CH373865A - Verfahren zur Erzeugung von Vitamin B12 durch Propionsäurebakterien - Google Patents

Description

  Verfahren zur Erzeugung von     Vitamin        B,2    durch     Propionsäurebaliterien       Die Erfindung     betrifft    ein Verfahren zur Erzeu  gung von     Vitamin    B12 durch Vergärung eines Kohle  hydrate,     Aminosäuren    und Nährsalze enthaltenden       Gärmediums    mittels     Propionibacterium        shermanii     Stamm 33.  



  Der     Propionibacterium        shermanii    Stamm 33  wurde aus einer Quarkprobe in folgender Weise iso  liert:  <I>Anreicherungskultur</I>  Je etwa 1 g Quark verschiedener Herkunft werden  in     Reagenzröhrchen    mit je 10     em3    eines Nährmediums  vermischt, das je Liter folgende Bestandteile enthält:

    
EMI0001.0014     
  
    10 <SEP> g <SEP> Glucose
<tb>  1,5 <SEP> g <SEP> Stickstoff <SEP> in <SEP> Form <SEP> eines <SEP> Casein-Proteoly  sates
<tb>  1 <SEP> g <SEP> Stickstoff <SEP> in <SEP> Form <SEP> eines <SEP> Casein-Säure  hydrolysates
<tb>  1,6 <SEP> g <SEP> NaH.P04
<tb>  1,6 <SEP> g <SEP> K3P04
<tb>  0,4 <SEP> g <SEP> MgCl2 <SEP> - <SEP> 6H20
<tb>  10 <SEP> mg <SEP> FeS04 <SEP> ' <SEP> 7H20
<tb>  12 <SEP> mg <SEP> C0S04 <SEP> - <SEP> 7H20
<tb>  4 <SEP> mg <SEP> Pantothensäure
<tb>  0,3 <SEP> mg <SEP> Biotin
<tb>  5 <SEP> g <SEP> Hefeextrakt.

         Nach dem Einstellen eines     pH-Wertes    von 6,8  wird das Medium in üblicher Weise     sterilisiert.    Die  abgefüllten je 10     cm3        Nährmedium        überschichtet    man  mit etwas Paraffinöl. Man bebrütet nun in einem  gründlich evakuierten     Exsikkator    vier bis fünf Tage bei  30  C in Gegenwart eines     mit        101/aiger    alkalischer       Pyrogallollösung    beschickten Schälchens. Durch diese  Massnahmen wird das     Aufkommen    anderer Keime  weitgehend unterdrückt.

           Reinzüchtung     Die     Reinzüchtung    der Kultur erfolgt vorteilhaft  in der     Hochschichtkultur    (10 cm hoch, in Röhrchen)  unter Benutzung desselben     Nährbodens    wie zuvor, der  aber mit 2 %     Agar    verfestigt wird. Die verschiedenen  Anreicherungskulturen werden für sich in steigender  Verdünnung     in    den sterilen,     verflüssigten        Agar    bei  40  C eingetragen und durch Rollen gut verteilt.

   Man  bebrütet nun die     einzelnen    Proben in der gleichen  Weise wie oben beschrieben und wählt zur Isolierung  jene Röhrchen aus, die nicht zu stark bewachsen sind,  also gut getrennte Kolonien enthalten. Die ausgewähl  ten Röhrchen werden kurz im Wasserbad     erwärmt,     so dass sich der     Agarpfropfen    in eine     sterile        Petrischale     bringen lässt.

   Man sticht dann einzeln liegende Kolo  nien aus dem unteren Drittel des Pfropfens; wo die  am strengsten anaeroben Bedingungen vorhanden  waren, mit der Platinnadel aus, impft sie in ein glei  ches Medium, wie es für die Gewinnung der Anrei  cherungskultur verwendet worden war, über und kulti  viert nun weiter unter streng anaeroben     Bedingungen,     wie eingangs für die Gewinnung der Anreicherungs  kultur beschrieben.  



  Die so gewonnenen Proben werden auf ihr Ver  mögen zur Bildung von Vitamin     B12    Aktivität     in    übli  cher Weise, z. B. mit Hilfe von E.     coli,    L.     leichmanii     oder     Ochromonas        malhamensis,        geprüft.    Man wählt  nun die--- Kulturen mit dem höchsten     Vitamin-B1.-          Bildungsvermögen    aus und wiederholt den     Selektions-          prozess,    wie oben unter      Reinzüchtung     beschrieben.  



       Neugewonnene    Reinkulturen sind zunächst     gär-          schwach.    Erst im Verlauf weiterer Führung in flüs  sigem Medium und hoher Schicht und bei Einhaltung  streng anaerober Bedingungen wird das Wachstums  und Gärvermögen erhöht, und die Vitamin-B12-Pro-           duktion    erreicht dann eine Höhe von mindestens  15 mg je Liter     Gärmedium.     



  Folgende Arbeitsweise hat sich für die Erzielung  15 gärkräftiger Kulturen bewährt:  Man beimpft das     Nährmedium    jeweils mit 1014,  obiger Kultur durch     überschichten.    Die Luft über  dem Medium verdrängt man mit Kohlensäure. Das  Gärgefäss wird auf eine Atmosphäre Überdruck ge  bracht.

   Man bebrütet nun zwei Tage bei 30  C.     Wäh-          rend    dieser Zeit wird die Glucose verbraucht und  das     pH    sinkt auf 4,5.     Mit    einer gesättigten     Na2C03     Lösung wird das     pH    auf 6,6 gebracht und l     "/o        Ghi-          cose    zugesetzt. Die     Durchmischung    wird mit     Kohlen-          säure,    die ein steriles     Wattefilter    passiert und in fein       verteilter    Form durch das Medium geleitet wird, vor  genommen.

   Man     bebrütet    nun weitere zwei Tage bei       28     C, wobei das Medium wieder unter einer Atmo  sphäre Druck steht. Durch diese Arbeitsweise wird  schliesslich der hochleistungsfähige Stamm 33 heraus  gezüchtet.  



  Der in der geschilderten Weise gewonnene     Pro-          pionibacterium-shermanii-Stamm    33 besitzt folgende  Eigenschaften: Die Zellen der Kultur liegen in     Diplo-          form    und in     kurzen,    höchstens viergliedrigen Ketten  vor.

   Bei Verwendung des beschriebenen Mediums,  Einhaltung einer Impfgabe von     i0"/o>,    möglichst  anaerober     Gärführung,    fortlaufender     pH-Korrektur     und Zuckerzugabe liegt die Grösse der Zellen noch  unter     0,5,u.        Im    übrigen wurden bei der Identifizierung  nach     Bergeys    Manual of     Determinative        Bacteriology     alle für das     Propionibacterium        shermanii    geforderten       Charakteristika    ermittelt. Der Stamm zeichnet sich  durch besondere     Gärfreudigkeit    z.

   B.     im    Glucose  medium aus, vergärt aber     Lactose    im Gegensatz zu  den Angaben     Bergeys    nur in     geringem    Masse und sehr  zögernd.  



  Die besonderen     Eigenschaften    des Stammes 33,  sein hohes     Vitamin-B12    Bildungsvermögen, die unter  der Norm liegende Grösse der     Bakterienzellen    und die  rasche Zunahme der Bakteriendichte stellen sich erst  nach     zahlreichen    Passagen in flüssigem Medium ein,  wie oben geschildert.  



  Es ist vorteilhaft, die nach dem erfindungsge  mässen Verfahren durchzuführende Gärung in einem  sterilen Medium, das einen     assimilierbaren    Zucker,  durch     proteolytischen    oder hydrolytischen Abbau von  Proteinen gewonnene     Aminosäuren,    die üblichen  Nährsalze,     eine        Kobaltquelle,        Pantothensäure,        Biotin     und     5,6-Dimethylbenzimidazol        enthält,

      unter anaero  ben     Verhältnissen    bei 28 bis 32  C unter fortlaufen  dem oder zeitweisem weiterem Zusatz von Zucker  und Einstellung des     pH-Wertes    auf 6 bis 7 wäh  rend etwa zehn bis zwölf Tagen vor sich gehen zu  lassen. Als Zucker bewähren sich insbesondere Glu  cose,     Invertzucker    und     Maltose.    Für die Herstellung  des     Aminosäuregemisches    können sowohl pflanzliche  als auch tierische Eiweissstoffe verwendet werden,  z. B. Weizen oder Maiskleber, Kartoffel- oder Soja  proteine,     Casein,        Blutalbumin,        Fischeiweiss    usw.

   Nach  Beendigung der Gärung kann man die Bakterienmasse    mit Vorteil alsdann durch Zentrifugieren oder Filtrie  ren von der Gärlösung abtrennen und das gebildete  Vitamin     B12    daraus in an sich bekannter Weise iso  lieren.  



  Eine besonders geeignete Ausführungsform der  Erfindung besteht darin, dass man ein     wässriges        Gär-          medium,        das    1     bis    2     %        eines        vergärbaren        Zuckers,     z. B.

   Glucose,     Invertzucker    oder     Maltose,    ein vor  zugsweise aus Casein durch     proteolytischen    Abbau  mittels     Trypsin    und durch Säurehydrolyse gewonnenes       Aminosäuregemisch    in einer etwa 2,5 g Stickstoff je  Liter Gärmedium entsprechenden Konzentration, Na  trium-, Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Phosphat-,     Sul-          phat-    und Chlorionen in üblicher Konzentration, ein  wenig     Pantothensäure    und     Biotin,    sowie Kobalt     ent-          hält,    einen     pH-Wert    von 6,

  6 aufweist und sterilisiert ist,  mit     10'0/n    einer drei bis fünf Tage alten     Vorkultur    des       Propionibacterium-shermanii-Stammes    33 in einem  gleichartigen Gärmedium, das aber noch etwas Hefe  extrakt     enthält,    beimpft, während zehn bis zwölf  Tagen bei 28 bis 30  C bebrütet, wobei man fortlau  fend total 5 bis 8     Vol.         /o    Zucker und etwa nach dem  ersten Drittel der     Gesamtbebrütungsdauer        5,6-Di-          methyl-benzimidazol,    vorzugsweise in Form einer  etwa 70     o/oaigen    alkoholischen Lösung,

   bis zu einer  Konzentration von etwa 20 mg pro Liter     Gärmedium     zusetzt, die Bakterienmasse alsdann von der     Gär-          flüssigkeit    abtrennt, in Wasser suspendiert, auf etwa       pH    6 stellt, einige Minuten auf 85 bis 120  C erhitzt  und zentrifugiert, die vereinigten     Zentrifugierfiltrate     neutral stellt, die darin enthaltenen Vitamine an  Aktivkohle     adsorbiert,    daraus mittels eines     wässrigen     Alkohols, vorzugsweise     Isopropanol,        eluiert    und in an  sich bekannter Weise aus den vereinigten     Eluaten    in  kristallisierter Form gewinnt.

       Zweckmässigerweise          wird    die Extraktion der     Bakterienmasse    mit kleineren  Wassermengen so lange wiederholt (meist 3- bis 4mal),  bis der letzte Extrakt kaum noch gefärbt ist.  



  Nach erfolgter Kultivierung der genannten Bakte  rien kann die Gärbrühe als solche mittels an sich be  kannten Massnahmen auf ein     Vitamin-B12        haltiges     Konzentrat für     Futtermittelzwecke    verarbeitet werden.  Man kann aber auch die in der oben geschilderten  Weise gewonnene     Vitamin-B12        haltige    Bakterienmasse  für den selben Zweck verwenden.

      <I>Beispiel</I>  Man stellt ein Medium her, das je Liter folgende  Bestandteile enthält: Ein durch Säurehydrolyse von  Casein     gewonnenes        Aminosäuregemisch,    entsprechend  einem Stickstoffgehalt von 1     g/L,    ein durch     tryptische     Verdauung von Casein erhaltenes     Aminosäuregemisch     entsprechend einem Stickstoffgehalt von 1,5     g/L,    fer  ner je 1,6g     NaH2P04    und     K.P04,        0,4g        MgCl2    -     6H20,     10 mg     FeS04    -     7H20,

      12 mg     C0S04    -     7H20,    4 mg       Pantothensäure,    0,3 mg     Biotin    und 10 g technische  Glucose. Nach der Einstellung eines     pH-Wertes    von  6,6 und Sterilisierung des Mediums beimpft man mit  10 % des Volumens einer Kultur des     Propionibac-          terium-shermanii-Stammes    33, die vier Tage lang bei      28 bis 30  in einem gleichartigen Medium, das aber  je Liter noch 5 g Hefeextrakt enthält, gezüchtet wor  den war.  



  Nach der     Beimpfung    bebrütet man den Gäransatz  die ersten zwei Tage bei 30 , sodann bei 28  und stellt  vom zweiten Gärtag an den     pH-Wert    täglich auf 6,6  ein. Nach dem Absinken des Zuckergehaltes unter       0,

  5        %        setzt        man        täglich        konzentrierte        sterile        Glucose-          lösung        entsprechend        etwa        1%        des        Mediums        zu        und     hält so die Gärung zehn Tage lang in Gang.

   Am fünf  ten Gärtag versetzt man das Gärmedium mit     5,6-          Dimethylbenzimidazol    in     70 /oiger        alkoholischer     Lösung in einer Menge von 20 mg je Liter.  



  Nach zwölftägiger Gärdauer wird die Gärbrühe,  die nun gemäss dem mikrobiologischen Test eine       Vitamin-B12-Aktivität    von 18,8 mg je Liter aufweist,  zentrifugiert, wodurch man je Liter 25 g Bakterien  feuchtmasse gewinnt. Man suspendiert dieselbe in  Wasser (1 Liter Wasser für je 250 g     Bakterienmasse),     versetzt die Suspension mit 0,1 g     Natriumsulfit    je  Liter, stellt auf     pH    6,0 ein und erhitzt 15 Minuten  auf 90  C. Nach dem     Erkalten        zentrifugiert    man und  wiederholt den     Extraktionsprozess    noch viermal mit  kleineren Mengen Wasser.

   Man gewinnt so einen  orangerot gefärbten     wässrigen    Extrakt in einer Menge       von        20'%        des        Volumens        des        ursprünglichen        Gär-          mediums.        Nach        Zusatz        von    1     @%        Aktivkohle        (bezogen     auf das Volumen) rührt man     1/,    Stunde.

   Durch Zentri  fugieren erhält man das     Kohleadsorbat,    das man  anschliessend achtmal jeweils 10 Minuten mit einer  Mischung von 70     Vol.        II/o        Isopropanol,    25     Vol.    11/o  Wasser und 5     Vol.        1/o    Benzol bei Siedetemperatur       eluiert.    Man erhält dabei ein rein rot gefärbtes     Eluat     in einer Menge von 8 0/11 des Volumens des ursprüng  lichen Mediums. Durch Destillation im Vakuum kon  zentriert man das     Eluat    auf     i/10    des Volumens, also  etwa 0;8 0/11 des Volumens des ursprünglichen  Mediums.

   Dieses Konzentrat enthält nun gemäss der       spektrophotometrischen    Messung 2,2 mg Vitamin     B12     je     cm3,    also entsprechend 17,6 mg aus 1 Liter des  ursprünglichen     Gärmediums.    Durch weitere Verar  beitung dieses     Eluatkonzentrates    erhält man 15,3 mg  kristallisiertes     Cobalamin    aus je 1 Liter des ursprüng  lichen Mediums.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12, da durch gekennzeichnet, dass man Propionibacterium shermanii Stamm 33 in einem Kohlehydrate, Amino- säuren und Nährsalze enthaltenden Gärmedium kulti viert. UNTERANSPRACHE 1.

   Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem sterilen Medium, das einen assimilierbaren Zucker, ein durch proteoly- tischen oder hydrolytischen Abbau von Proteinen gewonnenes Aminosäuregemisch, ein Kobaltsalz und andere Nährsalze, Pantothensäure, Biotin und 5,6- Dimethylbenzimidazol enthält,

   anaerob bei 28 bis 32 C fortlaufend oder mit Unterbrechungen unter weiterem Zusatz von Zucker bei einem pH-Wert von 6 bis 7 während etwa zehn bis zwölf Tagen kultiviert. 2. Verfahren gemäss Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bakterienmasse durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der Gärlösung ab trennt und das gebildete Vitamin daraus isoliert. 3.

   Verfahren gemäss den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein sterilisiertes, wässriges Gärmedium, das 1 bis 2111/o Zucker, aus Casein gewonnene Aminosäuren entsprechend etwa 2,5 g assimilierbarem Stickstoff je Liter Gärmedium, Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Phosphat-, Sulfat- und Chlorionen, ein wenig Pantothensäure und Biotin, Kobaltionen in einer Konzentration von 1 bis 2,5 mg pro Liter Gärmedium enthält, einen pH 6,6 aufweist,

   mit einer drei bis fünf Tage alten Kultur eines ausser dem Propionibacterium-shermanii- Stamm 33 noch etwas Hefeextrakt enthaltenden Gär- mediums gleicher Zusammensetzung, beimpft, bei 28 bis 30 während zehn bis zwölf Tagen bebrütet, wobei man fortlaufend total 5 bis 8 Vol. I0/11 Zucker 'und etwa nach dem ersten Drittel der Gesamtbebrü- tungsdauer 5,6-Dimethyl-benzimidazol, vorzugsweise in Form einer etwa 70o/oigen alkoholischen Lösung, bis zu einer Konzentration von etwa 20 mg pro Liter Gärflüssigkeit zusetzt,

   die Bakterienmasse alsdann von der Gärflüssigkeit abtrennt, nochmals in Wasser suspendiert, auf etwa pH 6 stellt, einige Minuten im Autoklaven auf 85 bis 120 C erhitzt und zentri fugiert, diesen Extraktionsvorgang nochmals wieder holt, die vereinigten Zentrifugierfiltrate neutral stellt, das darin enthaltene Vitamin B12 an Aktivkohle adsor- biert und daraus mittels eines wässrigen Alkohols, vor zugsweise Isopropanol,

   eluiert und aus den vereinigten Eluaten in kristallisierter Form gewinnt.