JPH01501199A - 硝化細菌の水性懸濁液の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 硝化細菌の水性懸濁液の調製方法 この発明は、アンモニアまたは亜硝酸塩を含有する増殖培地を用いた硝化細菌の 水性懸濁液の調製方法とその方法を実施するための装置に関し、前記増殖培地に おいては、特定の硝化酵素系の誘発によって細菌が代謝的および生理的に活性を 保持し、細菌を長期間保存することができて最終的には使用することが可能であ る。

すべての生育し得る有機体と同様に、細菌は生理学的な温度における恒久のエネ ルギー供給に依存している。それらは異なる物質の代謝からエネルギーを得てお り、それによって、その過程において、エネルギー源、水素供与体および炭素源 に従って特定される種々の代謝群が生成される。水素供与体に従って、微生物は 「有機力源生物」または「無機力源生物」と呼ばれる。最初の場合には、有機化 合物はエネルギー源として使用される。他方、Ｈ２、Ｎ　Ｈ３、Ｈ２Ｓ　ｓ　Ｓ 　ＳＣ０ｓＦｅ”、ＮＨ４＋またはＮＯ２−のような無機エネルギー源を使用し た場合に無機力源生物的な生育が達成される。

シュードモナス属またはエシェリキア属のような有機力源生物的に生育する生物 の生育をニトロソモナス属またはニトロバクタ−のような無機力源生物的な生物 の生育と比較した場合に、両者の代謝のタイプの間には、世代時間に関して大き な差異がある。ニトロバクタ−が無機力源生物の生育条件の下では少なくとも１ ０時間の世代時間を有するのに対して、エシェリキア属の世代時間は約２０分で ある。この差異の理由は、利用される基質の酸化から得られるエネルギーの量の 違いである。

エネルギー生成のために使用される無機基質によって、硝化細菌の種の代謝は異 なる。アンモニアの酸化は３段階で行なわれ、最初はモノオキシゲナーゼによる アンモニアのヒドロキシルアミンへの酸化である。

ａ、）　ＮＨ３＋ＸＨ２＋　０２　ＮＨ２０Ｈ＋　Ｘ　＋　Ｈ２０次いで、ヒド ロキシルアミンのニトロキシルを経た亜硝酸塩への酸化がエネルギー生成段階と して行なわれる。この反応の鍵となる酵素はヒドロキシルアミン酸化還元酵素で ある。

ｂ、）　ＮＨ２０Ｈ＋２　Ｃｙｔ　ｃ’＋→（ＮＯＨ）　＋２　Ｈ”十Ｃｙｔ　 （，２“ｅ、）　（Ｎｏｎ）　＋　Ｘ　＋　Ｈ２０−Ｎｏ２−　＋ＸＨ２＋　Ｈ ”細菌による亜硝酸塩の酸化は次の式にまとめることができる ＮＯ２−＋０．５　Ｏ２−Ｎ０３− しかしながら、酸化の間に亜硝酸塩から取られた酸素原子は空気ではなく水に由 来するものである。これは、亜硝酸塩から放出され酸素に移動した電子と同様に 、次に示す部分反応によって示される。

ａ、）　ＮＯ２−＋Ｈ２０＋２　Ｃｙｔ　ａｌ”　ＮＯ３−＋２　Ｈ”＋２　Ｃ ｙｔ　ａｔ”ｂ、）　２　Ｃｙｔ　ａ、”＋２　Ｃｙｔ　ｃ”　−２Ｃｙｔ　ｃ ”　＋２　Ｃｙｔ　ａ、”ｅ、）　２　Ｃｙｔ　ｅ”　＋２　Ｃｙｔ　ａａ３” 　→２　Ｃ）Ｉｔ　ａａ３”　＋２　Ｃｙｔ　ｃ３＋ｄ、）　Ｚ　Ｃｙｔ　ａａ ３”　＋２　Ｈ”＋０．５０２　＝Ｚ　ＣＹｔ　ａａ３”　十Ｈ２０膜表面結合 性酵素である亜硝酸塩酸化還元酵素が呼吸鎖への電子伝達の原因である。

別の生育因子は水素イオン濃度である。細菌の生育はｐＨ値に依存し、ｐＨ７， ８が最適である。より低い場合と同様により高いｐＨ値は生育を阻害し、ｐＨ最 適値からのより大きな逸脱は有毒でさえある。アンモニアの酸化によって酸が生 成する場合、または培地に供給された有機酸が代謝されて完全に酸化し、ｐＨ値 が増加する場合に、ｐＨ値の変動が起こり得る。

酸素の供給は細菌の生育にとって意味がある。嫌気的に生育する微生物が、例え ば、終末水素受容体として硝酸塩または硫酸塩を使用するのに対して、好気性微 生物は終末水素受容体として分子状酸素を使用する。前者に対しては、たとえ低 濃度であっても酸素は有毒である。しかしながら、好気性微生物にとっても高い 酸素分圧はを毒となり得る。さらに、酸素要求量は増殖相と共に変化する。細胞 が対数増殖期にある場合には、定常期にある場合よりも酸素要求量が多い。休止 細胞は生育細胞よりも酸素を必要とはしない。プロセス制御バイオリアクター（ ｐｒｐｃｅｓｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｓ）を使用する 場合には、大腸菌およびシュードモナス属のような増殖速度の速い微生物を、平 衡通気（ｂａｌａｎｃｅｄ　ａｅｒａｔｉｏｎ　）法によって何の問題なく、高 い細胞濃度で、生育させることができる。

しかし現時点では、硝化細菌を用いてそのような高い細胞濃度を達成する方法は ない。　酸素の供給は、硝化細菌を保存する場合にまた問題となる。工業的な使 用に利用し得る細胞を多量に保持するためには、細胞は活性を保っていなげれば ならず、かつその上に酸素に対して保護されていなければならない。

一方における酸素供給の必要性と他方における嫌気条件との間のこれらの複雑な 関係は、異なった生理学的状態の細胞を一緒に生育させるためのシステムを要求 する。

この発明の目的は、例えば、工業的な使用に対する細胞の高い収量を達成する、 特定の硝化酵素系の誘発を伴う、水性培地における硝化細菌の生育および貯蔵方 法を提供することにある。硝化細胞の貯蔵安定性は、大腸菌またはシュードモナ ス属のような他の細菌の貯蔵安定性よりも高く、通常の方法によって生育した硝 化微生物の貯蔵安定性よりさえも高くあるべきである。さらに、細菌は、例えば １年以上の貯蔵期間の後でさえも活性を保持しているべきである。

この発明によると、前述した方法の問題は、請求の範囲第１項記載の特徴によっ て解決される。空気、純粋酸素、または空気と純粋酸素の混合物を、適当な培養 培地内に浸され環状に配置された気体透過性無孔管に通す。酸素走性が陽性であ る結果として、硝化細菌は管の表面に密着して細胞外ポリマーのバイオフィルム （ｂｉｏｒｉｌｍ　）を形成する。微生物はバイオフィルム領域で生育し、この フィルムは硝化作用を行なうものによってのみ生成される。空気輸送管の酸素消 費は、バイオフィルム領域内の好気性条件が管表面近傍にのみ存在するほど多い 。培地の他の部分は嫌気性に近い。そこでは、同じ微生物が、有機化合物を用い て硝化作用を元に戻すことによって生育する。

一般に、通性化学合成無機力源無機栄養的に生育するすべての硝化細菌が、この 発明による方法を実施するために使用することができる。３０ηタンパク質／ノ をこえる非常に高い細胞収量が、ニトロバクタ−属の構成員（例えば、Ｎ１ｔｒ ｏｂａｃｔｅｒ　ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　、　Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、　１３Ｂ、２８１−２８３の他にＮ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｗｉｎｏｇｒａ ｄｓｋｙｉ　ＡＴＣＣ２５３９１）を用いて達成される。

この発明のさらなる特徴によると、硝化細菌を生育させるための気体輸送管の代 わりに、液容積に対する液面の割合が低いボトルのような培養フラスを用いるこ とによって、別々のコンパートメントを作ることもできる。培養フラスコを、無 菌ではあるが気密ではないキャップを用いて使用する場合には、液面直下に高酸 素分圧の狭い帯域が形成される。バイオフィルムは液面上に形成され、それは構 造および組成において管上のバイオフィルムと類似している。細胞は、この領域 および直下の高酸素分圧領域において硝化を行なうが、それらが嫌気的に生育し 長期間活性状態を留めるより深い領域においては酸素に対して保護されている。

例えば、この方法を実施するために、容積１ノの普通の実験瓶（１）を使用する ことができる。スクリューキャップを締めることにより、酸素の拡散速度が得ら れる程度には酸素が供給されるが、酸素の供給を容易に減少させることができ、 異なったコンパートメントを作り出す。

もちろん、正しい増殖培地は重要である。酵母抽出物、ペプトンおよびピルベー トのような有機化合物の存在および酸素の欠如の下では、硝化細菌は、硝酸塩ま たは亜硝酸塩をそれぞれ終末電子受容体として使用し、生育エネルギーを生成す る。そのような代謝は、１．５ｇ酵母抽出物／Ｊ！、１．５ｇペプトン／ノ、０ ．５５ｇピルベート／ノ、および２ｇ硝酸ナトリウム／Ｊ！を用いて達成される 。０．１５ｇ酵母抽出物／、１７．０．１５ペプトン／ｌ！、および０．０５５ ｇピルベート／ノのみを用いても硝酸塩の還元はなされる。

ピルベートの代わりに、グリセリンのような他の有機化合物も使用することがで きる。１ｇグリセリン／Ｊ！を用いることで好ましい生育が得られ、ピルベート またはアセテートと比較して、この物質の酸化からは細胞傷害性ＯｐＨ値の増加 は起こらない。さらに、グリセリンの存在下において硝化細菌を生育させること は高価ではない。グリセリンを唯一の有機基質とし、硝酸塩を電子受容体として 用いることによってさえも細菌は生育する。

高い硝化作用活性を有する硝化微生物を生育させるためには、亜硝酸塩酸化還元 酵素を誘発させる必要がある。亜硝酸塩の酸化の鍵となる酵素は、亜硝酸塩の存 在下だけではなく、硝酸塩の存在下または好気性条件下でも誘発される。誘発は 、例えば、酵素活性の評価またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパ ク質の分離のような生化学的分析によって示すことができる。ゲル電気泳動を用 いた分離は、３２，０００．７０．０００、および１１Ｂ、ｏｏｏＤの主要タン パク質を有する硝化ニトロバクタ−細胞に典型的なバンド・パターンを示す。

この発明に従って生育させた細菌は、特に産業的な目的に使用することができる 。それらは、アンモニアまたは亜硝酸塩のような窒素化合物を排除しなければな らない場所で使用することができる。これらの化合物は、魚のふ化のための水を 定期的に汚染する。培養細菌は、環境を汚染することなく自然な方法でこれらの 化合物を除去することができる。特に、生来淡水または海水に適合している菌株 を開発することができる。適用の他の分野は、排水または飲料水の処理である。

この発明に従って生育させた細菌は、長い開始相（ｓｔａｒｔｐｈａｓｅｓ）を 短縮させるための開始培養株として使用することができる。

この発明のさらなる特徴は、従属請求項に記載してあり、図面に示したこの方法 を実施するために使用される培養フラスコに従って以下に記述する。

細菌の培養フラスコは、スクリューキャップ３とシーリング４で密封することが 可能なねじ山２を有するフラスコ１である。排出管６がスクリューキャップ３お よびシーリング４の穴７．９に配置されているのに対して、導入管５は穴７．８ に配置されている。導入および排出管５．６の末端は、増殖培地１１中に浸され て環状に配置されている管ｌＯに接続されている。空気ポンプは気体の供給に使 用される管５の入口１４に接続することができる。出口１５は排出管６を外界に 開放している。

硝化細菌の水性懸濁液を調製するために、フラスコｌに増殖培地１１をねじ山２ の端１６まで満たして滅菌し、次いで培養細菌を接種する。硝化細菌に使用する 接種物は１−５％である。管ｌＯの他に導入および排出管５．６を有する閉室装 置１７を配置し、フラスコ１をスクリューキャップ３およびシーリング４によっ て密封する。例えば酸素のような気体を、空気ポンプまたは他の気体供給装置に よって、導入管５および管１０を通して排出管６に送る。培養物は、暗所内で、 硝化細菌の最適生育温度である２５−３０℃でインキュベートする。増殖相を決 定するために、シーリング４を通して、または閉室装置１７を取外した後に、無 菌のカニユーレを用いて定期的に試料を採取することができる。遅くとも定常期 に達した時には、酸素の供給を停止する。導入および排出管５．６および管１０ を有する密封装置１７全体は、無菌条件の下で普通のスクリューキャップに代え ることができる。この段階で、培養物を長期間、３０℃またはより低い温度、例 えば室温で保存することができる。

国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．特定の硝化酵素系の誘発の下で細菌が代謝的にかつ生理学的に活性を保ち、 細菌を長期間保存しかつ最終的に使用することができる硝化細菌の水性懸濁液の 調製方法であって、密封された培養フラスコの内部により高いもしくはより低い 酸素分圧を有する独立したコンパートメントを作り、遅くとも定常増殖期に達し たときに培養細菌が酸素の欠如した状態に保たれることを特徴とする、アンモニ アまたは亜硝酸塩を含有する増殖培地を使用する硝化細菌の水性懸濁液の調製方 法。
2. ２．気体が硝化細菌の懸濁液を通過することを特徴とする請求の範囲第１項に記 載の方法。
3. ３．空気が欠如した状態に保たれている懸濁液に浸された無孔性の管の膜を、気 体が通過することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．管の膜を通過する気体が空気または酸素であることを特徴とする請求の範囲 第３項に記載の方法。
5. ５．連続的な気体流が管の膜を通過することを特徴とする請求の範囲第４項に記 載の方法。
6. ６．基本無機塩培地、アンモニアまたは亜硝酸塩または有機物質を含有する増殖 培地を用いることを特徴とする、通性化学合成無機力源無機栄養的微生物の生育 のための請求の範囲第１項ないし第５項に記載の方法。
7. ７．基本培地に、電子受容体として亜硝酸塩または硝酸塩を添加することを特徴 とする請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．有機物質としてグリセリン、アセテート、またはピルベートまたはそれらの 組合わせを用いることを特徴とする請求の範囲第６項および第７項に記載の方法 。
9. ９．増殖培地に酵母抽出物および／またはペプトンを添加することを特徴とする 請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．嫌気性領域のそばに好気性のコンパートメントを形成するための培地中に 浸した管を使用する代わりに、培地の上部の狭い領域において、好気性の条件の 下で硝化細菌を生育させることを特徴とする請求の範囲第３項ないし第９項に記 載の方法。
11. １１．振とうも撹拌もされておらずかつ気密でない静置培養物が、気相および液 相の間に、気相から液相への酸素の拡散速度が硝化細菌のための培地における酸 素の吸収速度よりも小さくなるような大きさの液面を有することを特徴とする請 求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．細菌を、暗所で、一定温度３０℃で生育させることを特徴とする請求の範 囲第１項ないし第１１項に記載の方法。
13. １３．環状に配置された気体透過性の無孔性管（１０）が増殖培地（１１）中に 浸漬され、その末端部分で気体導入管（５）および気体排出管（６）と結合して いることを特徴とする、密封装置を有する培養フラスコを用いた請求の範囲第１ 項ないし第９項に記載の方法を実施するための装置。
14. １４．気体導入管（５）および気体排出管（６）がシーリング（４）の穴（８、 ９）に配置され、かつ閉室装置（１７）によって管（１０）と共にフラスコ（１ ）に接続されていることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の装置。
15. １５．管（１０）がシリコーンゴム等からなるものであることを特徴とする請求 の範囲第１３項および第１４項に記載の装置。