CN112029664A - 一种可长期保持微生物降解性状的菌株保存方法 - Google Patents

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Abstract

高效降解菌株能长期保存并保持降解性状的稳定是环境污染的生物修复领域的一个重要环节。本发明采用缺氧保存的策略，将菌株用一定的包埋载体固定化后置于硅油‑水的双液相体系中来长期保存。该方法可满足污水处理、土壤修复、废气净化、固废处理等高效菌株的保存的需求，既能达到保证菌株存活，又能使菌株具有持续的降解功能特性。本方法保存的菌株能在5年甚至更长时间存活，不被污染，不需驯化，活化后的菌株具有稳定的污染物降解能力。

Description

一种可长期保持微生物降解性状的菌株保存方法
技术领域
本发明涉及微生物保存与生物降解领域，利用这种微生物保存方法，微生物不但能够以某特定底物为营养在缺氧环境下长期存活，而且能够使微生物一直处于含有降解底物的环境压力下，从而保证不丢失降解性状。具有保存条件简单，活化迅速，能持续保证降解功能的特点。
背景技术
随着工业的快速发展，污染物排放日益增多，带来了越来越严重的环境污染问题。生物修复技术是目前处理环境污染的重要手段之一。而关键的功能菌株是生物修复技术的核心，目前有大量高效污染物降解菌株被研究者从环境中分离和筛选得到，但是在菌株保存过程中存在着微生物变异快，功能性状易丢失的情况。如何有效保存降解菌株的存活，又保持菌株的特定功能活性不丢失，成为环境微生物和生物修复领域的热点问题。
菌种保存方法因微生物的不同而异。在菌种保存过程中，必须使微生物的代谢处于停滞状态，才能在一定的时间内不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，故菌种保存方法多依据这三个因素而设计。
菌种保存方法有多种，常规方法有固体平板保存、固体斜面保存、甘油保存等，常因传代次数多、易污染、易变异，给保存带来诸多不利。真空冷冻干燥法，具有保存时间长、成活率高、变异小等优点，但操作技术难度大，花费高，需特殊设备，一般单位不易做到。迫切需要一种可长期保持微生物降解性状的菌株保存方法。
发明内容
本发明所要解决的菌株保存技术问题在于提供了一种可长期保持微生物降解性状的菌株保存方法。。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种可长期保持微生物降解性状的菌株保存方法，其特征在于：将高效降解菌株利用特定混合包埋载体进行固定化，然后转入双液相系统中进行缺氧长期保存。
首先制作菌株的固定化细胞：使用聚乙烯醇(PVA)9％(w/v)和海藻酸钠1％(w/v)并添加活性炭粉和沸石颗粒各0.1％(w/v)混合为固定化载体并在95℃水浴中加热2小时充分混匀，经121℃高温灭菌后与一定量菌液混合，利用注射器将载体与菌液混合液滴加到饱和硼酸和2％(w/v)氯化钙的混合交联剂中，形成2～3mm的颗粒小球，在4℃下交联约12小时，而后取出小球分别用生理盐水和灭菌无机盐培养基各洗涤3遍，得到固定化微生物小球。然后，将固定化微生物在无机盐培养基中添加可被微生物利用的特异底物进行培养，待底物被降解消耗殆尽后，再次加入适量底物，连续3～5次后将固定化微生物连同该无机盐培养基转移至一个无菌旋口瓶中，以无菌硅油密封覆盖在无机盐培养基上层，硅油与无机盐溶液体积比为1∶5，硅油中适当添加可被微生物降解底物。旋紧瓶盖室温密封保存，每半年添加适量降解底物于硅油中，使固定化后的微生物不但能够以底物为营养在缺氧环境下有限生长，而且能够使微生物一直处于含有一定浓度降解底物的环境压力下从而保证不丢失降解性状。
涉及到的培养基：
种子液体培养基：酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，水定溶到1L，pH 7.0；
无机盐培养基组成：NaCl 1.00，NH4NO31.00，K2HPO41.50，KH2PO40.50，MgSO4·7H2O0.20；目标污染物，3～5.00g；2mL的微量元素液；水定溶到1L，pH 7.0；其中，微量元素液配置：每H3BO30.232g，ZnSO4·7H2O 0.174g，FeSO4(NH4)2SO4·6H2O 0.116g，CoSO4·7H2O0.096g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.022g，CuSO4·5H2O 8mg，MnSO4·4H2O 8mg，水定容到1L(自然pH)；
具体实施方式
为进一步说明本发明，特以硝基苯降解菌的保存为例加以说明实施过程。
实施实例：
硝基苯降解菌的保存，步骤如下：
(1)硝基苯降解菌种子液的培养。
培养基组成：种子液培养基：酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，水定溶到1L，pH 7.0；
接种和培养条件：从平板上挑取一单菌落，接种于50ml LB液体培养基中。30℃，150rpm摇床培养至对数生长期后期。将菌液在室温下6000rpm离心10min后用无菌水洗涤两次，并制成菌悬液即为种子液。
(2)硝基苯降解菌的固定化。过程如下：
使用聚乙烯醇(PVA)9％(w/v)和海藻酸钠1％(w/v)并添加活性炭粉和沸石颗粒各0.1％(w/v)混合为固定化载体并在95℃水浴中加热2小时充分混匀，经121℃高温灭菌后与一定量菌液混合，利用注射器将载体与硝基苯降解菌种子液混合液滴加到饱和硼酸和2％(w/v)氯化钙的混合交联剂中，形成2～3mm的颗粒小球，在4℃下交联约12小时，而后取出小球分别用生理盐水和灭菌无机盐培养基各洗涤3遍，得到固定化微生物小球。
(3)固定化细胞转入双液相体系长期保存。方法如下：
将固定化微生物在无机盐培养基中添加可被微生物利用的特异底物硝基苯100mg/L进行培养，待硝基苯被降解消耗殆尽后，再次加入100mg/L硝基苯，连续3～5次后将固定化微生物连同该无机盐培养基转移至一个无菌旋口瓶中，以无菌硅油密封覆盖在无机盐培养基上层，硅油与无机盐溶液体积比为1∶5，硅油中适当添加可被微生物降解底物。旋紧瓶盖室温密封保存，每半年添加适量硝基苯于硅油中，使固定化后的微生物不但能够以底物为营养在缺氧环境下有限生长，而且能够使微生物一直处于含有一定浓度降解底物的环境压力下从而保证不丢失降解性状。
无机盐培养基组成：NaCl 1.00，NH4NO31.00，K2HPO41.50，KH2PO40.50，MgSO4·7H2O0.20；目标污染物，3～5.00g；2mL的微量元素液；水定溶到1L，pH 7.0；其中，微量元素液配置：每H3BO30.232g，ZnSO4·7H2O 0.174g，FeSO4(NH4)2SO4·6H2O 0.116g，CoSO4·7H2O0.096g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.022g，CuSO4·5H2O 8mg，MnSO4·4H2O 8mg，水定容到1L(自然pH)；
(4)固定化菌株细胞的复苏。首先将保存有固定化小球的双液相体系中的硅油吸出，然后将含有固定化小球的溶液一同转入无菌锥形瓶中，并加入50ppm的硝基苯，30℃，150rpm摇床培养24小时，取出固定化小球破碎释放出微生物细胞，并以接种环将菌株在含有100ppm硝基苯的营养培养基固体平板上划活。营养培养基固体平板为种子液体培养基基础上添加2％(w/v)的琼脂粉。

Claims (3)

1.一种可长期保持微生物降解性状的菌株保存方法，其特征在于：将高效降解菌株利用特定混合包埋载体进行固定化，然后转入双液相系统中进行缺氧长期保存。
2.根据权利要求1所述的微生物固定化方法，其特征在于，具体步骤如下：使用9％(w/v)聚乙烯醇(PVA)和1％(w/v)海藻酸钠，并添加活性炭粉和沸石颗粒各0.1％(w/v)，混合为固定化载体，在95℃水浴中加热2～5小时充分混匀，经121℃高温灭菌后与一定量菌液混合，利用注射器将载体与菌液混合液滴加到饱和硼酸和2％(w/v)氯化钙的混合交联剂中，形成2～3mm的颗粒小球，在4℃下交联约12小时，而后取出小球分别用生理盐水和灭菌无机盐培养基各洗涤3遍，得到固定化微生物小球。
3.根据权利要求1所述将固定化微生物小球转入双液相系统中长期缺氧保存的方法，其特征在于：将固定化微生物在无机盐培养基中添加可被微生物降解利用的特异底物进行培养，待底物被降解消耗殆尽后，再次加入适量底物，连续3～5次后将固定化微生物连同该无机盐培养基转移至一个无菌旋口瓶中，以无菌硅油密封覆盖在无机盐培养基上层，形成双液相系统，硅油与无机盐溶液体积比为1∶5，硅油中适当添加可被微生物降解利用的目标污染物，旋紧瓶盖室温密封保存，每半年添加适量降解底物于硅油中。
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