HUT58796A - Process for producing acetylized heterologue polypeptides - Google Patents

Process for producing acetylized heterologue polypeptides Download PDF

Info

Publication number
HUT58796A
HUT58796A HU903721A HU372190A HUT58796A HU T58796 A HUT58796 A HU T58796A HU 903721 A HU903721 A HU 903721A HU 372190 A HU372190 A HU 372190A HU T58796 A HUT58796 A HU T58796A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
rbst
somatotropin
lysine
positions
fermentation
Prior art date
Application number
HU903721A
Other languages
English (en)
Other versions
HU903721D0 (en
Inventor
David Paul Brunner
Robert Lee Garlick
Gary Clyde Harbour
Stephen Baker Lyle
John Edward Mott
Jules A Shafer
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of HU903721D0 publication Critical patent/HU903721D0/hu
Publication of HUT58796A publication Critical patent/HUT58796A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

A találmány tárgya a mikrobiológia és proteinkémia területére esik. Részletesebben egy, a rekombináns heterolog polipeptidek fermentációval történő előállítási eljárás, pontosabban szarvasmarha szomatotropin (rbSt) előállítási eljárás, valamint ebből készített új rbSt.
A találmány háttere
A szintézis és a kémiailag jellemzett körülmények a mikroorganizmusok szaporításához jól ismertek. A baktériumok szaporítására alkalmas hagyományos táptalaj alkalmas a heterolog polipeptideket termelő rekombináns baktériumok szaporítására. A fontos aminosavak mennyisége csökken a táptalajban, miközben jó minőségű heterolog polipeptidek keletkeznek nagy mennyiségben. Ilyen körülmények között a fermentáció során heterolog polipeptidek új acetilezett analógjai, így például rbSt is keletkezhetnek.
A természetben előforduló bovine szomatotropin (bSt) vagy növekedési hormon kinyerhető a szarvasmarha hipofízis mirigyéből mint heterogén proteinek keverékéből (Páladra, A.C. et al., 1983. CRC Reviews in Biochem. , 15:25-26). Meghatározatlan elektroforetikus különbségek mutatkoznak, ha a natív marha hipofízis extraktumokat anion cserélő kromatográfiásan frakciónálják (Hart, I.C. et al., 1984. Biochem. J., 218:573-581). Az izoform hipozízis bovine szomatotropinok (pbSt) különböző izoelektromos ponttal (pl) jellemezhetők, a domináns formához a pl=8,2 tartozik.
- 3 Ismert, hogy a bSt deamidálódáson mehet keresztül, miközben zárt szerkezetek jönnek létre, és nagy számban keletkeznek alacsonyabb pl-vel jellemezhető formák, melyek pl 7.0, 6.0 és 5.5-nél izoelektromosan fokuszálhatóak (Lewis, U.J., et al., 1970. Biochim. Biophys. Acta., 214:498-508; Secchi, C., et al., 1986. Int.J. Peptide Rés. 28:298-306).
Technika állása
A marha szomatotropin acetilálása, alapvetően az £ -amino csoportként jelenlevő lizin csoportnál a protein pozitív töltésének csökkenését eredményezi az acetilcsoport semleges természetének köszönhetően, így a keletkezett bSt-k pl értékei csökkennek. A bSt kémiai acetilálása ismert, azonban így számtalan acetilezett termék keletkezik, mert a lizinnel együtt számos más aminosav is reakcióba lép (Oikawa, A., et al., 1967. Biochem. J., 104:947-952; De Satz,
V. B. és J.A. San törne 1981. Int. J. Peptide Protein Rés. 18:492-499).
A természetes eredetű proteinek acetilezése ismert. A Tobacco Mosaic vírusból származó dipeptid acetilálással történő modifikálását ismertették legelőször (Narita, K, 1958. Biochim. Biophys. Acta, 28:184-191). Ezen túl nagy számú protein, mint például ovalbumin, tojás albumin, hemoglobinok, histonok tartalmaz acetilezett aminosavakat (Harris, J.I., 1959. Biochem. J. 71:445-459; Narita, K., 1961. Biochem. Biophys. Rés. Comm. 5:160-164; Schroeder,
W. A. et al., 1962. Biochim. Biophys. Acta, 63:532-534;
Phillips, D.M.P., 1963. Biochem. J., 87:258-263).
Az N**-acetilált proteinek széles körben fordulnak elő az eukariota és prokariota szervezetek és vírusok esetében (Driessen, H.P.C. et al., 1985. CRC Crit. Rév. Biochem., 18:281-325). Például az a vélemény, hogy az Ehrlich hasvízkór sejtek oldható proteinjeinek 80%-a NK -acetilezett (Brown, J.L. és W.K. Roberts. 1976. J.Biol. Chem. 251: 1009-1014). N0'·-acetilezés úgy tűnik nem random folyamat, alanin és szerin elsődleges célpontok, míg a metionin, glicin és aszpartiksav csak kevés proteinben van modifikált formában, és számos aminosav nem ismeretes N6* -acetilezett formában (Wold, F., 1981. Ann. Rév. Biochem., 50:783-814).
A proteinek, melyek oldalláncban vannak acetilezve, egy másik csoportja a természetben ismerten jelenlevő acetilezett proteineknek, habár kevésbé jelentősek, mint az N01 -acetilezett proteinek. Az Nft -acetilázok különböznek az -acetilázoktól, míg az előbbi specifikus a lizin £-amino-csoportjához és a sejtmagban vagy citosolban van lokalizálva, addig N00 -acetilázok a riboszomához kapcsolódnak (Sterner, R. et al., 1979. J. Bioi. Chem. 254: 11577-11583; Pestana, A. and H.C. Pitot, 1975. Biochemistry, 14:1397-1403; Pestana, A. and H.C. Pitot, 1975. Biochemistry 14:1404-1412) .
Viszont mindkét acetiláz típus katalizálja az acetil vándorlást a CoA-acetil-ról a proteinekre (Wold, F-, fentebb idézett publikációja).
-acetilezése a lizin csoportoknak első ízben a H3 és H4 hisztonok esetében lett kimutatva (Allfrey, V.G., et al., 1964. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 51:786-794). A hisztonokon túl egyéb DNS-hez kapcsolódó proteinek, mint nagy mobilitásé proteinek (HMG) szintén -acetilezett (Sterner, R. , et al., fentebb idézett publikáció).
Az Escherichi a coli-ból származó proteinek közül kevés rendelkezik lizinen túli savakkal. Az E.coli piruvat dehidrogenáz komplex a lipoil részben acetilezett, amely rész lizin amino-csoportjához kötődik a proteinen (Adamson,
S.R., et al., 1986. Biochem. Cell. Bioi., 64:250-255). A legtöbb beszámoló, amely E.coli-ban levő proteinek acetilezésével foglalkozik, a riboszomális proteinek acetilezésére koncentrál. Az E.coli riboszomális L7 proteinjének (212 proteint termel) szerin csoportjának és riboszomális S5 és S18 proteinek alanin csoportjainak ΝΛ -acetilezését ismertetik (Brot, N. and H. Weissbach, 1972. Biochem. Biophys. Rés. Commun. 49:673-679; Wittmann-Liebold, B. and B. Greurer, 1978. FEBS Lett·, 95:91-98; Yaguchi, M., 1976. FEBS Lett. 59:217-220).
Korábban nem volt ismert az acetilezett heterolog polipeptidek előállítása vendég mikroorganizmusokkal, mint például E.coli, és nem volt ismert az acetilezett bSt.
A találmány összefoglalása
A jelen találmány az acetilezett heterolog polipeptidek fermentációs úton történő előállítása, részletesebben rekombináns bovin szomatotropin analógok (rbSt) és új rbSt ily módon történő előállítása.
Még részletesebben a jelen találmány egy eljárásra vonatkozik, amellyel rbSt acetilezett analógja állítható elő olyan mikroorganizmussal, melynek növekedése egy meghatározott fermentációs közegben végezhető, mely közegben az aminosavak koncentrációja alacsony.
Még részletesebben jelen találmány egy új acetilezett rbSt analógra vonatkozik.
Még részletesebben a mikroorganizmus egy rekombináns mikroorganizmus és az rbSt kifejezetten egy heterolog polipeptid.
A jelen találmány tehát vonatkozik egy acetilezett rbSt előállítási módszerre, amikor a specifikusan a lizin csoportokat alginin és/vagy glutamin csoportokkal helyettesítjük, továbbá az így keletkező új rbSt molekulákra.
A találmány részletes ismertetése
A továbbiakban heterolog polipeptid(ek)” nem természetes eredetűek, hanem transzformált gazda mikroorganizmussal szintetizáltak. Például egy E.coli gazda mikroorganizmussal elő lehet állítani bst-t, inzulint, interferont, stb. Az így előállított polipeptideket hívjuk heterolog poli• *
- 7 peptidek-nek. A jelen találmánnyal kapcsolatosan különösen érdekesek azok a heterolog polipeptidek, melyeket az emlős szomatotropinok tartalmaznak, mint például a bSt.
Az alábbiakban használatos aminosavaknak alacsony koncentrációja egy olyan koncentrációt jelent, amely elég alacsony ahhoz, hogy a rajta tenyésztett mikroorganizmus által egy ún. minimál aminosav koncentrációra redukálódjon, amely úgy is meghatározható, mint exogén (külső) aminosav-koncentráció, amely túl alacsony ahhoz, hogy represzálja (viszszanyomja) az aminosav bioszintetikus enzimek szintézisét, vagy akadályozza hatásosan a visszacsatoló aktivitást.
Az alacsony koncentrációjú aminosavaknak a minimál aminosav koncentrációra történő ilyen redukciója a heterológ polipeptid bioszintézise folyamán vagy közvetlen előtte történik. Például E.coli gazdaszervezet és a specifikus minta rbSt polipeptid esetében az aminosav alacsony koncentrációja egyenként kevesebb, mint 0,50 mM, mivel 0,1% élesztő extrakt pótlásból származott. Az alacsony koncentrációjú aminósav minimum aminosavkoncentrációra redukálódott, amely kevesebb, mint 0,05 mM - minden esetben.
Az alkalmazott rekombináns gazda mikroorganizmusok ebben a találmányban rekombináns DNS technikákkal készültek, melyek jól ismertek a szakmabeliek előtt és megismerhetők pl. a Molekuláris klónozás, T. Maniatis, et al., a Cold Spring Harbor Laboratory (1982) és a Practical Guide to Molecular Cloning, Perbal, B., John Wiley et Sons (1984) • · · ·
- 8 művekben, amelyeknek a hivatkozásait itt összefoglaltuk. A hasznos gazda mikroorganizmusok magukba foglalják a jól ismert gazdák valamelyikét, amelyek alkalmasak a klónozás, a heterológ gén kifejlesztésére és befogadására, mint például Bacillus, Saccharomyces és Streptomyces törzsek.
A heterológ polipeptidet termelő rekombináns mikroorganiznusokat folyékony táptalajon tenyésztik. A táptalaj tartalmazza az ismert tápanyagokat, amelyek kielégítik a mikroorganizmus sejt növekedési igényeit, ezáltal elősegítve, hogy a mikroorganizmus növekedjen és szaporodjon egy előre meghatározott sejtsűrűségig. Ez az anyag magába foglalja a szén-, nitrogén- és ásványi anyag forrásokat, mint a kén, foszfor, magnézium, kálium, réz, cink, mangán és vas. Aminosavakat fehérje hidrolizátum formában adhatunk hozzá, rendszerint természetes formában előforduló fehérje anyagokat, mint a kazeint, szójalisztet, laktalbumint (tejfehérje) , állati szövetet, élesztősejteket és zselatint, savas vagy enzimatikus bontáshoz. Tiszta aminosav keverékek szintén alkalmazhatók.
Oxigént is adunk a táptalajnak. Hogy elérjük a legnagyobb tenyészsűrűséget, a tenyésztést rendszerint olyan módon hajtjuk végre, hogy az oxigén/folyadék érintkezési felület nagysága nőjön.
A kultúrát befolyásoló fontos környezeti faktorok a pH és a hőmérséklet. A hőmérséklet a minimum és maximum hőmérsékletek formájában adható meg. A legtöbb baktérium egy meglehetősen szűk hőmérsékleti' tartományon túl maximális
>
X
- 9 növekedést mutat. A nazofil baktériumok számára, mint az E.Coli esetében, az optimális hőmérsékleti tartomány körülbelül 25 °C-tól 42 °C-ig terjed, legkedvezőbb a kb. 37 °C. A legtöbb szervezet képes tolerálni a hidrogénionkoncentrációt néhány pH egységen belüli tartományban. A baktériumok számára, mint az E.Coli, a tolerálható pH intervallum kb. 6-tól 8-ig terjed, legkedvezőbb a 6,8 pH.
Ha egy heterológ polipeptidet kódoló gén működése egy elnyomható kontroll szekvencia hatása alatt van, akkor az specifikusan akadályozhatja annak a működését (kifejeződését) egy előre meghatározott növekedési szintig, ez egy olyan sejtkultúrával érhető el, amelyhez megfelelő represszort adagolnak (pl. triptofánt, amikor a működés a triptofán promotor és operátor ellenőrzése alatt áll).
A tenyésztés után a sejteket olyan feldolgozás alá vetik, hogy kinyerhetők legyenek a heterológ fehérjék. Ez rendes körülmények között magába foglalja a sejtek szétzúzását, a nyers heterológ polipeptid elválasztását a baktérium fehérjétől egy vagy több lépcsős extrahálással, a polipeptid oldását (annak hidrofób jellegétől függően), a szulfhidrilek oxidálását megfelelő diszulfid kötések kialakítása céljából, megfelelő esetben további tisztítását a polipeptideknek ion-cserélő kromatográfiával, gélfiltrációval, nagy nyomású folyadék kromatográfiával vagy más fehérje tisztítási eljárással.
Heterológ fehérje termelés céljából rekombináns mikroorganizmusokkal fermentációs folyamatot végezhetünk, például rbSt E.coli K-12 törzsekben. Ezek a fermentációk alacsony élesztő extrakt, 0,1% élesztő extraktot tartalmazó fermentációs anyaggal járnak együtt és hatásosan segítik a rekombinációs mikroorganizmusokban a polipeptidek képződését.
A szomatotropinok molekuláris heterogenitása következtében a különböző szomatotropinok aminosav helyeinek (reziduum) pozíció száma különbözhet. Az eredeti emlős szomatotropin elnevezés magába foglalja ezeket a természetesen előforduló fajokat. Az 1. Térkép a bSt egyik fajának specifikus aminosav szekvenciáját mutatja be. A számozás más szomatotropinok esetében különbözhet, ahol analógok fordulnak elő. A szakmában alaposan tájékozottak könnyen tehetik helyére a megegyező aminosav-szekvenciákat a többféle eredetű emlős szórnatotropinokban és azok analógjaiban.
A pbSt izoformákban fordulnak elő, amelyek izoelektromos pontjaikban különböznek. Izoelektromos fokuszálással az 5.5, 6.0 és 7.0 pl értékkel szorosan egymás melletti sávok halmaza mellett a legnagyobb mennyiségben a 8,2 pl értékű forma jelentkezik. RbSt szintén tartalmaz alacsonyabb pl értékű fajokat, 5.5, 6.0 és 7.0 pl értékkel. Az rbSt lúgos vizes oldatban (így 0,lM (NH^^CO^ (pHlO) történő incubálása az alacsonyabb izoelektromos ponttal rendelkező fajok felé való eltolódását idézi elő. Kiterjedt szerkezeti analízis kimutatta a lúgos'kezelést követően a váltó11 • · · · 4 · • · « ♦ · « • · · · · · · · · · • · ··· · «· « zást, amely magába foglalta a 99-es aminosav reziduumban (1. Térkép) elhelyezkedő aszparagin átalakulását izoaszparaginsav illetve aszparagin savvá (lásd S.N. 07/299, 107 sz. US szabadalmi bejelentés, elsőbbsége 1989. február 19.)
Izolált rbSt, amelyet a 99-es (Asn 99) (1. Térkép) aminosav reziduumban lokalizált aszparagin helyett szerinnel helyettesítettünk, így elkerülve az izoaszparaginsav keletkezését, szintén 5.0, 6.0 és 7.0 pl értékű rbSt fajokat tartalmazott. A 7.0 pl értékű Ser99 fajok az összes rbSt fajok közel 30%-át tették ki. Tisztított 7.0 pl értékű természetes rbSt (Asn99) anyagot használva, a független szerkezetvizsgálatok legalább négy 7.0-es pl értékű fajtát mutattak ki, amelyek a 157., 167., 171. és 180-as lizin reziduumok (helyek) acetilezésével képződtek. (1. Térkép) Ilyen egyszeres acetilezés nélkül egy természetes 8.2 pl értékű Ser99 rbSt lenne megfigyelhető. A lizin reziduumok többszörös párhuzamos acetilezése, a 7-nél kisebb pl értékű fajok megjelenését segíti elő. Más rbSt lizin reziduumok (30, 64, 70, 112, 114, 139 és 144-es - 1. Térkép) acetilezését nem detektáltuk, de jelen lehetnek.
A lizin reziduumoknak a fehérje túltermelés céljából a fermentáció folyamán történő tervszerű acetilezése képessé teszi a fehérjék szintézisét arra, hogy nagyobb rezisztenciával rendelkezzenek a tripszin és tripszinhez hasonló proteázok és lizin specifikus átalakító reagensek okozta fehérjebomlásával szemben. Továbbá, mivel az £-aminocsöpörtón
* · · • « · · ···· > · · • · · ·
- 12 levő lizin acetilezése a polipeptid pl értékében csökkenést vált ki, mégpedig egy egység acetilezésenként, az ilyen polipeptid feltehetően kevésbé érzékeny, mint a hasonló, de emlős keringési rendszeréből származó polipeptid. Egy alacsonyabb pl érték feltehetően növeli az rbSt oldhatóságát izolálási és átalakítási körülmények között.
Más szempontból kívánatos lenne a lizin reziduumok esetében acetilezés nélkül produkálni rbSt-t. Ez hozzásegítené a homogén termékek előállítását a terméktisztaság megőrzése mellett.
A fermentáció alatti specifikus lizin reziduumok acetilezése az rbSt túltermelés céljából meglepő volt és az ilyen acetilezés mechanizmusa nem ismert. E találmányt megelőzően nem voltak ismertek a fermentációs módok arra vonatkozóan, hogy rbSt-t kapjunk lizin reziduumok acetilezésével. Továbbá nem voltak ismertek azok a módszerek, amelyekkel megelőzhető az rbSt keletkezése folyamán a specifikus lizin helyek acetileződése.
Baktérium tenyészet: E.coli törzset (DU45) alkalmaztunk. Ezt a törzs a K-12 típusú (ATCC e23716) E.coli törzsből származott a lambda profág és F plazmid eltávolításával és rpoH112 alléi bevitelével. Ezt a törzset aztán pURA99Ser-m4-gyel alakítottuk át, egy hőmérséklet érzékeny, ál-gazdabaktériummá, amely pURA-4 plazmádból származott és bST kódoló gént tartalmazott (PCT/US88/00328 számú PCT bejelentés), a 99-es helynél (1. Térkép) az aszparay1 s i
·♦·· ··«·
- 13 gint szerinnel helyettesítve (lásd S.N. 07/299, 107 sz.
US. bejelentés).
Táptalajok: a megjelölt táptalajok Vogel és Bonner E táptatajon alapultak (Vogel, H.J. és D.M. Bonner, 1955. I. Bioi. Chem., 218:97-106). A primer-mag és fermentációs táptalaj elkészítéséhez a következő összetétel és jegyzőköny reprezentálható :
Primer-tápoldat
Komponensek Mennyiség/liter
Na(NH4)HPO4.H2O 10.90 g
K2HPO4 2.61 g
citromsav. H2O 2.10 g
MgSO4.zH2O 0.99 g
(NH4)2SO4 0.66 g
élesztő extrakt 10.44 g
Glycerol 5.00 g
R.O. víz
A primér táptalajhoz, a fenti komponenseket 1000 ml-re töltöttük fel vízzel (fordított ormozisos tisztaságú: R.O.) és 300 ml-es mennyiségekre osztottuk szét az első sterilizáláshoz. A táptalajt 121 °C-on 20 percig sterilizáltuk.
A sterilizálás után a táptalajt lehűtöttük és 0,5 ml steril ampicillint adtunk hozzá (25 g/l-t R.O. vízbe, amelyet NaOH-dal 8 pH-ra titráltuk és sterilen szűrtük. 0,45 U.m) .
·<·« ··»·
- 14 Fermentációs közeg
Komponensek Mennyiség/liter
Na(NH4)HPO4.H2O 10.90 g
k2hpo4 2.61 g
vízmentes citromsav 1.92 g
MgSO4.7H2O 0.25 g
(nh4)2so4 0.66 g
Élesztő extrakt 1.00 g
SAG4130 0.75 g
R.O.víz
A fermentációs közeget a fenti komponensek mennyiségének 200-szoros megnövelésével és 165 1 R.O. vízzel oldva (hidratálva) 250 1-es fermentálóban készítettük elő. A fermentációs táptalajt 121 °C-on 20 percig sterilizáltuk (a sterilizálás folyamán a táptalaj térfogatának 20 1-es növekedésével számoltunk a gázlecsapódás következtében). A sterilizálást követően a közeg pH-ját 6,6-6,9 között állítottuk be. A hűtés folyamán két aszeptikus adalékanyagot adtunk a teljesség végett a fermentációs rendszerhez.
Az első adalék a mikrotópanyagok 200 ml-es aliquot mennyiségéből állt (végső koncentrációk: (NH^)θ(MOy), ; H3BO
MnCl2.4H2O, 319,4jpM; ZuSO^ . ΪΗ^Ο 40,1,μΜ), amelyet (0,4 5 m-es) szűréssel sterilizáltunk. A második adalékanyag 15 1 cerelózból állt (8,24 kg cerelóz 14 1-re való feltöltése R.O. vízzel és H2SO^-gyel 4-es pH-ta való állítással).
3, 1,6 mM; CoCl2.gH20, 120um; CuSO^, 25,5 ÜM;
- 15 A fermentációs médiumot 25%-os NaOH-dal 7,2 pH-ra állítottuk a beoltást megelőzően. Az alacsony élesztőkivonatú fermentációs médium 0,1% élesztő kivonatot tartalmazott a
DU45 tenyészetekre vonatkozóan.
- 16 1. Térkép Szarvasmarha szomatotropin aminosav szekvenciája
ala phe pro ala met ser leu ser giy 10 leu phe ala asn ala val
leu arg ala gin 20 his leu his gin leu ala ala asp thr phe 30 lys
glu phe glu arg thr tyr ile pro glu 40 gly gin arg try ser ile
gin asn thr gin 50 val ala phe cys phe ser glu thr ile pro 60 ala
pro thr gly lys asn glu ala gin gin 70 lys ser asp leu glu leu
leu arg ile ser 80 leu leu leu ile gin ser trp leu giy pro 90 leu
gin phe leu ser arg val phe thr asn 100 ser leu val phe giy thr
ser asp arg val 110 tyr glu lys leu lys asp leu glu glu gly 120 ile
leu ala leu met arg glu leu glu asp 130 gly thr pro arg ala giy
gin ile leu lys 140 gin thr tyr asp lys phe asp thr asn met 150 arg
ser asp asp ala leu leu lys asn try 160 giy leu leu ser cys phe
arg lys asp leu 170 his lys thr glu thr tyr leu arg val met 180 lys
cys arg arg phe giy glu ala ser cís 190 ala phe
F
1. Példa
Acetilezett rbSt előállítása élesztő kivonat alacsony fermentációjával
Minden egyes primer tenyészetet egy ampullányi kultúrával oltottunk be (kb. 1 ml), majd 28 °C-on 0,7-0,8 A550 kultúrasűrűségig inkubáltuk. Az inkubációt követően minden egyes primer tenyészetet jég közé tettünk a fermentorban történő felhasználás előtt. A primer kultúrát ampicillinnel egészítettük ki, hogy a kultúrák minden lényeges plazmid hordozó baktériumot tartalmazzanak.A DU45 fermentáció iniciálása 600 ml oltóanyaggal végzett beoltással történt. A fermentor pH-ját vízmentes ammóniával szabályoztuk, hogy a 7,2-7,4 közötti értéket tudjuk tartani. A fermentor keverése 320 fordulat/perc és levegőztetése 300 slm-mel 10 psig ellennyomással történt. A kultúrák tenyésztési hőmérséklete 27 °C volt. A DU45 fermentáció is 27°C-on történt, amelynél a plazmid folyamatosan replikálódott és az rbSt szintézis spontán indukálódott (88/003280 számú PCT szabadalmi bejelentés szerint).
A tenyészetből a kezdési időponthoz képest eltérő időtartamok után mintákat vettünk és analíziseket végeztünk a tenyészet sűrűségének (550 nm-nél mért abszorbancia), teljes bakteriális száraztömegnek, a teljes rbSt koncentrációnak, glükóz koncentrációnak, szabad ammónia koncentrá18 ciónak, acetát koncentrációnak és az alakos elemek mikroszkópos identifikálásának (azonosítása) a meghatározására.
A DU45 törzs fermentációs kultúrájából nyert tisztított rbSt preparátumokból izoelektromos fókuszálással (IEF) állapították meg az acetilált rbSt szintjét (pl 7,0 volt szemben a Ser99-rbSt 8,2-es pl értékével). Minél több volt a pl 7,0-es rbSt, az összes rbSt-nek annál nagyobb része volt monoacetilált formában. Az IEF-t 1 mm vastagságú horizontális gél lapon végeztük 5% T és 3% C alkotórészekkel, pH=3,5-9,5 tartományban (LKB PAG plate 1804-101). A futtatás denaturálószer nélkül történt, max. 1500 V-on, állandó 30 W teljesítménnyel 10°C-on. Ezután a géleket 30 percig szobahőmérsékleten fixáltuk triklórecetsav 11,5 (W/v)%-os vizes oldatában, amely szulfoszalicilsavra 3,5 (W/v) %-os volt. A festés 60°C-on történt 10 percig Coomassie Blue R250 0,1 (W/v) %-os oldatában, amelyet 25% etilalkohol : 8% ecetsavban készítettünk. A visszafestés szintén 25% etanol:8%ecetsavval történt. Az rbSt fajták mennyiségi meghatározását az IEF gélben LKB lézer denzitométerrel végeztük el.
A fermentációs mintákat alacsony fermentációjú élesztőkivonaton tartottuk fenn, és a monoacetiált rbSt (ez a 7,0 pl formája a Ser99 rbSt-nek) mennyiségét IEF-fel mérték. Az 1. Táblázat mutatja a monoacetiált rbSt fajták szintjét az rbSt preparátumok 24,9%-34,7% frakcióiban a fermentáció során. Ezek az adatok azt is jelzik, hogy a monoacetilált rbSt-k a fermentáció korai szakaszában jelentősek (a beoltást követő 17 órában), majd viszonylag állandó marad a folyamat végéig.
2. Példa
A 99, 181 és 189-es pozícióban szerint kódoló rbSt gén pozíció-irányított mutagenézise, mely eredményeként a 157, 167, 171 és 180 pozícióban lizint kódol
1. A 99, 181 és 189-es pozícióban szerint kódoló rbSt gén konstruálása
A négy terminális lizin modifikálására használt rbSt gént m4-nek jelölték. Az m4 gén szerkezete ismert (PCT/ US88/00328 sz. PCT szabadalmi bejelentés). Később az m4 gént tovább módosítottuk a 99., 181. és a 189. pozíciójú szerin-kodonok beépítésével. A pTrp-bGH-m4-99Ser vektor konstrukciója a 99. pozíció szerin-helyettesítésével kezdődött az S.N. 07/299, 107 számú US bejelentés szerint.
Az m4 rbSt gént tartalmazó pDH-bSt-m4-Serl81/9 vektort a 181. és 189. pozícióban való helyettesítéssel folytattuk az S.N. 07/304,733 számú US bejelentés szerint, melynek elsőbbségi időpontja 1989. január 31.
Egy, a 99., 181. és 189. pozícióban szerint kódoló m4 rbSt gént a pTrp-bGH-m4-99Ser és a pDH-bSt-m4-Serl81/9 vektorok egyedi, Eco Rl-es és MstlI restrikciós enzimekkel való hasítás segítségével lett konstruálva (New England Biolábs, Beverly, MA). Mindkét restrikciós enzim egy hasítási hellyel rendelkezik, s így egy nagyobb és égy kisebb vektor-fragment (kb. 814 bp<hosszúságú) keletkezik.
- 20 A 814 bázispár hosszúságú darabot izoláltuk a pTrp-bGHm4-99Ser-ből az előzőleg már leírt (PCT/US 88/00389) technikával. Ez egy E.coli triptofán promoter szekvenciát, a trpL roboszómakötő helyet (rbs) és az rbSt m4-99Ser gént tartalmazza a 175. kodonnal bezárólag. Az MstlI restrikciós szekvencia azonban az rbSt génben a 175., 176. és 177. pozíción túl helyezkedik el. Ez a fragment tartalmazza az m4 és a 99Ser megváltozásokat. A vektor fragmentumot a pDH-bSt-m4-Serl81/9-ből izoláltuk, amely megtartja az rbSt 181. és 189. szerin-kodon módosulását. A két izolált fragment (PCT/US88/00328) lett összekapcsolva és E.coli MC1000 kompetens sejtek transzformálására lett alkalmazva. (Experiments with Gene Fusion Strain Kit, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). A vektor-DNS a transzformált sejtekből nyerhetők és DNS székvenálással lett igazolva a szerin-kodonok jelenléte a 99., 181. és a 189. helyeken. E vektorok egyike pDH-m4-TS-ként lett jelölve (Triple Serin).
2. A pDH-m4-TS egy fragmentjének klónozása M13 mp9-ben
A pozíció-irányított mutagenezis módszerének alkalmazásához kell a célszekvenciát az M13 mp9 vektorba klónozni. Az M13 mp9 a Site Directed Mutagenesis Kit-jéből (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) szerezhető be. Az M13 mp9 vektort és a pDH-m4-TS vektort Psti és BartiHI restrikciós enzimekkel hasíthatok. Mindkét enzim hasítja az M13 mp9-et és pDH-m4-TS-t. Az M13 mp9-ből keletkező két darab közül az egyik géleken nem detektálható. A látható M13 mp9 fragmenst izoláltuk (közelítőleg 7230 bp). A pDH-m4-TS, egy kb. 3200 és egy kb. 310 bp méretű részekre hasad; mindkettőt izoláltuk. A kisebbik tartalmazza az rbSt kódoló szekvenciát a 91-191 aminosavakig, és lizin kodonokat tartalmaz a 157., a 167., 171. és 180. pozíciókban. A 310 bp fragmentum BHM 71-18 kompetens sejtek fertőzésére lett használva (ez a törzs is a fent említett mutagenezis kit-ben található). A transzfekció módszerét, az inszerciós plakkok meghatározásának és az egyfonalas DNS (ssDNS) izolálásának módszereit 1983-ban publikálták (Messing, J.: Meth. Enzymol. 10 1 20-98) . A plakk kialakulás β-galaktocidáz indikátorok X-gal és IPTG jelenlétében folyt (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), ahogy a fenti publikációban leírták. A 310 bp fragmentum megléte és ssDNS preparáltsága DNS szekvenálással lett igazolva. A vektor jelölése: M13 mp9-181/9S.
3. A 157., 167., 171. és 180. pozíciójú lizin kodonok helyettesítése arginin kodonnal
A mutagenezis protokolját a Boehringer Site Directed Mutagenesis Kit tartalmazza. Az M13 mp9 rer dsDNS hasítása EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel történt. A' • ♦ ♦ ·
- 22 protokol röviden a következőket írja le: az M13 mp9-181/9S ssDNS-éből kb. 1,25 g-ot hibridizáltattunk 0,5 g EcoRI HindlII-mal hasított M13 mp9 rer dsDNS hibridizációs pufferben. A szétcsavarodást (kiolvasztást) a keverék 100 °C-ra való melegítésével, majd négy perc után lassan lehűtve (Sj'b-ra) végeztük. A 40 1-nyi keveréket 65 °C-on tartottuk 20 percen át, majd jég közé helyzetük. Mindez egyfonalas gap-ot (törést) okoz a dsDNS molekula célzott DNS szakaszában. E keverékből 8 1-t adtunk 2 1 kináz oldathoz, amely a benne lévő oligonukleotidok segítségével elvégzi a kívánt bázis megváltozásokat legalább 4 pmol koncentrációban. Az oligonukleotidban mind a 4 lizin-arginin változás megvan, és jelölve van a törést tartalmazó szakasz egyfonalas komplementerével. Az arginin kodon-váltó helyen az oligonukleotid szekvenciája: 5’ GAA ACG ACG GGA ACG CAT AAC CCT CAG GTA CGT CTC CGT ACG ATG CAG GTC GCG CCG GAA GCA GGA GAG CAG ACC GTA GTT ACC GAG CAG CGC.
A primer kiolvasztása 5 perces, 65 °C-os inkubálással, majd lassú szobahőmérsékletre hűtéssel történik. Az ssDNS régió többi részét dsDNS-sé alakítottuk dNTP, T4 DNS ligáz és klenon jelenlétében, szobahőmérsékleten, 45 perc alatt. A reakciót EDTA-val és 10 perces 65 °C-ra való melegítéssel állítottuk le. A reakcióeleggyel BHM 71-18 mutS kompetens sejteket fertőztek. A sejteket ezután LB szuszpenzióban növesztettük egy éjszakán (kb. 12 órán) át, majd az M13 fágtörzset a felülúszóból (szupernatans) preparáltuk. MK30-3-ra, a plakkokat kiválasztottuk és az seDNS-t preparáltuk. A kívánt
mutációkat tartalmazó kiónokat szekvencia analízissel azonosítottuk .
4. Lizin-arginin megváltozásokat tartalmazó rbSt fragmentum klónozása pURA expressziós vektorba
Lizin-arginin M13 fagból kétfonalas M13 DNS-t preparáltunk a fentebb leírt Messing módszerrel. PstI és BamHI enzimekkel hasítottuk: 7200 és 310 bp hosszúságú részek keletkeztek belőle. A 310 bp hosszúságút izoláltunk és a 2. részben leírtak szerint izolált pDH-m4-TS Pstl/BamHI vektor farmenthez kapcsoltuk (ligáz). A két ligáit fragmentummal MC1000 kompetens sejtjeit transzformáltuk. Vektor DNS-t egyedileg preparáltuk a transzformánsokból és DNS szekvenálással jellemeztük azokat. A kívánt változásokat (99 ser, 157 arg, 167 arg, 171 arg, 180 arg, 181 ser és 189 ser) tartalmazó vektort pDH-m4-TS/QA-ként jelöltük.
A módosított gén pURA expressziós vektorba való klónozásához (PCT/US88/00328) a pDH-m4-TS/QA vektor DNS-ét EcoRIgyel és HindlII-mal hasítjuk kb. 2800 és 850 bp hosszúságú vektor fragmentumokra, amelyek trp promotert, a trpL rbs és rbSt kódoló szekvenciákat tartalmazzák a 186. pozícióig. A HindlII restrikciós hely úgy tűnik, túl van a 186., 187. és 188. aminosavak kodonjain. A pURA-BSTm4-181/9 vektor a fenti enzimatikus kezelések után is megtartotta a 189. pozícióban levő szerin szubsztitúciót, a kapott vektor tartalmazza a 99 ser, 157 arg, 167 -arg, 171 arg, 180 arg,
181 ser és 189 ser változásokat. E vektort pURA-m4-TS/QAval jelöltük és BST-AC törzset transzformáltunk vele (PCT/US88/ 00328 sz. PCT bejelentés) a fermentáció továbbfejlesztéséhez. A 157., 167., 171. és 180. pozícióban levő arginin reziduumok, a lizin-reziduumok acetilációjának megakadályozásával az alacsonyabb izoelektromos pontú rbSt féleségek kialakulása elkerülhető.
Hasonló módszerekkel a 157., 167., 171. és 180. pozíciókban a lizin-reziduumok vagy egyéb alkalmas aminosavakkal pl. glutaminsavval helyettesíthetők. Heterológ polipeptidekben, hasonló acetilációs folyamatok eredményeképpen egyéb lizinek is helyettesíthetők. Az ilyen acetilált molekulák meghatározására szolgálnak az alábbi módszerek.
1. Táblázat
8,2 és 7,0 PI-s rbSt species-ek szintje alacsony fermentációjú élesztő extraktumban
Fermentációs minta1 rbSt species százalék
pl 8,2 Pl 7,0
17 óra 71,4 28,6
19 óra 65,3 34,7
22 óra 72,9 27,1
26 óra 75,8 24,9
33 óra 75,0 25,0
A ráoltást követő fermentációs idő. Az rbSt szintézis spontán indukciója a ráoltást követő 15 óra után jelentkezik.

Claims (11)

  1. Igénypontok
    1. Eljárás heterolog polipeptid acetilezésére azzal j e 1 leme zve, hogy olyan mikroorganizmust alkalmazunk, mely egy gazda mikroorganizmus heterolog polipeptidet kódoló DNA szekvenciával transzformált és a kérdéses mikroorganizmust aminosavakat alacsony koncentrációban tartalmazó fermentációs közegben szaporítjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus egy heterolog polipeptidet kódoló rekombináns DNA molekulával transzformált baktérium.
  3. 3. bSt azzal jellemezve, hogy a 157, 167,
    171 és 180 pozíciójú lizin aminosav maradékok acetilezve vannak.
  4. 4. Állati szomatotropin azzal jellemezve, hogy az 1. Térkép szerinti natív szomatotropin 157, 167, 171 és 180 pozíciójú lizinjeinek legalább egyike argininnel van helyettesítve.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti állati szomatotropin azzal jellemezve, hogy az állat emlős.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti emlős szomatotropin, azzal jellemezve, hogy az emlős szarvasmarha.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti emlős szomatotropin azzal jellemezve, hogy az emlős disznó.
    Λ
  8. 8. Α 6. igénypont szerinti szomatotropin azzal jellemezve, hogy a lizinek mindegyike argininnel van helyettesítve.
  9. 9. A 6. igénypont szerinti szomatotropin azzal jellemezve, hogy a 157, 167, és 171 pozíciójú lizin argininnel a 180 pozíciójú lizin glutaminnal van helyettesítve.
  10. 10. A 6. igénypont szerinti szomatotropin azzal jellemezve, hogy a 157, 167, 171 és 180 pozíciójú lizin vagy argininnel vagy glutaminnal van helyettesítve .
  11. 11. A 6. igénypont szerinti szomatotropin azzal jellemezve, hogy a 157, 167, 171 és 180 pozíciójú lizinek mindegyike glutaminnal van helyettesítve.
HU903721A 1989-03-15 1990-01-23 Process for producing acetylized heterologue polypeptides HUT58796A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32390189A 1989-03-15 1989-03-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU903721D0 HU903721D0 (en) 1991-12-30
HUT58796A true HUT58796A (en) 1992-03-30

Family

ID=23261207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU903721A HUT58796A (en) 1989-03-15 1990-01-23 Process for producing acetylized heterologue polypeptides

Country Status (11)

Country Link
EP (2) EP0719792A2 (hu)
JP (1) JPH04504060A (hu)
KR (1) KR920700292A (hu)
AT (1) ATE142270T1 (hu)
AU (1) AU629929B2 (hu)
CA (1) CA2045173A1 (hu)
DE (1) DE69028396T2 (hu)
DK (1) DK0463115T3 (hu)
ES (1) ES2091241T3 (hu)
HU (1) HUT58796A (hu)
WO (1) WO1990010706A1 (hu)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6140071A (en) * 1994-01-27 2000-10-31 Somatogen, Inc. Proteins with mutations to decrease N-terminal methylation
CN100402649C (zh) * 2000-05-10 2008-07-16 阿斯比奥制药株式会社 在基因重组多肽的生产中抑制副产物生成的方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE142270T1 (de) 1996-09-15
EP0719792A2 (en) 1996-07-03
JPH04504060A (ja) 1992-07-23
DK0463115T3 (hu) 1997-02-17
EP0463115B1 (en) 1996-09-04
AU5406090A (en) 1990-10-09
DE69028396D1 (de) 1996-10-10
EP0719792A3 (hu) 1996-07-24
HU903721D0 (en) 1991-12-30
CA2045173A1 (en) 1990-09-16
ES2091241T3 (es) 1996-11-01
EP0463115A1 (en) 1992-01-02
DE69028396T2 (de) 1997-02-13
WO1990010706A1 (en) 1990-09-20
KR920700292A (ko) 1992-02-19
AU629929B2 (en) 1992-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5275306B2 (ja) 活性なβ−ＮＧＦを得るための方法
KR20040023686A (ko) 펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및디펩타이드의 제조방법
JP3036775B2 (ja) ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼの製造法
WO2001044469A1 (fr) PROCEDE DE PRODUCTION DE PEPTIDE KiSS-1
WO1997001627A1 (en) High-level expression and efficient recovery of ubiquitin fusion proteins from escherichia coli
RU2096455C1 (ru) Дипептидиламинопептидаза и способ ферментативного отщепления n-концевых дипептидов met-tyr, met-arg или met-asp от полипептидной последовательности
Schlatter et al. The primary structure of the psychrophilic lactate dehydrogenase from Bacillus psychrosaccharolyticus
AU600891B2 (en) Expression in E. coli of hybrid polypeptides containing the growth hormone releasing factor sequence
HUT58796A (en) Process for producing acetylized heterologue polypeptides
JP3095183B2 (ja) 新規酵素及びそれをコードするｄｎａ
US5369016A (en) Peptide amidase and the use thereof
JPH0630771A (ja) バクテリアルトランスグルタミナーゼの製造法及び関連物
JPH11137254A (ja) バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼの製造法
JP3066473B2 (ja) Ｄｎａおよびその用途
JP2845558B2 (ja) メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列
KR100365838B1 (ko) 브레비바실러스 보스테렌시스 ｂｃｓ-1 에서 유래한 신규내열성 ｄ-입체특이적 디펩티다아제 및 이를 이용한ｄ-아미노산 함유 펩타이드의 합성 방법
JP4374945B2 (ja) 新規なセリンプロテアーゼ
CA2451528C (en) Novel aminopeptidase derived from bacillus licheniformis, gene encoding the aminopeptidase, expression vector containing the gene, transformant and method for preparation thereof
JP4561021B2 (ja) ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法
JPH07163341A (ja) 安定化された改変タンパク質
KR0132003B1 (ko) 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법
SCHLATTER et al. Structure and function of L-lactate dehydrogenase from thermophilic, mesophilic and psychrophilic bacteria, VIII. The primary structure of the psychrophilic lactate dehydrogenase from Bacillus psychrosaccharolyticus
JPS6244920B2 (hu)
JPH07107980A (ja) カビプロテインジスルフィドイソメラーゼの高効率製造法
JPH07289275A (ja) Ｄ−プロリンの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee