CH373865A

CH373865A - Process for the production of vitamin B12 by propionic acid bacteria

Info

Publication number: CH373865A
Application number: CH6772058A
Authority: CH
Inventors: Becher Elisabeth; Bernhauer Konrad Dr Prof; Wilharm Georg
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1958-12-24
Filing date: 1958-12-24
Publication date: 1963-12-15
Also published as: BE585465A; ES254882A1

Description

  

  Verfahren zur Erzeugung von     Vitamin        B,2    durch     Propionsäurebaliterien       Die Erfindung     betrifft    ein Verfahren zur Erzeu  gung von     Vitamin    B12 durch Vergärung eines Kohle  hydrate,     Aminosäuren    und Nährsalze enthaltenden       Gärmediums    mittels     Propionibacterium        shermanii     Stamm 33.  



  Der     Propionibacterium        shermanii    Stamm 33  wurde aus einer Quarkprobe in folgender Weise iso  liert:  <I>Anreicherungskultur</I>  Je etwa 1 g Quark verschiedener Herkunft werden  in     Reagenzröhrchen    mit je 10     em3    eines Nährmediums  vermischt, das je Liter folgende Bestandteile enthält:

    
EMI0001.0014     
  
    10 <SEP> g <SEP> Glucose
<tb>  1,5 <SEP> g <SEP> Stickstoff <SEP> in <SEP> Form <SEP> eines <SEP> Casein-Proteoly  sates
<tb>  1 <SEP> g <SEP> Stickstoff <SEP> in <SEP> Form <SEP> eines <SEP> Casein-Säure  hydrolysates
<tb>  1,6 <SEP> g <SEP> NaH.P04
<tb>  1,6 <SEP> g <SEP> K3P04
<tb>  0,4 <SEP> g <SEP> MgCl2 <SEP> - <SEP> 6H20
<tb>  10 <SEP> mg <SEP> FeS04 <SEP> ' <SEP> 7H20
<tb>  12 <SEP> mg <SEP> C0S04 <SEP> - <SEP> 7H20
<tb>  4 <SEP> mg <SEP> Pantothensäure
<tb>  0,3 <SEP> mg <SEP> Biotin
<tb>  5 <SEP> g <SEP> Hefeextrakt.

         Nach dem Einstellen eines     pH-Wertes    von 6,8  wird das Medium in üblicher Weise     sterilisiert.    Die  abgefüllten je 10     cm3        Nährmedium        überschichtet    man  mit etwas Paraffinöl. Man bebrütet nun in einem  gründlich evakuierten     Exsikkator    vier bis fünf Tage bei  30  C in Gegenwart eines     mit        101/aiger    alkalischer       Pyrogallollösung    beschickten Schälchens. Durch diese  Massnahmen wird das     Aufkommen    anderer Keime  weitgehend unterdrückt.

           Reinzüchtung     Die     Reinzüchtung    der Kultur erfolgt vorteilhaft  in der     Hochschichtkultur    (10 cm hoch, in Röhrchen)  unter Benutzung desselben     Nährbodens    wie zuvor, der  aber mit 2 %     Agar    verfestigt wird. Die verschiedenen  Anreicherungskulturen werden für sich in steigender  Verdünnung     in    den sterilen,     verflüssigten        Agar    bei  40  C eingetragen und durch Rollen gut verteilt.

   Man  bebrütet nun die     einzelnen    Proben in der gleichen  Weise wie oben beschrieben und wählt zur Isolierung  jene Röhrchen aus, die nicht zu stark bewachsen sind,  also gut getrennte Kolonien enthalten. Die ausgewähl  ten Röhrchen werden kurz im Wasserbad     erwärmt,     so dass sich der     Agarpfropfen    in eine     sterile        Petrischale     bringen lässt.

   Man sticht dann einzeln liegende Kolo  nien aus dem unteren Drittel des Pfropfens; wo die  am strengsten anaeroben Bedingungen vorhanden  waren, mit der Platinnadel aus, impft sie in ein glei  ches Medium, wie es für die Gewinnung der Anrei  cherungskultur verwendet worden war, über und kulti  viert nun weiter unter streng anaeroben     Bedingungen,     wie eingangs für die Gewinnung der Anreicherungs  kultur beschrieben.  



  Die so gewonnenen Proben werden auf ihr Ver  mögen zur Bildung von Vitamin     B12    Aktivität     in    übli  cher Weise, z. B. mit Hilfe von E.     coli,    L.     leichmanii     oder     Ochromonas        malhamensis,        geprüft.    Man wählt  nun die--- Kulturen mit dem höchsten     Vitamin-B1.-          Bildungsvermögen    aus und wiederholt den     Selektions-          prozess,    wie oben unter      Reinzüchtung     beschrieben.  



       Neugewonnene    Reinkulturen sind zunächst     gär-          schwach.    Erst im Verlauf weiterer Führung in flüs  sigem Medium und hoher Schicht und bei Einhaltung  streng anaerober Bedingungen wird das Wachstums  und Gärvermögen erhöht, und die Vitamin-B12-Pro-           duktion    erreicht dann eine Höhe von mindestens  15 mg je Liter     Gärmedium.     



  Folgende Arbeitsweise hat sich für die Erzielung  15 gärkräftiger Kulturen bewährt:  Man beimpft das     Nährmedium    jeweils mit 1014,  obiger Kultur durch     überschichten.    Die Luft über  dem Medium verdrängt man mit Kohlensäure. Das  Gärgefäss wird auf eine Atmosphäre Überdruck ge  bracht.

   Man bebrütet nun zwei Tage bei 30  C.     Wäh-          rend    dieser Zeit wird die Glucose verbraucht und  das     pH    sinkt auf 4,5.     Mit    einer gesättigten     Na2C03     Lösung wird das     pH    auf 6,6 gebracht und l     "/o        Ghi-          cose    zugesetzt. Die     Durchmischung    wird mit     Kohlen-          säure,    die ein steriles     Wattefilter    passiert und in fein       verteilter    Form durch das Medium geleitet wird, vor  genommen.

   Man     bebrütet    nun weitere zwei Tage bei       28     C, wobei das Medium wieder unter einer Atmo  sphäre Druck steht. Durch diese Arbeitsweise wird  schliesslich der hochleistungsfähige Stamm 33 heraus  gezüchtet.  



  Der in der geschilderten Weise gewonnene     Pro-          pionibacterium-shermanii-Stamm    33 besitzt folgende  Eigenschaften: Die Zellen der Kultur liegen in     Diplo-          form    und in     kurzen,    höchstens viergliedrigen Ketten  vor.

   Bei Verwendung des beschriebenen Mediums,  Einhaltung einer Impfgabe von     i0"/o>,    möglichst  anaerober     Gärführung,    fortlaufender     pH-Korrektur     und Zuckerzugabe liegt die Grösse der Zellen noch  unter     0,5,u.        Im    übrigen wurden bei der Identifizierung  nach     Bergeys    Manual of     Determinative        Bacteriology     alle für das     Propionibacterium        shermanii    geforderten       Charakteristika    ermittelt. Der Stamm zeichnet sich  durch besondere     Gärfreudigkeit    z.

   B.     im    Glucose  medium aus, vergärt aber     Lactose    im Gegensatz zu  den Angaben     Bergeys    nur in     geringem    Masse und sehr  zögernd.  



  Die besonderen     Eigenschaften    des Stammes 33,  sein hohes     Vitamin-B12    Bildungsvermögen, die unter  der Norm liegende Grösse der     Bakterienzellen    und die  rasche Zunahme der Bakteriendichte stellen sich erst  nach     zahlreichen    Passagen in flüssigem Medium ein,  wie oben geschildert.  



  Es ist vorteilhaft, die nach dem erfindungsge  mässen Verfahren durchzuführende Gärung in einem  sterilen Medium, das einen     assimilierbaren    Zucker,  durch     proteolytischen    oder hydrolytischen Abbau von  Proteinen gewonnene     Aminosäuren,    die üblichen  Nährsalze,     eine        Kobaltquelle,        Pantothensäure,        Biotin     und     5,6-Dimethylbenzimidazol        enthält,

      unter anaero  ben     Verhältnissen    bei 28 bis 32  C unter fortlaufen  dem oder zeitweisem weiterem Zusatz von Zucker  und Einstellung des     pH-Wertes    auf 6 bis 7 wäh  rend etwa zehn bis zwölf Tagen vor sich gehen zu  lassen. Als Zucker bewähren sich insbesondere Glu  cose,     Invertzucker    und     Maltose.    Für die Herstellung  des     Aminosäuregemisches    können sowohl pflanzliche  als auch tierische Eiweissstoffe verwendet werden,  z. B. Weizen oder Maiskleber, Kartoffel- oder Soja  proteine,     Casein,        Blutalbumin,        Fischeiweiss    usw.

   Nach  Beendigung der Gärung kann man die Bakterienmasse    mit Vorteil alsdann durch Zentrifugieren oder Filtrie  ren von der Gärlösung abtrennen und das gebildete  Vitamin     B12    daraus in an sich bekannter Weise iso  lieren.  



  Eine besonders geeignete Ausführungsform der  Erfindung besteht darin, dass man ein     wässriges        Gär-          medium,        das    1     bis    2     %        eines        vergärbaren        Zuckers,     z. B.

   Glucose,     Invertzucker    oder     Maltose,    ein vor  zugsweise aus Casein durch     proteolytischen    Abbau  mittels     Trypsin    und durch Säurehydrolyse gewonnenes       Aminosäuregemisch    in einer etwa 2,5 g Stickstoff je  Liter Gärmedium entsprechenden Konzentration, Na  trium-, Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Phosphat-,     Sul-          phat-    und Chlorionen in üblicher Konzentration, ein  wenig     Pantothensäure    und     Biotin,    sowie Kobalt     ent-          hält,    einen     pH-Wert    von 6,

  6 aufweist und sterilisiert ist,  mit     10'0/n    einer drei bis fünf Tage alten     Vorkultur    des       Propionibacterium-shermanii-Stammes    33 in einem  gleichartigen Gärmedium, das aber noch etwas Hefe  extrakt     enthält,    beimpft, während zehn bis zwölf  Tagen bei 28 bis 30  C bebrütet, wobei man fortlau  fend total 5 bis 8     Vol.         /o    Zucker und etwa nach dem  ersten Drittel der     Gesamtbebrütungsdauer        5,6-Di-          methyl-benzimidazol,    vorzugsweise in Form einer  etwa 70     o/oaigen    alkoholischen Lösung,

   bis zu einer  Konzentration von etwa 20 mg pro Liter     Gärmedium     zusetzt, die Bakterienmasse alsdann von der     Gär-          flüssigkeit    abtrennt, in Wasser suspendiert, auf etwa       pH    6 stellt, einige Minuten auf 85 bis 120  C erhitzt  und zentrifugiert, die vereinigten     Zentrifugierfiltrate     neutral stellt, die darin enthaltenen Vitamine an  Aktivkohle     adsorbiert,    daraus mittels eines     wässrigen     Alkohols, vorzugsweise     Isopropanol,        eluiert    und in an  sich bekannter Weise aus den vereinigten     Eluaten    in  kristallisierter Form gewinnt.

       Zweckmässigerweise          wird    die Extraktion der     Bakterienmasse    mit kleineren  Wassermengen so lange wiederholt (meist 3- bis 4mal),  bis der letzte Extrakt kaum noch gefärbt ist.  



  Nach erfolgter Kultivierung der genannten Bakte  rien kann die Gärbrühe als solche mittels an sich be  kannten Massnahmen auf ein     Vitamin-B12        haltiges     Konzentrat für     Futtermittelzwecke    verarbeitet werden.  Man kann aber auch die in der oben geschilderten  Weise gewonnene     Vitamin-B12        haltige    Bakterienmasse  für den selben Zweck verwenden.

      <I>Beispiel</I>  Man stellt ein Medium her, das je Liter folgende  Bestandteile enthält: Ein durch Säurehydrolyse von  Casein     gewonnenes        Aminosäuregemisch,    entsprechend  einem Stickstoffgehalt von 1     g/L,    ein durch     tryptische     Verdauung von Casein erhaltenes     Aminosäuregemisch     entsprechend einem Stickstoffgehalt von 1,5     g/L,    fer  ner je 1,6g     NaH2P04    und     K.P04,        0,4g        MgCl2    -     6H20,     10 mg     FeS04    -     7H20,

      12 mg     C0S04    -     7H20,    4 mg       Pantothensäure,    0,3 mg     Biotin    und 10 g technische  Glucose. Nach der Einstellung eines     pH-Wertes    von  6,6 und Sterilisierung des Mediums beimpft man mit  10 % des Volumens einer Kultur des     Propionibac-          terium-shermanii-Stammes    33, die vier Tage lang bei      28 bis 30  in einem gleichartigen Medium, das aber  je Liter noch 5 g Hefeextrakt enthält, gezüchtet wor  den war.  



  Nach der     Beimpfung    bebrütet man den Gäransatz  die ersten zwei Tage bei 30 , sodann bei 28  und stellt  vom zweiten Gärtag an den     pH-Wert    täglich auf 6,6  ein. Nach dem Absinken des Zuckergehaltes unter       0,

  5        %        setzt        man        täglich        konzentrierte        sterile        Glucose-          lösung        entsprechend        etwa        1%        des        Mediums        zu        und     hält so die Gärung zehn Tage lang in Gang.

   Am fünf  ten Gärtag versetzt man das Gärmedium mit     5,6-          Dimethylbenzimidazol    in     70 /oiger        alkoholischer     Lösung in einer Menge von 20 mg je Liter.  



  Nach zwölftägiger Gärdauer wird die Gärbrühe,  die nun gemäss dem mikrobiologischen Test eine       Vitamin-B12-Aktivität    von 18,8 mg je Liter aufweist,  zentrifugiert, wodurch man je Liter 25 g Bakterien  feuchtmasse gewinnt. Man suspendiert dieselbe in  Wasser (1 Liter Wasser für je 250 g     Bakterienmasse),     versetzt die Suspension mit 0,1 g     Natriumsulfit    je  Liter, stellt auf     pH    6,0 ein und erhitzt 15 Minuten  auf 90  C. Nach dem     Erkalten        zentrifugiert    man und  wiederholt den     Extraktionsprozess    noch viermal mit  kleineren Mengen Wasser.

   Man gewinnt so einen  orangerot gefärbten     wässrigen    Extrakt in einer Menge       von        20'%        des        Volumens        des        ursprünglichen        Gär-          mediums.        Nach        Zusatz        von    1     @%        Aktivkohle        (bezogen     auf das Volumen) rührt man     1/,    Stunde.

   Durch Zentri  fugieren erhält man das     Kohleadsorbat,    das man  anschliessend achtmal jeweils 10 Minuten mit einer  Mischung von 70     Vol.        II/o        Isopropanol,    25     Vol.    11/o  Wasser und 5     Vol.        1/o    Benzol bei Siedetemperatur       eluiert.    Man erhält dabei ein rein rot gefärbtes     Eluat     in einer Menge von 8 0/11 des Volumens des ursprüng  lichen Mediums. Durch Destillation im Vakuum kon  zentriert man das     Eluat    auf     i/10    des Volumens, also  etwa 0;8 0/11 des Volumens des ursprünglichen  Mediums.

   Dieses Konzentrat enthält nun gemäss der       spektrophotometrischen    Messung 2,2 mg Vitamin     B12     je     cm3,    also entsprechend 17,6 mg aus 1 Liter des  ursprünglichen     Gärmediums.    Durch weitere Verar  beitung dieses     Eluatkonzentrates    erhält man 15,3 mg  kristallisiertes     Cobalamin    aus je 1 Liter des ursprüng  lichen Mediums.



  The invention relates to a method for the production of vitamin B12 by fermentation of a fermentation medium containing carbohydrates, amino acids and nutrient salts by means of Propionibacterium shermanii strain 33.



  Propionibacterium shermanii strain 33 was isolated from a quark sample in the following way: <I> Enrichment culture </I> About 1 g of quark from different origins are mixed in test tubes with 10 em3 of a nutrient medium each containing the following components per liter:

    
EMI0001.0014
  
    10 <SEP> g <SEP> glucose
<tb> 1.5 <SEP> g <SEP> nitrogen <SEP> in <SEP> form <SEP> of a <SEP> casein proteolysate
<tb> 1 <SEP> g <SEP> nitrogen <SEP> in <SEP> form <SEP> of a <SEP> casein acid hydrolyzate
<tb> 1.6 <SEP> g <SEP> NaH.P04
<tb> 1.6 <SEP> g <SEP> K3P04
<tb> 0.4 <SEP> g <SEP> MgCl2 <SEP> - <SEP> 6H20
<tb> 10 <SEP> mg <SEP> FeS04 <SEP> '<SEP> 7H20
<tb> 12 <SEP> mg <SEP> C0S04 <SEP> - <SEP> 7H20
<tb> 4 <SEP> mg <SEP> pantothenic acid
<tb> 0.3 <SEP> mg <SEP> biotin
<tb> 5 <SEP> g <SEP> yeast extract.

         After adjusting the pH to 6.8, the medium is sterilized in the usual way. The filled 10 cm3 nutrient medium is covered with a little paraffin oil. Incubation is then carried out in a thoroughly evacuated desiccator for four to five days at 30 ° C. in the presence of a small dish filled with 101% alkaline pyrogallol solution. These measures largely suppress the emergence of other germs.

           Pure cultivation The pure cultivation of the culture takes place advantageously in the high layer culture (10 cm high, in tubes) using the same nutrient medium as before, but which is solidified with 2% agar. The different enrichment cultures are entered individually in increasing dilution into the sterile, liquefied agar at 40 ° C. and distributed well by rolling.

   The individual samples are then incubated in the same way as described above and, for isolation, those tubes are selected that are not overgrown, i.e. contain well-separated colonies. The selected tubes are briefly heated in a water bath so that the agar plug can be placed in a sterile Petri dish.

   You then prick individually lying colonies from the lower third of the plug; Where the most severe anaerobic conditions existed, use the platinum needle to inoculate it in a medium similar to that used to obtain the enrichment culture, and then continue to cultivate under strictly anaerobic conditions, as was done at the beginning for the production of the enrichment culture.



  The samples obtained in this way are on their Ver like to the formation of vitamin B12 activity in übli cher way, z. B. with the help of E. coli, L. leichmanii or Ochromonas malhamensis, checked. Now select the --- cultures with the highest vitamin B1 production capacity and repeat the selection process as described above under pure breeding.



       Newly obtained pure cultures are initially weak in fermentation. Only in the course of further management in a liquid medium and in a high layer and if strictly anaerobic conditions are observed will growth and fermentation capacity be increased and vitamin B12 production will then reach a level of at least 15 mg per liter of fermentation medium.



  The following working method has proven itself to achieve 15 cultures with strong fermentation: The nutrient medium is inoculated with 1014 each by layering the above culture. The air above the medium is displaced with carbonic acid. The fermentation vessel is brought to one atmosphere overpressure.

   Incubation is then carried out for two days at 30 ° C. During this time, the glucose is consumed and the pH sinks to 4.5. The pH is brought to 6.6 with a saturated Na2CO3 solution and 1/10 glacose is added. Mixing is carried out with carbonic acid, which is passed through a sterile cotton wool filter and passed through the medium in finely divided form.

   Incubation is then carried out for a further two days at 28 ° C., the medium being under atmospheric pressure again. This way of working ultimately results in the high-performance strain 33 being bred.



  The Propionibacterium shermanii strain 33 obtained in the manner described has the following properties: The cells of the culture are in dipole form and in short, at most four-membered chains.

   When using the medium described, adhering to an inoculation dose of 10 "/ o>, if possible anaerobic fermentation, continuous pH correction and sugar addition, the size of the cells is still below 0.5, and the rest of the identification according to Bergey's Manual of Determinative Bacteriology determined all of the characteristics required for Propionibacterium shermanii The strain is characterized by its particular ability to ferment, e.g.

   B. in the glucose medium, but in contrast to the information Bergeys fermented lactose only to a small extent and very hesitantly.



  The special properties of strain 33, its high vitamin B12 production capacity, the below-normal size of the bacterial cells and the rapid increase in bacterial density only become apparent after numerous passages in liquid medium, as described above.



  It is advantageous to carry out the fermentation according to the method according to the invention in a sterile medium which contains an assimilable sugar, amino acids obtained by proteolytic or hydrolytic degradation of proteins, the usual nutrient salts, a cobalt source, pantothenic acid, biotin and 5,6-dimethylbenzimidazole,

      under anaerobic conditions at 28 to 32 C with continuous or intermittent addition of sugar and adjustment of the pH value to 6 to 7 for about ten to twelve days. Glucose, invert sugar and maltose are particularly useful as sugars. Both vegetable and animal proteins can be used to produce the amino acid mixture, e.g. B. Wheat or corn gluten, potato or soy proteins, casein, blood albumin, fish protein, etc.

   After fermentation has ended, the bacterial mass can then advantageously be separated from the fermentation solution by centrifugation or filtration and the vitamin B12 formed can be isolated therefrom in a manner known per se.



  A particularly suitable embodiment of the invention consists in that an aqueous fermentation medium containing 1 to 2% of a fermentable sugar, e.g. B.

   Glucose, invert sugar or maltose, an amino acid mixture obtained preferably from casein by proteolytic degradation using trypsin and acid hydrolysis in a concentration corresponding to about 2.5 g nitrogen per liter of fermentation medium, sodium, potassium, magnesium, iron, phosphate , Sulphate and chlorine ions in the usual concentration, contains a little pantothenic acid and biotin, as well as cobalt, a pH value of 6,

  6 has and is sterilized, inoculated with 10'0 / n of a three to five day old preculture of Propionibacterium shermanii strain 33 in a similar fermentation medium, but which still contains some yeast extract, for ten to twelve days at 28 to 30 C, continuously adding a total of 5 to 8 vol. / O sugar and after about the first third of the total incubation period 5,6-dimethylbenzimidazole, preferably in the form of an approximately 70% alcoholic solution,

   up to a concentration of about 20 mg per liter of fermentation medium is added, the bacterial mass is then separated from the fermentation liquid, suspended in water, adjusted to about pH 6, heated to 85 to 120 C for a few minutes and centrifuged, the combined centrifugation filtrates neutral, the vitamins contained therein are adsorbed on activated charcoal, eluted therefrom by means of an aqueous alcohol, preferably isopropanol, and recovered in crystallized form from the combined eluates in a manner known per se.

       The extraction of the bacterial mass is expediently repeated with smaller amounts of water (usually 3 to 4 times) until the last extract is barely colored.



  After the cited bacteria have been cultivated, the fermentation broth as such can be processed into a concentrate containing vitamin B12 for feed purposes by means of measures known per se. However, the bacterial mass containing vitamin B12 obtained in the manner described above can also be used for the same purpose.

      <I> Example </I> A medium is prepared which contains the following components per liter: An amino acid mixture obtained by acid hydrolysis of casein, corresponding to a nitrogen content of 1 g / L, an amino acid mixture obtained by tryptic digestion of casein corresponding to a nitrogen content of 1.5 g / L, also 1.6g each of NaH2P04 and K.P04, 0.4g MgCl2 - 6H20, 10 mg FeS04 - 7H20,

      12 mg C0S04 - 7H20, 4 mg pantothenic acid, 0.3 mg biotin and 10 g technical glucose. After the pH has been adjusted to 6.6 and the medium has been sterilized, 10% of the volume of a culture of Propionibacterium shermanii strain 33 is inoculated for four days at 28 to 30 in a similar medium, but each Liter still contains 5 g of yeast extract.



  After the inoculation, the fermentation batch is incubated for the first two days at 30, then at 28, and from the second day of fermentation the pH is adjusted to 6.6 daily. After the sugar content has dropped below 0,

  Concentrated sterile glucose solution is added to 5% daily, corresponding to about 1% of the medium, and fermentation is kept going for ten days.

   On the fifth day of fermentation, the fermentation medium is mixed with 5,6-dimethylbenzimidazole in 70% alcoholic solution in an amount of 20 mg per liter.



  After a fermentation period of twelve days, the fermentation broth, which according to the microbiological test now has a vitamin B12 activity of 18.8 mg per liter, is centrifuged, whereby 25 g of moist bacteria are obtained per liter. It is suspended in water (1 liter of water for 250 g of bacterial mass each time), 0.1 g of sodium sulfite per liter is added to the suspension, the pH is adjusted to 6.0 and the mixture is heated to 90 ° C. for 15 minutes. After cooling, it is centrifuged and repeated repeat the extraction process four times with smaller amounts of water.

   In this way an orange-red colored aqueous extract is obtained in an amount of 20% of the volume of the original fermentation medium. After adding 1% activated charcoal (based on the volume), the mixture is stirred for 1/1 hour.

   Centrifugation gives the carbon adsorbate, which is then eluted eight times for 10 minutes each time with a mixture of 70 vol. II / o isopropanol, 25 vol. 11 / o water and 5 vol. 1 / o benzene at the boiling point. A purely red-colored eluate is obtained in an amount of 80/11 of the volume of the original medium. The eluate is concentrated to 1/10 of the volume by distillation in vacuo, that is to say about 0.8% of the volume of the original medium.

   According to the spectrophotometric measurement, this concentrate now contains 2.2 mg of vitamin B12 per cm3, i.e. 17.6 mg from 1 liter of the original fermentation medium. Further processing of this eluate concentrate gives 15.3 mg of crystallized cobalamin from 1 liter of the original medium.

Claims

PATENT CLAIM Process for the production of vitamin B12, characterized in that Propionibacterium shermanii strain 33 is cultivated in a fermentation medium containing carbohydrates, amino acids and nutrient salts. SUB-TALK 1.

Method according to claim, characterized in that in a sterile medium which contains an assimilable sugar, an amino acid mixture obtained by proteolytic or hydrolytic degradation of proteins, a cobalt salt and other nutrient salts, pantothenic acid, biotin and 5,6-dimethylbenzimidazole,

Cultivated anaerobically at 28 to 32 C continuously or intermittently with further addition of sugar at a pH of 6 to 7 for about ten to twelve days. 2. The method according to dependent claim 1, characterized in that the bacterial mass is separated from the fermentation solution by centrifugation or filtration and the vitamin formed is isolated therefrom. 3.

Process according to dependent claims 1 and 2, characterized in that a sterilized, aqueous fermentation medium containing 1 to 2111 / o sugar, amino acids obtained from casein corresponding to about 2.5 g of assimilable nitrogen per liter of fermentation medium, sodium, potassium, magnesium -, iron, phosphate, sulfate and chlorine ions, a little pantothenic acid and biotin, contains cobalt ions in a concentration of 1 to 2.5 mg per liter of fermentation medium, has a pH of 6.6,

with a three to five-day-old culture of a fermentation medium of the same composition containing some yeast extract in addition to Propionibacterium shermanii strain 33, incubated at 28 to 30 for ten to twelve days, continuously adding a total of 5 to 8 vol / 11 sugar 'and after about the first third of the total incubation period 5,6-dimethylbenzimidazole, preferably in the form of a 70% alcoholic solution, up to a concentration of about 20 mg per liter of fermentation liquid,

The bacterial mass is then separated from the fermentation liquid, suspended again in water, adjusted to about pH 6, heated for a few minutes in the autoclave to 85 to 120 C and centrifuged, this extraction process repeated again, the combined centrifugation filtrates neutral, the vitamin B12 contained therein adsorbed on activated carbon and from it by means of an aqueous alcohol, preferably isopropanol,

eluted and recovered from the combined eluates in crystallized form.