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Verfahren zur Erzeugung von Vitaminen der B12-Gruppe durch Propionsäurebakterien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Vitaminen der B12-Grttppe
durch Vergärung eines Kohlenhydrate, Aminosäuren und Nährsalze enthaltenden Gärmediums
mittels Propionsäurebakterien, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Propionibacterium-shermanii-Stamm
33 verwendet.
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Der Propionibacterium-shermanii-Stamm 33 wurde aus einer Quarkprobe
in folgender Weise isoliert: Anreicherungskultur Je etwa 1 g Quark verschiedener
Herkunft werden in Reagenzröhrchen mit je 10 ml eines auf den PH-Wert von 6,8 eingestellten
und in üblicher Weise sterilisierten Nährmediums vermischt, das je Liter folgende
Bestandteile enthält:
| 10 g Glukose, |
| 1,5 g Stickstoff in Form eines Casein- |
| Proteolysates, |
| 1 g Stickstoff in Form eines Casein- |
| Säurehy drolysates, |
| 1,6g Na H2 P04, |
| 1,6 g K3 P 04, |
| 0,49 Mg C12 - 6H20, |
| 10 mg Fe S 04 - 7 H201 |
| 12 mg Co S 04 - 7 H2 0, |
| 4 mg Pantothensäure, |
| 0,3 mg Biotin, |
| 5 g Hefeextrakt. |
Die abgefüllten und beimpften je 10 ml Nährmedium überschichtet man mit etwas Paraffinöl.
Man bebrütet nun in einem gründlich evakuierten Exsikka,tor 4 bis 5 Tage bei 30°
C in Gegenwart eines mit 10'°/o,iger alkalischer Pyrogallol-Lösung beschickten Schälchens.
Durch diese 'Maßnahmen wird das Aufkommen anderer Keime weitgehend unterdrückt.
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Reinzüchtung Die Reinzüchtung der Kultur erfolgt vorteilhaft in der
Hochschichtkultur (10 cm hoch, in Röhrchen) unter Benutzung desselben Nährbodens
wie zuvor, der aber mit 2'% Agar verfestigt wird. Die verschiedenen Anreicherungskulturen
werden für sich in steigender Verdünnung in den sterilen, verflüssigten Agar bei
40° C eingetragen und durch Rollen gut verteilt. Man bebrütet nun die einzelnen
Proben in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, und wählt zur Isolierung jene
Röhrchen aus, die nicht zu stark bewachsen sind, also gut getrennte Kolonien enthalten.
Die ausgewählten Röhrchen werden kurz im Wasserbad erwärmt, so daß sich der Agarpfropf
in eine sterile Petrischale bringen läßt. Man sticht dann einzeln liegende Kolonien
aus dem unteren Drittel des Pfropfens, wo die am strengsten anaeroben Bedingungen
vorhanden waren, mit der Platinnadel aus, impft sie in ein gleiches Medium über,
wie es für die Gewinnung der Anreicherungskultur verwendet worden war, und kultiviert
nun weiter unter streng anaeroben Bedingungen, wie eingangs für die Gewinnung der
Anreicherungskultur beschrieben.
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Die so gewonnenen Proben werden auf ihr Vermögen zur Bildung von Vitamin
B12-Aktivität in üblicher Weise geprüft, z. B. mit Hilfe von E. coli, L. leichmanii
oder Ochromonas malhamensis. Man wählt nun die Kulturen mit dem höchsten Vitamin
B12 Bildungsvermögen aus und wiederholt den Selektionsprozeß, wie oben unter »Reinzüchtung«
beschrieben.
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Neugewonnene Reinkulturen sind zunächst gärschwach. Erst im Verlauf
weiterer Führung in flüssigem Medium und hoher Schicht und bei Einhaltung streng
anaerober Bedingungen werden das Wachstums- und Gärvermögen erhöht, und die Vitamin
B12 Produktion erreicht dann eine Höhe von mindestens 15 mg je Liter Gärmedium.
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Folgende Arbeitsweise hat sich für die Erzielung gärkräftiger Kulturen
bewährt: Man beimpft das Nährmedium jeweils mit 10% obiger Kultur durch Überschichten.
Die Luft über dem Medium verdrängt man mit Kohlensäure. Das Gärgefäß wird auf 1
Atm. Überdruck gebracht. Man bebrütet nun 2 Tage bei 30° C. Während dieser Zeit
wird die Glucose verbraucht, und das p$ sinkt auf 4,5. Man bringt das pH mit einer
gesättigten Nag C 03 Lösung
auf 6,6 und setzt 1% Glucose zu. Die
Durchmischung wird mit Kohlensäure vorgenommen, die ein steriles Wattefilter passiert
und in feinverteilter Form durch das Medium geleitet wird. Man bebrütet nun weitere
2 Tage bei 28° C, wobei das Medium wieder unter 1 Atm. Druck steht. Durch diese
Arbeitsweise wird schließlich der hochleistungsfähige Stamm 33 herausgezüchtet.
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Der in der geschilderten Weise gewonnene Propionibaeterium-shermanii-Stamm
33 besitzt folgende Eigenschaften: Die Zellen der Kultur liegen in Diploform und
in kurzen, höchstens viergliedrigen Ketten vor. Bei Verwendung des beschriebenen
Mediums, Einhaltung einer Impfgabe von 10°/o, möglichst anaerober Gärführung, fortlaufender
pH-Korrektur und Zuckerzugabe liegt die Größe der Zellen noch unter 0,5 1. Im übrigen
wurden bei der Identifizierung nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology
alle für das Propionibacterium shermanii geforderten Charakteristika ermittelt.
Der Stamm zeichnet sich durch besondere Gärfreudigkeit z. B. im Glucose-Medium aus,
vergärt aber Lactose, im Gegensatz zu den Angaben Bergeys, nur in geringem Maße
und sehr zögernd. Er ist in die American Type Culture Colleetion unter der ATCC-Nr.13
673 aufgenommen worden.
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Die besonderen Eigenschaften des Stammes 33, sein hohes Vitamin B12
Bildungsvermögen, die unter der Norm liegende Größe der Bakterienzellen und die
rasche Zunahme der Bakteriendichte stellen sich erst nach zahlreichen Passagen in
flüssigem Medium ein, wie oben geschildert.
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Es ist vorteilhaft, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführende
Gärung in einem sterilen Medium, das einen assimilierbaren Zucker, ein durch proteolytischen
oder hydrolytischen Abbau von Proteinen gewonnenes Aminosäuregemisch, die üblichen
Nährsalze, eine Kobaltquelle,. Pantothensäure, Biotin und 5,6-Dimethyl-benzimidazol
enthält, unter anaeroben Verhältnissen bei 28 bis 32° C unter fortlaufendem oder
zeitweisem weiterem Zusatz von Zucker und Einstellung des PH-Wertes auf 6 bis 7
während etwa 10 bis 12 Tagen vor sich gehen zu lassen. Als Zucker bewähren sich
insbesondere Glucose, Invertzucker und Maltose. Für die Herstellung des Aminosäuregemisches
können sowohl pflanzliche als auch tierische Eiweißstoffe verwendet werden, z. B.
Weizen- oder Maiskleber, Kartoffel- oder Sojaproteine, Casein. Blutalbumin, Fischeiweiß
usw. Nach Beendigung der Gärung kann man die Bakterienmasse mit Vorteil alsdann
durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der Gärlösung abtrennen und die gebildeten
Vitamine der B12 Gruppe daraus in an sich bekannter Weise isolieren.
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Eine besonders geeignete Ausführungsform der Erfindung besteht darin,
daß man ein wäßriges Gärmedium, das 1 bis 2% eines vergärbaren Zuckers, z. B. Glucose,
Invertzucker oder Maltose, ein vorzugsweise aus Casein durch proteolytischen Abbau
mittels Trypsin und durch Säurehydrolyse gewonnenes Aminosäuregemisch in einer etwa
2,5 g Stickstoff je Liter Gärmedium entsprechenden Konzentration, Natrium-, Kalium-,
Magnesium-, Eisen-, Phosphat-, Sulfat-und Chlorionen in üblicher Konzentration,
ein wenig Pantothensäure und Biotin, Kobaltionen in einer Konzentration von 1 bis
2,5 mg je Liter Gärmedium enthält, pH 6,6 aufweist und sterilisiert ist, mit 10%
einer 3 bis 5 Tage alten Vorkultur des Propionibacterium-shermanii-Stammes 33 in
einem gleichartigen Gärmedium, das aber noch etwas Hefeextrakt enthält, beimpft,
während 10 bis 12 Tagen bei 28 bis 30° C bebrütet, wobei man fortlaufend total 5
bis 8 Volumprozent Zucker und etwa nach dem ersten Drittel der Gesamtbebrütungsdauer
5,6-Dimethylbenzimidazol, vorzugsweise in Form einer etwa 70%igen alkoholischen
Lösung, bis zu einer Konzentration von etwa 20 mg pro Liter Gärmedium zusetzt, die
Bakterienmasse alsdann von der Gärflüssigkeit abtrennt, in Wasser suspendiert, auf
etwa pH 6 stellt, einige Minuten im Autoklav auf 85 bis 120° C erhitzt und zentrifugiert,
diesen Extraktionsvorgang wiederholt, die vereinigten Zentrifugierfiltrateneutral
stellt, die darin enthaltenen Vitamine an Aktivkohle adsorbiert, daraus mittels
eines wäßrigen Alkohols, vorzugsweise Isopropanol, eluiert und in an sich bekannter
Weise aus den vereinigten Eluaten in kristallisierter Form gewinnt. Zweckmäßigerweise
wird die Extraktion der Bakterienmasse mit kleineren Wassermengen so lange wiederholt
(meist drei- bis viermal), bis der letzte Extrakt kaum noch gefärbt ist.
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Die nach dem obigen Verfahren erhältliche Gärbrühe kann als solche
mittels an sich bekannter Maßnahmen auf ein Vitamin B12 haltiges Konzentrat für
Futtermittelzwecke verarbeitet werden. Man kann aber auch die in der oben geschilderten
Weise gewonnene Vitamin B12 haltige Bakterienmasse für denselben Zweck verwenden.
Beispiel Man stellt 10l eines Mediums her, das folgende Bestandteile enthält: Ein
durch Säurehydrolyse von Casein gewonnenes Aminosäuregemisch, das insgesamt 10 g
Stickstoff enthält, ein durch tryptische Verdauung von Casein erhaltenes Aminosäuregemisch,
das insgesamt 15 g Stickstoff enthält, ferner je 16 g Na H2 P 04 und K3 P 04, 4
g Mg C12 - 6 H= O, 100 mg Fe S O4 - 7 H2 O, 120 mg Co S O4 - 7 H2 O, 40 mg Pantothensäure,
3 mg Biotin und 100 g technische Glucose. Nach der Einstellung eines pH-Wertes von
6,6 und Sterilisierung des Mediums beimpft man mit 1 1 einer Kultur des Propionibacterium-shermanii-Stammes
33 (ATCC Nr. 13 673), die 4 Tage bei 28 bis 30° C in einem gleichartigen Medium,
das aber je Liter noch 5 g Hefeextrakt enthält, gezüchtet worden war.
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Nach der Beimpfung bebrütet man den Gäransatz die ersten 2 Tage bei
30° C, sodann bei 28° C und stellt vom zweiten Gärtag an den pH-Wert täglich auf
6,6 ein. Nach dem Absinken des Zuckergehaltes unter 0,5"/o setzt man täglich konzentrierte
sterile Glucoselösung entsprechend etwa 1"/o des Mediums zu und hält so die
Gärung 10 Tage lang in Gang. Am fünften Gärtag versetzt man das Gärmedium mit 5,6-Dimethyl-benzimidazol
in 70%iger alkoholischer Lösung in einer Menge von 20 mg je Liter.
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Nach 12tägiger Gärdauer wird die Gärbrühe, die nun gemäß dem mikrobiologischen
Test eine Vitamin B12 Aktivität von 18,8 mg je Liter aufweist, zentrifugiert, wodurch
man 250 g Bakterienfeuchtmasse gewinnt. Man suspendiert dieselbe in 1 1 Wasser,
versetzt die Suspension mit 0,1 g Natriumsulfit, stellt auf pH 6,0 ein und erhitzt
15 Minuten auf 90° C. Nach dem Erkalten zentrifugiert man und wiederholt den Extraktionsprozeß
noch viermal mit kleineren Mengen Wasser. Man gewinnt so einen orangerotgefärbten
wäßrigen Extrakt in einer Menge von 20°/o des Volumens des ursprünglichen Gärmediums.
Nach Zusatz von 1% Aktivkohle (bezogen auf das Volumen) rührt man 1/2 Stunde. Durch
Zentrifugieren erhält man das Kohleadsorbat, das man anschließend achtmal jeweils
10 Minuten mit einer Mischung von 70 Volumprozent
Isopropanol, 25
V olumprozent Wasser und 5 Volumprozent Benzol bei Siedetemperatur eluiert. Man
erhält dabei ein reinrotgefärbtes Eluat in einer Menge von 8'% des Volumens des
ursprünglichen Mediums. Durch Destillation im Vakuum konzentriert man das Eluat
auf ein Zehntel des Volumens, also etwa 0,8% des Volumens des ursprünglichen Mediums.
Dieses Konzentrat enthält nun gemäß der spektrophotometrischen Messung 2,2 mg Vitamin
B12 je ml, also entsprechend 17,6 mg aus 1 1 des ursprünglichen Gärmediums. Durch
weitere Verarbeitung dieses Eluatkonzentrates erhält man 15,3 mg kristallisiertes
Cobalamin je 1 1 des ursprünglichen Mediums.