JPH04504060A - アセチル化異種ポリペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アセチル化異種ポリペプチド類 発明の分野 本発明は、微生物学およびタンパク質化学の分野におけるものである。より詳細 には、本発明は組換え異種ポリペプチド、特にウシ・ソマトトロピン（ｒ　ｂＳ 　ｔ）を生産する発酵方法およびそれにより生産された新規ｒｂＳｔに関する。

発明の背景 微生物を培養するための合成的かつ化学的にはっきりとした培地は公知である。

バクテリアを収穫するための通常の栄養培地は異種ポリペプチドを生産する組換 えバクテリアを増殖させるのに用いられてきた。増殖培地中における高価なアミ ノ酸量を減少させると同時に良質の異種ポリペプチドの発現を高レベルに保持す ることは望ましい。該培地における発酵の間に、異種ポリペプチド、例えばｒｂ Ｓｔの新規のアセチル化アナログを生産することができる。

天然に存在するウシ・ソマトトロピン（ｂｓｔ）すなわち成長ホルモンは、異種 タンパク質の混合物としてウシの下垂体から精製することができる（バラディニ 、エイ、シー（Ｐａｌａｄｉｎｉ、　Ａ、　Ｃ，）ら、１９８３、シー・アール ・シー・クリティカル拳しビ二−ズ・イン・バイオケミストリー（ＣＲＣＲｅｖ ｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１５：２５〜５６）。天然のウシ下垂体 抽出物を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画した場合、明らかでない電 気泳動的な不均一さが見られる（ハート、アイ・シー（Ｈａｒｔ、　１．　Ｃ， ）ら、１９８４、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）、 ２１８．５７３〜５８１）。下垂体のウシ・ソマトトロピン（ｐｂＳｔ）は、等 電点（ｐＩ）が異なるアイＶ７ｔ−ム（ｉｓｏｆｏｒｍ）で存在し、最多形態の ｐＩは８．２である。ｂｓｔは脱アミド化が起こりうる部位を有し、その結果、 等電点電気泳動上でｐＩ７．ｏ、６．０および５．５に狭い間隔を隔てるバンド の集合として観察される、低ｐＩの形態数が増加することが公知である（ルイス 、ニー・ジェイ（Ｌｅｗｉｓ、　Ｕ、　Ｊ、　）ら、１９７０、ビオシミ力・工 ・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　 ）、２１４：４９Ｂ　〜５０８．セッチ、シー（Ｓｅｃｃｈｉ、　Ｃ，）ら、１ ９８６、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテ ィン・リサーチ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ、　）、２８　：　 ２９８〜３０６）。

情報の開示 ウシ・ソマトトロピンのアセチル化、主にリジン残基のε−アミ７基でのアセチ ル化により、該アセチル部分の中性性のため該タンパク質の陽電荷が減少し、し たがってｐｌが減少したｂｓｔ種が生じる。ｂｓｔの化学的アセチル化の方法は いくつか報告されているが、そのような方法ではリジン以外の他のいくつかのア ミノ酸と反応するため、多数のアセチル化生成物が生じる（オイカワ、エイ（Ｏ ｉｋａｗａ、　Ａ、　）ら、１９６７、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｊ、　）、１０４：９４７〜９５２；デ・ザノツ、ブイ・ビー（Ｄｅ 　５ａｔｚ、　Ｖ、　Ｂ、）およびジェイ・エイ・サントメ（Ｊ、　Ａ、　５ａ ｎｔｏａ＋ｅ）、１９８１、インク−ナショナル・ジャーナル・オブ・ベプタイ ド・アンド・プロティン・リサーチ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　）、１８：４９２〜４９９）。

天然に存在するタンパク質のアセチル化は公知である。タバコ・モザイク・ウィ ルス由来のジペプチドはアセチル化により修飾されることが最初に示された（ナ リタ、ケイ（Ｎａｒｉｔａ、　Ｋ、　）、１９５８、ビオシミカーｘ−ピオフィ ジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、２８：１８ ４〜１９１）。ついで、オボアルブミン、卵アルブミン、ヘモグロビンおよびヒ ストンを包含する多数のタンパク質がアセチル化アミノ酸を含有することが示さ れている（ハリス、ジェイ・アイ（Ｈａｒｒｉｓ、　Ｊ、　１．　）、１９Ｓ９ 、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｌ、）、７１：４４５〜４５９ ；ナリタ、ケイ（Ｎａｒｉｔａ、　Ｋ、　）、１９６１、バイオケミカル・アン ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　）、５：、１６０　′１６４；シ 、０−ダー、ダブり１御・エイ（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ、　ｗ、　Ａ、　）ら、１ ９６２、ビオシミ力・工・ピオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐ ｈｙｓ。

Ａｃｔａ）、６３：５３２〜５３４；フィリップス、ディー・エム・ビー　（Ｐ ｈｉ　１１　ｉｐｓ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｐ、　）、１９６３、バイオケミカル・ジ ャーナル（ＢｉｏｃｈｅＩＩｌ、　Ｊ、　）、８７　：　２５８〜２６３）、タ ンパク質のＮ’−アセチル化は真核および原核生物およびウィルスの間に広く見 られる（トウリーセン、エイチ・ビー・シー（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ、　Ｈ，Ｐ、　 Ｃ，）ら、１９８５、シー・アール・シー・クリティカル・レビューズ・イン・ バイオケミストリー（ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、１ ８　：　２８１〜３２５）。

例えば、エールリッヒの腹水細胞の可溶性タンパク質の８０％がＮ”−アセチル 化されることが示唆されている（ブラウン、ジェイ・エル（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、 　Ｌ、）およびダブりニー・ケイ・ロバート（Ｗ、　Ｋ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ）、 １９７６、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２５１　：１００９〜１０１４）、Ｎ”−アセチ ル化はランダムな工程ではないようである。というのはアラニンおよびセリン残 基が主要な標的であり、一方メチオニン、グリシンおよびアスパラギン酸は、少 数のタンパク質においてのみ修飾されているにすぎず、いくつかのアミノ酸はＮ ’−アセチル化されることが公知ではないからである（ウォルド、エフ（Ｖｏｉ ｄ、Ｆ、）、１９８１　、アン・レブ・バイオケム（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　）、５０　：　７８３〜８１４）。

タンパク質の側鎖のアセチル化は、起こる頻度はＮ”−アセチル化の場合より低 いが、自然に起こることが公知であるもう１つの種類のタンパク質アセチル化で ある。Ｎｏ−アセチラーゼは、リジンのε−アミン基について特異的であり核お よび細胞質ゾル中に存在するが　Ｎ　ａ−アセチラーゼはリポソームに結合して いるようだから　Ｎ　ｌ−アセチラーゼはＮ”−アセチラーゼと相違する（シュ テルナー、アール（Ｓｔｅｒｎｅｒ、　Ｒ，）ら、１９７９、ジャーナル・オブ ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）、２５４ 　：　１１５７７〜１１５８３；ベスタナ、エイ（Ｐｅｓｔａｎａ、　Ａ、　） およびエイチ・シー・ピトット（Ｈ，Ｃ，Ｐｉｔｏｔ）、１９７５、バイオケミ ストリー（Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ）、１４：　１３９７〜１４０３；ペス タナ、エイ（Ｐｅｓｔａｎａ、　Ａ、　）およびエイチ・シー・ピトｙ　ト（Ｈ ，Ｃ，ＰｉｔＯｔ）、１９７５、バイオケミストリー　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ）、１４：１４０４〜１４１．２）、　しかしながら、その両タイプのアセ チラーゼは共に、アセチルＣｏＡからタンパク質へのアセチルの転移を触媒する （ウオルド、エフ（Ｔｏｌｄ、　Ｆ、　）、前掲）。

リジン残基のＮｏ−アセチル化は最初、ヒストンＨ３およびＨ４で起こることが 示されたくアルフレイ、ブイ・ジー（Ａｌｌｆｒｅｙ、　Ｖ、　Ｇ、　）ら、１ ９６４、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シズ・オブ・ザ・ユナイテイツド・スティソ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ｕ、　ｓ、　Ａ、　）、５１ニア８６〜７９ ４）。ヒストンに加えて、ハイ・モビリティ−・グループ（ＨＭＧ）タンパク質 のような他のＤＮＡ結合性タンパク質もＮ“−アセチル化される（シュテルナー 、アール（Ｓｔｅｒｎｅｒ、　Ｒ，）ら、同上）。

エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）株から得られるタン ノくり質がアセチル化されるという報告はほとんどない。イー・コリ（Ｅ。

ｃｏｌ　ｉ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、該タンパク質上のりジン残 基のＮ“−アミノ基と結合したりボイル残基においてアセチル化される（アダム ソン、ニス・アール（Ａｄａｍｓｏｎ、　Ｓ、　Ｒ，）ら、１９８６、バイオケ ム・セル・バイオ口（ＢｉｏｃｈｅｔＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、）、６４：２５０〜 ２５５）。イー・コリにおけるタンパク質のアセチル化に関する報告のほとんど は、リポソームタンパク質のアセチル化に集中している。イー・コリのリポソー ムタンパク質Ｌ７上のセリン残基のＮｏ−アセチル化（これによりＬ１３タンパ ク質を生成する）およびリポソームタンパク質Ｓ５およびＳ１８の上のアラニン 残基のＮ’−アセチル化が記載されている（プロット、エル（Ｂｒｏｔ、　Ｎ、 　）およびエイチ・ワイスバッハ（Ｈ，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）、１９７２、バイ オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミユニケーションズ（Ｂ ｉｏｃｈｅ＋ａ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍａ、　）、４９　：　 ６７３〜６７９　、ウイットマンーリーボルト、ビー（Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉ ｅｂｏｌｄ、　Ｂ、　）、およびビー・ブロイラー（Ｂ、　Ｇｒｅｕｒｅｒ）、 １９７８、エフ・イー・ビー・ニス・しターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　）、９ ５：９１〜９８；ヤマグチ、エム（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｍ、）、１９７６、エ フ・イー・ビー・ニス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｌ、）、５９：２１７〜２ ２０）。

宿主微生物、例えばイー・コリにより生産されたアセチル化異種ポリペプチドに ついては未だ報告されておらず、またアセチル化ｂＳｔについての明確な報告も 未だない。

発明の概要 本発明は一般に、アセチル化された異種ポリペプチド、特に組換え生産されたウ シ・ソマトトロピン（ｒｂＳｔ）のアナログ生産用発酵およびそれにより生産さ れた新規ｒｂｓｉに関する。

より詳細には本発明は、低濃度のアミノ酸を含有するはっきりとした発酵培地上 で微生物を増殖させることによる、ｒｂＳｔのアセチル化アナログの生産方法に 関する。

より詳細には、本発明はｒｂＳｔの新規アセチル化アナログに関する。

より詳細には、該微生物は組換え微生物であり、そうして発現されるｒｂＳｔは 異種ポリペプチドである。

また本発明は、特定のりジン残基をアルギニンおよび／またはグルタミン残基で 置換することによりアセチル化ｒｂＳｔの生産を回避する方法およびそうして生 産される新規ｒｂＳｔ分子に関する。

発明の詳細な説明 形質転換宿主微生物により自然には合成されないポリペプチドを意味する。例え ば、イー・コリ宿主はｂｓ　ｔ，インシュリン、インターフェロン等を生産しう る。こうして生産されたポリペプチドは「異種ポリペプチド」と呼ばれる。本発 明の文脈において特に興味深いのは哺乳動物ソマトトロビン、例えばｂｓｔから なる異種ポリペプチドである。

本明細書中に使用する「アミノ酸の低濃度」とは、培養微生物により「アミノ酸 の最小濃度」にまで減少できるのに十分に低い濃度を意味し、「アミノ酸の最小 濃度」とは、アミノ酸生合成酵素の生合成を抑制しまたはその活性を有効にフィ ードバノク阻害するほどに低い外因性アミノ酸の濃度と定義される。そのような 「アミノ酸の低濃度」から「アミノ酸の最小濃度」への減少は異種ポリペプチド の生合成の間および少し前に起こる。例えば、本明細書中の実施例におけるイー ・コリ宿主およびｒｂＳｔポリペプチドでは、０、１％酵母二牛ス補足の場合、 「アミノ酸の低濃度」とは、それぞれ約０．５０ｍＭ以下を意味する。「アミノ 酸の低濃度」は、それぞれ約０．０５ｍＭ以下である「アミノ酸の最小濃度」に 減少する。

本発明で使用する組換え宿主微生物は、当業者にはよく知られており、例えば、 本明細書中に参照文献として合体させる「モレキユラー・クローニング（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊ　（テ４−−　７　ニアテイス（７Ｊ１１ｉ ａｔｉｓ）ら、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（　１　９　８　２）　 ）および「ア・プラクティクカル・ガイド・トウー・モレキュラー・クローニン グ（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ）Ｊ　（バーパル、ビー（Ｐｅｒｂａｌ．　Ｂ．　）、ジョン・ウィリ ー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）（１９８４））に記載 された組換えＤＮＡ技術によりつくる。有用な宿主微生物は、異種の遺伝子のク ローニングおよび発現に適するよく知られた宿主のいずれも包含し、例えば、バ シルス、サツカロミセスおよびストレプトミセス株を包含する。

異種のポリペプチドを生産しり組換え微生物は液体栄養培地中で培養する。該培 地は、微生物の細胞増殖要件を満たす過剰の通常の栄養物質からなり、それによ り該微生物は予め設定した細胞密度にまで増殖できる。この物質は炭素源、窒素 源および硫黄、リン、マグネシウム、カリウム、銅、亜鉛、マンガンおよび鉄の ような無機物源を包含する。通常、カゼイン、大豆粉、ラクトアルブミン、動物 組織、酵母細胞およびゼラチンのような天然に存在するタンパク様物質を酸また は酵素消化に付すことにより得られるタンパク質の加水分解物の形態でアミノ酸 を加えてもよい。また、純アミノ酸の混合物を加えてもよい。

また、酸素を該培地に供給する。最大培養密度を得るために、培養は通常、酸素 ／液体の接触面領域を増加させるような方法で行う。

該培養に影響を及ぼす重要な環境要因は、ｐＨおよび温度を包含する。該温度は 最小および最大増殖温度の範囲とする。大部分のバクテリアは相当狭い温度幅で 最大増殖を示す。イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のような中温バクテリアでは、 最適温度範囲は約２５°Ｃ〜約４２℃、好ましくは約３７°Ｃである。大部分の 生物は数ｐＨ単位の範囲の水素イオン濃度に耐性である。イー・コリのようなバ クテリアでは、耐えうるｐＨは約６〜８の範囲にあり、好ましくは約６．８であ る。

異種ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制しうる発現制御配列の制御下 にある場合、適当なリプレッサー（例えば、発現がトリプトファン・プロモータ ーおよびオペレーターの制御下にある場合にはトリプトファン）を該培地に加え ることにより、該細胞培養が予め決めた増殖レベルに到達するまで、その遺伝子 の発現を特異的に抑制できる。

収穫後、該細胞を加工して異種ポリペプチドを回収する。通常、これは細胞を破 壊するとと、粗異種ポリペプチドを１またはそれ以上の抽出工程によりバクテリ アのタンパク質から分離すること、該ポリペプチドを（その疎水性に依存して） 可溶化すること、適当な場合にスルフヒドリルを酸化して適当なジスルフィド結 合を形成することおよびイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、高速液体ク ロマトグラフィーまたは他のタンパク質精製方法により該ポリペプチドを更に精 製することを包含する。

本発明者らは発酵を行って、組換え微生物により異種ポリペプチドを生産した。

例えばイー・コリ　Ｋ−１２株中のｒｂｓｔである。

これらの発酵は、０．１％の酵母エキスを含有する「低酵母エキス」発酵培地を 包含し、組換え微生物中でのポリペプチドの過剰発現を有効に維持する。

ソマトトロピンの分子の異質性のため、種々のソマトトロピンのアミノ酸残基の 位置番号が相違しうる。「天然の哺乳動物ソマトトロピン」なる語は、これらの 天然に存在する種を包含する。チャート１は、ｂｓｔの１つの種に特異的なアミ ノ酸配列を示す。アナログが包含される場合には、他のソマトトロピンについて のナンバリングが相違することがある。当業者であれば別の天然の哺乳動物ソマ トトロピンまたはそのアナログにおける対応するアミノ酸配列を容易に位置付け することができる。

ｐｂＳｔは、その個々の等電点が相違するアイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）で 存在する。最も豊富な形態は８．２のｐｌを示し、等電点電気泳動上、ｐｌ７． ｏ、６．０および５．５に狭い間隔をあけて存在するバンドの一群が明らかであ る。またＲｂ５ｔは、ｐｌ７．０．６．０および５．５の群となる低ｐ１種を含 有することが判明した。Ｏ，ＬＭ　ＮＨ４Ｃｏｔ　（ｐＨ１０）のような水性塩 基中、ｒｂＳｔをインキュベートすることにより、低等電点を有する種への大き なシフトが起こる。広範な構造分析により、塩基処理後の修飾は、アミノ酸残基 ９９（チャート１）に位置するアスパラギンのイソアスパラギン酸およびアスパ ラギン酸への変換を含むことが示された（本明細書中に参照文献として合体させ る１９８９年２月１９日付は同時継続米国特許出願Ｓ、Ｎ、０７／２９９．ｌ　 ０７参照）。

また、アミノ酸残基９９（Ａｓｎ９９）（チャート１）に位置するアスパラギン がセリン（Ｓｅｒ９９）で置換され、それによりイソアスパラギン酸の形成を回 避する単離されたｒｂＳｔは、７．ｏ１６．０および５．○のｐｌを有するｒｂ Ｓｔ種を含む。５ｅｒ９９ｒｂＳｔのｐｌ７．０の種は得られるｒｂＳｔの合計 量の約３０％になる。天然ｒｂＳｔ　（Ａｓｎ９９）の精製されたｐｌ７．０の 物質の独立した構造分析により、少な（とも４個のｐＴ７．０の種がリジン残基 １５７．１６７．１７１および１８０（チャート１）をアセチル化することによ り形成されたことが示された。そのような単一のアセチル化がなければ、本来の ｐ　Ｉ　Ｂ、　２は５ｅｒ９９　ｒｂＳｔで観察されるであろう。複数のりジン 残基の同時アセチル化により、ｐｉ＜７．０を示すｒｂＳｔ種が生じる。他のｒ 　ｂ　Ｓ−ｔリジン残基（３０，６４，７０，１１２，１１４，１３９および１ ４４位、チャート１）のアセチル化は未だ検出されていないが、存在するかもし れない。

タンパク質の過剰発現のための発酵の間における、リジン残基の意図したアセチ ル化により、トリプシンおよびトリプシン様のプロテアーゼおよびリジン特異的 修飾試薬によるタンパク質分解により耐性のあるタンパク質の合成が可能となる 。さらに、ε−アミノ基上のリジン残基のアセチル化によりポリペプチドのｐＩ が１アセチル化当たり１単位減少するため、そのようなペプチドは、該ポリペプ チドを投与した哺乳動物の血液循環から腎臓による除去をより受けにくくなるこ とが予想される。また、低ｐ■は、単離および処方の条件下でｒｂＳｔの溶解性 を増加させることが予想される。

逆に、リジン残基をアセチル化しないでｒｂＳｔを生産することが望ましいかも しれない。これは、生成物の精製をしなくて済む均一な生成物の生産を許容する であろう。

ｒｂＳｔの過剰発現のための発酵の間のりジン残基の特異的アセチル化は予想外 のことであり、そのアセチル化の機構は公知でない。

本発明以前には、リジン残基がアセチル化されたｒｂＳｔを得る公知の発酵方法 は存在しなかった。さらに、ｒｂＳｔの過剰発現の間のりジン残基の特異的アセ チル化を回避するための公知方法も存在しなかった。

バクテリアの培養：イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＤＵ４５を使用した。

この株はラムダ・プロワ１−ジおよびＦプラスミドを取去し、ｒｐｏＨ１１２の 対立遺伝子を導入することによりイー・コリに−１２（ＡＴＣＣｅ　２３７１６ ）野生型法から得た。ついでこの株を、プラスミドｐＵＲＡ−４由来であり残基 ９９のアスパラギン（チャート１）がセリンで置換されたｂｓｔをコードする遺 伝子を含有する（ここに参照文献として合体させるＰＣＴ特許出願Ｐ　ＣＴ／Ｕ 　５８Ｂ１００３２Ｂ）温度感受性ランナウェイ複製ベクターであるプラスミド ｐＵＲＡ−９９Ｓｅ　ｒ−Ｍ４で形質転換した（同時継続米国特許出願Ｓ、Ｎ、 　０７／２９９．１０７）。

培養培地：はっきりとした培地はボーゲルおよびボンナーの培地Ｅを基礎とした （ボーゲル、エイチ・ジエイ（Ｖｏｇｅｌ、　Ｈ，Ｊ、　）およびディー・エム ・ボンナー（Ｄ、　Ｍ、Ｂｏｎｎｅｒ）、１９５５、ジャーナル・オブ・バイオ ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２１８．９７〜１０ ６）。１次種および発酵培地を調製するための組成および方法は以下の通りであ 、る。

Ｎａ（Ｎ）１４）ＨＰＯ４４ｔＯ１０，９０ｇＫ、ＨＰｏ、　２．６１ｇ クエン酸・Ｈ＊０　２．　Ｌｏｇ ＭｇＳＯ＊・７ＨｔＯＯ，９９ｇ （ＮＬ）　ｔｓＯ＊　０．６６ｇ 酵母エキス　１０．４０ｇ グリセロール　５．００ｇ Ｒ００，水 １次種培地には、前記成分を水（逆浸透グレード、Ｒ，Ｏ，）で水和して十分に １０００ｍ１２とし、滅菌前に３００ｍｇ容量に分けた。

該種培地を１２１°Ｃで２０分間滅菌した。滅菌後、該種培地を冷却し、０．５ ｍ１２の滅菌したアンピシリン（ＮａＯＨでｐＨｓ、ｏに滴定し無菌濾過（０， ４５μｍ）したＲ、Ｏ，水中２５ｇ／（２）を加えた。

Ｎａ（ＮＨ，）ＨＰＯ，・Ｈ，０１０，９０ｇＫＪＰＯ−２，６１ｇ クエン酸（無水）　１．９２ｇ ＭｇＳＯ４・７ＨｔＯ０，２５ｇ （ＮＨａ）ｙｓｃｌ＋　’　０．６６ｇ酵母エキス　１．００ｇ ５ＡＧ４１３０　０．７５ｍ１２ Ｒ１０，水 ２５０リツトルの発酵槽中、前記成分の量を２００倍に増加させそれを１６５す 、トルのＲ，Ｏ，水中で水和することにより該発酵培地を調製した。ついで、該 発酵培地を１２１°Ｃで２０分間滅菌した（滅菌の間、蒸気の凝縮のため２０リ ツトルの培地容量の増加を見積もった）。滅菌後、該培地のｐＨを調べ、ｐＨ６ ，６〜６．９を確認した。冷却と同時に２つの無菌添加を行って発酵培地を完成 させた。最初の添加は、濾過酸！１（０，４５μＭ）した微量栄養素（最終濃度 ：　（ＮＨ−）ｅ（ＭＯＪｔ４・４ＨｔＯ１１２μＭ；　ＨｓＢＯｓ、１．６＋ ｎＭ；　ＣｏＣＱｔ−６ＨｔＯ１１２ｈＭ；Ｃｕ５Ｏａ、２５．５μＭ；　Ｍｎ ＣＱｔ・４Ｈ＊０１３１９．４μＭ；　ＺｎＳＯ４・７ＨｔＯ１４０，１μＭ） 　２００ｍＱ分からなる。２回目の添加は、１５リツトルのセレローズ（ｃｅｒ ｅｌｏｓｅ）（Ｒ，Ｏ，水で十分１４リツトルにしＨ，ＳＯ，でｐＨ４，０に調 整した８、２４ｋｇセレローズ）からなる。接種前に該発酵培地を２５％ＮａＯ ＨでｐＨ７，２に調整した。

低酵母エキス発酵培地は、ＤＵ４５培養については０．１％の発酵エキスを含有 していた。

実施例１　低酵母エキス発酵の間のアセチル化ｒｂＳｔの生産各１次種培養を、 １培養アンプル（約１ｍ＆）含量接種し、２８℃で培養密度が０．７〜０．８Ａ □。になるまでインキユベートした。

インキュベート後、発酵槽の接種のための使用に先立ち、各１次種培養を氷上に 置いた。すべての１次種培養をアンピシリンで補足して実質的にすべてのプラス ミド産生バクテリアを含有する培養を得た。６００ｍ２の接種物を接種すること によりＤＵ４５発酵を開始した。無水アンモニアで発酵槽のｐＨを制御して、ｐ Ｈ７，２〜７．４を維持した。発酵槽の撹拌速度および通気速度を３２０ｒｐｍ および３００ｓ　１ｍに、背圧（ｂａｃｋｐｒｅｓｓｕｒｅ）を１０ｐｓｉｇに した。

許容しうる２７℃の温度で培養を増殖させた。プラスミド・ランチウェイ複製お よびｒｂＳｔ合成は自発的に誘導される（ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０ ０３２８０）から、ＤｔＪ４５発酵では始終２７°Ｃに保持した。

該１次種および発酵槽から幾度も培養の１部分を取り出し、培養密１！（５５０ ｎｍでの吸収光度）、バクテリア全乾燥重量、全ｒｂＳｔ濃度、グルコース濃度 、遊離アンモニア濃度、アセテート濃度の定量のための一連の分析手段および顕 微鏡による封入体の同定および定量に付した。

精製ｒｂＳｔの調製物をＤＵ４５株の発酵培養から得、等電点電気泳動（ＩＥＦ ）に付して、アセチル化ｒｂＳｔ　（Ｓｅｒ９９−ｒｂＳｔのｐ１７．０対８． ２）のレベルを定量した。ｐＨ７，０のｒｂＳｔのレベルが増大するほど、モノ アセチル化形態の全ｒｂＳｔ画分は増大した。Ｔ５％、Ｃ３％の組成の厚さ１ｍ ｍの水平スラブゲル中で、ｐＨを３．５〜９．５の範囲（ＬＫＢ　ＰＡＧプレー ト１８０４−１０１）にしてＩＥＦを行った。いずれの変性剤も存在させること なく、最大１５００Ｖおよび１０°Ｃで３０Ｗの定出力でゲルを泳動させた。水 性の１１．５％（ｗ／ｖ）ｌ−リクロロ酢酸、３．５％（Ｗ／Ｖ）スルホサリチ ル酸中、室温で３０分間、ゲルを固定した。

２５％エタノール、８％酢酸中、０．１％（Ｗ／Ｖ）コーマシー・ブルーＲ２５ ０で６０℃にて１０分間染色を行った。２５％エタノール、８％酢酸中でゲルを 脱色した。ＩＥＦゲル中のｒｂＳｔ種の定量をＬＫＢレーザー・デンシトメータ ーを使用して行った。

低酵母エキス発酵過程の間に発酵サンプルを得、モノアセチル化ｒｂＳｔ　（Ｓ ｅｒ９９ｒｂＳｔのｐＨ７，ｏの形態）のレベルをＩＥＦにより定量した。表１ のデータは、ｒｂＳｔ調製におけるｒｂＳｔのモノアセチル化ｒｂＳｔ種のレベ ルは、発酵過程の間２４゜９％〜３４．７％の［１分パーセントの範囲となるこ とを示す。さらに、これらのデータは、モノアセチル化ｒｂＳｔ種のレベルが初 期の発酵サンプルにおいて重要であり（例えば、接種後１７時間）、発酵の継続 時間を通じて比較的一定であることを示す。

実施例２　９９．１８１および１８９位がセリン・コドンに置換されたｒｂＳｔ 遺伝子の１５７．１６７．１７１および１８０位のリジン・コドンの部位特異的 突然変異誘発１．９９．１８１および１８９位にセリンのコドンを含有するｒｂ Ｓｔ遺伝子の構築 ４個の末端リジンの修飾に使用するｒｂＳｔ遺伝子をｍ４と称する。ｍ４遺伝子 の構築は先に記載されている（ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／Ｕ　Ｓ　８８１０　Ｏ３ ２Ｂ）。９９．１８１および１８９位にセリン・コドンを挿入することにより、 ざらに該ｍ４遺伝子を修飾した。

９９位がセリンで置換されたｍ４遺伝子を含有するベクターｐＴｒｐ−ｂＧＨ− ｍ４−９９Ｓｅ　ｒの構築は、同時継続米国特許出願Ｓ。

Ｎ、０７／２９９，１０７１ｍ記載されティる。１８１および１８９位がセリン で置換されたｍ４　ｒｂＳｔ遺伝子を含有するベクターｐＤＨ−ｂＳ　ｔ−ｍ４ −Ｓｅ　ｒ　１８１／９の構築は、本明細書中参照文献として合体させる、１９ ８９年１月３１日付は同時継続米国特許出願Ｓ、Ｎ、　０７／３０４．７３３に 記載されている。

ｐＴｒｐ−ｂＧＨ−ｍ４−９９Ｓｅ　ｒおよびｐＤＨ−ｂＳｔ−ｍ４−３　ｅ　 ｒ　１８１／９ベクターをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｓ　ｔ　ＩＩ　 （二ａ−・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｖ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ ｓ）、ベベアリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）　、マサチューセリン（ＭＡ）”）で消化 することにより、９９．１８１および１８９位にセリン・コドンを含有するｍ４ ｒｂＳｔ遺伝子を構築する。各制限酵素は該ベクターを１回切断し、大ベクター 断片および約８１４塩基対（ｂ　ｐ）の小断片を生成する。ｐＴｒｐ−ｂＧＨ− ｍ４−９９Ｓｅ　ｒ消化物から、先に記載の技術（ＰＣＴ／ｌＪｓ　８　Ｂ１０ ０３２　Ｂ）を用いて８１４ｂｐ断片を単離した。この断片は、イー・コリ（Ｅ 、ｃｏｌｉ）のトリプトファン（ｔｒｐ）　・プロモーターの配列、ｔｒｐＬリ ボーム結合部位（ｒ　ｂ　ｓ）およびコドン１７５までのｒｂＳｔｍ４−９９Ｓ ｅｔ遺伝子のコーディング配列を含有する。Ｍｓｔｌｌの制限配列は、ｒｂＳｔ 遺伝子中、コドン１７５．１７６および１７７にわたって位置する。この断片は 、ｍ４および９９Ｓｅｒの変換を含有する。ｐＤＨ−ｂＳ　ｔ　−ｍ４−Ｓ　ｅ 　ｒ　１８１／９からのベクター断片を単離した。この断片は、１８１および１ ８９のセリン・コドンの修飾のためのｒｂＳｔコープイン配列を保持する。その ２個の単離した断片を先に記載（ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８）（７）通り連 結し、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＭＣ１００Ｏ（ジ・エクスパーリメンツ・ ウィズ・ジーン・ツージョン・ストレイン・キット（ｔｈｅＥｘｐｅｒｉｍｅｎ ｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　５ｔｒａｉｎ　Ｋｉｔ）、コールド ・スプリング＋ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）で入手可能 ）のコンピテント細胞に形質転換するために使用した。ベクターＤ　Ｎ　Ａを形 質転換細胞から単離し、ＤＮＡ配列決定により分析して９９．１８１および１８ ９位のセリン・コドンの存在を確認した。該ベクターの１つをｐＤＨ−ｍ４−Ｔ Ｓ（トリプル・セリン）と称した。

２、ｐＤＨ−ｍ４−ＴＳからの断片のＭ１３ｍｐ９中へのクローニング 用いた部位特異的突然変異誘発法は、標的配列をＭ１３ｍｐ９ベクターへクロー ニングすることを要する。Ｍ１３ｍｐ９キットは「部位特異的突然変異誘発キッ ト」　（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ）　、インディアナポリス（Ｉ ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）　、インディアナ（ＩＮ））で供される。Ｍ１３ｍｐ ９　ｄｓＤＮＡおよびｐＤＨ−ｍ４−ＴＳベクターを制限酵素ＰｓｔｌおよびＢ ａｍＨＩで消化する。各制限酵素はＭ１３ｍｐ９およびｐＤＨ−ｍ４−ＴＳを１ 回切断する。Ｍ　１３　ｍ　ｐ　９の消化により２つの断片が生成し、その１つ はゲル上で検出不可能である。可視のＭ１３ｍｐ９断片（約７．２３０　ｂ　ｐ ）を単離した。ｐＤＨ−ｍ４−ＴＳの消化により、約３２００および３１０ｂｐ のサイズを有する大きさの２つの断片が生成する。両断片を単離した。その小さ い方の断片は、アミノ酸９１〜１９１に対応するｒｂＳｔフ−ディング配列を含 有し、１５７．１６７．１７１および１８０位にリジン・コドンを含む。該３１ 　ｏｂｐ断片およびＭ１３ｍｐ９断片を連結しＢＨＭ７１−１８（この株は突然 変異誘発キット（前掲）で提供された。）のコンピテント細胞にトランスフェク トするのに使用した。該トランスフェクション、挿入物を含有するプラークの同 定および１本鎖ＤＮＡ　（ｓ　５ＤＮＡ）の単離に使用した方法は、既に記載さ れている（メッシング、ジェイ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）　、１９８３、メノソ ノズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　１０１：２０ 〜９８）。β−ガラクトシダーゼ指示薬、Ｘ−Ｇａ１およびＩＰＴＧ（シグマ・ ケミカル・コーポレイション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏ、）、セント ルイス（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ）　、ミズリー（ＭＯ）から入手可能）の存在下、メ ッシングによる記載（前掲）の通りプラークの形成を行った。ｓ　ｓ　ＤＮＡを 調製し、ＤＮＡ配列決定により３１０ｂｐの断片の存在を確認した。該ベクター をＭ１３ｍｐ９−１８１／９Ｓと称した。

３．１５７．１６７．１７１および１８０位のリジン・コドンのアルギニン拳コ ドンへの置換 ベーリンガーの「部位特異的突然変異誘発キット」で提供された突然変異誘発法 を使用した。Ｍ１３ｍｐ９　ｒｅｖ　ｄｓＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨ ｉｎｄｌｌｌで消化した。方法を以下に簡単に記載する：提供されたハイブリダ イゼーシッン緩衝液の存在下、Ｍ１３ｍｐ９−１８１／９Ｓの５ｓＤＮＡの約１ ．２５μｇをＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｌ！切断Ｍ１３ｍｐ９　ｒｅｖ　ｄｓＤＮ Ａｏ、５μｇとハイブリダイズさせた。該混合物を４分間１００°Ｃに加熱し、 その後６５°Ｃに徐々に冷却することによりアニーリングを行う。該混合物（４ ０ｕ（２）を６５℃で２ｏ分間保ち、氷上に置く。これにより、標的ＤＮＡ配列 にわたって一本鎖のギャップを含有するｄｓＤＮＡ分子が生成する。このギャッ プのある混合物８μｇを、少なくとも４μｍｏＱの濃度を有し所望の塩基変化を 含有するキナーゼ・オリゴヌクレオチド２μｇに加える。該オリゴヌクレオチド は全部で４個のリジンからアルギニンへの変換を含有し、該一本鏑のギャップ領 域内の配列に相補するように設計されている。アルギニン・コドン変化を有する オリゴヌクレオチドの配列には以下のようにアンダーラインを施す： ５’ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＧＧＡ醇狙ＣＡＴ　ＡＡＣＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＴ Ａ　ＣＧＴ　ＣＴＣＣＧＴ躯冴ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣ空ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＣ Ａ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＡＣＣＧＴＡ　ＧＴＴ俊ＧＡＧＣＡＧ　ＣＧＣ 該プライマーを、６５°Ｃで５分間インキュベートし室温まで徐々に冷却するこ とによりアニールさせる。ブライミング後、ギャップのある５ｓＤＮＡ領域の残 りを、ｄＮＴＰ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびフレノウの存在下、４５分間室温 で満たすことによりｄｓＤＮＡに変換する。ＥＤＴＡを加え６５°Ｃに１０分間 加熱することにより該反応を停止する。該反応混合物はＢＨＭ７１−１８ｍｕ　 ｔ　Ｓのコンピテント細胞をトランスフェクトすることに使用する。このトラン スフェクトした細胞を、ＬＢジグロス中一夜増殖させ、Ｍ１３ファージ・ストッ クを上澄みから調製する。ついで、該Ｍ１３ファージをＭＫ３０−３上で平板培 養し、プラークを選択し、５ｓＤＮＡを調製する。所望の突然変異を有するクロ ーンを配列分析により同定する。

４、リジンからアルギニンへの変換を有するｒｂＳｔ断片のｐＵＲＡ発現ベクタ ーへのクローニング メノシングによる記載（前掲）の通りにリジンからアルギニンへのＭ１３ファー ジから２本鎖Ｍ１３ＤＮＡを調製する。制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌおよび ＢａｍＨＩで該ＤＮＡを消化する。

これにより７，２００および３１０ｂｐの断片が生成する。３１０ｂｐ断片を単 離し、先に２項で単離したｐＤＨ−ｍ４−ＴＳからのＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩベク ター断片と連結した。この２断片を連結し、ＭＣ１０００のコンピテント細胞を 形質転換するのに使用した。

ベクターＤＮＡを個々の形質転換体から調製し、ＤＮＡ配列決定により特徴付け た。所望の変化（９９ｓｅｒ、１５７ａｒｇ、１６７ａｒｇ、１７１ａｒｇ、１ ８０ａｒｇ、１８１ｓｅｒおよび１８９ｓｅｒ）を有する候補物をｐＤＨ−ｍ４ −ＴＳ／ＱＡと称した。

修飾遺伝子をｐＵＲＡ発現ベクター（ＰＣＴ／ＵＳ８Ｂ１０○３２８）にクロー ニングするために、ｐＤＨ−ｍ４−ＴＳ／ＱＡのベクターＤＮＡをＥｃｏＲＩお よびＨｉｎｄｌｌｌで消化して、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐＬ　ｒｂｓおよび １８６位までのｒｂＳｔ：＋−ディング配列を含有する約２，８００ｂｐおよび ８５０ｂｐのベクター断片を得た。該Ｈｉｎｄｌｌｌ制限部位配列は、アミノ酸 １８６．１８７および１８８についてのコドンにわたり生じる。同時継続米国特 許出願Ｓ、Ｎ、　０７／３０４．７３３ｉ、１．記載のｐＵＲＡ−ＢＳｔｍ４− １８１／９ベクターをＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨＩで消化した。この消化により 約５．０００および８５０ｂｐのベクター断片を得る。該５，０ＯＯｂｐ断片を 単離し、ｐＤＨ−ｍ４−ＴＡ／ＱＡからの８５０ｂｐ断片に連結する。該連結を 使用してＭＣ１０ｏＯコンピテント細胞を形質転換した。ベクターＤＮＡを単離 し、制限分析および配列分析により分析する。前記酵素による消化後のｐＵＲＡ −ＢＳ　ｔｍ４−１８１／９ベクターはなお、１８９位にセリン置換を保持して いるので、最終ベクターは９９ｓｅｒ、１５７ａｒｇ、１６７ａｒｇ、１７１ａ ｒｇ、１８０ａｒｇ、１８１ｓｅｒおよび１８９ｓｅｒの変換を含有する。該ベ クターをｐＵＲＡ−ｍ４−ＴＳ／ＱＡと称し、発酵評価のためのＢＳＴ−ＩＣ株 （ＰＣＴ特許出ａＰＣＴ／ＵＳ８Ｂ１００３２８）１ｍ形質転換する。１５７． １６７．１７１および１８０位がアルギニン残基の場合、リジン残基のアセチル 化が回避され低等電点を有するｒｂＳｔの付随的生成が回避される。

同様の方法を使用して、１５７．１６７．１７１および１８０位のりジン残基を 他の受容可能なアミノ酸、例えばグルタミンで置換できる。また、同様の方法を 使用して、同様のアセチル化の加工に付される他の異種ポリペプチド中の他のリ ジンを置換できる。このアセチル化された分子は、本明細書中に記載した方法に より決定でチャート　１．　ウシ・ソマトトロピンのアミノ酸配列ａｈａ　ｐｂ ｍ　ｐｒｏ　ａｌａ　ｍ＠セｓｉｒ　ｌａｕ　ｓａｒ　ｇｌｙ　ｌａｕ　ｐｂｍ 　ａｈａ　ａｓｎ　ａｌａ　ｖａＬｐｒｏ　ｔｈｒ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　ａｓｎ　 ｇｌｕ　ａｌａ　ｇｉｎ　ｇｌｎ　ｌｙｓ　ｓｉｒ　ａｓｐ　ｌａｕ　ｇＬｕ　 ｌ＠ｕｓａｒ　ａｓｐ　ａｓｐ　ａｌａ　ｌａｕ　ｌｅｕ　ｌｙｓ　ａｓｎ　ｔ ｒｙ　ｇｌｙ　１・ｕ　ｌａｕ　ｓａｒ　ａｙｓ　ｐｈａ国際調査報告 １ｅｌｔ’Ｍｌｉ崗１４−ｉｆｆｉ＃ＩＩＭＮ＊、　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００ ３２６

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．低濃度のアミノ酸を有する発酵培地上で宿主微生物を増殖させることを特徴 とする、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換された該宿主微生 物により発現された該異種ポリペプチドをアセチル化する方法。
2. ２．該微生物が、該異種ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子で形質転換 されたバクテリアである請求項１記載の方法。
3. ３．１５７、１６７、１７１および１８０位のリジンに対応する少なくとも１個 のアミノ酸残基がアセチル化されたｂＳｔ。
4. ４．チャート１に示す天然ソマトトロピンの１５７、１６７、１７１または１８ ０残基に対応する少なくとも１個のリジン残基がアルギニンで置換された動物ソ マトトロピン。
5. ５．該動物が哺乳動物である請求項４記載の動物ソマトトロピン。
6. ６．該哺乳動物がウシである請求項５記載の哺乳動物ソマトトロピン。
7. ７．該哺乳動物がプタである請求項５記載の哺乳動物ソマトトロピン。
8. ８．すべてのリジン残基がアルギニンで置換された請求項６記載のソマトトロピ ン。
9. ９．リジン１５７、１６７および１７１がアルギニンで置換され、リジン１８０ がグルタミンで置換された請求項６記載のソマトトロピン。
10. １０．リジン１５７、１６７、１７１および１８０がアルギニンまたはグルタミ ンのいずれかで置換された請求項６記載のソマトトロピン。
11. １１．リジン１５７、１６７、１７１および１８０がすべてグルタミンで置換さ れた請求項６記載のソマトトロピン。