während des stationären Betriebs konstant gehalten wird. Bei dem kontinuierlichen Verfahren wird eine gegebene Menge frischen Substrats bzw. Nährsubstrats zugeführt, während die gleiche Menge des aus dem Reaktionsbehälter ausfließenden Mediums aus dem Behälter entnommen wird, so daß die Methan bildenden Bakterien in einer Menge anwachsen, die der Menge der mit dem entnommenen, ausfließenden Medium mitgeführten Bakterien entspricht. Folglich beträgt die aus der Beschickungs- und Entnahmegeschwindigkeit der Gär- bzw. Fermentationsflüssigkeit berechnete Verdoppelungszeit der Methan bildenden Bakterien in dem Gärungsverfahren etwa 100 h. Dies bedeutet, daß das Anwachsen oder die Vervielfältigung der Methan bildenden Bakterien bei dem Gärverfahren ein geringes Ausmaß hat, wodurch gezeigt wird, daß die Methanbildungsaktivität in der stationären Wachstumsphase der Methan bildenden Bakterien für die Methangärung sehr wichtig ist.

In Bergey's Manual of Determinative Bacteriology wird deutlich beschrieben, daß Methan bildende Bakterien sehr strenge Anaerobier sind, die innerhalb kurzer Zeit absterben, wenn Sauerstoff selbst in sehr kleinen Mengen in das System eingemischt wird. Diese Eigenschaft einer hohen Empfindlichkeit und niedrigen Beständigkeit gegen Sauerstoff bringt beträchtliche Schwierigkeiten mit sich, wenn ein Inokulum bzw. eine Impfkultur Methan bildender Bakterien aufbewahrt bzw. erhalten, einer Massenkultivierung unterzogen und/oder transportiert wird. Methan bildende Bakterien, die für praktische Anwendungen vorgesehen sind, sollten daher wünschenswerterweise eine hohe Beständigkeit gegen Sauerstoff haben.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Methangärverfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem für die Gärung bzw. Fermentierung Methan bildende Bakterien eingesetzt werden, die einen hohen Wirkungsgrad der Methanbildung zeigen und eine hohe Beständigkeit gegenüber Sauerstoff haben, wobei das Verfahren unter relativ milden Temperaturbedingungen durchführbar sein soll.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch das im Patentanspruch 1 gekennzeichnete Methangärverfahren gelöst. Die Methangärung sollte unter sauerstofffreien Bedingungen durchgeführt werden, jedoch kann die Gä-¹ rung bzw. Fermentierung bei einem bestimmten Wert des Sauerstoff-Partialdruckes bewirkt werden, wenn die Bakterien des vorstehend erwähnten Typs verwendet werden.

Ausführungsformen der Erfindung werden nachstehend näher erläutert.

Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um Methan bildende Bakterien zu finden, die in der stationären Wachstumsphase eine hohe Methanbildungsaktivität haben und gegen Sauerstoff beständig sind. Das heißt, daß eine Vielzahl von Bakterien aus Ablagerungen bzw. Sedimenten von Teichen und Sümpfen bzw. Mooren und aus Schlämmen anaerober Faulbehälter überprüft bzw. gesichtet wurde. Als Ergebnis wurde ein Stamm von mesophilen (25 bis 40⁰C), Methan bildenden Bakterien gesammelt. Dieser Stamm wird Methanobacterium sp. St-23 genannt und wurde mit der Bezeichnung FERM BP-44 bei dem Fermentationsforschungsinstitut der Behörde für industrielle bzw. gewerbliche Wissenschaft und Technologie des japanischen Ministeriums für Welthandel und Industrie (Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry of Japan) hinterlegt. Es sei besonders erwähnt, daß der für die Erfindung eingesetzte Stamm der Gattung Methanobacterium in der stationären Wachstumsphase eine Methanbildungsaktivität von mehr als 8,7 χ 10~⁸ ml/(Zelle · Tag) hat, sogar bei einem Sauerstoff-Partialdruck von 33,8 mbar die Methanbildungsaktivität zeigt und unter einem Sauerstoff-Partialdruck von bis zu 203 mbar lebensfähig ist.

Dieser Stamm wurde aus einem Teichsediment als dominante Art isoliert, wobei festgestellt wurde, daß ' dieser Stamm in dem Schlamm in einer Anzahl von bis 10⁹ Bakterien pro ml des Schlammes lebt.

Der Stamm erreicht leicht seine stationäre Wachstumsphase, wenn er in einem bekannten Nährmedium bei einer Temperatur von 25 bis 45⁰C kultiviert wird. Beispielsweise führt die Flüssigkeitskultur dieses Stammes bei 35⁰C unter Verwendung eines Nährmediums

mit der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung
etwa 7 Tagen zu einer stationären Wachstumsphase.

Tabelle 1

KH₂PO₄	0,021%
K₂HPO₄	0,021%
(NH₄J₂SO₄	0,021%
NaCl	0,042%
MgSO₄ · 7 H₂O	0,0084%
CaCl₂ · 2 H₂O	0,015%
Resazurin-
Natriumsalz	0,001%
ZnSO₄ · 7 H₂O	100μg/ml
MnCl₂ · 4 H₂O	30 μg/mI
H₃BO₃	300 μg/ml
CoCl₂ · 6 H₂O	200μg/ml
NiCl₂ · 6 H₂O	20 μg/ml
Na₂MoO₄ · 2 H₂O	30 μg/ml
FeCl₃ ■ π H₂O	150μg/ml
Biotin*)	0,4 μg/ml
Folsäure	0,4 μg/ml
Pyridoxinhydrochlorid*)	2 μg/ml
Thiaminhydrochlorid*)	1 μg/ml
Riboflavin*)	1 μg/ml
Nicotinsäure	1 μg/ml
Calciumpantothenat	1 ^g/ml
Vitamin Bi₂	0,02 μg/ml
p-Aminobenzoesäure*)	1 μg/ml
DL-^-Liponsäure*)	1 μg/ml
Cysteinmonohydro-
chloridmonohydrat*)	0,025%
Na₂S · 9 H₂O*)	0,025%
Na₂CO₃*)	0,4%

in 35⁰C kultiviert wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die Zugabe von Sauerstoff in einer Menge von bis zu 2 ml nach 3 Tagen zur Bildung von geringen Methanmengen (0,05 ml CH₄/3 Tage) führte. Durch den Schalen- bzw. Plattentest wurde auch festgestellt, daß selbst nach 14 Tagen keine Kontaminierung bzw. Verunreinigung des Systems mit anderen Bakterien eingetreten war und daß die Anzahl der Bakterien nicht abnahm, wenn bis zu 12 ml Sauerstoff zugegeben wurden. Die

ίο Sauerstoff menge von 12 ml in 60 ml Leerraum entspricht fast der Sauerstoffkonzentration in Luft; dies bedeutet, daß der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm dem Sauerstoff-Partialdruck der Luft in lebensfähigem Zustand widerstehen kann. In diesem Zusammenhang ist berichtet worden, daß Bakterien der Art Methanobacterium mobile in Gegenwart einer Sauerstoffmenge, die nicht größer als ein Äquivalent des Reduktionsmittels ist, absterben (Journal of Bacteriology, Bd. 95, Spalte 1943, 1968). Die Eigenschaften des erfindungsgemäß eingesetzten Stammes unterscheiden sich demnach in hohem Maße von den Eigenschaften dieser bekannten Stämme.

Der Stamm FERM BP-44 hat die folgenden, bakteriologischen Eigenschaften. Es sei angemerkt, daß die KuI-tür unter Anwendung eines Nährmediums mit der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung und einer Gasphase, die aus 80 Vol.-% Wasserstoff und 20 Vol.-% Kohlendioxid bestand, durchgeführt wurde.

*) Diese Verbindungen werden getrennt sterilisiert.

30

35

Als die Kultur, in der die Bakterien vollständig die stationäre Phase erreicht hatten, unter Anwendung eines Substrats bzw. Nährsubstrats aus Wasserstoff und Kohlendioxid zur Bestimmung der Methanbildungsaktivität eingesetzt wurde, wurde gefunden, daß die Aktivität mindestens 8,7 χ 10-⁸ml/(Tag · Bakterium) betrug.

> Die Zellzahlbestimmung wurde nach dem Koloniezahlbestimmungsverfahren durchgeführt. Die Analyse des Methangases wurde mittels Gaschromatographie durchgeführt. Die vorstehend beschriebene Methanbildungsaktivität entspricht 13 m³ CH₄/Tag, wenn der Berechnung ein Fassungsvermögen von 1,5 m³ des Behälters bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren auf der Grundlage von 10⁸ Bakterien/ml, einer unteren Grenze der Konzentration der erfindungsgemäß eingesetzten, Methan bildenden Bakterien im Schlamm, zugrunde gelegt wird. Dies stellt eine sehr hohe Methanbildungsaktivität dar.

Nachstehend wird die Beständigkeit dieser Bakterien gegen Sauerstoff beschrieben.

Der folgende Test wurde durchgeführt: 50 ml des Nährmediums mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung wurden in eine 110 ml fassende Serumflasehe eingefüllt, so daß der Leerraum 60 ml betrug, und dazu wurden als Reduktionsmittel zum Reduzieren von Sauerstoff 1 ml Schwefelwasserstoff und Cystein zugegeben. Dann wurde zu dem Leerraum Sauerstoff in ei-

, ner Menge von 0 bis 12 ml zugegeben, und in den Leerraum wurde außerdem eine Gasmischung aus 80 Vol.-% Wasserstoff und 20 Vol.-% Kohlendioxid bis zur Erzielung eines Druckes von 1,52 bar eingeleitet, worauf bei

(1) Beobachtungen mit optischem Mikroskop und Elektronenmikroskop

Das Bakterium ist ein gerades bis schwach gekrümmtes Stäbchen, das einen Durchmesser von 0,3 μπι, eine Länge von 1,3 bis 3,3 μίτι und gerundete Enden hat. Das Bakterium macht eine in beträchtlichem Ausmaß unäquivalente Teilung durch und liegt gelegentlich in einer Form vor, die in der Nähe einer Kugel liegt. Das Bakterium ist nicht sporenbildend, nicht bewegungsfähig, weist keine Geißeln auf und ist gram-negativ.

(2) Oberflächenkolonien

Die Bakterien zeigen ein schlechtes bzw. schwaches Wachstum. 4 Tage nach der Impfung bzw. Inokulation treten Mikrokolonien auf, und die Bakterien bilden inl4 Tagen Kolonien mit einem maximalen Durchmesser von 0,7 bis 1 mm. Junge Kolonien sind rund und ganzrandig und haben eine weiße bis hellgelbe Farbe, und alte Kolonien sind dünn, flach und in radialer Richtung runzelig auf ihrer flachen Oberfläche.

(3) Wachstumsbedingungen ·

Die Bakterien sind mesophile, anaerobe Bakterien, die in der Nähe des neutralen pH-Bereiches wachsen und für das Wachstum Wasserstoff und Kohlendioxid oder Formiate oder Acetate ausnutzen. Sie widerstehen einem Sauerstoff-Partialdruck von bis zu 203 mbar und sind unter einem Sauerstoff-Partialdruck von bis zu 33,8 mbar zur Produktion von Methan befähigt. Bei der Verwendung von Pepton und Aminosäuren und Coenzym M wird keine Beschleunigung des Wachstums festgestellt. Man fand, daß Hefenextrakt das Wachstum in geringem Maße beschleunigt. Eine lösliche Fraktion des Teichsediments trägt nicht zur Beschleunigung des Wachstums bei, jedoch führt die Kultur zusammen mit einem bestimmten Typ von Bakterien zu einer bemerkenswerten Beschleunigung des Wachstums.

(4) Andere Angaben

Die lösliche Fraktion eines Homogenats der erfindungsgemäß verwendeten, Methan bildenden Bakterien emittiert bei der Anwendung von Ultraviolettstrahlen des nahen ÜV-Bereichs eine bläulich-grüne Fluoreszenz.

Die taxonomische Zuordnung des erfindungsgemäß verwendeten Stammes wird nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology bestimmt. Im Hinblick darauf, daß die Bakterien stäbchenförmig und zur Produktion von Methan befähigt sind, wird angenommen, daß sie zu der Gattung Methanobacterium gehören und mit Methanobacterium formicicum oder Methanobacterium mobile nahe verwandt sind. Diese verwandten Bakterien unterscheiden sich jedoch in mancher Beziehung, wozu gehört, daß sie Acetat nicht ausnutzen können, von den erfindungsgemäß verwendeten, Methan bildenden Bakterien. Infolgedessen wird angenommen, daß es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm um einen neuen Stamm handelt, der zu der Gattung Methanobacterium gehört.

Der Stamm Methanobacterium sp. FERM BP-44 wird zur Methangärung eingesetzt, indem er in einen Fermenter inokuliert bzw. eingeimpft wird, der anorganische Salze,Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und eine Mikroflora aus Mikroorganismen enthält, die dazu dienen, Kohlenstoffquellen in niedermolekulare Materialien, wozu beispielsweise Wasserstoff und Kohlendioxid gehören, umzuwandeln, die durch die Bakterien für die Methangärung ausgenutzt werden können. Diese Mikroorganismen können leicht erhalten werden, indem man einen Schlamm, beispielsweise Küchenabfälle, bei einer zum Abtöten von Methan bildenden Bakterien ausreichenden Temperatur, beispielsweise einige Minuten lang bei etwa 70° C, einer Wärmebehandlung unterzieht. Die Methangärung kann natürlich kontinuierlich oder chargenweise und unter anaeroben Bedingungen durchgeführt werden.

Zur Verbesserung des Wirkungsgrades des Wachstums haben die Erfinder eine Untersuchung durchgeführt, um Mikroorganismen zu erhalten, die eine beschleunigende Wirkung auf das Wachstum des Methan bildenden Stammes zeigen, wobei festgestellt wurde, daß ein als YN -28 bezeichneter Stamm für diesen Zweck besonders wirksam ist. Dieser Stamm wurde bei dem Fermentationsforschungsinstitut der Behörde für industrielle bzw. gewerbliche Wissenschaft und Technologie hinterlegt, und zwar mit der Bezeichnung FERM BP-141. Der Stamm FERM BP-141 zeigt die höchste wachstumsbeschleunigende Wirkung von 935 Stämmen, die durch willkürliche Überprüfung bzw. Sichtung isoliert wurden, und die Wirkung dieses Stammes wurde durch den nachstehend beschriebenen Versuch bestätigt.

300 ml eines Mediums mit der in Tabelle 2 angegebenen Zusammensetzung wurden in einen 500 ml fassenden Kolben eingefüllt.

10

15

20

25

30

35

40 CaCl₂ · 2 H₂O
ZnSO₄ · 7 H₂O
MgCl₂ · 4 H₂O
H₃BO₃

CoCl₂ · 6 H₂O
NiCl₂ ■ 2 H₂O
Na₂MoO₄ · 2H₂O
FeCl₂-WH₂O
Cysteinhydrochlorid*)
Na₂S-9 H₂O*)
Natrium-Resazurin
Na₂CO₃
Nicotinsäure*)
Vitamin Bi₂*)
Thiaminhydrochlorid*)
Paraaminobenzoesäure¹

0,015% 100 μg/ml 30 μg/ml 300 μg/ml 200 μg/ml 20 μg/ml 30μg/ml 150μg/m! 0,025% 0,025% 0,001% 0,4% 20 μg/ml

■)

5,6 μg/ml 5 μg/ml

*) Diese Verbindungen werden getrennt sterilisiert.

Dann wurde in dem Medium ein Dialysierbeutel aus· Acetylcellulose aufgehängt, worauf der Stamm FERM BP-141 in die innere Flüssigkeit und der Stamm FERM BP-44 in die äußere Flüssigkeit eingeimpft bzw. inokuliert wurde. Der Kolben wurde mit einem Baumwollbzw. Wattestopfen versehen, und die Bakterien wurden bei einer Temperatur von 35° C in einer Gasphase aus 90% Stickstoff, 5% Wasserstoff und 5% Kohlendioxid kultiviert. Zwei Tage nach dem Beginn der Kultivierung erreichte die optische Dichte der äußeren Flüsigkeit bei 660 nm den Wert 0,5. Durch mikroskopische Beobachtung wurde festgestellt, daß sich die beiden Bakterienarten nicht durch den Dialysierbeutel hindurch vermischt hatten. Im Gegensatz dazu wurde bei einem Kontrollversuch, bei dem der Stamm FERM BP-141 nicht in die innere Flüssigkeit eingeimpft wurde, festgestellt, daß die optische Dichte bei 660 nm nach dem 7. Tag 0,01 betrug. Demnach zeigte der Stamm FERM BP-141 eine hohe wachstumsbeschleunigende Wirkung auf den Methan bildenden Stamm FERM BP-44.

Der Stamm FERM BP-141, der in einem als Grundmedium eingesetzten, jeweils 1 % Pepton und Hefenextrakt enthaltenden PY-Medium kultiviert wird, hat die folgenden bakteriologischen Eigenschaften.

Tabelle 2

Trypticase (BBL)

Hefenextrakt

KH₂PO₄

K₂HPO₄

(NH₄J₂SO₄

NaCl

MgSO₄ · 7 H₂O

45

50

55

60

0,05%

0,021%

0,042%

0,0084%

(1) Mikroskopische Beobachtung

Dieser Stamm ist stäbchenförmig, hat einen Durchmesser von 1 bis 1,2 μπι und eine Länge von 3 bis 15 μίτι und wird einzeln oder in kurzen Ketten gefunden. Er ist bewegungsfähig, und seine Sporen haben eine zentrale bis subterminale Position. Die Sporen sind oval, und die Bakterien sind gram-positiv.

(2) Oberflächenkolonien

Die Kolonien sind in der Anfangsstufe der Kultivierung rund, ganzrandig und konvex, haben 3 Tage nach dem Beginn der Kultivierung einen Durchmesser von 6 bis 8 mm und werden kreisförmig mit unregelmäßigen Rändern und haben im Längsschnitt fast die Form eines Vierecks bzw; eines Trapezes. Sie haben eine gelblichweiße Farbe und eine glänzende Oberfläche. Die Trür bung variiert in Abhängigkeit von dem Bildungsgrad der Sporen, und ihr Wachstum ist gut.

65

(3) Physiologische Eigenschaften Die Bakterien sind in bezug auf die hydrolytische

Aktivität gegenüber Gelatine und Casein, die Lecitinase-Aktivität und die Aktivität hinsichtlich der Freisetzung von Schwefelwasserstoff positiv.

(b) Negativ in bezug auf die Lipase- und die Urease-Aktivität.

(c) Zur Bildung von Säuren aus Fructose, Glucose und Maltose befähigt.

(d) Schwach positiv in bezug auf die Fähigkeit zur BiI-, dung von Säuren aus Mannose, Ribose und Xylose.

(e) Negativ in bezug auf die Bildung von Säuren aus ' Äsculin, Lactose, Mannit, Melibiose, Salicin, Saccharose und Stärke.

(f) Positiv in bezug auf die Hydrolyse von Äsculin und negativ in bezug auf die Hydrolyse von Stärke.

(4) Andere Angaben

Die Flüssigkeitskultur führt zu einem zähflüssigen Zellniederschlag.

Wenn die taxohomische Zuordnung des Stammes FERM BP-141 nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, bestimmt wird, ist es offensichtlich, daß der Stamm zu der Gattung Clostridium gehört. Im einzelnen ergibt sich, daß der Stamm der Art Clostridium bifermentans ähnelt bzw. gleicht, und da keine Grundlage für den Nachweis, daß es sich um eine andere Art handeln könnte, gefunden wurde, scheint die Annahme berechtigt zu sein, daß es sich bei diesem Stamm um einen der Stämme von Clostridium bifermentans handelt. Es hat sich herausgestellt, daß ein zur Gattung Clostridium gehörender Stamm zur Wachstumsverstärkung des Stammes Methanobacterium sp. FERM BP-44 führt.

Der Stamm Methanobacterium sp. FERM BP-44 kann zusammen mit einem zu der Gattung Clostridium gehörenden Stamm vermischt und für das erfindungsgemäße Methangärverfahren eingesetzt werden.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

dieser Kultur wurden durch Zentrifugieren (8000 g; 10 min) 200 mg feuchte Zellen erhalten.

Beispiel 2

.'■■■'■'

Der Stamm FERM BP-44 wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert. Die durch Zentrifugieren aus vier Flaschen gesammelte Zellmasse wurde zur Durchführung des nachstehend beschriebenen Versuchs eingesetzt. Nicht zu den Methan bildenden Bakterien gehörende Mikroorganismen wurden durch Wärmebehandlung eines Schlammes in dem Methanfermenter erhalten, der unter Einsatz von Küchenabfällen als Ausgangsmaterial 20 min lang bei einer Temperatur von 7O⁰C betrieben wurde, so daß dieser Schlamm seine Methanbildungsaktivität verlor.

Das Ausgangsmaterial für die Gärung hatte die in Tabelle 3 angegebene Zusammensetzung mit einem pH-Wert von 7.

20

25

30

35

40

Tabelle 3

K₂HPO₄

KH₂PO₄

(NH₄)₂CO₃

Na₂CO,

FeCl₃ · 6H₂O

Maisquellwasser

Glucose

0,3% 0,2% 0,5% 0,3% 0,1% 0,5% 12%

Ein flüssiges Medium mit der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung wurde in einer Menge von 500 ml in eine 700 ml fassende Serumflasche eingefüllt und 10 min lang bei 120⁰C im Autoklaven sterilisiert; jedoch wurden Vitamine, Natriumcarbonat, Cysteinhydrochlorid und Natriumsulfid getrennt einer Filtersterilisierung unterzogen und dann mit dem nach der Beendigung der Autoklavenbehandlung erhaltenen, sterilisierten, flüssigen Medium vereinigt. Die Serumflasche wurde mit einem Butylkautschukstopfen dicht verschlossen und mit einem Aluminiumdeckel bedeckt. Dann wurde die Gasphase in dem Leerraum unter Anwendung einer Injektionsnadel durch eine Gasmischung aus 80 Vol.-% Wasserstoff und 20 Vol.-% Kohlendioxid bis zur Erzielung eines weiteren Druckwertes von 1,52 bar ersetzt. Des weiteren wurde die Flüssigkeitskultur des Stammes FERM BP-44 durch den Butylkautschukstopfen hindurch in einer Menge von 1% der gesamten Zusammensetzung bzw. Mischung injiziert und bei 35⁰C kultiviert. Während der Kultur wurde die Gasmischung an jedem zweiten Tag zugegeben. 10 Tage nach dem Beginn der Kultur wurde die Trübung bei einer Wellenlänge von 660 nm gemessen, wobei festgestellt wurde, daß die Trübung 0,01 betrug, und die Konzentration der Zellen, die durch das Koloniezahlbestimmungsverfahren bestimmt wurde, betrug lOVml. Aus Der Stamm FERM BP-44 und der wärmebehandelte Schlamm wurden in einer Gesamtmenge von 18 ml in eine 200 ml fassende Injektionsspritze eingefüllt, aus der die Luft abgeführt bzw. entnommen worden war. 2 ml des Ausgangsmaterials wurden durch den Spitzenteil der Injektionsspritze hindurch eingeführt, und die Spitze wurde mit einem Gummideckel bedeckt. Danach wurden jeden Tag 2 ml der fermentierten Flüssigkeit aus der Injektionsspritze entnommen, während 2 ml eines frischen Ausgangsmaterials zugegeben wurden.

Die Erzeugung von Gärgas wurde an der Skala der Injektionsspritze abgelesen, und das Gas wurde durch den Spitzenbereich hindurch entleert.

Bei dem Versuch wurden die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse erhalten. Es sei angemerkt, daß in dem am 4. Tage des Versuches erzeugten Gas eine Methankonzentration von 53% festgestellt wurde.

Tabelle 4

Tage nach dem
Beginn der Kultur

Menge des erzeugten Gases (ml)

145
210
195
200

Beispiel 3

ß00 ml des in Tabelle 2 angegebenen Nährmediums wurden in einen 500 ml fassenden Kolben eingefüllt, in dem die Stämme FERM BP-44 und FERM BP-141 gemeinsam in einer Atmosphäre aus 90 Vol.-% Stickstoff, 5 Vol.-% Wasserstoff und 5 Vol.-% Kohlendioxid kultiviert wurden. Von dem Nährmedium wurden in bestimmten Zeitintervallen Proben entnommen, und die Konzentration der Zellen in dem Nährmedium wurde

nach dem Koloniezahlbestimmungsverfahren bestimmt,
wobei die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse erhalten
wurden.

Tabelle 5

Kultivierungsdauer (h)

FERM BP-44 FERM BP-141

0	lOVml	4,5xlO³/ml
24	4 xlOVml	3,2 χ lOVml
48	8,2xlOVml	3,4xlO⁵/ml
72	l,lxlO«/ml	3,0xiaVml

Claims

Patentansprüche:

1. Methangärverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man als methanbildendes Bakterium den Stamm Methanobacterium sp. FERM BP-44 oder den Stamm Methanobacterium sp. FERM BP-44 zusammen mit einem zu der Gattung Clostridium gehörenden Stamm einsetzt.

2. Methangärverfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß der zu der Gattung Clostridium gehörende Stamm der Stamm Clostridium sp. FERM BP-141 ist.

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