EP0283503A1 - Verfahren zur herstellung einer wässrigen suspension von nitrifizierenden bakterien - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer wässrigen suspension von nitrifizierenden bakterien

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Publication number
EP0283503A1
EP0283503A1 EP87906409A EP87906409A EP0283503A1 EP 0283503 A1 EP0283503 A1 EP 0283503A1 EP 87906409 A EP87906409 A EP 87906409A EP 87906409 A EP87906409 A EP 87906409A EP 0283503 A1 EP0283503 A1 EP 0283503A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gas
oxygen
bacteria
nitrifying bacteria
nitrite
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP87906409A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eberhard Bock
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tetra Werke Dr Rer Nat Ulrich Baensch GmbH
Original Assignee
Tetra Werke Dr Rer Nat Ulrich Baensch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tetra Werke Dr Rer Nat Ulrich Baensch GmbH filed Critical Tetra Werke Dr Rer Nat Ulrich Baensch GmbH
Publication of EP0283503A1 publication Critical patent/EP0283503A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/08—Flask, bottle or test tube
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/24—Gas permeable parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of an aqueous suspension of nitrifying bacteria, in which the bacteria remain in the metabolically physiologically active state by induction of the enzyme systems specific for nitrification, can be stored for a long time and then used, using a nutrient medium, ammonia or Nitrite is added, and a device for performing the method.
  • organisms are referred to as "organotrophic" or "lithotrophic".
  • organic compounds are used as the energy source.
  • inorganic energy sources such as H 2 , NH 3 , H 2 S, S, CO, Fe 2+ , NH 4 + , NO 2 - and others are used.
  • the biochemistry of the metabolism of the individual types of nitrifying bacteria differs with regard to the inorganic substrates used for energy production.
  • the oxidation of the ammonia takes place in three reaction steps, whereby ammonia is first oxidized to hydroxylamine by a monooxygenase.
  • the key enzyme in this reaction is hydroxylamine oxidoreductase.
  • Another growth parameter is the hydrogen ion concentration.
  • the growth of the bacteria depends on the pH value and reaches an optimum at pH 7.8. Both higher and lower pH values inhibit growth and can even be toxic if there are major deviations from the optimum pH. Changes in pH can occur, for example, when there is acid formation by ammonia oxidation, or when organic acids added to the nutrient medium as a substrate break down, i. H. are completely oxidized and thus there is an increase in pH.
  • the oxygen supply is of crucial importance for the growth of the bacteria. Aerobic organisms need molecular oxygen to grow as a termirial hydrogen acceptor, while anaerobically growing ones
  • nitrate or sulfate Use organisms as the terminal hydrogen acceptor, for example nitrate or sulfate.
  • oxygen is toxic even at low concentrations.
  • excessive oxygen partial pressures can also be harmful to aerobic organisms.
  • the oxygen requirement also changes with the growth phase reached. If cells are in the logarythmic growth phase, their oxygen requirement is significantly higher than in the stationary phase. Resting cells require significantly less oxygen than growing ones
  • the object of the invention is to provide a method for growing and storing nitrifying bacteria in an aqueous medium with induction of the enzyme systems specific for nitrification, which enables high cell yields such. B. for industrial use.
  • the shelf life of the active cells of nitrifying organisms should far exceed the shelf life of other bacteria such as Escherichia coli and Pseudeomonas, but also go beyond the shelf life of nitrifying bacteria using previously known cultivation methods.
  • the bacteria should also remain during a longer storage of e.g. B. actively maintain a year and more.
  • a gas-permeable, non-porous tube is introduced in a loop in a suitable nutrient solution through which air or gaseous oxygen in the form of pure oxygen or, for example, as oxygen Air mixture is passed.
  • air or gaseous oxygen in the form of pure oxygen or, for example, as oxygen Air mixture is passed.
  • nitrifying bacteria collect on the tube and form a biofilm on the surface of the tube due to adhesion due to extracellular polymers. In the area of this The organisms exclusively grow and multiply from biofilms consisting of nitrificants.
  • the oxygen consumption in a hose through which air flows is so strong that aerobic conditions only exist in the immediate vicinity of the hose surface, ie in the area of the biofilm.
  • Other areas of the nutrient medium are almost anaerobic.
  • the same organisms grow by reversing nitrification using the organic substances.
  • all facultatively chemolithoautotrophically growing nitrifying bacteria are suitable for carrying out the method according to the invention.
  • Particularly high cell yields of more than 30 mg protein / 1 are provided by representatives of the genus Nitrobacter (e.g. Nitrobacter winogradskyi ATTC 25 391 and Nitrobacter hamburgensis, Arch. Microbiol. 136, 281-283).
  • separate compartments can also be achieved without the use of a gas-flow tube during the cultivation of nitrifying bacteria by the fact that the ratio of the liquid surface to the liquid volume by using appropriate culture vessels such as, for. B. bottle-shaped container is kept small. If culture vessels that are not gas-tight but sterile sealed are used, a zone of higher oxygen partial pressure is created in a narrow area below the liquid surface. A spongy skin is formed on the surface of the liquid, which is comparable in structure and composition to the biofilm on the tube. In this and the immediately lower zone of higher oxygen partial pressure, the cells nitrify, while in lower areas the cells are protected from oxygen, grow anaerobically and can survive long periods in the metabolically active state.
  • yeast extract, peptone and pyruvate are nitrifying bacteria with the exclusion of oxygen able to use nitrate or nitrite as a terminal electron acceptor and use the energy released for growth.
  • Such metabolic performance can be achieved by using 1.5 g of yeast extract per 1, 1.5 g peptone per 1, 0.55 g pyrovat per 1 and 2 g sodium nitrate per 1. Even in the presence of only 0.15 g yeast extract per 1, 0.15 g peptone per 1 and 0.055 g pyruvate per 1 there is still a nitrate reduction.
  • glycerin instead of pyruvate, other organic compounds such as. B. Glycerin are used, 1g glycerol per 1 also leads to good growth and offers the advantage over compounds such as pyruvate or acetate that there is no cell-damaging increase in pH by oxidation of this substrate.
  • the use of glycerin is also an inexpensive solution for growing the nitrifying bacteria. The bacteria even grow with glycerin as the only organic substrate and nitrate as the electron acceptor.
  • Bacteria which are treated according to the invention, can be used in a variety of ways, particularly industrially, wherever the removal of undesirable nitrogen compounds such as e.g. B. ammonia or nitrite, you will find their applications. For example, such substances pollute the waters for fish farming frequently and at regular intervals.
  • the bacterial cultures produced can be used to remove these substances in a natural and environmentally friendly way.
  • such bacterial strains can be cultivated, which naturally already belong to certain types of water such. B. fresh or salt water are adapted. Wastewater and drinking water purification is another area of application.
  • the bacteria treated according to the invention can primarily be used as starter cultures in order to overcome the frequently occurring long start-up phases.
  • the culture vessel for bacteria consists of a bottle-shaped container 1 with a screw thread 2, which is closed with a screw cap 3 and a seal 4.
  • a screw thread 2 Through the openings 7, 8 of the screw cap 3 and the seal 4, the inlet pipe 5, through the openings 7, 9, the outlet pipe 6 is guided.
  • a hose 10 is attached, which is loop-shaped immersed in the nutrient medium 11.
  • At the inlet opening 14 of the Inlet tube 5 can be connected, for example, a compressed air pump for gas supply.
  • the outlet opening 15 of the outlet tube 6 is free and represents a connection to the environment.
  • the container 1 is filled with nutrient solution 11 up to the shoulder 16 of the screw thread 2, sterilized and then inoculated with a bacterial culture.
  • the inoculum for nitrifying bacteria is 1 - 5%.
  • the closure device 17 is attached with the inlet and outlet pipes 5, 6 and the hose 10 and the container 1 is closed by means of the screw closure 3 and the seal 4.
  • gas such as B. oxygen passed through the inlet pipe 5 through the hose 10 and the outlet pipe 6.
  • the culture is incubated in the dark at the optimum growth temperature of 25 ° to 30 ° C. for nitrifying bacteria.
  • Samples for determining the growth phase can be taken regularly, for example with a sterile cannula after the seal 4 has been pierced or the closure device 17 has been removed.
  • the oxygen supply is stopped at the latest after reaching the stationary growth phase.
  • the entire closure device 17 is replaced together with the inlet and outlet pipes 5, 6 and the hose 10 under sterile conditions for a commercially available screw cap. In this state, the cultures at 30 ° C or at low temperatures such. B. kept at room temperature for a long time.

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Description

Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Suspension von nitrifizierenden Bakterien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Suspension von nitrifizierenden Bakterien, in der die Bakterien unter Induktion der für die Nitrifikation spezifischen Enzymsysteme im stoffwechselphysiologisch aktiven Zustand verbleiben, sich über lange Zeit aufbewahren und anschließend verwenden lassen, unter Einsatz eines Nährmediums, dem Ammoniak oder Nitrit zugesetzt wird, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Wie alle lebenden Organismen sind auch Bakterien bei physiologischen Temperaturen auf dauernde Energiezufuhr angewiesen. Diese Energie beziehen sie aus der Umsetzung verschiedenster Stoffe, wobei sich im Laufe der Evolution eine Reihe verschiedener Stoffwechselgruppen herausgebildet haben, die eine Spezifizierung nach der Energiequelle, dem Wasserstoffdonator und der Kohlenstoffquelle erlauben. Nach der verwendeten Wasserstoffdonatoren bezeichnet man Organismen als "organotroph" oder "lithotroph". Im ersten Fall werden als Energiequelle organische Verbindungen benutzt. Dagegen spricht man von lithotrophem Wachstum, wenn anorganische Energiequellen wie beispielsweise H2, NH3 , H2S, S, CO, Fe2+, NH4 +, NO2- u. a. verwendet werden.
Vergleicht man das Wachstum relativ anspruchsloser, organotroph wachsender Mikroorganismen wie beispielsweise Pseudomonas oder Escherichia mit dem Wachstum lithotropher Organismen wie Nitrosomonas oder Nitrobacter, werden große Unterschiede in den Generationszeiten beider Stoffwechseltypen deutlich. Escherichia wächst mit Generationszeiten von ca. 20 min., während Nitrobacter unter lithotrophen Bedingungen Generationszeiten von mindestens 10 h besitzt. Die Gründe für derartige Unterschiede liegen in der unterschiedlichen Energieausbeute bei der Oxidation der verwendeten Substrate.
Die Biochemie des Stoffwechsels der einzelnen Arten nitrifizierender Bakterien unterscheidet sich hinsichtlich der zur Energiegewinnung verwendeten anorganischen Substrate. Die Oxidation des Ammoniaks läuft in drei Reaktionsschritten ab, wobei zunächst Ammoniak durch eine Monooxigenase zu Hydroxylamin oxidiert wird.
a.) NH3 + XH2 + O2 →NH2OH + X + H2O
Anschließend erfolgt durch die Oxidation des Hydroxylamins über Nitroxyl zu Nitrit der eigentliche
Energiegewinn für die Zelle. Schlüsselenzym dieser Reaktion ist die Hydroxylaminoxidoreduktase.
b.) NH2OH + 2 Cyt C3+→(NOH) + 2 H+ + 2 Cyt c2+ c.) (NOH) + X + H2O → NO2- + XH2+
Die bakterielle Nitritoxidation läßt sich summarisch in der klassischen Gleichung
NO2- + 0,5 O2 →NO3-
ausdrücken. Allerdings stammt das bei der Oxidation vom Nitrit aufgenommene Sauerstoffatom nicht aus dem Sauerstoff der Luft, sondern aus Wasser. Folgende Teilreaktionen machen dies deutlich und zeigen die Übertragung der aus dem Nitrit freigesetzten Elektronen auf den Sauerstoff.
a.) NO2- + H2O + 2 Cyt a1 3+→ NO3- + 2 H+ + 2 Cyt a1 2+ b.) 2 Cyt a1 2+ + 2 Cyt c3+ → 2 Cyt c2+ + 2 Cyt a1 3+ c.) 2 Cyt c2+ - 2 Cyt aa33+ → 2 Cyt aa32+ + 2 Cyt c3+ d.) 2 Cyt aa3 2+ + 2 H+ + 0,5 O2 → 2 Cyt aa3 3+ + H20 Verantwortlich für die Einschleusung der Elektronen in Atmungskette ist das membrangebundene Enzym Nitritoxidoreduktase.
Ein weiterer Wachstumsparameter ist die Wasserstoffionenkonzentration. Das Wachstum der Bakterien ist abhängig vom pH-Wert und erreicht ein Optimum bei pH 7,8. Sowohl höhere als auch niedrigere pH-Werte hemmen das Wachstum und können bei größeren Abweichungen vom pH-Optimum sogar toxisch wirken. PH-Wert-Änderungen können beispielsweise dann auftreten, wenn es zu einer Säurebildung durch Ammoniak-Oxidation kommt, oder wenn dem Nährmedium als Substrat zugesetzte organische Säuren abgebaut, d. h. vollständig oxidiert werden und es somit zu einem pH-Wert-Anstieg kommt.
Von entscheidender Bedeutung für das Wachstum der Bakterien ist die Sauerstoffversorgung. Aerobe Organismen benötigen zum Wachstum molekularen Sauerstoff als termirialen Wasserstoffakzeptor, während anaerob wachsende
Organismen als terminalen Wasserstoffakzeptor beispielsweise Nitrat oder Sulfat verwenden. Für letztere ist Sauerstoff bereits in geringeren Konzentrationen toxisch. Doch auch für aerobe Organismen können zu hohe Sauerstoffpartialdrücke schädlich sein. Darüberhinaus ändert sich der Sauerstoffbedarf auch mit der erreichten Wachstumsphase. Befinden sich Zellen in der logarythmischen Wachstumsphase, ist ihr Sauerstoffbedarf wesentlich höher als in der stationären Phase. Ruhende Zellen benötigen wesentlich weniger Sauerstoff als wachsende
Zellen. Durch die Methode einer angepaßten Begasung lassen sich schnellwachsende Organismen wie beispielsweise Escherichia coli und Pseudomonas mittels prozessgesteuerter Fermentationsanlagen problemlos in Massen anziehen.
Gegenwärtig existieren für nitrifizierende Bakterien aber noch keine geeigneten Verfahren, um eine vergleichbar hohe Konzentration aktiver Zellen zu erhalten. Probleme hinsichtlich der Sauerstoffversorgung treten auch bei der Lagerung nitrifizierender Bakterien auf. Um solche Zellen beispielsweise für einen industriellen Einsatz in großen Mengen verfügbar zu halten, müssen die, Zellen in ihrem aktiven Zustand gehalten und gleichzeitig vor Sauerstoff geschützt werden.
Diese komplexen Zusammenhänge zwischen notwendiger Sauerstoffversorgung einerseits und der Notwendigkeit der Abwesenheit des Sauerstoffs andererseits erfordern ein System, das es ermöglicht, Zellen in unterschiedlichen physiologischen Zuständen gemeinsam zu kultivieren.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Anzucht und Lagerung von nitrifizierenden Bakterien in wässrigen Medium unter Induktion der für die Nitrifikation spezifischen Enzymsysteme darzustellen, das es ermöglicht, hohe Zellerträge z. B. für den industriellen Einsatz zu erreichen. Dabei soll die Lagerfähigkeit der aktiven Zellen nitrifizierender Organismen weit über die Lagerfähigkeit anderer Bakterien wie z.B. Escherichia coli und Pseudeomonas, aber auch über die Lagerfähigkeit nitrifizierender Bakterien nach bisher bekannten Anzuchtverfahren hinausgehen. Des weiteren sollen sich die Bakterien auch noch während einer längeren Lagerung von z. B. einem Jahr und mehr aktiv erhalten lassen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe bei dem eingangs genannten Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1. Dazu wird in eine geeignete Nährlösung schlaufenförmig ein gasdurchlässiger, nicht poröser Schlauch eingebracht, durch den Luft oder gasförmiger Sauerstoff in Form von reinem Sauerstoff oder beispielsweise als Sauerstoff-Luftgemisch geleitet wird. Als Folge positiver Aerotaxis sammeln sich nitrifizierende Bakterien auf dem Schlauch und bilden durch Adhäsion aufgrund extrazellulärer Polymere an der Oberfläche des Schlauches einen Biofilm. Im Bereich dieses ausschließlich aus Nitrifikanten bestehenden Biofilms wachsen und vermehren sich die Organismen. Die Sauerstoffzehrung ist bei einem luftdurchströmten Schlauch so stark, daß aerobe Bedingungen nur in unmittelbarer Umgebung der Schlauchoberfläche, d. h. im Bereich des Biofilms bestehen. Übrige Bereiche des Nährmediums sind nahezu anaerob. Hier wachsen die gleichen Organismen durch Umkehrung der Nitrifikation unter Verwendung der organischen Substanzen.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich grundsätzlich alle fakultativ chemolithoautotroph wachsenden nitrifizierenden Bakterien. Besonders hohe Zellerträge von mehr als 30 mg Protein/1 liefern dabei Vertreter der Gattung Nitrobacter (z. B. Nitrobacter winogradskyi ATTC 25 391 sowie Nitrobacter hamburgensis, Arch. Microbiol. 136, 281-283).
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung lassen sich getrennte Kompartimente ohne Verwendung eines gasdurchströmten Schlauches bei der Anzucht nitrifizierender Bakterien auch dadurch erreichen, daß das Verhältnis von der Flüssigkeitsoberfläche zum Flüssigkeitsvolumen durch Verwendung entsprechender Kulturgefäße wie z. B. flaschenförmige Behälter klein gehalten wird. Werden nicht gasdicht aber steril verschlossene Kulturgefäße verwendet, entsteht in einem engen Bereich unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche eine Zone höheren Sauerstoffpartialdruckes. An der Flüssigkeitsoberfläche kommt es zur Ausbildung einer Kahmhaut, die von ihrer Struktur und Zusammensetzung her dem Biofilm am Schlauch vergleichbar ist. In dieser und der unmittelbar darunter liegende Zone höheren Sauerstoffpartialdruckes nitrifizieren die Zellen, während in tiefergelegenen Bereichen die Zellen vor Sauerstoff geschützt sind, anaerob wachsen und lange Zeiten im stoffwechselaktiven Zustand überdauern können. Zur Durchführung dieses Verfahrens eignen sich beispielsweise handelsübliche Laborflaschen mit einem Volumen von 1 Liter (1). Durch Verschließen des Schraubenverschlusses läßt sich die Sauerstoffzufuhr auf einfache Weise so weit verringern, daß gerade noch genügend Sauerstoff in das Innere des Gefäßes diffundiert, so daß es zur Bildung unterschiedlicher Kompartimente kommt.
Wichtig ist natürlich der Einsatz geeigneter Nährmedien. In Gegenwart organischer Substanzen wie z. B. Hefeextrakt, Pepton und Pyruvat sind nitrifizierende Bakterien unter Sauerstoffabschluß in der Lage, Nitrat bzw. Nitrit als terminalen Elektronenakzeptor zu nutzen und die dabei frei werdende Energie zum Wachstum zu verwenden. Derartige Stoffwechselleistungen lassen sich bei Einsatz von 1,5 g Hefeextrakt pro 1, 1,5 g Pepton pro 1, 0,55 g Pyrovat pro 1 und 2 g Natriumnitrat pro 1 erzielen. Selbst in Gegenwart von nur 0,15 g Hefeextrakt pro 1, 0,15 g Pepton pro 1 und 0,055 g Pyruvat pro 1 findet noch eine Nitratreduktion statt.
An Stelle von Pyruvat können aber auch andere organische Verbindungen wie z. B. Glycerin eingesetzt werden, 1g Glycerin pro 1 führt ebenfalls zu gutem Wachstum und bietet gegenüber Verbindungen wie Pyruvat oder Acetat den Vorteil, daß es durch Oxidation dieses Subtrates nicht zu einem zellschädigenden pH-Wert-Anstieg kommt. Daneben stellt die Verwendung von Glycerin auch eine kostengünstige Lösung zur Anzucht der nitrifizierenden Bakterien dar. Die Bakterien wachsen sogar mit Glycerin als einzigem organischem Substrat und Nitrat als Elektronenakzeptor.
Um Zellen nitrifizierender Organismen zu erhalten, die eine starke Potenz zur Nitrifikation besitzen, ist es z. B. bei Nitrobacter erforderlich, die Nitritoxidoreductase zu induzieren. Die Induktion dieses Schlüsselenzyms der Nitritoxidation findet nicht nur in Gegenwart von Nitrit, sondern auch in Gegenwart von Nitrit oder bei Sauerstoffmangel statt. Biochemische Analysen wie z. B. die Bestimmung der enzymatischen Aktivität oder die Trennung der Mebranproteine über Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigen dies. Gelelektrophoretische Trennungen zeigen ein für die nitrifizierenden Zellen von Nitrobacter typisches Bandenmuster mit Hauptproteinen beim 32000, 700000 und 116000 D.
Bakterien, die erfindungsgemäß behandelt werden, lassen sich in vielfacher Weise insbesondere industriell nutzen, überall dort, wo die Beseitigung unerwünschter Stickstoffverbindungen wie z. B. Ammoniak oder Nitrit erfolgen soll, finden sie ihre Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise belasten derartige Stoffe häufig und in periodischen Abständen die Gewässer für Fischzuchten. Zur Beseitigung dieser Stoffe auf natürlichem und die Umwelt nicht belastenden Wege lassen sich die hergestellten Bakterienkulturen einsetzen. Insbesondere lassen sich solche Bakterienstämme züchten, die naturgemäß schon an bestimmte Gewässerarten wie z. B. Süß- oder Salzwasser angepaßt sind. Als weiteres Anwendungsgebiet erweist sich die Abwasser- und Trinkwasserreinigung .
Hierfür lassen sich die erfindungsgemäß behandelten Bakterien vornehmlich als Starterkulturen verwenden, um die häufig auftretenden langen Anlaufphasen zu überwinden.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen beschrieben und nachstehend anhand der in der Zeichnung dargestellten Ausführungsform eines Kulturgefäßes zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert.
Das Kulturgefäß für Bakterien besteht aus einem flaschenförmigen Behälter 1 mit Schraubgewinde 2, der mit einem Schraubverschluß 3 und einer Dichtung 4 verschlossen ist. Durch die Durchbrechungen 7, 8 des Schraubverschlusses 3 und der Dichtung 4 ist das Einlaßrohr 5, durch die Durchbrechungen 7, 9 das Auslaßrohr 6 geführt. An den Enden 12, 13 des Ein- und Auslaßrohres 5, 6 ist ein Schlauch 10 befestigt, der schlaufenförmig in das Nährmedium 11 eingetaucht ist. An der Einlaßöffnung 14 des Einlaßrohres 5 kann zur Gasversorgung beispielsweise eine Druckluftpumpe angeschlossen werden. Die Auslaßöffnung 15 des Auslaßrohres 6 ist frei und stellt eine Verbindung zur Umgebung dar.
Zur Herstellung einer wässrigen Suspension von nitrifizierenden Bakterien wird der Behälter 1 bis zum Ansatz 16 des Schraubgewindes 2 mit Nährlösung 11 gefüllt, sterilisiert und anschließend mit einer Bakterienkultur beimpft. Das Inoculum für nitrifizierende Bakterien beträgt dabei 1 - 5%. Danach wird die Verschlußeinrichtung 17 mit den Ein- und Auslaßrohren 5, 6 sowie dem Schlauch 10 angebracht und der Behälter 1 mittels des Schraubverschlusses 3 und der Dichtung 4 verschlossen. über eine Druckluftpumpe oder eine andere Gasversorgungseinrichtung wird Gas wie z . B. Sauerstoff über das Einlaßrohr 5 durch den Schlauch 10 und das Auslaßrohr 6 geleitet. Die Bebrütung der Kultur erfolgt im Dunkeln bei der für Nitrifikanten optimalen Wachstumstemperatur von 25° bis 30°C. Regelmäßig können Proben zur Bestimmung der Wachstumsphase beispielsweise mit einer sterilen Kanüle nach Durchstechen der Dichtung 4 oder Abnahme der Verschlußeinrichtung 17 entnommen werden. Spätestens nach Erreichen der stationären Wachstumsphase wird die Sauerstoffversorgung eingestellt. Die gesamte Verschlußeinrichtung 17 wird zusammen mit dem Ein- und Auslaßrohr 5, 6 und dem Schlauch 10 unter sterilen Bedingungen gegen einen handelsüblichen Schraubdeckel ausgetauscht. In diesem Zustand können die Kulturen bei 30°C oder auch bei niedrigen Temperaturen wie z. B. bei Raumtemperatur über lange Zeit aufbewahrt werden.
INTERNATIONALE ANMELDUNG VERÖFFENTLICHT NACH DE INTERNATIONALE ZUSAMMENARBEIT AUF DEM GEBIET DES
(51) Internationale Patentklassifikation 4 (11) Internationale Veröffentlich ungsnumm er: WO 88/ 0 C12N 1/20 A3 (43) Internationales
Veröffentlichungsdatum : 7. April 1988 (07.
(21) Internationales Aktenzeichen: PCT/EP87/00538 (81) Bestimmungsstaaten: AT (europäisches Patent), BE (europäisches Patent), CH (europäisches Pa
(22) Internationales Anmeldedatum: DE (europäisches Patent), DK, FR (europäische
22. September 1987 (22.09.87) tent), GB (europäisches Patent), HU, IT (eur sches Patent), JP, KR, LU (europäisches Patent) (europäisches Patent), NO, SE (europäisches Pa
(31) Prioritätsaktenzeichen: P 3632 532.5 SU, US.
(32) Prioritätsdatum: 25. September 1986 (25.09.86)
VerβffentHcht
(33) Prioritätsland: DE Mit internationalem Recherchenbericht.
Vor Ablauf der fiir Änderungen der Ansprüche zugel
Frist. Veröffentlichung wird wiederholt falls Änderu
(71) Anmelder (für alle Bestimmungsstaaten ausser US): TEeintreffen.
TRAWERKE DR. RER. NAT. ULRICH BAENSCH GMBH [DE/DE]; Herrenteich 78, D-4520 Meile 1 (88) Veröffentlich ungsdatam des internationalen Recherche (DE). richts: 5. Mai 1988 (05.0
(72) Erfinder; und
(75) Erfinder/Anmelder (nur für US) : BOCK, Eberhard [DE/ DE]; Herwigredder 110a, D-2000 Hamburg 56 (DE).
(74) Anwälte: SCHMIDT-BOGATZKY, J. usw.; Schloßmühlendamm 1, D-2100 Hamburg 90 (DE).
(54) Title: PROCESS FOR PRODUCING AN AQUEOUS SUSPENSION OF NITRIFYING BACTERIA
des Sauersto s wer en ausgesc ossen.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Suspension von nitrifizierenden Bakterien, in der die Bakterien unter Induktion der für die Nitrifikation spezifischen Enzymsysteme in stoffwechselphysiologisch aktivem Zustand verbleiben, sich über lange Zeit aufbewahren und anschließend verwenden lassen, unter Einsatz eines Nährmediums, dem Ammoniak oder Nitrit zugesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß in dem geschlossenen Kulturgefäß in getrennten Kompartimenten hohe und niedrige Sauerstoffpartialdrücke erzeugt werden und die Bakterienkultur spätestens nach Erreichen der stationären Wachstumsphase unter Sauerstoffabschluß gehalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch das als Suspension nitrifizierender Bakterien ausgebildete Nährmedium ein Gas geleitet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas durch eine in die unter Luftabschluß gehaltene Suspension eingebrachte Schlauchmembran aus einem nichtporösen Material geleitet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Gas Luft oder Sauerstoff durch die Schlauchmembran geleitet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein kontinuierlicher Gasstrom durch die Schlauchmembran geleitet wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Anzucht fakultativ chemolithoautotropher Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß Nährmedien verwendet werden, die aus einer mineralischen Grundlösung, Ammoniak oder Nitrit oder organischen Substraten bestehen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Grundlösung Nitrit oder Nitrat als Elektronenakzeptoren zugeführt werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß als organische Substrate Glycerin, Acetat oder Pyruvat oder Kombinationen dieser Verbindungen eingesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Hefeextrakt und/oder Pepton dem Nährmedium zugesetzt werden.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle des in das Nährmedium eingebrachten Schlauches zur Erzeugung eines aeroben Kompartiments neben einem anaeroben Bereich die nitrifizierenden Bakterien im engen Bereich der oberen Schicht der Nährlösung unter aeroben Bedingungen kultiviert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß in stehenden, weder geschüttelten noch gerührten nicht gasdicht verschlossenen Kulturen die Flüssigkeitsoberfläche zwischen Gas- und Flüssigkeitsphase gerade so groß ist, daß die Geschwindigkeit, mit der Sauerstoff von der Gasphase in die Flüssigkeitsphase diffundiert, kleiner ist als die Geschwindigkeit, mit der der Sauerstoff von den nitrifizierenden Bakterien im Nährmedium aufgezehrt wird.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzucht der Bakterien im Dunkeln bei einer konstanten Temperatur von 30°C erfolgt.
13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den
Ansprüchen 1 bis 9, mit einem als Kulturgefäß dienenden Behälter mit Verschlußeinrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß ein gasdurchlässiger, nichtporöser Schlauch (10) schlaufenförmig in die Nährlösung (11) eingebracht ist, der endabschnittseitig mit einem Gaseinlaßrohr (5) und einem Gasauslaßrohr (6) verbunden ist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Gaseinlaßrohr (5) und das Gasauslaßrohr (6) durch die Ausnehmungen (8, 9) der Dichtung (4) geführt und zusammen mit dem Schlauch (10) mittels einer Verschlußeinrichtung (17) an dem Behälter (1) befestigt ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Schlauch (10) aus Silikongummi oder dergleichen besteht.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5314542A (en) * 1993-08-06 1994-05-24 Precision Aquarium Testing, Inc. Nitrosomonas preservation and reactivation for aquaria
US5573951A (en) * 1995-06-07 1996-11-12 Accumed, Inc. Dual chamber blood culture bottle with rotating inlet valve assembly
US5580786A (en) * 1995-06-07 1996-12-03 Accumed, Inc. Dual chamber blood culture bottle with syringe capture and piston assembly
US5607860A (en) * 1995-06-07 1997-03-04 Accumed, Inc. Dual chamber blood culture bottle
US5652143A (en) * 1995-06-07 1997-07-29 Accumed, Inc. Dual chamber blood culture bottle with break seal
GB2333472B (en) * 1998-01-21 1999-12-15 Membrane Extraction Tech Ltd Performing bioreactions using a tubular elastomer membrane
US8076118B2 (en) * 1999-01-29 2011-12-13 Morris Barrington A Live water compositions for bio-cycling of aquariums
US6376229B2 (en) 1999-01-29 2002-04-23 World Wide Imports Enterprises, Inc. Method for preservation of marine microorganisms
GB9907258D0 (en) * 1999-03-29 1999-05-26 Medeval Limited Sampling apparatus and method of sampling using same
EP1197548A4 (de) * 1999-06-10 2006-03-01 Bicom Corp Verfahren einer hochkonzentrierten kultur aus in aktiviertem belebtschlamm enthaltenen nitrifizierenden oder denitrifizierenden bakterien; kulturpromotor, welcher in einem hochkonzentrations-kulturverfahren von nitrifizierenden bakterien verwendung findet und verfahren der gewichtsverlustbehandlung von belebtschlamm
DE10325404B4 (de) * 2003-06-05 2013-05-29 Willy Thenn Wässriges Suspensionsmedium mit lebensfähigen Milchsäurebakterien für probiotische Anwendungen
CA2470765A1 (fr) * 2004-06-10 2005-12-10 Pierre-Philippe Claude Methode de conditionnement de formulations microbiennes
US20080081364A1 (en) * 2006-10-03 2008-04-03 Greenfield Richard M Preservation system for stratabound microorganisms
US8778669B2 (en) 2009-07-22 2014-07-15 Corning Incorporated Multilayer tissue culture vessel
EP2377918A1 (de) * 2010-04-16 2011-10-19 ETH Zurich Verfahren zur direkten Herstellung von Gärungsprodukten aus Biomassen in einem Biolfilmreaktor
FR2993186B1 (fr) 2012-07-13 2014-07-25 Polyor Sarl Filtres macro/microporeux pour l'incubation et le diagnostique de l'activite microbiologique d'echantillons environnementaux
US9005550B2 (en) 2012-10-29 2015-04-14 Corning Incorporated Multi-layered cell culture vessel with manifold grips
CN108611289A (zh) * 2016-12-09 2018-10-02 中国科学院生态环境研究中心 一种硝化细菌的培养方法及其专用培养基
WO2018202717A1 (en) * 2017-05-02 2018-11-08 Krüger A/S A method of manufacturing a microbial starter culture
CN112029664A (zh) * 2019-05-17 2020-12-04 天津科技大学 一种可长期保持微生物降解性状的菌株保存方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US755519A (en) * 1903-05-04 1904-03-22 George T Moore Process of preparing for distribution organisms which fix atmospheric nitrogen.
US865965A (en) * 1907-01-17 1907-09-10 George Herbert Earp-Thomas Art of growing and distributing nitro-gathering bacteria.
US4072577A (en) * 1974-05-31 1978-02-07 Samson Helfgott Method and miniaturized apparatus for cultivating bacteria
US4290891A (en) * 1978-03-30 1981-09-22 Ackerman Roy A Method for growing a deammonifying culture and use thereof in wastewater treatment
DE2838542A1 (de) * 1978-09-04 1980-03-13 Biotechnolog Forschung Gmbh Stoffe der empirischen summenformel c tief 25 h tief 33 n tief 3 o tief 3 s tief 2
ES8608576A1 (es) * 1984-08-03 1986-07-16 Biotechnolog Forschung Gmbh Procedimiento y aparato para el gaseado exento de burbujas de liquidos,especialmente de medios de cultivo previstos particularmente para propagar cultivos de tejidos

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HUT52151A (en) 1990-06-28

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