DD219794A5 - Verfahren zur gewinnung einer das coenzym b tief 12 produzierenden fermentbruehe - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer das Coenzym B12 und andere Corrinoide produzierenden Fermentbruehe. In dem erfindungsgemaessen Verfahren kommen eine neue, mesophile, methanproduzierende gemischte Mikropopulation und fuer die anaerobe, septische Fermentierung bekannte Praekursoren und zum Teil bekannte Naehrstoffe zur Anwendung.

Description

16 149 58

Verfahren zur Gewinnung einer das Coenzym B,₂ produzierenden Fermehtbrühe

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer das Coenzym B₁₂ und andere Corrinoide (zum Beispiel den Faktor III) produzierenden Fermentbrühe. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kommen eine neue, mesop'hile, methan^ produzierende gemischte Mikropopulation und für die anaerobe, septische Fermentierung bekannte Präkursoren und zum Teil bekannte Nährstoffkomponenten zur Anwendung.

/ ,

Obwohl die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Präkursoren und die einzelnen Komponenten des Nährmediuras bekannt sind, so ist doch ihre Anzahl und ihre Menge wesentlich geringer, ihr Verhältnis anders als bisher zur fermentative^ Herstellung von B-,- verwendet.

Die erfindungsgemäß hergestellte Fermentbrühe kann getrocknet oder wärmebehandelt und in dieser Form als Futtermittel oder Futtermittelzusatz (Premix) verwendet werden, * ferner kann gewünschtenfalls aus der Fermentbrühe das Vitamin B^ (Cyanocobalamin), für human- und veterinärmedizinische Zwecke gewonnen werden.

2 -

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Es ist bekannt, daß das Vitamin B₁₂ bei seiner Gewinnung durch Fermentation in den gezüchteten Zellen nicht in freiem Zustand vorliegt, sondern in Form einer Verbindung mit Corrinstruktur (Coenzyra B-, ₂) , in der das zentrale Cobaltatom des Corringerüstes keine Cyanogruppe, sondern eine Desoxyadenosylgruppe trägt.

In der,vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck Wirkstoff für das Gemisch der aktiven Corrinoide, das Coenzym B₁₂ und den Faktor III gebraucht (Barker et al.: Biol. Chem. 235, 480 /I960/).

Das Inokulum kann ein "zum Anlegen neuer, steriler Kulturen verwendeter Virus, Mikroorganismus, eine Zellsuspension oder ein pflanzliches Organ, ein Gewebe oder eine Zelle sein" (Sträub, F.B.-: Biologiai Lexikon II, unveränderter Nachdruck S. 287, Akadem'iai Kiado Budapest, 1978). Das erfindungsgemäS verwendete Inokulum enthält eine anaerobe, septische, raesophile, metanproduzierende gemischte Hikropopulation.

- ' · · .' . Präkursoren (Vorstufen) sind Ausgangsverbindungen, aus denen im Laufe der biologischen Reaktionen das Endprodukt entsteht (s. ebenda III, S. 437, zum Beispiel 5,6-Diraethyl- benzimidazole Cobaltchlorid usw.).

Der Nährboden ist das zur Zucht der Mikroorganismen bereitete Nährmedium. Der Nährboden enthält in aufnehmbaren Zustand alle diejenigen Nährstoffe, die der Mikroorganismus während der Kultivierung braucht (s. ebenda IV, S. 249, z.B. Methanol, Ammoniumhydrogencarbonat, Magnesiumchlorid usw.). In der vorliegenden Beschreibung soll,unier dem

Ausdruck Nährmedium das die Nährstoffe und mit diesen zusammen die Präkursoren enthaltende Medium verstanden werden.

Nährstoffe sind die für die ffiikropopulation lebenswichtigen chemischen Substanzen (zum Beispiel die Kohlenstoff- und die Stickstoffquelle). Das Methanol hat in der vorliegenden Erfindung eine doppelte Funktion: es ist einesteils die Kohlenstoffquelle der Biosynthese und liefert darüber hinaus die zur Entstehung der gemischten Mikropopulation erforderliche Energie. ·

Eine halbkontinuierliche Fermsntierung liegt dann vor, wenn die mesophile, methanproduzierende gemischte Mikropopulation dauernd gebildet wird, ,die Fortnahme von Fermentbrühe und der Zusatz von Nährstoffen jedoch periodisch, vorzugsweise täglich ein- oder zweimal, geschieht". .

Die erfindungsgemäß vorgenommene halbkontinuierliche "aufrechterhaltende" Fermentation hat einen doppelten Zweck: die Zusammensetzung der neuen, mesophilen, methanproduzierenden gemischten Mikropopulation wird über längere Zeit hinweg (wenigstens ein 3ahr) bewahrt; in dieser Kultur ist der Wirkstoffgehalt relativ gering. Zum anderen wird der "aufrechterhaltenden" Fermentation periodisch - vorzugsweise täglich ein- oder zweimal - Startfementbrühe für die "produzierende" diskontinuierliche Fermentation entnommen. Letztere hat einen höheren Wirkstoffgehalt. Unter diskontinuierlicher "produzierender" Fermentation (Batchfermentation) wird hier ein diskontinuierlicher Arbeitsgang verstanden, bei dem als Startfermentbrühe die die neue, mesophile, methanproduzierende gemischte iHikropopulation enthaltende Fermentbrühe verwendet wird. \ '

Für die Herstellung des Coenzyms B-, _? sind infolge seiner Bedeutung zahlreiche Fermen-tationsverfahren und Aufarbeitungstechnologien bekannt. Der größte Teil dieser Verfahren

-⁴ -. . . '. : '.ν

Sind aerobe, sterile Verfahren, die den Vorteil haben, daß spezifisch mehr Coenzym B-,- produziert wird. Nachteilig ist jedoch, daß die Kosten wesentlich höher sind, und daß kompliziertere Vorrichtungen verwenden werden müssen. Auch besteht die Gefahr einer Kulturinfektion.

Die Biosynthese des Coenzyms Bi₂ ^wur"de von 0. Florent und L. Nimet (H.O. Pepper and 0. Perlman:. Microbial Technology, 2nd ed., Vol.I, 497-519) zusammengefaßt.

· - j .· ' " -

Es ist bekannt, daß vor etwa zwei Qahrzehnten das Coenzym Β-,ρ aus den im Abwasserschlamm enthaltenen Nährstoffen mit Hilfe der ebenfalls dort enthaltenen Bakterien durch Fermentation hergestellt wurde. Gegebenenfalls ,wurde der Abwasserschlamm durch unterschiedliche weitere Nährstoffe. ergänzt. Das Verfahren hat den großen Vorteil, daß^ves unter septischen Bedingungen vorgenommen werden kann. Nachteilig ist,jedoch, daß für jede Fermentierung eine große Menge Abw₍asserschlamm von der jeweiligen Abwasserreinigungsstation zum Fermentierbetrieb transportiert werden mußte. Die Zusammensetzung des Abwasserschlammes , seine Bakterienpopulation schwankte, und nicht zuletzt konnten auch "Feldstämme" in den Abwasserschlamm gelangen, die die Entstehung, oder besser ausgedrückt, die gezielte Herausbildung einer stabilen Bakterienpopulation unmöglich machten.

In der HU-PS 153 740 wird ein neues Verfahren zur Herstellung des Coenzyms B-J₂ ^au^ anaeroben, septischem Wege vorgeschlagen. Gemäß diesem Verfahren wird dem die entsprechenden Nährstoffe enthaltenden Nährmedium nur ein einziges Mal Abwasserschlamm .zugesetzt, und nach wenigstens fünfmaligem Weiterimpfen reichert sich eine gemischte Population· an, die bereits an sich fähig ist, die Funktion des Inokulums zu übernehmen und Coenzym.B^« ·*·^η einer¹ Menge von 6-6,2 mg/1 Fermentbrühe zu produzieren. Bei diesem sog. "abwasser-

schlammfreien" Verfahren muß jedoch wenigstens fünfmal weitergeimpft (übergeimpft, auf ein frisches Medium übertragen) werden, d.h. die Adaptierung der im Abwasserschlamm vorhandenen Mikroorganismen an die Produktion von Β-,ρ ist zeitraubend, die Mikroorganismen produzieren wenig Coenzym ^B12 ^unc* brauchen viele verschiedene Nährstoffe, deshalb ist das Verfahren teuer. · " ' ,

Zur Herstellung des Coenzyms 3-, ₂ "durch, anaerobe septische Fermentation und zur Erhöhung derAusbeute sind zahlreiche Weitere Methoden bekannt geworden (z.B. US-PS 3 954 971 und 3 979 259) ; diese wurden alle zu dem alleinigen Zweck ausgearbeitet, das oben erwähnte "abwasserschlammfr'eie" Verfahren zu intensivieren. -

Eine mesophile, methanproduzierende gemischte Mikropopu-' lation wurde zum ersten Male' in der ungarischen Patentschrift Nr. 167 658 beschrieben. Sie besteht aus den im Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen (OKI) unter den Nummern 00076,, 00077, 00078 und 00079 hinterlegten folgenden Stämmen : Corynebacetrium sp. (Bezeichnung 24 Al)₁ Corynebaceterium sp. (Bezeichnung 62 B 9),.Lactobacillus sp.( Bezeichnung 244B/C 1) und Propionibacterium sp. (Bezeichnung 239 Al/6). An Nährböden, die von den üblichen abweichende Nährstoffe enthalten , läßt sich diese anaerobe , mesophile , methanproduzierende gemischte Population jedoch nur schwer adaptieren, es muß 6-7-fnal weitergeimpft werden, und ein Weiterimpfungszyklus dauert etwa , sieben Tage. Um eine Fermentation auf diese gemischte Mikropopulation umzustellen, sind in industriellem Maßstab 50^-50 Tage erforderlch, d.h. das Ganze ist zeit- und kostenaufwendig.

Den bisher bekannten Fermentationsverfahren zur Gewinnung des Coenzyms B-,- unter Verwendung anaerober/ mesophiler,

methanprbduzierender Mikroorganismen ist gern einsam, daß sie eine große Anzahl (18-20) verschiedener Nährmediumkomponenten in beträchtlicher Menge erfordern. Ferner sind manche dieser Komponenten, zum Beispiel Melasse , Hydrolysat von Bierhefe, Leberextrakt, Maisquellwasser und SuI-fitablaugenpulver, natürlichen Ursprungs, und deshalb ,schwankt ihre Zusammensetzung. Dieser Umstand macht die Produktion von Coenzyra B-,- unvermeidbar schwankend. Ein weiterer Teil der Nährstoffe, zum Beispiel Glycin und Vernsteinsäure, sind teuer. .

Ziel der Erfindung: ' '

Ziel der Erfindung ist es, Anzahl und Menge der Nährstoffe zu verringern, die Verwendung natürlicher Nährstoffe zu vermeiden und dabei die Wirkstoffproduktion auf der gleichen Höhe zu halten, zweckmäßig noch zu erhöhen, um so die Nachteile der bekannten Methoden zu vermeiden.

Darlegung des Wesens der Erfindung: '

Es wurde nun gefunden, daß durch Einsatz eines eine neue, anaerobe , mesophile , raethanproduzierende Mikropopulation enthaltenden Inokulums und die parallele Durchführung einer halbkontinuierlichen Aufrechterhaltungs- und einer diskontinuierlichen Produktionsfermentation die Anzahl der Nährstoffe auf etwa die Hälfte, der spezifische Nährstoffbedarf je nach Nährstoff um 10-30 % und die spezifischen Kosten (Kosten/Wirkstoff) um 20-25 % reduziert werden können , von den fünf natürlichen Nährstoffen vier fortgelas- -sen werden können, die teuren Nährmediumkomponenten Glycin und Bernsteinsäure nicht erforderlich sind, das Maisquellwasser gewünschtenfalls durch die,wärraebehandelte (hydrolysierte) Lösung des Maisquellwassers beziehungsweise durch Maisschlempe (in der Alkoholherstellung anfallender

Abfallstoff) beziehungsweise dessen Hydrolysat ersetzt werden kann und gleichzeitig die Wirkstoffproduktion um 20-30 % ansteigt.

Das srfindungsgemäBe Verfahren unterscheidet sich in folgendem von den bekannten Verfahren:

- zum Starten der Fermentation wird ein eine neue, anaerobe, mesophäle , raethanproduzierende gemischte Mikropopulation enthaltendes Inokulum verwendet;

- vom Ansetzen des Inokulutns dauert es nur 14-15 Tage, bis Startmaterial für die diskontinuierliche produzierende Fermentation entnommen werden kann; dies erforderte bei den bisherigen Verfahren bisher 40-50 Tage; ^ -

- es wird ,ein neues Nährmedium verwendet, in dem die Anzahl der Nährstoffe etwa die Hälfte der üblicherweise verwendeten ausmacht und ihre Menge (mit Ausnahme desMethanols und des in verschwindend geringer Menge erforderlichen o-Xylidins) um etwa 10-30 % reduziert werden kann; j

- statt Maisquellwässer wird bevorzugt dessen hydrolysierte Lösung oder mit Maisschlerape vermischtes Maisquellwasser oder das Hydrolysat des Gemisches verwendet.

In der folgenden Tabelle werden der Nährstoffbedarf und die produzierte Menge an Coenzym B-^₂ für das bekannte Verfahren gemäß der ungarischen Patentschrift Nr· 183 und für das erfindun'gsgeraäSe Verfahren angegeben, pie Vergleichsdaten sind dimensionslos, ihre Bezugsgrundlage sind die Werte gemäß dem bekannten Verfahren, das in jedem Falle als 1 betrachtet wurde. './..'

Tabelle

Komponente Verfahren gemäß erfindungs·

HU-PS 183 549 gemäß

Methanol	1	1,11
Maisquellwasser	1	0,78
Ammoniurnhydrogencarbonat	1	0,78
Ammoniumsulfat ^ -	1 \	0,92
Magnesiumchlorid	1 ;	0,98
Cobaltchlorid	1	0,69
5,6-Dimethylbenzimidazol	1	0,80
o-Xylidin	r ' :.	1,75
Natriurahydrogensulfit	0	i,o ,
Hydrolysat von Bierhefe	1	0
industrieller Leberextrakt	- α	' ' ' ' 1O
Melasse	1
SuIfitablaugenpulver .	1
Afijmoniumhydroxyd	1	/o:, ·
Diamraoniumhydrogenphosphat	1	0
Glycin	1	0
Bernsteinsäure		ο
Natriumtripolyphosphät :	1	ο ' ·
Aceton r	1	' .. Ο : - '
tägliche Wirkstoffproduktion	1

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung einer unter anaeroben, septischen Bedingungen das Coenzyms B₁₂ produzierenden Fermentbrühe unterr Verwendung eines neuen, anaeroben, mesophilen, mathanproduzierenden Inokulums gemischter Mikropopulation und unter Verwendung eines Methanol , Präkursoren und zum Teil bekannte Nährstoff komponenten enthaltenden neuen Nährmediums. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist kennzeichnend-), daß man

\— Q —

a) 6.8 Tage lang 5-15 Vol.-% der die anaerobe, mesophile, methanproduzierende gemischte Hikropopulation enthaltenden Inokulumfermentbrühe abnimmt und / durch das gleiche Volumen eines Maisquellwasser.-Hydrolysat und/oder Maisschlempe oder deren Hydrolysat und sonstige bekannte Nährstoffkomponenten in geringerer Anzahl und Menge enthaltenden Nährmediums ersetzt und die fortgenommene Fermentbrühe gewünschtenfalls aufarbeitet,

b) nach Erreichen einer Mehtanolassimilationsgeschwin-. digkeit von wenigstens 0,15-0,2 g Methanol/l Fermentbrühe und Stunde das Fortnehmen der Fermentbrühe in der gleichen Weise fortsetzt, jedoch Ammoniumsul- ,. fat und, o-Xylidin enthaltendes Nähermediura zusetzt, ^die Fermentierung 6-8 Tage fortsetzt und gewünschten-'.falls die fortgenommene Fermentbrühe aufarbeitet,

c) nach Erreichen einer Assimilationsgeschwindigkeit von 0,2-0,3 g Methanol/l Fermentbrühe und Stunde (nach Abschluß der Umwandlung der Inokulumfermentbrühe in die aufrechterhaltende Fermentbrühe) das Fortnehmen der Fermentbrühe und den Zusatz von Nährmedium auf die unter·b) beschriebene Weisel fortsetzt, wobei man gegebenenfalls das Fortnehmen der Fermentbrühe für einige Tage unterbricht, und

d) zu den forgenommenen 5-15 Vol.-% aufrechterhaltender Fermentbrühe am ersten Tag die unter b) genannten Nährstoffe und gewünschtenfalls am zweiten Tag nur Methanol, Maisquellwasser oder Maisquellwasserhydrolysat und Ammoniumcarbonat gibt und nach der. Fermentation die produzierende Fermentbrühe aufarbeitet, und -

e) die Schritte c) und d) täglich wiederholt.

- 10 -

ί-rf indungsgemäß geht man im einzelnen so vor, daß man von der unter Punkt a) des Beispiels 1 beschriebenen Inokulumfermentbrühe täglich, 5-15 VoI.-%, vorzugsweise etwa 10 Vol.-%, fortnimmt. Diese Fermentbrühe enthält wenig Wirkstoff, jedoch steigt die Wirkstoffkonzentra-' tion mit der Zeit an; Die fortgenommene Menge kann aufgearbeitet werden. Zu dem zurückgebliebenen Inokulum gibt man die in Wasser beziehungsweise Methanol von 30 bis 35 C gelösten Komponenten des Nährmediuras:

- Methanol -

- hydrolysierte Lösung von Maisquellwasser,

- Aramoniümhydrogencarbonat,

- Magnesiumchlorid,

- Cobaltchlorid,

- 5,6-Dimethylbenzimidazol und

- Natriumhydrogensulfit. ,

Statt der hydrolysieren Lösung des Maisquellwassers kann auch Maisquellwasser oder wärmebehandelte Maisschlerape, gewüoschtenfalls im Gemisch mit Maisquellwasser oder dessen hydrolysierter Lösung, verwendet werden.

Dia Fortnahme der etwa 10 VoI*-% Fermentbrühe und der Zusatz von Nähnaedium werden 6-8 Tage lang fortgesetzt. In dieser Zeit wird die Produktionsfähigl'<eit der gemischten Population für Coenzym B₁₂ fortschreitend besser; das kann durch Analyse des Wirkstoffgehaltes der Fermentbrühe sowie durch Messung der Geschwindigkeit der Methanolassirailation (im folgenden: Methanolyse) verfolgt werden. Wenn die Geschwindigkeit der Methanolyse den Schwellenwart von stündlich 0,2 g/l Fermentbrühe erreicht, werden dem Nährmediura außer den oben bereits aufgeführten Stoffen noch Aramoniufflsulfat und o-Xylidin zugesetzt. Die Fortnahme von Fermentbrühe und der Zusatz von Nährraedium werden noch etwa's 7-10 Tage lang fortgesetzt. In dieser Zeit erreicht

die Methanolysegeschwindigkeit einen Wert von 0,3 g Methanol/l Fermentbrühe und Stunde ; dieser Wert ist für , den Gleichgewichtszustand der halbkontinuierlichen Fermentation kennzeichnend. Die im halbkontinuierlichen 8etrieb gehaltene aufrechterhaltende Fermentbrühe enthält etwa 15r-16 mg/1 Wirkstoff. Die halbkontinuierliche aufrechterhaltende Fermentierung kann wenigstens ein Oahr lang fortgesetzt werden; man nimmt einfach jeden Tag etrwa 10 Vol.% Fermentbrühe ab und fügt stattdessen das gleiche Volumön des durch Ammoniumsulfat und o-Xylidin ergänzten Nähermediums hinzu.

Nachdem die aufrechterhaltende Fermentation ihren Gleichgewichtszustand erreicht hat, wird die entnommene Fermentbrühe nicht mehr aufgearbeitet oder verworfen, sondern diskontinuierlich , chargenweise ein bis zwei Tage lang nachfermentiert (produzierende Fermentierung).

Die chargenweise produzierende Fermentierung wird folgendermaßen vorgenommen, Zu der von der aufrechterhaltenden Fermentbrühe entnommenen Fermentbrühe gibt man ein Nährmedium, das mit Ausnahme von Magnesiumchlorid und Natriumhydrogensulfit die gleichen Nährstoffe enthält» wobei die Mengen fallweise anders sein können. Gewünschtenfalls setzt man der produzierenden Fermentierung am zweiten Tag nur noch Methanol, .Maisquellwasser (oder die weiter oben angegebenen sonstigen Stoffe) und Ammoniumhydrogencarbonat zu. Die chargenweise Nachfermentierung ist innerhalb von zwei Tagen beendet,;und die Ferraentbrühe enthält - abhängend von dem Start der halbkontinuierlichen Fermentierung sowie der Art und Menge der Nährstoffe 26-32 mg/1 Wirkstoff.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorteile:

- Die Zeit, in der sich das Inokulum in die aufrechterhaltende Fermentbrühe umwandelt,, ist verhältnismäßig kurz.

-.Dadurch ,daß weniger natürliche Nährstoffe verwendet werden, schwankt die Wirkstoffproduktion )der aufrechterhaltenden und der produzierenden Fermentierung) nur ganz geringfügig. . '

- Durch Verringerung von Anzahl und Menge der Nährstoffe ist das Verfahren wirtschaftlicher.

- Obwohl das Nährmedium weniger Nährstoffe in geringe- \rer Menge enthält, ist'die innerhalb der Zeiteinheit produzierbare Menge an Wirkstoff etwa 20-30 % größer' als im- Falle ' der bekannten Verfahren. ·''.-,.' '- Durch die Verringerung der Anzahl der Nährsto'ffe und insbesondere durch das Fortlassen der natürlichen Nährstoffe ist die Gewinnung des /Wirkstoffes aus der Fermentbrühe einfacher.

Ausführunasbeispiele:

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der folgenden Beispiele näher beschi Beispiele beschränkt.

Beispiele näher beschrieben, ist jedoch nicht auf diese

a) Herstellung der Inokulums

In einen Laborglä,sfermentor von 10 Liter Nu.tzvolumen werden 6000 ml auf 30-32 C vorgewärmtes Leitungswasser gefüllt .Die folgenden, entsprechend vorbereiteten (s. weiter unten) Nährstoffe werden zugesetzt:

35 ml Methanol , , 10.0 ml Hydrolysat aus 50 g Maisquellwasser

30 Q Ammoniurahydrogencarbonat '1,0 g Magnesiumchlorid . .

0,05 g kobaltchlorid . ;

0,03 g 5,6-Dimethylbenzimidazol 0,30 g Natriumhydrogensulfit.

Nach Zusatz der Komponenten wird das Nährrnedium gründlich homogenisiert und dann mit Leitungswasser der genannten Temperatur auf 8000. ml auf gefüllt. Dann werden dem Nährboden 2000 ml nachverrotteter Abwasserschlamm zugesetzt, der der anaeroben Nachverrottung der städtischen Abwasserreinigungsstation frisch entnommen wurde. Das Gemisch wird verrührt, der Glasfe^mentor durch eine Gummiplatte ver-, schlossen und dann in, einen Thermostat von 32-34⁰C'Temperatur gestellt.

Im folgenden wird jeden Tag (nach vorherigem Homogenisieren) eine Probe von 50 ml Volumen genommen. Dann warden 35 ml Methanol zugesetzt, eine weitere Probe von 200 ml Volumen wird genommen und die Fermentation nach Verschließen des Fermentors fortgesetzt.

Nach siebentägige^* Fermentierung bei konstanter Temperatur erhält man die Fsrmentbrühe der 1. Generation. . <

An der vor dem Zusatz des Methanols genommenen Probe werden der pH-Wert und die Methanolkonzentration der Fermentbrühe bestimmt. Die nach dem Methanolzusatz genommene Probe von 200 ml wird in ein bei 32-34⁰C thermostatisiertes Gasometer gefüllt und die Geschwindigkeit der Biogasproduktion gemessen , Die Probe wird aus dem Gasometer bei der Zugabe der folgenden Dosis Methanol in den Fermentor zurückgegossen.

Am siebenten Tag der Fermentierung wird eine MaßstabsvergröSerung 1:5 vorgenommen: in einen Fermentor des Nutzvolumens 50 Liter werden 30 Liter auf 30-32⁰C vorgewärmtes Leitungswasser gefüllt« Zu dem Wasser werden die auf die gleiche Weise- vorbereiteten Nährstoffe gegeben: ~

175 ml Methanol .

500 ml hydrolysierte Lösung von 250 g Maisquellwasser 150 g Ämmoniumhydrogencarbönat .

- IA- -

5 g Magnesiumchlorid ,

0,25 g Kobaltchlorid

0,15 g 5 ,δ-Oimethylbenzimidazol

,1,5 g Natriumhydrogensulfit.

Nach Zusatz der Nährstoffe wird das Nährraedium mit Leitungswasser der angegebenen Temperatur auf 40 Liter aufgefüllt. Dann wird die gesamte Menge der sieben Tage alten Fermentbrühe (1. Generation) zu dem frisch bereiteten Nährmedium gegeben. Nach intensivem Homogenisieren wird der Ferrnentor verschlossen, und die anaerobe Fermentation wird bei 32-34 C weitere sieben Tage lang fortgesetzt. Auch in dieser Zeit werden täglich 50 ml als Probe entnommen und 175 ml Methanol zugesetzt. Nach dem Zusatz wird eine, Probe von 200 ml Volumen genommen. An den Proben werden pH-Wert, Methanolkonzentration und Geschwindigkeit der Biogasbildung auf die beschriebene Weise bestimmt. Die nach den zweiten sieben Tagen der Fermentierung erhaltene Fermentbrühe ist die sog. 2. Generation.

Am 7.' Tag der zweiten Generation werden 10 % der Ferraentbrühe (5,0 1) entnommen und durch das gleiche Volumen Nährboden der folgenden Zusammensetzung ersetzt:

5000 ml 30-32 C warmes Leitungswasser , 175 ml Methanol . ;

50 ml hydroiysierte Lösung von 25 g Maisquellwasser

' 15 g Ammoniumhydrogencarbonat

0,25 g Kobaltchlorid

0,1.5 g 5,6-Oimethylbenzimidazol

0,10 g Natriumhydrogensulfit ' _,.-'"·

,Nach gründlichem Homogenisieren wird der Fermantor verschlossen. Die Fermentation wird einen Tag-' lang bei 32 bis 34⁰C fortgesetzt.

- 15 -

Auf die beschriebene Weise entsteht das neue, eine anaerobe, mesophile, methanproduzierende gemischteMikropopulation enthaltende Inokulum. Die Stämme dar Mikrppopulation sind beim Ungarischen Landesamt für Gesundheitswesen unter den Nummern 00076\ 00079 (21.12.71) und Ό0271 (26.7.83) deponiert. In der genannten Reihenfolge handelt es sich um die Stämme Corynebacterium sp. (Bezeichnung 24 A 1); Propionibacterium sp. (Bezeichnung 239 A-^/6) ; Methanococcus sp. (Bezeichnung MC-017). Für das Inokulum, ist charakteristisch, daß der pH-Wert bei 5,4-5,8 liegt und die Biogasproduktion 0,5-0,8 1 Biogas/l Fermentbrühe und Tag beträgt.

Das Inokulum ist nunmehr zur Heranbildung der sich aufrechterhaltenden Fermentbrühe geeignet. Dabei werden jeweils etwa 10 Vol.-% der Inokulumferraentbrühe entnommen und aufgearbeitet', die Entahme wird" durch Zusatz des gleichen Volumens Nährlösung ersetzt. Diese Kultur kann auf diese halbkontinuierliche Weise lange Zsit unverändert aufrechterhalten werden. In den ersten Tagen wird eine Probe genommen, deren Wirkstoffgehalt gemäß der ungarischen Patentschrift Nr. 167 658 bestimmt wird; er beträgt 7,3 mg/L

Die Nährstoffe vverden auf folgende Weise vorbereitet. Zur Wärmebehandlung des Maisquellwassers wird Maisqüellwasser mit einem Trockensubstanzgehalt von -etwa 45 Gew.-% mit der gleichen Menge Leitungswasser verdünnt, bis zum Sieden erhitzt und 15 Minuten lang gekocht. Nach dem Abkühlen wird die Lösung auf ihr -ursprüngliches Volumen aufgefüllt. Die auf diese Weise bereitete frische Lösung ist das Maisquellwasserhydrolysat.

Das zur Herstellung des Inokulums vorgesehene Maisquellwasser wird vor der Verwendung auf seine mikrobiologische Eignung geprüft. Dazu werden in einen Laborglasfermentor von 10 Liter Nutz^olumen 9 Liter auf 30-32°C vorgewärmtes Wasser gefüllt und dann die folgenden Nährstoffe zugesetzt:

' "- 16 - ^; '

50 - -ml Methanol

5G g, des zu untersuchenden Maisquellwassers (unhydrolysiert, ohne Wärmebehandlung) rait 45 % Trockensubstanzgehalt

30 g Ammoniumhydrogencarbonat

1 g Magnesiumchlorid ' ' _/

0,05 ο ' Kobaltchlorid

0,03 g 5,6-Dimethylbenziraidazol

0,20 g Natriumhydrogensulf it, . .

Nach dem Vermischen des Nährmediums werden aus dem pro-^s duzieVenden Fermentor 300 ml Fermentbrühe zugegeben, das Volumen wird mit auf 30-32 C vorgewärmtem Leitungswasser auf 10 Liter aufgefüllt.. Die Öffnung des Ferraentors wird mit einer Gummiplatte verschlossen und der Fermentor bei 32-34⁰C thermostatisiert. Täglich wird auf gerührt, mit· 50 ml Methanol versetzt und eine Probe von 200 ml Volumen entnommen, an der die Geschwindigkeit der Biogasbildung' gemessen wird. Wenn am 4. Tag der Fermentierung die Biogasbildung wenigstens 0,3-0,6 1 Gas/l Fermentbrühe und Stunde ausmacht, ist das Maisquellwasser nach der beschrie benen Wärmebehandlung zur Herstellung des Inokulums geeignet . · " . ..

Das 5,6-Diraethylbenziniidazol wird in der vorgeschriebenen Menge Methanol gelöst zu dem Nährmedium gegeben. Die übrigen Nährstoffe werden unmittelbar zugesetzt.

b) die halbkontinuierliche Aufrechterhaltung

Von dem in dem Fermentor mit 50 Liter Nutzvolumen hergestellten Inokulum werden täglich etwa 10 % entnommen und aufgearbeitet. Diese Menge wird durch das gleiche

Volumen Aufrechterhaltungsmedium ersetzt, das auf folgende Weise bereitet wird.

- 17 -

5 Liter Wasser werden auf 30-35⁰C erwärmt, folgende Nähr-' stoffe werden zugegeben:

300 ml Methanol

50 ml hydrolysierte Lösung aus 25 g Maisque11wasser

17,5 g Ammoniumhydrogencarbonat 0,5 g Kobaltchlorid . · ,

0,03 g 5 ,ö'-Dimethylbenzimidazol (das vorher in 10 rai Methanol gelöst wurde),

0,15 g Natriurahydrogensulfit. „

Nach dem Homogenisieren wird das Nährmedium zu dem das Inokulum enthaltenden 50-Liter-Fermentor gegeben,! der Fermentor wird verschlossen und die Fermentierurig bei 32-34⁰C ' fortgesetzt. Von den täglich entnommenen 5 Litern wird eine Probe' genommen, an der pH-Wert, der Wirkstoffgehalt und der Methanolgehalt bestimmt werden. -,; . . ' \

Am 6.-8. Tag der Fermentation mit dem -,.AufrechterhaltUngsmedium erreicht die Methanolyse eine Geschwindigkeit von 0,2 g Methanol/l Fermentbrühe und Stunde. Nun gibt man zu dem, oben genannten Nährmedium 5 g Ammoniurasulfat und 0,2 g o-Xylidin. Das o-Xyiidin wird vorher in 15 ml Methanol gelöst. ' .

Im folgenden wird die tägliche Fortnahme der Ferraentbrühe, ihr Ersatz durch das Amraöniumsulfat und o-Xylidin enthaltendes Nährmedium täglich wiederholt. Dadurch wird die Inokulumfermentation allmählich in die Aufrechterhaltungsfermentation umgewandelt, deren Wirkstoff gehalt 17,5 mg/1 beträgt.

c) die chargenweise produzierende Fermentierung

Die der halbkontinuierlichen Aufrechterhaltungsfsrmentierung entnommenen 5 Liter Fermentbrühe werden zwecks

- 18: -

Erhöhung des Wirkstoffgehaltes einer isiachfermentierung unterzögen ,, Zu diesem Zweck wird dia Fertnantbrühe . mit den folgenden Nährstoffen versetzt:

45 . g Methanol .

3,,5 g Maisquellwasser (Trockengehalt 45 %)

2,5 g Ammoniumhydrogencärbonat

1,5 g "Ammoniuaisulf at

.O_#O.O5g Kobaltchlorid' > \- '

,0,01 g 5 ,S-Qiraehtylbenziniidazol ..'

0,01 g O-Xylidin .< . ' . - .

Das 5,6-üinvethylbenzimidazol und das o-Xylidin werden vorher in 5 ml Methanol gelöst, sq-daS die Gesamtmenge.Methanol 50 ml beträgt. Nach dem Zusatz der Nährstoffe wird der Fermentof verschlossen und einen Tag bei 32-34.C stehengelassen nächsten Tag werden die folgenden. Nährstoffe zugesetzt:

. 20 ml Methanol ' ' .· . 1,_#5 g Maisquellwasser (Trockengehalt 45 %) 1,5 g Ammoniumhydrogencarbonat.

Nach dem Homogenisieren wird bei ,32-34 C einen weiteren Tag lang fermentiert. Danach hat die Ferraentbrühe einen Wirkstoffgehalt von 26 mg/1.

Beispiel 2

Auf die im Beispiel Ib beschirebene Weise wird eine halbkontinuierliche Aufrechterhaltungsfermentation betrieben . Der Wirkstoff gehalt der Ferraentbrühe beträgt 17,5 mg/i. . Die zyklische Fortnähme der Fermentbrühe und die Zugabe von Nährmediura wird für vier Tage unterbrochen. Dies geschieht folgendermaßen: an einem bestimmten Tag- der Fermentierung wird nur· ein Liter Fermentbrühe entnommen. In den folgenden vier Tagen werden täglich 450 ml Methanol und in 250 ml Leitungswasser der Tempen die folgenden Nährstoffe zugesetzt:

in 250 ml Leitungswasser der Temperatur von 30-35⁰C gelöst

- 19 -

50 g hydrplysierte Lösung von Maisquellwasser

30 g Ammoniumhydrogencarbonat

10 , g Aramoniumsulfat

0,5 g Magnesiumchlorid ,

• °'¹⁵ g Kobaltchlorid

0,10 g 5 ,6-OitnethylbenzirQidazol 0,10 g o-Xylidin

0,10 g Natriumhydrogensulfit. .

Während der vier Tage wird keine Fermentbrühe entnommen. Am 5« Tag wird der halbkontinuierliche Betrieb wieder aufgenommen, d.h. täglich werden 5 1 entnommen und statt dessen 500 ml Methanol sowi.e, gelöst in 5 1 Wasser der Temperatur 30-32 C, die folgenden Nährstoffe zugegeben:

50 g hydrolysierte Lösung von Maisquellwasser

17,5 g Aramoniunihydrogencarbonat

5 g Ammoniurasulfat '

0,5 g Magnesiumchlorid

0,05 g Kobaltchlorid

...( 0,03 g 5,6-Oiraethylbenziinidazoi

- 0,2 g o-Xylidin

0,15 g Natriurahydrogensulfit.

Im folgenden werden Ehtahme der Ferraentbrühe. und Zusatz des Nährmediuras auf die beschriebene Weise täglich einmal vorgenommen. Die dabei erhaltene Fermentbrühe hat einen ' / ' .

Wirkstoffgehalt von 24,6 mg/1.

Die aus dem Aufrechterhaltungsfermentor nunmehr jeden Tag entnommenen 5 Liter Fermentbrühe werden zwecks weiterer Erhöhung des Wirkstoffgehaltes gemäß Punkt c) des Beispiels 1 nachfermentiert. Nach 48 Stunden diskontinuierlicher Fermentation beträgt derWirkstoffgehalt 32 mg/1.

- 20 -

Beispiel. 3 . . ^:.

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß das wärmebehandelte (hydrolysierte) Maisquellwasser wirksamer ist als rohes Maisquel!wasser«

Man arbeitet auf die im Beispiel Ib) beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß man zu den 5 1 Nährlösung nicht die (aus 25 g Maisquellwassar hergestellte) hydr.olysier- , te Lösung verwendet, sondern das rohe Maisquellwasser, und-zwar in einer Menge von 50 g (45 %-±g), d.h. doppelt so viel. Die Aufrechterhaltungsfermentbrühe enthält dann 17,0 mg/1 Wirkstoff, die gemäß Beispiel Ic) nachfermentierte Charge 25,0 mg/1. Der Wirkstoffgehalt ist demnach im wesentlichen der gleiche wie gemäß Beispiel Ib) und Ic), obwohl die doppelte Menge Maisquellwassar eingesetzt wurde.

, Beispiel 4 · ' ' ."" ; .

Man arbeitet auf die im Beispiel Ib) beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß man in das dem halbkontinuierlichen Fermentor täglich zugesetzte Nährmedium nicht aus 25 g Maisquellwasser von 45 % Trockengehalt bereitete 50 ml Hydrolysat gibt, sondern die hydrolysierte Lösung von 75 g Maisschlempe des Trockengehaltes von 30 % in 75 ml Wasser. Die Wärmebehandlung (Hydrolyse) der Maisschlempe wird auf die gleiche Weise vorgenommen wie die des Maisquellwassers ( s .· Beispiel 1). ,

Bei der Nachfermentierung gemäß Beispiel Ic) Wird statt des dort zugesetzten Maisquellwassers 5,25- g (erster Tag) beziehungsweise 2,25 g (zweiter Tag) Maisschlempe verwendet. Nach zwei Tagen Nachfermentierung beträgt der Wirkstoffgehalt der Fermentbrühe 25,2 mg/1.

- 21 -

Das Beispiel zeigt, daS das hjaisquellvvasser beziehungsweise sein Hydrolysat auch durch wärmebehandelte Maisschlempe ersetzt werden kann.

Claims (3)

1. P a t e η t a n s ρ r ü ehe:

   Verfahren zur Herstellung einer unter anaeroben, septischen Bedingungen des Coenzym B-, ₂ produzierenden^ Fermentbrühe unter Verwendung eines neuen, anaeroben, mesophilen , methanproduzierenden Xnokulums gemischter Mikropopulation und unter Verwendung eines Methanol, Präkursoren und zum Teil bekannte Nährstoff komponenten enthaltenden neuen Nähermediums, gekennzeichnet dadurch, daß man '.''' .-.. ' ..'- .

   a) 6-8 Tage lang 5-15 Vöi.-% der die anaerobe, ntesophile, : methanproduzierende gemischte Mikropopulation enthal-

   ' . $ enden Inokulunif ermentbrühe abnimmt und durch das gleiche Volumen eines Maisquellwasser-Hydrolysat und/ oder Maisschlempe oder deren' Hydrolysat und sonstige,, bekannte Nährstoff komponenten in geringerer Anzahl und Menge enthaltenden Nä^rraediüms ersetzt, und die fortgenommene, Fermentbrühe gewünschtenfalls aufarbeitet,

   b) nach Erreichen einer Methanolassimilationsgeschwindigkeit von wenigstens 0,15-0,2 g Methanol/l Fermentbrühe und.Stunde das Fortnehmen der Fermentbrühe in der gleichen Weise fortsetzt, jedoch Ammoniumsulfat und o-Xylidin enthaltendes Nährmedium zusetzt, die, Fermentierungc 6t8 Tage fortsetzt und gewünschtenfalls die fortgenommene Fermentbrühe aufarbeitet,

   c) nach Erreichen.einer Assimilationsgeschwindigkeit von 0,2-0,3 g Methanol/l'Fermentbrühe und Stunde (nach Ab-

   • Schluß der Umwandlung der Inokulumfermentbrühe in die Aufrechterhaltungsfermentbrühe) das Fortnehmen der Fermentbrühe und den Zusatz¹ von Nährmedium auf die unter'b) beschriebene .Weise fortsetzt, wobei man gegebenenfalls, das Fortnehmen der Fermentbrühe für einige Tage unterbricht, '

   - 23 -

   d) zu den fortgenommenen 5-15 VoI.-% Auf rechterhaltungsfermentbrühe am ersten Tag die unter b) genannten Nährstoffs und gewünschtenfalls am zweiten Tag nur Methanol, Maisquellwasser oder Maisquellwassarhydroiysat und Ammoniumcarbonat gibt und nach der'Fermentierung die produzierende Fermentbrühe aufarbeitet und . - '

   e) die Schritte c) und d) täglich wiederholt.

   Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Charge (Batch)"produzierender Fermentbrühe , gekennzeichnet dadurch , daß man

   a.) nach Erreichen einer Assirailatipnsgescrnvindigkeit von 0,2 g Methanol/l Fermentbrühe und Stunde täglich 5 bis 25 Vol.)o der Aufrechterhaltungsfermentbrühe fortnirnrnt und durch das gleiche Volumen eines Maisquellvvasser-Hydrolysat und/oder Maisschlempe^Hydrolysat und sonstige bekannte Nährstoffkomponenten in geringerer Anzahl und Menge enthaltenden Nährmediums ersetzt, ge-" wünschtenfalls das Fortnehmen der Fermentbrühe für einige Tage unterbricht und die fortgenoramene Fermentbrühe aufarbeitet, '

   b) zu den fortgenommenen 5-15 Vol.-% Fermentbrühe am ersten Tag die unter a) genannten Nährstoffe und gewünschtenfalls am zweiten Tag nur Methanol gibt und die erhaltene Charge Ferraentbrühe aufarbeitet, und

   c) die Schritte a) und b) täglich wiederholt.

   Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß maq in der halbkontinuierlichen Aufrechterhaltungsf ermentation als Nährstoffe Methanol, die hydrolysierte Lösung von Maisquellwasser, Ammoniumhydrogencarbonat, Ammohiumsulfat, Magnesiumchlorid und Natriurahydrogensulfit, als Präkursoren Kobaltchlorid, 5,6-Oi-

   inethylbenziraidazol und gegebenenfalls o-Xylidin verwendet

   4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man in der produzierenden diskontinuierlichen Fermentierung als Nährstoffe Methanol, Maisquellwasser, Amrno· niumhydrogencarbonat , Araraoniumsulfat und die bekannten Präkursoren¹ verwendet. _y '
2. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2/ gekennzeichnet dadurch, daß man statt der hydrolysieren Lösung von Maisquellwasser hydrolysierte Maisschlem'pe oder hydroiy-'sierte Maisquellwasserlösung zusammen mit Maisschlempe verwendet. . ^N ] . '
3. 6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet-dadurch, daß man statt Maisquellwässer oder dessen hydrolysierter Lö-

   sung hydrolysierte Maisschlempe verwendet;

   - 25 -