Verfahren zur Erzeugung von Vitamin B,2 durch Propionsäurebaliterien Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeu gung von Vitamin B12 durch Vergärung eines Kohle hydrate, Aminosäuren und Nährsalze enthaltenden Gärmediums mittels Propionibacterium shermanii Stamm 33.
Der Propionibacterium shermanii Stamm 33 wurde aus einer Quarkprobe in folgender Weise iso liert: <I>Anreicherungskultur</I> Je etwa 1 g Quark verschiedener Herkunft werden in Reagenzröhrchen mit je 10 em3 eines Nährmediums vermischt, das je Liter folgende Bestandteile enthält:
EMI0001.0014
10 <SEP> g <SEP> Glucose
<tb> 1,5 <SEP> g <SEP> Stickstoff <SEP> in <SEP> Form <SEP> eines <SEP> Casein-Proteoly sates
<tb> 1 <SEP> g <SEP> Stickstoff <SEP> in <SEP> Form <SEP> eines <SEP> Casein-Säure hydrolysates
<tb> 1,6 <SEP> g <SEP> NaH.P04
<tb> 1,6 <SEP> g <SEP> K3P04
<tb> 0,4 <SEP> g <SEP> MgCl2 <SEP> - <SEP> 6H20
<tb> 10 <SEP> mg <SEP> FeS04 <SEP> ' <SEP> 7H20
<tb> 12 <SEP> mg <SEP> C0S04 <SEP> - <SEP> 7H20
<tb> 4 <SEP> mg <SEP> Pantothensäure
<tb> 0,3 <SEP> mg <SEP> Biotin
<tb> 5 <SEP> g <SEP> Hefeextrakt.
Nach dem Einstellen eines pH-Wertes von 6,8 wird das Medium in üblicher Weise sterilisiert. Die abgefüllten je 10 cm3 Nährmedium überschichtet man mit etwas Paraffinöl. Man bebrütet nun in einem gründlich evakuierten Exsikkator vier bis fünf Tage bei 30 C in Gegenwart eines mit 101/aiger alkalischer Pyrogallollösung beschickten Schälchens. Durch diese Massnahmen wird das Aufkommen anderer Keime weitgehend unterdrückt.
Reinzüchtung Die Reinzüchtung der Kultur erfolgt vorteilhaft in der Hochschichtkultur (10 cm hoch, in Röhrchen) unter Benutzung desselben Nährbodens wie zuvor, der aber mit 2 % Agar verfestigt wird. Die verschiedenen Anreicherungskulturen werden für sich in steigender Verdünnung in den sterilen, verflüssigten Agar bei 40 C eingetragen und durch Rollen gut verteilt.
Man bebrütet nun die einzelnen Proben in der gleichen Weise wie oben beschrieben und wählt zur Isolierung jene Röhrchen aus, die nicht zu stark bewachsen sind, also gut getrennte Kolonien enthalten. Die ausgewähl ten Röhrchen werden kurz im Wasserbad erwärmt, so dass sich der Agarpfropfen in eine sterile Petrischale bringen lässt.
Man sticht dann einzeln liegende Kolo nien aus dem unteren Drittel des Pfropfens; wo die am strengsten anaeroben Bedingungen vorhanden waren, mit der Platinnadel aus, impft sie in ein glei ches Medium, wie es für die Gewinnung der Anrei cherungskultur verwendet worden war, über und kulti viert nun weiter unter streng anaeroben Bedingungen, wie eingangs für die Gewinnung der Anreicherungs kultur beschrieben.
Die so gewonnenen Proben werden auf ihr Ver mögen zur Bildung von Vitamin B12 Aktivität in übli cher Weise, z. B. mit Hilfe von E. coli, L. leichmanii oder Ochromonas malhamensis, geprüft. Man wählt nun die--- Kulturen mit dem höchsten Vitamin-B1.- Bildungsvermögen aus und wiederholt den Selektions- prozess, wie oben unter Reinzüchtung beschrieben.
Neugewonnene Reinkulturen sind zunächst gär- schwach. Erst im Verlauf weiterer Führung in flüs sigem Medium und hoher Schicht und bei Einhaltung streng anaerober Bedingungen wird das Wachstums und Gärvermögen erhöht, und die Vitamin-B12-Pro- duktion erreicht dann eine Höhe von mindestens 15 mg je Liter Gärmedium.
Folgende Arbeitsweise hat sich für die Erzielung 15 gärkräftiger Kulturen bewährt: Man beimpft das Nährmedium jeweils mit 1014, obiger Kultur durch überschichten. Die Luft über dem Medium verdrängt man mit Kohlensäure. Das Gärgefäss wird auf eine Atmosphäre Überdruck ge bracht.
Man bebrütet nun zwei Tage bei 30 C. Wäh- rend dieser Zeit wird die Glucose verbraucht und das pH sinkt auf 4,5. Mit einer gesättigten Na2C03 Lösung wird das pH auf 6,6 gebracht und l "/o Ghi- cose zugesetzt. Die Durchmischung wird mit Kohlen- säure, die ein steriles Wattefilter passiert und in fein verteilter Form durch das Medium geleitet wird, vor genommen.
Man bebrütet nun weitere zwei Tage bei 28 C, wobei das Medium wieder unter einer Atmo sphäre Druck steht. Durch diese Arbeitsweise wird schliesslich der hochleistungsfähige Stamm 33 heraus gezüchtet.
Der in der geschilderten Weise gewonnene Pro- pionibacterium-shermanii-Stamm 33 besitzt folgende Eigenschaften: Die Zellen der Kultur liegen in Diplo- form und in kurzen, höchstens viergliedrigen Ketten vor.
Bei Verwendung des beschriebenen Mediums, Einhaltung einer Impfgabe von i0"/o>, möglichst anaerober Gärführung, fortlaufender pH-Korrektur und Zuckerzugabe liegt die Grösse der Zellen noch unter 0,5,u. Im übrigen wurden bei der Identifizierung nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology alle für das Propionibacterium shermanii geforderten Charakteristika ermittelt. Der Stamm zeichnet sich durch besondere Gärfreudigkeit z.
B. im Glucose medium aus, vergärt aber Lactose im Gegensatz zu den Angaben Bergeys nur in geringem Masse und sehr zögernd.
Die besonderen Eigenschaften des Stammes 33, sein hohes Vitamin-B12 Bildungsvermögen, die unter der Norm liegende Grösse der Bakterienzellen und die rasche Zunahme der Bakteriendichte stellen sich erst nach zahlreichen Passagen in flüssigem Medium ein, wie oben geschildert.
Es ist vorteilhaft, die nach dem erfindungsge mässen Verfahren durchzuführende Gärung in einem sterilen Medium, das einen assimilierbaren Zucker, durch proteolytischen oder hydrolytischen Abbau von Proteinen gewonnene Aminosäuren, die üblichen Nährsalze, eine Kobaltquelle, Pantothensäure, Biotin und 5,6-Dimethylbenzimidazol enthält,
unter anaero ben Verhältnissen bei 28 bis 32 C unter fortlaufen dem oder zeitweisem weiterem Zusatz von Zucker und Einstellung des pH-Wertes auf 6 bis 7 wäh rend etwa zehn bis zwölf Tagen vor sich gehen zu lassen. Als Zucker bewähren sich insbesondere Glu cose, Invertzucker und Maltose. Für die Herstellung des Aminosäuregemisches können sowohl pflanzliche als auch tierische Eiweissstoffe verwendet werden, z. B. Weizen oder Maiskleber, Kartoffel- oder Soja proteine, Casein, Blutalbumin, Fischeiweiss usw.
Nach Beendigung der Gärung kann man die Bakterienmasse mit Vorteil alsdann durch Zentrifugieren oder Filtrie ren von der Gärlösung abtrennen und das gebildete Vitamin B12 daraus in an sich bekannter Weise iso lieren.
Eine besonders geeignete Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass man ein wässriges Gär- medium, das 1 bis 2 % eines vergärbaren Zuckers, z. B.
Glucose, Invertzucker oder Maltose, ein vor zugsweise aus Casein durch proteolytischen Abbau mittels Trypsin und durch Säurehydrolyse gewonnenes Aminosäuregemisch in einer etwa 2,5 g Stickstoff je Liter Gärmedium entsprechenden Konzentration, Na trium-, Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Phosphat-, Sul- phat- und Chlorionen in üblicher Konzentration, ein wenig Pantothensäure und Biotin, sowie Kobalt ent- hält, einen pH-Wert von 6,
6 aufweist und sterilisiert ist, mit 10'0/n einer drei bis fünf Tage alten Vorkultur des Propionibacterium-shermanii-Stammes 33 in einem gleichartigen Gärmedium, das aber noch etwas Hefe extrakt enthält, beimpft, während zehn bis zwölf Tagen bei 28 bis 30 C bebrütet, wobei man fortlau fend total 5 bis 8 Vol. /o Zucker und etwa nach dem ersten Drittel der Gesamtbebrütungsdauer 5,6-Di- methyl-benzimidazol, vorzugsweise in Form einer etwa 70 o/oaigen alkoholischen Lösung,
bis zu einer Konzentration von etwa 20 mg pro Liter Gärmedium zusetzt, die Bakterienmasse alsdann von der Gär- flüssigkeit abtrennt, in Wasser suspendiert, auf etwa pH 6 stellt, einige Minuten auf 85 bis 120 C erhitzt und zentrifugiert, die vereinigten Zentrifugierfiltrate neutral stellt, die darin enthaltenen Vitamine an Aktivkohle adsorbiert, daraus mittels eines wässrigen Alkohols, vorzugsweise Isopropanol, eluiert und in an sich bekannter Weise aus den vereinigten Eluaten in kristallisierter Form gewinnt.
Zweckmässigerweise wird die Extraktion der Bakterienmasse mit kleineren Wassermengen so lange wiederholt (meist 3- bis 4mal), bis der letzte Extrakt kaum noch gefärbt ist.
Nach erfolgter Kultivierung der genannten Bakte rien kann die Gärbrühe als solche mittels an sich be kannten Massnahmen auf ein Vitamin-B12 haltiges Konzentrat für Futtermittelzwecke verarbeitet werden. Man kann aber auch die in der oben geschilderten Weise gewonnene Vitamin-B12 haltige Bakterienmasse für den selben Zweck verwenden.
<I>Beispiel</I> Man stellt ein Medium her, das je Liter folgende Bestandteile enthält: Ein durch Säurehydrolyse von Casein gewonnenes Aminosäuregemisch, entsprechend einem Stickstoffgehalt von 1 g/L, ein durch tryptische Verdauung von Casein erhaltenes Aminosäuregemisch entsprechend einem Stickstoffgehalt von 1,5 g/L, fer ner je 1,6g NaH2P04 und K.P04, 0,4g MgCl2 - 6H20, 10 mg FeS04 - 7H20,
12 mg C0S04 - 7H20, 4 mg Pantothensäure, 0,3 mg Biotin und 10 g technische Glucose. Nach der Einstellung eines pH-Wertes von 6,6 und Sterilisierung des Mediums beimpft man mit 10 % des Volumens einer Kultur des Propionibac- terium-shermanii-Stammes 33, die vier Tage lang bei 28 bis 30 in einem gleichartigen Medium, das aber je Liter noch 5 g Hefeextrakt enthält, gezüchtet wor den war.
Nach der Beimpfung bebrütet man den Gäransatz die ersten zwei Tage bei 30 , sodann bei 28 und stellt vom zweiten Gärtag an den pH-Wert täglich auf 6,6 ein. Nach dem Absinken des Zuckergehaltes unter 0,
5 % setzt man täglich konzentrierte sterile Glucose- lösung entsprechend etwa 1% des Mediums zu und hält so die Gärung zehn Tage lang in Gang.
Am fünf ten Gärtag versetzt man das Gärmedium mit 5,6- Dimethylbenzimidazol in 70 /oiger alkoholischer Lösung in einer Menge von 20 mg je Liter.
Nach zwölftägiger Gärdauer wird die Gärbrühe, die nun gemäss dem mikrobiologischen Test eine Vitamin-B12-Aktivität von 18,8 mg je Liter aufweist, zentrifugiert, wodurch man je Liter 25 g Bakterien feuchtmasse gewinnt. Man suspendiert dieselbe in Wasser (1 Liter Wasser für je 250 g Bakterienmasse), versetzt die Suspension mit 0,1 g Natriumsulfit je Liter, stellt auf pH 6,0 ein und erhitzt 15 Minuten auf 90 C. Nach dem Erkalten zentrifugiert man und wiederholt den Extraktionsprozess noch viermal mit kleineren Mengen Wasser.
Man gewinnt so einen orangerot gefärbten wässrigen Extrakt in einer Menge von 20'% des Volumens des ursprünglichen Gär- mediums. Nach Zusatz von 1 @% Aktivkohle (bezogen auf das Volumen) rührt man 1/, Stunde.
Durch Zentri fugieren erhält man das Kohleadsorbat, das man anschliessend achtmal jeweils 10 Minuten mit einer Mischung von 70 Vol. II/o Isopropanol, 25 Vol. 11/o Wasser und 5 Vol. 1/o Benzol bei Siedetemperatur eluiert. Man erhält dabei ein rein rot gefärbtes Eluat in einer Menge von 8 0/11 des Volumens des ursprüng lichen Mediums. Durch Destillation im Vakuum kon zentriert man das Eluat auf i/10 des Volumens, also etwa 0;8 0/11 des Volumens des ursprünglichen Mediums.
Dieses Konzentrat enthält nun gemäss der spektrophotometrischen Messung 2,2 mg Vitamin B12 je cm3, also entsprechend 17,6 mg aus 1 Liter des ursprünglichen Gärmediums. Durch weitere Verar beitung dieses Eluatkonzentrates erhält man 15,3 mg kristallisiertes Cobalamin aus je 1 Liter des ursprüng lichen Mediums.