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Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure und ihrer
Salze durch Fermentation. Die Erfindung be- steht im wesentlichen in der Züchtung be- stimmter Stämme von Mikroorganismen der
Gattung Bacillus in einem Zucker sowie stickstoffhaltige und anorganische Stoffe enthaltenden Kulturmedium, unter solchen Bedingungen, dass sich darin eine grosse Menge 1-Glutaminsäure oder deren Salze anreichert, die dann daraus gewonnen werden. Es ist bekannt, dass bei der Züchtung von Mikroorganismen in einem geeigneten Medium verschiedene Aminosäuren entstehen. Die so erzeugte Menge ist jedoch sehr klein und es wurde noch nicht darüber berichtet, dass irgendeine spezielle Aminosäure durch Fermentation in grosser Menge in einem Medium angereichert werden konnte.
Der Grund, dass sich Aminosäuren in einem biologischen System so schwer anreichern lassen, liegt darin, dass die Aminosäuren die Komponenten von Proteinen sind und eine in einem Medium einmal gebildete Aminosäure dazu neigt, leicht wieder Proteine, Polypeptide usw. zurückzubilden oder die Säure wird durch verschiedene biochemische Reaktionen in andere Substanzen übergeführt oder zersetzt. Mit andern Worten, eine Aminosäure kann in einem Kulturmedium nur schwer in monomeren Zustand angereichert werden.
Unter dem Ausdruck monomerer Zustand" wird hier der monomolekulare Zustand als freie Säure oder als Salz verstanden.
Dies ist der Grund, warum ein Fermentationsprozess, also die unmittelbare Ausnützung der biochemischen Aktivität lebender Mikroorganismen, bisher noch nicht für die Biosynthese und Anreicherung von 1-Glutaminsäure vorgeschlagen wurde. Die bekannte Biosynthese wird in einem enzymatischen System durchgeführt, d. h. es wird eine besondere Enzymart aus Mikroorganismen oder aus tierischen oder pflanzlichen Geweben extrahiert und mit geeigneten Substraten in Reaktion gebracht, z. B. mit oc-Ketoglutarsäure und Ammoniumverbindungen unter sehr engen Reaktionsbedingungen, wie dies in der deutschen Patentschrift Nr. 931582 und der USA-Patentschrift Nr. 2, 749, 274 beschrieben ist, wobei diese Reaktionen unter anaeroben Bedingungen durchgeführt werden.
Anderseits ist es bekannt, dass bestimmte Mikroorganismen oc-Ketoglutarsäure aus Kohlehydraten unter aeroben Bedingungen bilden können, wie dies beispielsweise in den USA-Patentschriften Nr. 2, 443, 919 und 2, 724, 680 beschrieben ist.
Es sind daher zwei verschiedene Verfahrensschritte notwendig, um 1-Glutaminsäure aus Kohlehydraten herstellen zu können, u. zw. ein unter aeroben Bedingungen verlaufender Verfahrensschritt zur Herstellung von K-Ketoglutar- säure aus Kohlehydraten und ein unter anaeroben Bedingungen verlaufender Verfahrensschritt zur Herstellung von 1-Glutaminsäure aus oc- Keto- glutarsäure. Die direkte Erzeugung von 1Glutaminsäure aus Kohlehydraten unter Verwendung eines bestimmten Mikroorganismus unter aeroben Fermentationsbedingungen war bisher nicht bekannt.
Es wurde nun gefunden, dass eine grosse Menge 1-Glutaminsäure direkt aus Kohlehydraten gebildet werden kann, wenn man einen Mikroorganismus verwendet, welcher die später beschriebenen zwei biochemischen Bedingungen erfüllt. Bei Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich, 1-Glutaminsäure in einem einstufigen Verfahren direkt aus Kohlehydraten herzustellen.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird eine wesentliche Menge 1-Glutaminsäure bei der Kultivierung von bestimmten Stämmen von Mikroorganismen der Gattung Bacillus in einem flüssigen Medium direkt erzeugt.
Dabei werden grosse Mengen l-Glutaminsäure im monomeren Zustand im flüssigen Medium angesammelt.
Nebenreaktionen, die während der Züchtung von Organismen der Gattung Bacillus in einem flüssigen Medium vor sich gehen, z. B. eine Polymerisation oder Zersetzung von 1-Glutaminsäure, werden beim erfindungsgemässen Verfahren weitgehend unterdrückt.
Die im flüssigen Medium angereicherte 1Glutaminsäure ist zufolge ihres monomeren Zustandes leicht zu gewinnen.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird ein Stamm der Gattung Bacillus mit be- sonderen, im folgenden angegebenen biochemischen Eigenschaften in einem flüssigen Medium inokuliert. Während der Fermentation wird
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der pH-Wert dieses Mediums auf etwa 6-9 eingestellt und auf dieser Höhe gehalten, wo- durch eine grosse Menge 1-Glutaminsäure bzw. deren Salz gebildet wird, welche dann abgetrennt wird.
Es wurde gefunden, dass Stämme von Mikro- organismen, die für das Verfahren gemäss der
Erfindung brauchbar sind, zwei spezifisch bio- chemische Bedingungen erfüllen müssen ; sie müssen nämlich erstens oc-Ketoglutarsäure aus
Zucker erzeugen und zweitens müssen sie eine starke 1-Glutaminsäuere-Dehydrogenase-Aktivität haben und besonders für die Umkehrreaktion der erwähnten reversiblen enzymatischen Reaktion, das ist die reduktive Aminierung von cz-Ketoglutarsäure, stark aktiv sein.
Es wurden Mikroorganismen ausgewählt, die den erwähnten beiden biochemischen Bedingungen entsprechen und es wurde festgestellt, dass die Gattung Bacillus sich für die industrielle Anwendung sehr gut eignet.
Die Stärke der 1-Glutaminsäure-Dehydro- genase-Aktivität, besonders der Aktivität eines Stammes für die reduktive Aminierung von cz- Ketoglutarsäure, steht in engem Zusammenhang mit der Fähigkeit dieses Mikroorganismus 1-Glutaminsäure zu erzeugen. Diese biochemischen Eigenschaften eines Mikroorganismus sind für die Anreicherung von 1-Glutaminsäure besonders wichtig.
Ein Merkmal der Erfindung liegt auch in der Kontrolle des Fermentationsvorganges. Als
Kulturmedium kann irgendeine bekannte, für das Wachstum von Mikroorganismen der Gattung
Bacillus geeignete Zusammensetzung verwendet werden. Um einen kräftigen Kohlehydratmeta- bolismus durch den Mikroorganismus herbeizu- führen, können dem Kulturmedium verschiedene stickstoffhaltige Substanzen, anorganische Stoffe oder andere vom Organismus benötigte Stoffe zugesetzt werden. Durch den Kohlehydratmetabolismus neigen organische Säuren im allgemeinen dazu, sich anzureichern und das Medium sauer zu machen. Es wurde gefunden, dass die Erzeugung von 1-Glutaminsäure durch den pH-Wert des Mediums während des Fermentationsablaufes wesentlich beeinflusst wird. Die Erzeugung wird begünstigt, wenn der pH-Wert zwischen 6, 0 und 9, 0 gehalten wird.
Der optimale pH-Wert scheint zwischen etwa 7, 0 und 8, 5 zu liegen. Gemäss der Erfindung wird der pH-Wert durch Zusatz einer ein basisches Stickstoffradikal enthaltenden Verbindung auf 6, 5-8, 5 eingestellt und in dieser Höhe gehalten. So wird die gebildete < x-Ketoglutarsäure mit Ammoniumionen vereinigt, die aus den zugesetzten basischen Stickstoffradikalen stammen und es bildet sich 1-Glutaminsäure, u. zw.
durch die Wirkung der stark reduktiven Aminierung der im Mikroorganismus enthaltenen 1-Glutaminsäure-Dehydrgenase zufolge der letzteren und durch die Einhaltung eines optimalen pH-Bereiches werden die verschiedenen störenden Nebenreaktionen vermindert, so dass die Reak- tion der 1-Glutaminsäurebildung die Neben- reaktionen überwiegt und sich 1-Glutaminsäure in grossen Mengen anreichert.
Für die Neutralisation des Kulturmediums können verschiedene Wege eingeschlagen werden.
Dem Medium kann die notwendige Menge
Ammoniumionen zugeführt werden. Auch die kombinierte Anwendung von Ammoniumsalzen und Alkalien liegt im Rahmen des Verfahrens gemäss der Erfindung.
Versuch 1 : Verschiedene Mikroorganismen wurden hinsichtlich der erwähnten beiden bio- chemischen Bedingungen untersucht und ge- eignete davon ausgewählt. Auf die beiden spezifischen biochemischen Erfordernisse wurde wie folgt geprüft : Die Methode zur Feststellung der Fähigkeit, < x-Ketoglutarsäure aus zuckerhaltigen Materialien zu produzieren, ist in Fachkreisen wohl bekannt. Es wurde z. B. ein Stamm in einem flüssigen, Zucker und andere Nährstoffe enthaltenden Medium als Schüttelkultur gezüchtet. Die gewonnene Säure wurde durch Papier-Chromatographie geprüft ; nötigenfalls wurde auch eine quantitative Analyse durch Kolorimetrieren nach Friedemann-Haugen's durchgeführt.
Durch diese Probe wurden jene Mikroorganismen ausgewählt, die imstande waren, beträchtliche Mengen α-Ketoglutarsäure zu erzeugen.
Dann wurde die 1-Glutaminsäure-Dehydro- genase-Aktivität untersucht, besonders bezüglich der Stärke der reduktiven Aminierung von oc-Ketoglutarsäure. Die Probe wurde, wie noch beschrieben wird, durch Ammoniakabsorption in einer Reaktionsmischung durchgeführt, unter
Verwendung unverletzter Zellen oder des Mycels.
Die quantitative Prüfung Ammoniakabsorption wurde nach einer Methode ausgeführt, die in "Microdiffusion Analysis and Volumetric Error" (E. J. Conway, London Crosby Lockwood and
Son Ltd. 1950) beschrieben ist.
Der zu prüfende Mikroorganismus wurde als
Schüttelkultur gezüchtet, z. B. in Glucosebouillon, Kojiextrakt oder Czapek-Lösung. Nach 20-40 Stunden wurden die Zellen oder das Mycel durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in einer PhosphatPufferlösung mit einem pH-Wert von 8 suspendiert. Die Reaktionsmischung für die Prüfung der erwähnten Enzymaktivität hatte folgende Zusammensetzung :
Tabelle 1 siehe auf Seite 3.
Der pH-Wert wurde auf 8, 0 eingestellt und die Reaktionsmischung auf 10 cm3 aufgefüllt.
Es wurden gleichzeitig zwei Kontrollversuche durchgeführt. Die eine mit einer Glukoselösung und die andere mit der Glukose fx-Ketoglutar- säurelösung der oben angegebenen Reaktionsmischung. Diese zweite Kontrollösung ergibt die Grundmenge der Ammoniakabsorption in dieser Reaktion. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde bei 370 stehengelassen. Die verbrauchte Ammoniakmenge wurde gemessen, um die erwähnte Enzymaktivität zu bestimmen.
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Tabelle l Zusammensetzung der Reaktionsmischung
EMI3.1
<tb>
<tb> Kanzentration <SEP> verwendete <SEP> Menge
<tb> Glukoselösung <SEP> .................... <SEP> 100 <SEP> mMole <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> α¯ketoglutarsäurelösung <SEP> ................. <SEP> 200 <SEP> mMole <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> Diammonphosphatlösung <SEP> 100 <SEP> mMole <SEP> ! <SEP> 1 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Zellen <SEP> (oder <SEP> Mycel) <SEP> Suspension <SEP> (nasse <SEP> Zellen
<tb> oder <SEP> Mycel) <SEP> ....................... <SEP> 30-50 <SEP> mg/cm3 <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> Phosphat-Pufferlösung <SEP> (pH-8) <SEP> 1/15 <SEP> Mole <SEP> 5 <SEP> cm3
<tb> 9 <SEP> cm3
<tb>
Die Ergebnisse sind der Tabelle 2 zu entnehmen.
Tabelle 2
Ammoniakabsorption /cm3 2)
EMI3.2
<tb>
<tb> Reaktions- <SEP> Reaktions- <SEP> Starke <SEP> der
<tb> Organismus <SEP> mischung <SEP> (a) <SEP> mischunjg <SEP> (b) <SEP> Enzvmwirkung)
<tb> (Glukose <SEP> enhaitend) <SEP> (keine <SEP> glukose) <SEP> enzymwirkung)
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtils <SEP> ................... <SEP> 28 <SEP> 5 <SEP> *
<tb> 1 <SEP> Bacilus <SEP> natto <SEP> ...................... <SEP> 16 <SEP> 7 <SEP> *
<tb> 3Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 15 <SEP> 4 <SEP>
<tb> 4 <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> ................ <SEP> 35 <SEP> ! <SEP> 5 <SEP> **
<tb> 5 <SEP> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> ................ <SEP> 42 <SEP> 6 <SEP> **
<tb> 6 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 116 <SEP> 18 <SEP> 5 <SEP> * <SEP>
<tb> 7 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 128.................
<SEP> 52 <SEP> 12 <SEP> *** <SEP>
<tb> 8 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 165 <SEP> ............... <SEP> 32 <SEP> 8 <SEP> **
<tb> 9 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534.......... <SEP> 98 <SEP> 16 <SEP> ***** <SEP>
<tb> 10 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 416.......... <SEP> 82 <SEP> 14 <SEP> **** <SEP>
<tb> 11 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 1056 <SEP> ""'" <SEP> 42 <SEP> 5 <SEP> *** <SEP>
<tb> 12 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 2143....... <SEP> 17 <SEP> 4 <SEP> * <SEP>
<tb> 13 <SEP> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> Nr. <SEP> 618......... <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> * <SEP>
<tb> 14 <SEP> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr. <SEP> 812.....................
<SEP> 62 <SEP> 16 <SEP> **** <SEP>
<tb> 15 <SEP> Zygosaccharomyces <SEP> major <SEP> 42 <SEP> 8 <SEP> *** <SEP>
<tb> 16 <SEP> Aspergillus <SEP> orycae <SEP> Nr. <SEP> 3181.............. <SEP> 26 <SEP> 12 <SEP> * <SEP>
<tb> 17 <SEP> Aspergillus <SEP> orycae <SEP> Nr. <SEP> 3216.............. <SEP> 46 <SEP> 16 <SEP> *** <SEP>
<tb> 18 <SEP> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423 <SEP> 48 <SEP> 14 <SEP> *** <SEP>
<tb> 19 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4235........ <SEP> 32 <SEP> 12 <SEP> ** <SEP>
<tb> 20 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4261........ <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> * <SEP>
<tb> 1) <SEP> Die <SEP> absorbierte <SEP> Ammoniakmenge <SEP> wurde <SEP> durch <SEP> folgende <SEP> Gleichung <SEP> berechnet.
<tb>
Ammoniakabsorption <SEP> = <SEP> (Gefundene <SEP> Menge)- <SEP> (Grundmenge) <SEP>
<tb> Die <SEP> Grundmenge <SEP> wird <SEP> erhalten, <SEP> wenn <SEP> α-Ketoglutarsäure <SEP> und <SEP> Glukose <SEP> von <SEP> der <SEP> vollständigen <SEP> Reaktionsmischung <SEP> genommen <SEP> werden. <SEP> Die <SEP> individuellen <SEP> Werte <SEP> der <SEP> Grundmenge <SEP> des <SEP> absorbierten <SEP> Ammoniaks <SEP> wurden
<tb> in <SEP> der <SEP> Tabelle <SEP> weggelassen.
<tb>
2) <SEP> * <SEP> bedeutet <SEP> 1-20 <SEP> y <SEP> Ammoniakabsorption <SEP> in <SEP> der <SEP> Reaktionsmischung <SEP> (a).
<tb>
Die aus der Tabelle 2 entnehmbaren Resultate zeigen, dass die Stärke der reduktiven Amini-
EMI3.3
selbst innerhalb der gleichen Art, sehr variabel ist. Ausserdem geht daraus hervor, dass zwischen den taxonomischen Positionen und der Stärke der erwähnten Enzymreaktion keine Beziehung besteht. Auf diese Weise kann angenommen werden, dass die Stärke der Enzymreaktion zum spezifischen Charakter eines individuellen Stammes in verschiedenen taxonomischen Gruppen oder Arten gehört.
Ein Vergleich der Ammoniakabsorption in den Reaktionsmischungen (a) und (b) ergibt, dass sie in der Mischung (a) viel höher ist als in der Mischung (b). Dies bedeutet, dass die Glukose die für die Reaktion erforderliche Energie liefern kann.
Daraus ergibt sich, dass die Reaktion fermentierbaren Zucker braucht, um eine hohe Ammo-
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niakabsorption zu erzielen. Die Reaktion wird also in Gegenwart von fermentierbarem Zucker zufriedenstellend verlaufen.
Aus Tabelle 3 ist die durch Mikroorganismen mit stark reduktiver Aminisierungsaktivität ge- bildete Menge 1-Glutaminsäure zu ersehen ; auch Fälle ohne Glutaminsäurebildung sind daraus zu entnehmen. Die in drei Tage alten Schüttelkulturen angereicherte Menge 1-Glutaminsäure wurde analytisch bestimmt.
Tabelle 3
EMI4.1
<tb>
<tb> Erzeugung <SEP> von <SEP> 1-Glutaminsaure
<tb> Stärke <SEP> der <SEP> enzymatischen <SEP> (mg/100 <SEP> cm2)
<tb> Organismus <SEP> Aministietung
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ...................... <SEP> ** <SEP> 420 <SEP> -
<tb> 2 <SEP> Bacillus <SEP> natto <SEP> ......................... <SEP> * <SEP> 40 <SEP> -
<tb> 3 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 116 <SEP> ..................... <SEP> * <SEP> 60 <SEP> -
<tb> 4 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 128................. <SEP> *** <SEP> 410 <SEP> I <SEP> - <SEP>
<tb> 5 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534.......... <SEP> ***** <SEP> 980 <SEP> - <SEP>
<tb> 6 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 416.......... <SEP> **** <SEP> 0-
<tb> 7 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 1056.......
<SEP> *** <SEP> 360- <SEP>
<tb> 8 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 2143....... <SEP> * <SEP> 40 <SEP> - <SEP>
<tb> 9 <SEP> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr. <SEP> 812.............. <SEP> **** <SEP> 670-
<tb> 10 <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> N4.3181.................. <SEP> * <SEP> - <SEP> 30
<tb> 11 <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> Nr. <SEP> 3216.............. <SEP> *** <SEP> - <SEP> 520
<tb> 12 <SEP> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423 <SEP> *** <SEP> - <SEP> 340
<tb> 13 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4216........ <SEP> *-60 <SEP>
<tb> 1) <SEP> Das <SEP> Medium <SEP> A <SEP> enthält <SEP> : <SEP> Glukose <SEP> 50 <SEP> g, <SEP> Pepton <SEP> 5 <SEP> g, <SEP> Harnstoff <SEP> 5 <SEP> g, <SEP> K2HPO1, <SEP> 1,0 <SEP> g, <SEP> MgSO <SEP> !. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> ;
<SEP> es <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> l <SEP> aufgefüllt.
<tb>
2) <SEP> Das <SEP> Medium <SEP> B <SEP> enthält <SEP> : <SEP> Glukose <SEP> 50 <SEP> g, <SEP> Maisquellwasser <SEP> 10 <SEP> g, <SEP> Ammoniumsulfat <SEP> 15 <SEP> g, <SEP> KHPO <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> ; <SEP>
<tb> MgSO5.7 <SEP> H2O <SEP> 0,1 <SEP> g; <SEP> es <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> l <SEP> aufgefüllt. <SEP> Während <SEP> der <SEP> Züchtung <SEP> wurden <SEP> Ammoniak
<tb> und <SEP> Natriumhydroxyd <SEP> zugesetzt, <SEP> so <SEP> dass <SEP> der <SEP> pur-vert <SEP> des <SEP> Mediums <SEP> zwischen <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> und <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> lag.
<tb>
Nach den in Tabelle 3 wiedergegebenen Resultaten besteht augenscheinlich ein Zusammenhang zwischen der Stärke des enzymatischen Aminisierungsvermögens der intakten Zellen oder des Mycels und der tatsächlichen 1-Glutaminsäureanreicherung bei der Schüttelkultur-Fermentation. Nach diesen Ergebnissen ist es klar, dass die beiden spezifischen, biochemischen Aktivitäten eines Mikroorganismus mit der Erzeugung und Anreicherung der 1-Glutaminsäure in unmittelbarem Zusammenhang stehen.
Versuch 2 : Die pH-Wert-Kontrolle in einem Fermentationsmedium.
Es wurde das in Tabelle 3 angegebene Nährmedium verwendet. Für die Einstellung des pH-Wertes des Mediums während der Fermen- tation auf 6, 5-8, 5 können solche Substanzen verwendet werden, welche basischen Stickstoff enthalten und Ammoniumionen liefern, so dass der pH-Wert nach der alkalischen Seite verschoben wird. Solche Substanzen sind z. B.
NH3, NH4OH, (NH2)2CO, (NH4)2CO3 usw.
Auch verschiedene Ammoniumsalze wie (NH4)2SO4, NH4Cl und NH4N03 können zusammen mit Alkalihydroxyden verwendet werden.
EMI4.2
und damit in der Begünstigung der enzymatischen Reaktion für die Anreicherung von 1-Glutamat.
Entsprechende Resultate sind aus Tabelle 4 zu entnehmen.
Tabelle 4
EMI4.3
<tb>
<tb> pH <SEP> auf <SEP> 6,5-8,5 <SEP> gehalten
<tb> ohne <SEP> pH
<tb> Kontrolle <SEP>
<tb> % <SEP> AusMedium <SEP> Organismus <SEP> 1-Glutamin- <SEP> 1-Glutamin- <SEP> Konsumierte <SEP> bez. <SEP> auf
<tb> säuremenge <SEP> säuremenge <SEP> Glukose <SEP> konsumierte
<tb> (mg/100 <SEP> cm2) <SEP> (mg/100 <SEP> cm3) <SEP> g/100 <SEP> cm3) <SEP> Glukose
<tb> A <SEP> Bacillus <SEP> subtilis................ <SEP> 22 <SEP> 420 <SEP> 2,4 <SEP> 17,5
<tb> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534 <SEP> .... <SEP> 240 <SEP> 980 <SEP> 3,2 <SEP> 30,6
<tb> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr.812 <SEP> ............ <SEP> 23 <SEP> 670 <SEP> 3,0 <SEP> 22,3
<tb> B <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> Nr. <SEP> 3216 <SEP> ........ <SEP> 8 <SEP> 520 <SEP> 3,4 <SEP> 15,3
<tb> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423 <SEP> ............
<SEP> 3 <SEP> 340 <SEP> 3,2 <SEP> 10,6
<tb>
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(Die Zusammensetzung der Medien A und B ist die gleiche wie in Tabelle 3.)
Tabelle 4 zeigt, dass eine richtige pH-Kontrolle bei der Fermentation für eine starke Anreicherung der 1-Glutaminsäure im Medium von wesentlicher Bedeutung ist. Ohne pH-Kon- trolle wird keine Anreicherung erzielt, selbst wenn der Organismus an sich dafür geeignet wäre.
Wie aus den oben angegebenen Versuchen hervorgeht, gibt es viele Stämme, welche zwei biochemische Bedingungen, nämlich die Fähig- keit zur Bildung von x-Ketoglutarsäure aus zuckerhaltigem Material und eine hohe 1-Gluta- minsäure-Dehydrogenase-Aktivität erfüllen und unter gewissen Fermentationsbedingungen 1-
Glutaminsäure erzeugen können. Ein Mikro- organismus der Gattung Bacillus, wie beispiels- weise Bacillus subtilis, Bacillus natto und Bacillus megatherium, hat sich für die Herstellung von 1-Glutaminsäure in industriellem Massstab als besonders geeignet erwiesen.
Die Mikroorganismen Bacillus subtilis, Bacillus natto und Bacillus megatherium werden in
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,
6. Auflage, beschrieben.
Wie aus den später angeführten Beispielen hervorgeht, kann als Stickstoff quelle des Nähr- substrates sowohl anorganisch gebundener als auch organisch gebundener Stickstoff dienen.
Die Zucker- und Stickstoffquelle kann verschiedenster Art sein. Es kann als Kohlehydratquelle Glukose, Fruktose, Mannose, Sukrose, Maltose, Melasse und hydrolysierte Stärke bzw.
Gemische dieser Stoffe verwendet werden. Als
Stickstoff enthaltende Substrate können Ammoniak, Harnstoff, Ammonchlorid, Ammonazetat oder andere anorganische oder organische Ammoniumsalze, Pepton, Fleischextrakt, Abguss von Getreideweiche, hydrolisiertes Kasein, Fischmehl oder digestiertes Fischmehl, Sojabohnenmehl oder digestiertes Sojabohnenmehl verwendet werden.
Die Fermentationstemperatur kann von 28 C bis 33 C betragen. Die Fermentation wird bei einem pH-Wert von 6 bis 9 während eines Zeitraumes von 2 bis 5 Tagen, u. zw. als Schüttelkulturfermentation oder submerse Fermentation mit Belüftung und Rühren, durchgeführt. Zur Regelung des pH-Wertes des Substrates im Bereich von pH 6 bis 9 werden neutralisierende Substanzen, wie beispielsweise Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumverbindungen bzw. Verbindungen, welche Aminogruppen enthalten, wie beispielsweise Ammoniumhydroxyd, Ammoniumkarbonat od. dgl., oder Alkalilaugen, wie beispielsweise Natronlauge, verwendet.
Nach Vollendung der Fermentation werden die Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren vom Substrat abgetrennt und das Filtrat wird unter verringertem Druck konzentriert. Auf diese Weise erhaltenes Konzentrat wird mit 5-n Salzsäure auf einen pH-Wert von 3, 2 eingestellt und dann in einem kühlen Raum stehen- gelassen, wobei sich Rohkristalle von l-Glutaminsäure abscheiden.
Die im Substrat erzeugte 1-Glutaminsäure bzw. deren Salze wird auf irgendeine geeignete Art, beispielsweise mittels eines Ionenaustauschharzes abgetrennt. In den folgenden Beispielen sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Kulturen der in den folgenden Beispielen genannten Stämme von Mikroorganismen der Gattung Bacillus sind in den verschiedenen Kultursammlungen, wie beispielsweise im Northern Regional Research Laboratory (N. R. R. L.) des Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, und im Institute of Applied Microbiology (I. A. M.) der Universität Tokio hinterlegt. Derartige Kulturen können auch in einfacher Weise mittels der üblichen Auswahlverfahren aus natürlichen Materialien erhalten werden.
Mikroorganismen der Gattung Bacillus sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" in identifizierbarer Weise beschrieben.
EMI5.1
Pepton, 5 g Harnstoff, 1, 0 g K, HPO, und 0, 1 g MgSO4. 7 H O wurden in Leitungswasser aufgelöst und das Volumen der Lösung wurde auf 1 1 gebracht. Der pH-Wert des Mediums war ungefähr 7, 5. Es wurden je 30 cm3 dieses Substrates in 250 cm3-Erlenmeyer-Kolben eingebracht und 10 Minuten lang einer Temperatur von 110 C ausgesetzt. Das Substrat in einem dieser Kolben wurde mit 3 cm3 einer Impfflüssigkeit von Bacillus subtilis versetzt, welcher auf Glukosebouillon unter Verwendung einer Schüttelkulturvorrichtung bei 28 C 24 Stunden lang gezüchtet worden war.
Ein derartiger Stamm von Bacillus subtilis ist unter der Bezeichnung N. R. R. L. 558 im Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Ill., hinterlegt. Die Fermentation wurde unter Verwendung einer Schüttelkulturvorrichtung bei 28 C ausgeführt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Substrates durch Zugabe von 0, 5 bis 1, 0 cm3 10%iger NH40H in Abständen von 4 bis 6 Stunden auf einem Wert zwischen 6 und 9 gehalten. Nach vier Tagen wurde das fermentierte Substrat zentrifugiert und die Bakterienzellen entfernt.
Der l-Glutaminsäuregehalt der überstehenden Flüssigkeit wurde unter Ver-
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überstehende Flüssigkeit wurde im Vakuum auf 1/5 des ursprünglichen Volumens eingedampft und der pH-Wert des auf diese Weise erhaltenen Konzentrates mittels 5n-HCI auf 3, 2 eingestellt. : Diese Lösung wurde in einem kühlen Raum so lange stehengelassen, bis eine wesentliche
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strates erhielt man 3, 6 g rohe l-Glutaminsäure.
Beispiel 2 : Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch (NH) CO als Neutralisationsmittel verwendet
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wurde. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Substrates durch Zugabe von 0, 5 cm3 einer 10%igen (NHJaCO3-Lösung in Abständen von 4 bis 6 Stunden auf einen Wert zwischen 6 und 9 eingestellt. Nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen enthielt das Substrat 5, 2 mg 1-Glutaminsäurefcm3.
Beispiel 3 : Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch ein Substrat verwendet wurde, welches in der folgenden Weise hergestellt worden war : 100 g Glukose, 5 g Fleischextrakt, 5 g NC-Amin, 5 g Harnstoff, 1 g K2HP04 und 0, 25 g MgS04. 7 H20 wurden in Leitungswasser aufgelöst und die Lösung auf ein Volumen von 1 1 gebracht. Der pH-Wert dieses Substrates betrug ungefähr 7, 0. Nach der Sterilisierung und nach dem Abkühlen wurde das Substrat mit demselben Mikroorganismus wie in Beispiel 1 angeimpft und submers unter Belüftung und unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C der Fermentation unterworfen. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Substrates, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch Zugabe einer 10%igen (NH4)2CO3-Lösung auf 6 bis 9 eingestellt.
Nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen enthielt das Substrat 4, 5 mg 1-Gluta- minsäure/cm3.
Beispiel 4 : Es wurde das in Beispiel 1 angegebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch als Mikroorganismus Bacillus natto verwendet wurde. Eine Kultur von Bacillus natto ist unter der Bezeichnung I. A. M. 1-3 im Institute of Applied Microbiology der Universität Tokio hinterlegt. Nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen enthielt das Substrat 2, 1 mg 1-luta- minsäure/cm3.
Beispiel 5 : Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch Bacillus megatherium als Mikroorganismus verwendet wurde. Eine Kultur von Bacillus megatherium ist unter der Bezeichnung I. A. M.
Bact. 1-12 (Bacillus megatherium de Bary) im Institute of Applied Microbiology der Universität Tokio hinterlegt. Nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen enthielt das Substrat 2, 6 mg 1-Glutaminsärue/cm3.
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Process for the production of 1-glutamic acid
The invention relates to a process for the production of 1-glutamic acid and its
Salts by fermentation. The invention consists essentially in the cultivation of certain strains of microorganisms
Genus Bacillus in a culture medium containing sugar as well as nitrogenous and inorganic substances, under such conditions that a large amount of 1-glutamic acid or its salts accumulate therein, which are then obtained from it. It is known that growing microorganisms in a suitable medium produces various amino acids. However, the amount thus produced is very small and it has not yet been reported that any particular amino acid could be enriched in a medium in a large amount by fermentation.
The reason that amino acids are so difficult to accumulate in a biological system is that the amino acids are the components of proteins and an amino acid, once formed in a medium, tends to easily regenerate proteins, polypeptides, etc. or the acid is through various biochemical reactions converted into other substances or decomposed. In other words, it is difficult to accumulate an amino acid in a culture medium in the monomeric state.
The expression monomeric state "is understood here to mean the monomolecular state as a free acid or as a salt.
This is the reason why a fermentation process, i.e. the direct use of the biochemical activity of living microorganisms, has not yet been proposed for the biosynthesis and accumulation of 1-glutamic acid. The known biosynthesis is carried out in an enzymatic system, i.e. H. a special type of enzyme is extracted from microorganisms or from animal or plant tissues and reacted with suitable substrates, e.g. B. with oc-ketoglutaric acid and ammonium compounds under very narrow reaction conditions, as described in German Patent No. 931582 and US Patent No. 2, 749, 274, these reactions being carried out under anaerobic conditions.
On the other hand, it is known that certain microorganisms can form α-ketoglutaric acid from carbohydrates under aerobic conditions, as described, for example, in US Pat. Nos. 2,443,919 and 2,724,680.
Two different process steps are therefore necessary in order to be able to produce 1-glutamic acid from carbohydrates, u. between a process step running under aerobic conditions for producing K-ketoglutaric acid from carbohydrates and a process step running under anaerobic conditions for producing 1-glutamic acid from oc-ketoglutaric acid. The direct production of 1-glutamic acid from carbohydrates using a specific microorganism under aerobic fermentation conditions was not previously known.
It has now been found that a large amount of 1-glutamic acid can be formed directly from carbohydrates by using a microorganism which fulfills the two biochemical conditions described later. When carrying out the process according to the invention, it is possible to produce 1-glutamic acid directly from carbohydrates in a one-step process.
According to the method according to the invention, a substantial amount of 1-glutamic acid is produced directly in a liquid medium in the cultivation of certain strains of microorganisms of the genus Bacillus.
Large amounts of l-glutamic acid in the monomeric state are accumulated in the liquid medium.
Side reactions that occur during the cultivation of organisms of the genus Bacillus in a liquid medium, e.g. B. polymerization or decomposition of 1-glutamic acid are largely suppressed in the process according to the invention.
The 1-glutamic acid enriched in the liquid medium is easy to obtain due to its monomeric state.
According to the method according to the invention, a strain of the genus Bacillus with special biochemical properties specified below is inoculated in a liquid medium. During fermentation will
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the pH of this medium is adjusted to about 6-9 and kept at this level, as a result of which a large amount of 1-glutamic acid or its salt is formed, which is then separated off.
It has been found that strains of microorganisms which are responsible for the method according to the
Invention are useful, must meet two specific biochemical conditions; First of all, they must be made from oc-ketoglutaric acid
Produce sugars and, secondly, they must have a strong 1-glutamic acid dehydrogenase activity and be particularly active for the reverse reaction of the aforementioned reversible enzymatic reaction, that is the reductive amination of cz-ketoglutaric acid.
Microorganisms were selected which correspond to the two mentioned biochemical conditions and it was found that the genus Bacillus is very suitable for industrial use.
The strength of the 1-glutamic acid dehydrogenase activity, especially the activity of a strain for the reductive amination of cz-ketoglutaric acid, is closely related to the ability of this microorganism to produce 1-glutamic acid. These biochemical properties of a microorganism are particularly important for the accumulation of 1-glutamic acid.
Another feature of the invention is the control of the fermentation process. When
Culture medium can be any known for the growth of microorganisms of the genus
Bacillus suitable composition can be used. In order to induce a strong carbohydrate metabolism through the microorganism, various nitrogenous substances, inorganic substances or other substances required by the organism can be added to the culture medium. Through carbohydrate metabolism, organic acids generally tend to build up and make the medium acidic. It was found that the production of 1-glutamic acid is significantly influenced by the pH of the medium during the fermentation process. Production is favored if the pH is kept between 6.0 and 9.0.
The optimal pH seems to be between about 7.0 and 8.5. According to the invention, the pH is adjusted to 6.5-8.5 by adding a compound containing a basic nitrogen radical and is kept at this level. The formed <x-ketoglutaric acid is combined with ammonium ions, which originate from the added basic nitrogen radicals, and 1-glutamic acid is formed, u. between
Due to the effect of the strongly reductive amination of the 1-glutamic acid dehydrogenase contained in the microorganism as a result of the latter and by maintaining an optimal pH range, the various disruptive side reactions are reduced so that the 1-glutamic acid formation reaction outweighs the side reactions and 1-glutamic acid accumulates in large quantities.
Various approaches can be taken to neutralize the culture medium.
The medium can provide the necessary amount
Ammonium ions are supplied. The combined use of ammonium salts and alkalis is also within the scope of the method according to the invention.
Experiment 1: Various microorganisms were investigated with regard to the two biochemical conditions mentioned and suitable ones were selected. The two specific biochemical requirements were tested as follows: The method for determining the ability to produce <x -ketoglutaric acid from materials containing sugar is well known in the art. It was z. B. a strain is grown in a liquid medium containing sugar and other nutrients as a shake culture. The acid recovered was checked by paper chromatography; If necessary, a quantitative analysis was also carried out by colorimetry according to Friedemann-Haugen's.
From this sample those microorganisms were selected which were able to produce significant amounts of α-ketoglutaric acid.
Then the 1-glutamic acid dehydrogenase activity was investigated, especially with regard to the strength of the reductive amination of α-ketoglutaric acid. As will be described later, the sample was carried out by ammonia absorption in a reaction mixture, under
Use of intact cells or the mycelium.
The quantitative test of ammonia absorption was carried out by a method described in "Microdiffusion Analysis and Volumetric Error" (E. J. Conway, London Crosby Lockwood and
Son Ltd. 1950).
The microorganism to be tested was called
Shake culture grown, e.g. B. in glucose broth, koji extract or Czapek solution. After 20-40 hours, the cells or mycelium were separated by centrifugation, washed with water and then suspended in a phosphate buffer solution having a pH of 8. The reaction mixture for testing the enzyme activity mentioned had the following composition:
Table 1 see on page 3.
The pH was adjusted to 8.0 and the reaction mixture was made up to 10 cm3.
Two control experiments were carried out simultaneously. One with a glucose solution and the other with the glucose fx-ketoglutaric acid solution of the reaction mixture given above. This second control solution gives the basic amount of ammonia absorption in this reaction. The reaction mixture was allowed to stand at 370 for one hour. The amount of ammonia consumed was measured to determine the aforementioned enzyme activity.
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Table 1 Composition of the reaction mixture
EMI3.1
<tb>
<tb> Kanzentration <SEP> <SEP> amount used
<tb> Glucose solution <SEP> .................... <SEP> 100 <SEP> mmol <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> α¯ketoglutaric acid solution <SEP> ................. <SEP> 200 <SEP> mmoles <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> Diammonphosphate solution <SEP> 100 <SEP> mmol <SEP>! <SEP> 1 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> cells <SEP> (or <SEP> mycelium) <SEP> suspension <SEP> (wet <SEP> cells
<tb> or <SEP> mycelium) <SEP> ....................... <SEP> 30-50 <SEP> mg / cm3 <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> Phosphate buffer solution <SEP> (pH-8) <SEP> 1/15 <SEP> Mole <SEP> 5 <SEP> cm3
<tb> 9 <SEP> cm3
<tb>
The results are shown in Table 2.
Table 2
Ammonia absorption / cm3 2)
EMI3.2
<tb>
<tb> Reaction <SEP> Reaction <SEP> Strong <SEP> the
<tb> organism <SEP> mixture <SEP> (a) <SEP> mixture <SEP> (b) <SEP> enzyme effect)
<tb> (contains glucose <SEP>) <SEP> (no <SEP> glucose) <SEP> enzyme effect)
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtle <SEP> ................... <SEP> 28 <SEP> 5 <SEP> *
<tb> 1 <SEP> Bacilus <SEP> natto <SEP> ...................... <SEP> 16 <SEP> 7 <SEP> *
<tb> 3Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 15 <SEP> 4 <SEP>
<tb> 4 <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> ................ <SEP> 35 <SEP>! <SEP> 5 <SEP> **
<tb> 5 <SEP> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> ................ <SEP> 42 <SEP> 6 <SEP> **
<tb> 6 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> No. <SEP> 116 <SEP> 18 <SEP> 5 <SEP> * <SEP>
<tb> 7 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> No. <SEP> 128 .................
<SEP> 52 <SEP> 12 <SEP> *** <SEP>
<tb> 8 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> No. <SEP> 165 <SEP> ............... <SEP> 32 <SEP> 8 <SEP> **
<tb> 9 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> No. <SEP> 534 .......... <SEP> 98 <SEP> 16 <SEP> ***** <SEP>
<tb> 10 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> No. <SEP> 416 .......... <SEP> 82 <SEP> 14 <SEP> **** <SEP>
<tb> 11 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> No. <SEP> 1056 <SEP> "" '"<SEP> 42 <SEP> 5 <SEP> *** <SEP>
<tb> 12 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> No. <SEP> 2143 ....... <SEP> 17 <SEP> 4 <SEP> * <SEP>
<tb> 13 <SEP> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> No. <SEP> 618 ......... <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> * <SEP>
<tb> 14 <SEP> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> No. <SEP> 812 .....................
<SEP> 62 <SEP> 16 <SEP> **** <SEP>
<tb> 15 <SEP> Zygosaccharomyces <SEP> major <SEP> 42 <SEP> 8 <SEP> *** <SEP>
<tb> 16 <SEP> Aspergillus <SEP> orycae <SEP> No. <SEP> 3181 .............. <SEP> 26 <SEP> 12 <SEP> * <SEP>
<tb> 17 <SEP> Aspergillus <SEP> orycae <SEP> No. <SEP> 3216 .............. <SEP> 46 <SEP> 16 <SEP> *** < SEP>
<tb> 18 <SEP> Mucor <SEP> javanicus <SEP> No. <SEP> 3423 <SEP> 48 <SEP> 14 <SEP> *** <SEP>
<tb> 19 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> No. <SEP> 4235 ........ <SEP> 32 <SEP> 12 <SEP> ** <SEP>
<tb> 20 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> No. <SEP> 4261 ........ <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> * <SEP>
<tb> 1) <SEP> The <SEP> absorbed <SEP> amount of ammonia <SEP> was <SEP> calculated by <SEP> the following <SEP> equation <SEP>.
<tb>
Ammonia absorption <SEP> = <SEP> (<SEP> amount found) - <SEP> (basic amount) <SEP>
<tb> The <SEP> basic amount <SEP> is obtained <SEP>, <SEP> if <SEP> α-ketoglutaric acid <SEP> and <SEP> glucose <SEP> from <SEP> the <SEP> complete <SEP > Reaction mixture <SEP> can be used <SEP>. <SEP> The <SEP> individual <SEP> values <SEP> of the <SEP> basic amount <SEP> of the <SEP> absorbed <SEP> ammonia <SEP> were
<tb> in <SEP> of the <SEP> table <SEP> omitted.
<tb>
2) <SEP> * <SEP> means <SEP> 1-20 <SEP> y <SEP> ammonia absorption <SEP> in <SEP> of the <SEP> reaction mixture <SEP> (a).
<tb>
The results, which can be taken from Table 2, show that the strength of the reductive amino
EMI3.3
even within the same species, is very variable. It also shows that there is no relationship between the taxonomic positions and the strength of the enzyme reaction mentioned. In this way it can be assumed that the strength of the enzyme reaction belongs to the specific character of an individual strain in different taxonomic groups or species.
A comparison of the ammonia absorption in reaction mixtures (a) and (b) reveals that it is much higher in mixture (a) than in mixture (b). This means that the glucose can provide the energy necessary for the reaction.
It follows that the reaction needs fermentable sugars in order to achieve a high level of ammo
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to achieve niac absorption. The reaction will therefore proceed satisfactorily in the presence of fermentable sugar.
Table 3 shows the amount of 1-glutamic acid formed by microorganisms with a strongly reductive aminization activity; also cases without glutamic acid formation can be seen from it. The amount of 1-glutamic acid accumulated in three-day-old shaking cultures was determined analytically.
Table 3
EMI4.1
<tb>
<tb> Generation <SEP> of <SEP> 1-glutamic acid
<tb> Strength <SEP> of the <SEP> enzymatic <SEP> (mg / 100 <SEP> cm2)
<tb> Organism <SEP> Amination
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ...................... <SEP> ** <SEP> 420 <SEP> -
<tb> 2 <SEP> Bacillus <SEP> natto <SEP> ......................... <SEP> * <SEP> 40 <SEP > -
<tb> 3 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> No. <SEP> 116 <SEP> ..................... <SEP> * < SEP> 60 <SEP> -
<tb> 4 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> No. <SEP> 128 ................. <SEP> *** <SEP> 410 <SEP > I <SEP> - <SEP>
<tb> 5 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> No. <SEP> 534 .......... <SEP> ***** <SEP> 980 <SEP> - <SEP>
<tb> 6 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> No. <SEP> 416 .......... <SEP> **** <SEP> 0-
<tb> 7 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> No. <SEP> 1056 .......
<SEP> *** <SEP> 360- <SEP>
<tb> 8 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> No. <SEP> 2143 ....... <SEP> * <SEP> 40 <SEP> - <SEP>
<tb> 9 <SEP> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> No. <SEP> 812 .............. <SEP> **** <SEP> 670-
<tb> 10 <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> N4.3181 .................. <SEP> * <SEP> - <SEP> 30
<tb> 11 <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> No. <SEP> 3216 .............. <SEP> *** <SEP> - <SEP> 520
<tb> 12 <SEP> Mucor <SEP> javanicus <SEP> No. <SEP> 3423 <SEP> *** <SEP> - <SEP> 340
<tb> 13 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> No. <SEP> 4216 ........ <SEP> * -60 <SEP>
<tb> 1) <SEP> The <SEP> medium <SEP> A <SEP> contains <SEP>: <SEP> glucose <SEP> 50 <SEP> g, <SEP> peptone <SEP> 5 <SEP> g , <SEP> urea <SEP> 5 <SEP> g, <SEP> K2HPO1, <SEP> 1,0 <SEP> g, <SEP> MgSO <SEP>!. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP>;
<SEP> es <SEP> <SEP> was filled with <SEP> water <SEP> to <SEP> 1 <SEP> l <SEP>.
<tb>
2) <SEP> The <SEP> medium <SEP> B <SEP> contains <SEP>: <SEP> glucose <SEP> 50 <SEP> g, <SEP> corn steeple water <SEP> 10 <SEP> g, <SEP > Ammonium sulfate <SEP> 15 <SEP> g, <SEP> KHPO <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>; <SEP>
<tb> MgSO5.7 <SEP> H2O <SEP> 0.1 <SEP> g; <SEP> es <SEP> <SEP> was filled with <SEP> water <SEP> to <SEP> 1 <SEP> l <SEP>. <SEP> During <SEP> the <SEP> cultivation <SEP> <SEP> became ammonia
<tb> and <SEP> sodium hydroxide <SEP> added, <SEP> so <SEP> that <SEP> the <SEP> pure-vert <SEP> of the <SEP> medium <SEP> between <SEP> 6, <SEP > 5 <SEP> and <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> lag.
<tb>
According to the results shown in Table 3, there is apparently a connection between the strength of the enzymatic aminization capacity of the intact cells or the mycelium and the actual 1-glutamic acid accumulation in the shaking culture fermentation. After these results it is clear that the two specific, biochemical activities of a microorganism are directly related to the production and accumulation of 1-glutamic acid.
Experiment 2: pH control in a fermentation medium.
The nutrient medium given in Table 3 was used. To adjust the pH value of the medium during fermentation to 6.5-8.5, substances can be used which contain basic nitrogen and supply ammonium ions, so that the pH value is shifted towards the alkaline side. Such substances are e.g. B.
NH3, NH4OH, (NH2) 2CO, (NH4) 2CO3 etc.
Various ammonium salts such as (NH4) 2SO4, NH4Cl and NH4N03 can also be used together with alkali hydroxides.
EMI4.2
and thus in favoring the enzymatic reaction for the accumulation of 1-glutamate.
Corresponding results can be found in Table 4.
Table 4
EMI4.3
<tb>
<tb> pH <SEP> kept at <SEP> 6.5-8.5 <SEP>
<tb> without <SEP> pH
<tb> Control <SEP>
<tb>% <SEP> from medium <SEP> organism <SEP> 1-glutamine- <SEP> 1-glutamine- <SEP> consumed <SEP> re. <SEP> on
<tb> amount of acid <SEP> amount of acid <SEP> consumed glucose <SEP>
<tb> (mg / 100 <SEP> cm2) <SEP> (mg / 100 <SEP> cm3) <SEP> g / 100 <SEP> cm3) <SEP> glucose
<tb> A <SEP> Bacillus <SEP> subtilis ................ <SEP> 22 <SEP> 420 <SEP> 2.4 <SEP> 17.5
<tb> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> No. <SEP> 534 <SEP> .... <SEP> 240 <SEP> 980 <SEP> 3.2 <SEP> 30.6
<tb> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> No. 812 <SEP> ............ <SEP> 23 <SEP> 670 <SEP> 3.0 <SEP> 22.3
<tb> B <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> No. <SEP> 3216 <SEP> ........ <SEP> 8 <SEP> 520 <SEP> 3,4 <SEP> 15 , 3
<tb> Mucor <SEP> javanicus <SEP> No. <SEP> 3423 <SEP> ............
<SEP> 3 <SEP> 340 <SEP> 3.2 <SEP> 10.6
<tb>
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(The composition of media A and B is the same as in table 3.)
Table 4 shows that correct pH control during fermentation is essential for a high concentration of 1-glutamic acid in the medium. Without pH control, no enrichment is achieved, even if the organism itself were suitable for it.
As can be seen from the experiments given above, there are many strains which meet two biochemical conditions, namely the ability to form x-ketoglutaric acid from sugar-containing material and a high 1-glutamic acid dehydrogenase activity and, under certain fermentation conditions 1 -
Can produce glutamic acid. A microorganism of the genus Bacillus, such as, for example, Bacillus subtilis, Bacillus natto and Bacillus megatherium, has proven to be particularly suitable for the production of 1-glutamic acid on an industrial scale.
The microorganisms Bacillus subtilis, Bacillus natto and Bacillus megatherium are in
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,
6th edition, described.
As can be seen from the examples given later, both inorganically bound and organically bound nitrogen can serve as the nitrogen source of the nutrient substrate.
The sugar and nitrogen source can be of various types. As a source of carbohydrates, glucose, fructose, mannose, sucrose, maltose, molasses and hydrolyzed starch or starch can be used.
Mixtures of these substances are used. When
Nitrogen-containing substrates can be ammonia, urea, ammonium chloride, ammonium acetate or other inorganic or organic ammonium salts, peptone, meat extract, softened castings, hydrolyzed casein, fish meal or digested fish meal, soybean meal, or digested soybean meal.
The fermentation temperature can be from 28 C to 33 C. The fermentation is carried out at a pH of 6 to 9 for a period of 2 to 5 days, u. between shaking culture fermentation or submerged fermentation with aeration and stirring. To regulate the pH of the substrate in the range from pH 6 to 9, neutralizing substances such as ammonia, urea, ammonium compounds or compounds which contain amino groups, such as ammonium hydroxide, ammonium carbonate or the like, or alkali solutions such as sodium hydroxide solution are used , used.
After completion of the fermentation, the cells are separated from the substrate by filtration or centrifugation, and the filtrate is concentrated under reduced pressure. The concentrate obtained in this way is adjusted to a pH of 3.2 with 5N hydrochloric acid and then left to stand in a cool room, whereupon crude crystals of l-glutamic acid separate out.
The 1-glutamic acid or its salts generated in the substrate is separated off in any suitable manner, for example by means of an ion exchange resin. Embodiments of the present invention are described in the following examples. Cultures of the strains of microorganisms of the genus Bacillus mentioned in the following examples are in the various culture collections, such as in the Northern Regional Research Laboratory (NRRL) of the Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, and in the Institute of Applied Microbiology (IAM) of University of Tokyo deposited. Such cultures can also be obtained in a simple manner from natural materials using the usual selection processes.
Microorganisms of the genus Bacillus are described in an identifiable manner in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology ".
EMI5.1
Peptone, 5 g urea, 1.0 g K, HPO, and 0.1 g MgSO4. 7 HO were dissolved in tap water and the volume of the solution was brought to 1 liter. The pH of the medium was approximately 7.5. 30 cm3 of this substrate were placed in 250 cm3 Erlenmeyer flasks and exposed to a temperature of 110 ° C. for 10 minutes. To the substrate in one of these flasks was added 3 cc of an inoculating liquid from Bacillus subtilis which had been grown on glucose broth using a shaking culture device at 28 ° C. for 24 hours.
One such strain of Bacillus subtilis is deposited under the name N. R. R. L. 558 in the Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Ill. The fermentation was carried out at 28 ° C using a shaker culture device. During the fermentation, the pH of the substrate was kept at a value between 6 and 9 by adding 0.5 to 1.0 cm 3 of 10% NH40H at intervals of 4 to 6 hours. After four days the fermented substrate was centrifuged and the bacterial cells removed.
The l-glutamic acid content of the supernatant liquid was determined under
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Supernatant liquid was evaporated to 1/5 of the original volume in vacuo and the pH of the concentrate obtained in this way was adjusted to 3.2 by means of 5N HCl. : This solution was left in a cool room until substantial
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strates obtained 3.6 g of crude l-glutamic acid.
Example 2: The procedure described in Example 1 was repeated, but using (NH) CO as the neutralizing agent
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has been. During the fermentation, the pH of the substrate was adjusted by adding 0.5 cm3 of a 10% (NHJaCO3 solution at intervals of 4 to 6 hours to a value between 6 and 9. After a fermentation period of four days, the substrate contained 5.2 mg 1-glutamic acid fcm3.
Example 3: The procedure described in Example 1 was repeated, but using a substrate which had been prepared in the following manner: 100 g glucose, 5 g meat extract, 5 g NC-amine, 5 g urea, 1 g K2HPO4 and 0.25 g of MgS04. 7 H20 were dissolved in tap water and the solution was brought to a volume of 1 liter. The pH of this substrate was about 7.0. After sterilization and after cooling, the substrate was inoculated with the same microorganism as in Example 1 and subjected to fermentation submerged with aeration and stirring at a temperature of 28 ° C. During the fermentation, the pH of the substrate was adjusted to 6 to 9 by adding a 10% (NH4) 2CO3 solution, as described in Example 2.
After a fermentation period of four days, the substrate contained 4.5 mg 1-glutamic acid / cm3.
Example 4: The procedure given in Example 1 was repeated, but using Bacillus natto as the microorganism. A culture of Bacillus natto is deposited under the designation I.A.M. 1-3 in the Institute of Applied Microbiology of the University of Tokyo. After a fermentation period of four days, the substrate contained 2.1 mg 1-lutamic acid / cm3.
Example 5: The procedure described in Example 1 was repeated, except that Bacillus megatherium was used as the microorganism. A culture of Bacillus megatherium is known as I. A. M.
Bact. 1-12 (Bacillus megatherium de Bary) deposited in the Institute of Applied Microbiology of the University of Tokyo. After a fermentation period of four days, the substrate contained 2.6 mg 1-glutamic acid / cm3.