ES2328223T3 - Metodos para reducir la formacion de subproductos en la produccion de polipeptidos geneticamente modificados. - Google Patents
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Abstract
Un método para reducir la formación de un polipéptido de subproducción que contiene un resto de O-acetilserina en lugar de un resto de serina añadiendo al menos una de histidina, metionina o glicina al medio en un método para producir un polipéptido que contiene un resto de serina cultivando Escherichia coli transformada.
Description
Métodos para reducir la formación de
subproductos en la producción de polipéptidos genéticamente
modificados.
La presente invención se refiere a métodos para
reducir la formación de subproductos en la producción de
polipéptidos mediante técnicas de ingeniería genética y a métodos
para producir polipéptidos recombinantes caracterizados por la
reducción de la formación de subproductos.
Las técnicas de ingeniería genética se usan
frecuentemente en la producción de polipéptidos fisiológicamente
activos. Básicamente, los códigos genéticos normalmente se traducen
de forma muy fiel, pero algunas veces se incorpora un aminoácido o
un derivado aminoacídico que no se corresponde a la tabla de codones
en los polipéptidos durante la traducción. Por ejemplo, el
porcentaje de traducción errónea de ARNm ribosómico fue de 10^{-4}
por codón del experimento de incorporación de [^{35}S] Cys en
proteína flagelina de E. coli sin cisteína altamente
purificada. Sin embargo, la probabilidad de incorporación de
cisteína en esta proteína aumenta en gran medida en presencia del
antibiótico estreptomicina; esto se debe probablemente a que codones
de Cys (UGU y UGC) se traducen erróneamente por codones de Arg (CGU
y CGC) (Voet y Voet, Biochemistry, Vol. 2, segunda edición, Tokyo
Kagaku Dojin, págs. 869-870, 1998).
Tsai et al. describieron que se incorpora
norleucina con alta frecuencia en la ubicación que debe ocuparse de
forma natural por metionina en la expresión de IL-2
humana en E. coli (Tsai, L. B. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., Vol. 156, págs. 733-739,
1988). Se encuentra una descripción similar en la expresión de
somatotropina bovina (Bogosian, G. et al., J. Biol. Chem.,
Vol. 264, págs. 531-539, 1989). En ambos casos, los
autores suponen que la norleucina se sintetizó en células por la
activación de la ruta sintética de leucina en E. coli y se
añadió ARNt de metionina en lugar de metionina y, por tanto, se
incorporó en las proteínas expresadas.
Además de la incorporación errónea de
norleucina, Apostol et al. muestra que la norvalina se
incorporó erróneamente en la ubicación que se debe ocupar por
leucina en la producción de hemoglobina recombinante por E.
coli (Apostol I. et al., J. Biol. Chem., Vol. 272, págs.
28980-28988, 1997). En este caso, los autores
también suponen que la activación de la ruta sintética de leucina en
E. coli condujo a la producción de norvalina, que se
incorporó después en lugar de leucina.
Como para el anterior caso en el que se
incorpora norleucina en los polipéptidos deseados en lugar de
metionina, se ha conocido un método para reducir la incorporación
de norleucina en polipéptidos heterólogos expresados en
microorganismos transformados cultivados en un medio aumentando la
concentración de metionina y/o leucina o disminuyendo la cantidad
de norleucina en el medio de fermentación o combinando ambos
(Patente Japonesa Nº 2879063, Patente de Estados Unidos Nº
5599690).
Los presentes inventores investigaron un método
para producir de forma eficaz péptido natriurético auricular humano
(denominado más adelante en este documento también hANP, la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1; Kangawa, K.
et al., Biochem Biophys. Res. Commun., Vol. 118, págs.
131-139, 1984) mediante ingeniería genética usando
E. coli como una célula hospedadora y tuvieran éxito al
construir un método para producir de forma eficaz hANP a partir de
una proteína de fusión (Patente Japonesa Nº 1963624). En este
método, la proteína de fusión comprende un péptido protector que
consiste en los 97 aminoácidos N-terminales de
\beta-galactosidasa de E. coli, una
secuencia enlazadora de 3 restos aminoacídicos que incluye un resto
de lisina (Gln-Phe-Lys) y hANP y el
gen para esta proteína de fusión está codificado en un vector de
expresión obtenido de pBR322. La transcripción del gen de proteína
de fusión está controlada por un promotor de lactosa obtenido de
E. coli y la proteína de fusión expresada se acumula como
cuerpos de inclusión en E. coli. La proteína de fusión
resultante se solubiliza por un agente desnaturalizante y después se
trata con una proteasa que reconoce y escinde específicamente el
resto de lisina, API (proteasa I de Achromobacter [Masaki, T.
et. Al., Biochim. Biophys. Acta., Vol. 660, págs.
51-55, 1981]) para liberar hANP, que se purifica
por cromatografía para dar un producto final de hANP.
Durante estudios de este proceso de producción
de hANP, los presentes inventores encontraron una impureza que
tiene propiedades fisioquímicas similares a las de hANP y no se
puede separar de forma sencilla por cromatografía. Esta impureza se
detecta como una sustancia que eluye ligeramente después de hANP en
cromatografía líquida de alta presión de fase inversa analítica
(RP-HPLC) y existe en una proporción de
aproximadamente el 5% con respecto a hANP escindido por reacción
enzimática (este polipéptido de subproducción de impureza se
denominará más adelante en este documento R1). Este R1 fue difícil
de separar ya que su pico de elución se solapó con la porción de
cola de la curva de elución de hANP en HPLC preparativa usada en una
escala de producción.
Ya que hANP se usa como una medicina para tratar
insuficiencia cardiaca aguda, es importante proporcionar hANP con
alta pureza para un uso médico de este tipo. Los procesos de
producción actuales garantizan suficientemente el nivel de pureza
médica, pero tienen un problema en cuanto a los costes de producción
debido a que el polipéptido de subproducción R1 se tiene que
retirar durante la etapa de purificación a expensas de una pérdida
de rendimiento. Por tanto, ha sido un desafío importante encontrar
un medio para reducir la formación de la impureza en la producción
de hANP de alta pureza.
A partir del documento
US-A-5.670.340 se describe un
proceso para la producción de péptido natriurético en E.
coli. La materia sujeto se refiere a un método que no usa la
adición de al menos histidina, metionina o glicina.
En la producción de polipéptidos recombinantes,
los subproductos impuros se tienen que retirar durante la etapa de
purificación a expensas de una pérdida de rendimiento que conduce a
un posible problema en los costes de producción y es importante
encontrar un medio para reducir la formación de los subproductos en
la producción de polipéptidos recombinantes de alta pureza. Por lo
tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método
para reducir la formación de subproductos en la producción de un
polipéptido y un método para producir un polipéptido recombinante
caracterizado por la reducción de la formación de subproductos.
La presente invención proporciona un método para
reducir la formación de un polipéptido de subproducción que
contiene un resto de O-acetilserina en lugar de un
resto de serina añadiendo al menos una de histidina, metionina o
glicina al medio en un método para producir un polipéptido que
contiene un resto de serina cultivando células de E.
coli.
La presente invención también proporciona un
método para producir un polipéptido que contiene un resto de serina
cultivando células de E. coli transformadas, caracterizado
por la reducción de la formación de un polipéptido de subproducción
que contiene un resto de O-acetilserina en lugar de
un resto de serina añadiendo al menos una de histidina, metionina o
glicina al medio.
La Figura 1 muestra una vista esquemática del
vector de expresión pGH\alpha97SII.
La Figura 2 muestra los resultados de análisis
de HPLC de fase inversa de hANP escindido de la proteína de fusión
después de la finalización de una reacción enzimática.
La Figura 3 muestra los resultados de análisis
estructural de R1 por espectrometría de masas.
Para analizar la anterior impureza producida
durante el proceso de producción de hANP, se recogió un pico de R1
por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa C18
analítica y se analizó esta estructura por espectrometría de masas
y secuenciación de aminoácidos. Los resultados mostraron que R1
tiene un peso molecular superior en 42 que el de hANP. La
secuenciación de aminoácidos de R1 mostró que tiene la misma
secuencia de aminoácidos que la de hANP, indicando que R1 no se
produjo por sustitución de un aminoácido en hANP por otro
aminoácido sino un derivado de hANP que contiene un aminoácido
modificado.
Si existía una pluralidad de sitios de
modificación, deben aparecer varios derivados de combinaciones de
los mismos, pero solamente se obtuvo en realidad un único pico por
HPLC analítica, indicando que existe solamente un sitio de
modificación. La modificación parece ser acetilación en vista de la
reacción de modificación que tiene lugar durante la biosíntesis y
el peso molecular de 42.
Como para el sitio de acetilación, la secuencia
de aminoácidos de hANP implica la posibilidad de modificación en
restos de serina, arginina y tirosina. En primer lugar, el análisis
de aminoácidos C-terminales del único resto de
tirosina C-terminal de hANP mostró que el aminoácido
C-terminal de R1 es tirosina y rechazó la
posibilidad de modificación en el resto de tirosina. El resto de
arginina se modifica menos probablemente debido a que R1 también se
escinde de forma apropiada con una proteasa que reconoce
específicamente arginina (tripsina). Por tanto, se concluyó que
tuvo lugar acetilación en el resto de serina debido a que se mostró
que el producto de acetilación de resto de serina
O-acetilserina se sintetiza en células y se puede
incorporar en lugar del resto de serina durante la traducción en el
polipéptido. Además, R1 se podría detectar a partir del punto en el
que se liberó hANP de la proteína de fusión, que también indica que
R1 se debe producir durante la traducción en el polipéptido. Esto
condujo a la conclusión de que la modificación en R1 tuvo lugar
durante la expresión de la proteína de fusión pero no durante la
etapa de
purificación.
purificación.
Se intentó reducir la formación de R1 durante la
etapa de cultivo. No existe ninguna descripción de una modificación
de este tipo que aumenta el peso molecular en 42 en la producción de
un péptido recombinante en E. coli como una célula
hospedadora y, por lo tanto, no se ha conocido nada sobre el medio
para reducir la formación de R1. Se tomaron como centro de atención
los aminoácidos como constituyentes de proteínas y se intentó
reducir la formación de R1 añadiendo un aminoácido al medio para
inhibir la biosíntesis del aminoácido y, por tanto, para reducir la
formación de intermedios biosintéticos tales como
O-acetilserina.
Se realizaron evaluaciones cultivando células
productoras de hANP en presencia de uno cualquiera de 18 aminoácidos
(L-alanina, glicina, L-leucina,
L-isoleucina, L-fenilalanina,
L-serina, L-metionina,
L-cisteína, L-triptófano,
L-prolina, L-glutamina, acido
L-glutámico, L-asparagina, ácido
L-aspártico, L-treonina,
L-arginina, L-lisina y
L-histidina) y comparando los niveles de producción
de hANP y R1.
La L-valina no se ensayó debido
a que induce inhibición del crecimiento de células. La
L-tirosina tampoco se ensayó, debido a que parece
ser inadecuada para cultivo en masa debido a la baja
solubilidad.
Los resultados de la evaluación mostraron que la
adición de glicina, histidina o metionina de los 18
L-aminoácidos redujo la producción de R1 en el 50%
más, mostrando que la adición de estos aminoácidos reduce
significativamente la producción de R1. Es decir, se observó que la
adición de estos aminoácidos al medio reduce la producción de R1 y
también aumenta los niveles de producción de cuerpos de inclusión
por célula, mostrando que es un método útil para la producción en
masa de hANP de alta pureza. Los aminoácidos se pueden añadir en una
cantidad que inhibe la biosíntesis de los aminoácidos añadidos
(glicina, histidina y/o metionina) en células hospedadoras durante
el cultivo. Por ejemplo, se pueden añadir de forma apropiada para
evitar cualquier pérdida del contenido de aminoácidos al medio
controlado durante el cultivo. Alternativamente, los aminoácidos se
pueden añadir inicialmente al medio en una cantidad suficiente para
mantener un nivel de aminoácidos necesario incluso al final del
cultivo, después de que se haya calculado de forma preliminar el
nivel necesario de aminoácidos a partir de la composición de
aminoácidos de la célula hospedadora (véase Frederick C. H. et
al., Chemical Composition of Escherichia coli in
Escherichia coli and Salmonella, segunda edición, ASM press,
págs. 13-16), la densidad celular obtenida, la
composición de aminoácidos de la proteína a expresar y el nivel de
expresión.
Aunque la glicina, histidina o metionina se
evaluó como un único aminoácido en los siguientes ejemplos, se
puede esperar de forma suficiente que la producción de R1 se
reducirá adicionalmente por combinaciones de las mismas.
Se realizaron estas evaluaciones con respecto a
la producción de hANP como un ejemplo, pero también es muy probable
que las impurezas que dan un peso molecular de +42 se presentan en
la producción de polipéptidos que incluyen péptidos o proteínas
(especialmente que contienen serina) diferentes a hANP por técnicas
de ingeniería genética y, por lo tanto, el presente método se puede
aplicar de forma amplia a péptidos y proteínas producidos por
ingeniería genética. Además, también se puede esperar que la
presente invención reduzca la posible formación de uno o más
subproductos que tengan un resto de O-acetilserina
incorporado en uno o más de una pluralidad de restos de serina que
pueden estar contenidos en algunos péptidos o proteínas.
Los ejemplos de péptidos a los que se puede
aplicar la presente invención incluyen péptido natriurético de tipo
A, péptido natriurético de tipo B, bradiquinina, gastrina grande,
calcitonina, péptido relacionado con gen de calcitonina, factor de
liberación de corticotropina, cortistatina, péptido natriurético de
tipo C, defensina 1, elafina, endorfina \alpha, endorfina
\beta, endorfina \gamma, endotelina 1, endotelina 2, endotelina
1 grande, endotelina 2 grande, endotelina 3 grande, enquefalina,
galanina, gastrina grande, péptido inhibidor gástrico, grelina,
glucagón, péptido similar a glucagón 1, péptido similar a glucagón
2, factor liberador de hormona del crecimiento, histatina 5,
insulina, péptido de unión, hormona liberadora de hormona
luteinizante, hormona estimulante de melanocitos, midquina,
neuroquinina A, neuropéptido Y, neurotensina, oxitocina, péptido 20
N-terminal de proadrenomedulina, hormona
paratiroidea, péptido relacionado con PTH, péptido
histidina-metionina-27, polipéptido
de activación de adenilato ciclasa hipofisaria 38, factor
plaquetario 4, péptido T, secretina, factor tímico sérico,
somastostatina, urocortina, péptido intestinal vasoactivo y
derivados del mismo y los ejemplos de proteínas adecuadas incluyen
hormonas de crecimientos y derivados de las mismas.
Preferiblemente, la presente invención se aplica
a polipéptidos que contienen un resto de serina que tiene un peso
molecular de 1000-2000. Los polipéptidos que
contienen un resto de serina son más preferiblemente péptidos
natriuréticos auriculares, mucho más preferiblemente péptido
natriurético auricular humano.
Como células hospedadoras se usa Escherichia
coli.
Es decir, la presente invención se refiere
a:
a) un método para reducir la formación de un
polipéptido de subproducción añadiendo al menos uno de histidina,
metionina o glicina al medio en un método para producir un
polipéptido recombinante cultivando células de E. coli
transformadas,
b) un método para producir un polipéptido
recombinante cultivando células de E. coli transformadas,
caracterizado por la reducción de la formación de un polipéptido de
subproducción añadiendo al menos una de histidina, metionina o
glicina al medio,
c) el método como se define en a) o b), en el
que el polipéptido de subproducción es un derivado del polipéptido
recombinante que tiene un cambio de peso molecular de +42,
d) el método como se define en a) a c), en el
que el polipéptido de subproducción es un derivado de
acetilación,
e) el método como se define en a) a d), en el
que el polipéptido recombinante tiene serina en la molécula,
f) el método como se define en a) a e), en el
que el peso molecular del polipéptido recombinante es de
aproximadamente 1000 a 20000,
g) el método como se define en f), en el que el
polipéptido recombinante es un péptido natriurético auricular,
h) el método como se define en g), en el que el
péptido natriurético auricular es péptido natriurético auricular
humano.
La presente invención se refiere a un método
para reducir la formación de un polipéptido de subproducción
añadiendo al menos una de histidina, metionina o glicina al medio en
un método para producir un polipéptido recombinante cultivando
células de E. coli transformadas y un método para producir un
polipéptido recombinante caracterizado por la reducción de la
formación de un polipéptido de subproducción. Especialmente, la
presente invención tiene el efecto de reducir la formación de un
polipéptido de subproducción que contiene un resto de
O-acetilserina en lugar de un resto de serina y
posibilita proporcionar polipéptidos recombinantes de alta pureza a
costes de producciones menores que anteriormente.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la presente invención. Se podrán realizar diversos cambios y
modificaciones por los especialistas en la técnica y, por lo tanto,
la presente invención no se limita a los ejemplos sino que también
incluye tales cambios y modificaciones.
Un gen que codifica una proteína de fusión que
contiene un péptido protector que consiste en los 97 aminoácidos
N-terminales de
\beta-galactosidasa de E. coli (SEC ID Nº:
2), una secuencia enlazadora de 3 restos aminoacídicos que incluye
lisina (Gln-Phe-Lys) y hANP (SEC ID
Nº: 1) se clonó en el sitio EcoRI-DraI de pBR322
que carece de la región BalI-PvuII (Nature. 1980;
283: 216-8) para preparar el vector de expresión
pGH\alpha97SII (Figura 1, la secuencia génica de la proteína de
fusión no se muestra). El vector de expresión se construyó de
acuerdo con un protocolo convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa W3110 de E. coli que aloja el
anterior plásmido de expresión (W3110/pGH\alpha97SII) se cultivó
en medio NU mostrado en la Tabla 1 usando un fermentador de
tanque.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de incubación implicaron una
concentración de glucosa del 4,5%, 33ºC, pH 7.0 y un nivel de
oxígeno disuelto del 30%, y el pH y el nivel de oxígeno disuelto se
controlaron por adición gota a gota de amonio acuoso y aumentando
la velocidad de centrifugación, respectivamente. Después de que se
hubiera consumido la glucosa se añadió secuencialmente glicerol
como una fuente de carbono para inducir la expresión de la proteína
de fusión hANP a una temperatura de incubación controlada a 37ºC
durante aproximadamente 30 horas. Se observó la formación de
cuerpos de inclusión en células cultivadas y la proteína de fusión
expresada se correspondía al 30% o más de la proteína celular
total.
Después de la incubación, el cultivo se
homogeneizó con un homogeneizador Manton-Gaulin
(15M-8AT) a 500 kg/cm^{2} y se centrifugó para
recuperar fracciones precipitadas (cuerpos de inclusión). Después,
el cultivo se suspendió en una cantidad equivalente de
Tris-HCl 30 mM (pH 9,3) y después se volvió a
centrifugar para recuperar el precipitado. Esta operación de lavado
se repitió de nuevo y el precipitado final se suspendió en una
cantidad apropiada de tampón Tris-HCl 30 mM (pH
9,3).
Después, los cuerpos de inclusión se
suspendieron/disolvieron en tampón Tris-HCl 30 mM
(pH 9,3) que contenía urea 5 M. Los cuerpos de inclusión se usaron
en una cantidad que da un valor de DO660 de 220 cuando se
suspendieron en agua. A esta solución de cuerpos de inclusión se
añadieron 3,5 unidades/l de API (Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.) para una reacción de escisión a 30ºC durante 1,5 horas. La
Figura 2 muestra análisis de HPLC de fase inversa de hANP escindido
después de la finalización de la reacción enzimática. El análisis se
realizó a una temperatura de columna de 40ºC por elución en
gradiente con una solución mezclada (1:1) de solución A: solución
de ácido trifluoroacético (1\rightarrow1000) y solución B:
solución de acetonitrilo/ácido trifluoroacético
(0,95\rightarrow1000) a un caudal de 1 ml/min, en la que la
solución B se aumentó de forma constante desde una concentración
inicial del 43% hasta una concentración final del 52% a lo largo de
16 minutos. El R1 se detectó como una impureza a un tiempo de
elución relativo de 1,1 en comparación con hANP.
Después, R1 se purificó para análisis
estructural de R1. Después de la finalización del tratamiento
enzimático, la solución de reacción se ajustó a pH 5,0 con ácido
acético y el péptido protector se precipitó y después se retiró el
precipitado por centrifugación. Después, el sobrenadante se añadió a
una columna Cm-Toyopearl (TOSOH) equilibrada con
solución de acetato de amonio 50 mM (pH 5,0) que contenía urea 2,5 M
para adsorber R1 y hANP, y después se eluyó con un gradiente de
concentración de sales de cloruro sódico y se recogieron las
fracciones que contenían hANP y R1.
Las fracciones obtenidas de este modo se
combinaron con ácido acético en una cantidad equivalente al 20%
(vol/vol) y se pasaron a través de una columna de fase inversa (ODS
remojado) usando octadecilo (C18) como un ligando para adsorber
hANP a la columna, y después se eluyó hANP con gradiente de
acetonitrilo y se recogieron las fracciones que contenían hANP y
R1.
Las fracciones obtenidas de este modo se
aplicaron a una columna de HPLC de fase inversa analítica
(YMC-Pack
ODS-A-302: 4,6 mm x 150 mm) y se
recogieron los picos para R1 para dar R1 de alta pureza.
Se realizó el análisis estructural de R1 por
secuenciación de aminoácidos N-terminales de Edman y
análisis de peso molecular por espectrometría de masas (ionización
por electropulverización). Los resultados mostraron que la
secuencia N-terminal concordaba con la secuencia de
hANP. Los resultados de la espectrometría de masas mostraron un
peso molecular de 3122, que es mayor en 42 que el peso molecular de
hANP 3080 (Figura 3). Estos resultados analíticos sugieren que R1
puede ser alguna modificación de hANP. Se supuso que esta
modificación contenía un grupo acetilo debido al peso molecular de
+42 y la reacción de modificación que tiene lugar en células. La
secuencia de aminoácidos de hANP implica la posibilidad de
modificación en restos de serina, arginina y tirosina,
especialmente el resto de serina. Esto es debido a que se conoce que
el producto de acetilación de serina O-acetilserina
se sintetiza en células (Kredich, N. M.: Biosynthesis of cysteine in
Escherichia coli and Salmonella, segunda edición ASM press,
págs. 514-527) y parece que la
O-acetilserina se incorpora en lugar de serina
durante la traducción en el polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células de reserva congeladas de
W3110/pGH\alpha97SII en 100 ml de medio LBD (triptona al 1%,
extracto de levadura al 0,5%, D-glucosa al 1%,
tampón fosfato potásico 0,1 M [pH 7,0]) y se cultivaron con
agitación a 37ºC durante aproximadamente 7 horas. Al cultivo
resultante se añadió glicerol a una concentración final del 10% y
cada alícuota de 1 ml se distribuyó en 20 viales y se congeló para
experimentos posteriores.
Las células de reserva congeladas se inocularon
en 200 ml de medio NU mostrado en la Tabla 1 (excepto porque
contenía glucosa (4 g/l) como una fuente de carbono y 0,1 g/l de
extracto de levadura a pH 7,2) y se cultivaron con agitación a 33ºC
durante una noche. Las células se recogieron por centrifugación y se
lavaron una vez con solución salina fisiológica (NaCl al 0,9%) y se
suspendieron en una cantidad apropiada de solución salina
fisiológica (NaCl al 0,9%) para conseguir 7-8 veces
la densidad celular inicial.
Después, 2 ml de esta suspensión celular se
añadieron a 100 ml de medio NU (excepto porque contenía 0,1 g/l de
extracto de levadura y glicerina (10 g/l) como una fuente de carbono
a pH 6,9-7,0) que contenía 3 g/l de uno cualquiera
de L-alanina, glicina, L-leucina,
L-isoleucina, L-fenilalanina,
L-serina, L-metionina,
L-cisteína, L-triptófano,
L-prolina, L-glutamina, acido
L-glutámico, L-asparagina, acido
L-aspártico, L-treonina,
L-arginina, L-lisina y
L-histidina y se incubaron a 37ºC durante una
noche.
Las células de recuperaron del cultivo en cada
matraz por centrifugación (7000 rpm, 20 min) y después se
suspendieron en 5 ml de agua desionizada y se rompieron con un
dispositivo de ruptura de células ultrasónico. Después, los cuerpos
de inclusión se recuperaron en fracciones precipitadas por
centrifugación (12000 rpm, 5 min) y se suspendieron en 5 ml de
tampón Tris-HCl 30 mM (pH 9,3) y la suspensión se
volvió a centrifugar (12000 rpm, 5 min) y los cuerpos de inclusión
se lavaron y concentraron.
Después, los cuerpos de inclusión resultantes se
suspendieron/disolvieron en 1 ml de tampón Tris-HCl
30 mM (pH 9,3) que contenía urea 5 M. Los cuerpos de inclusión se
usaron en una cantidad que da un valor de DO660 de 22 cuando se
suspendieron en agua. La solución de reacción se hizo reaccionar con
0,004 unidades/ml de proteasa API (Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.) a 30ºC durante aproximadamente 150 min para liberar hANP de
la proteína de fusión. La solución de reacción se centrifugó (12000
rpm, 5 min) y 300 \mul del sobrenadante se combinaron con
13,5-15,5 \mul de ácido acético al 5% y se
diluyeron en 450 \mul de agua purificada. Los precipitados
formados durante esta operación se retiraron por centrifugación
(12000 rpm, 5 min) y el sobrenadante se analizó por HPLC (columna:
YMC-Pack ODS-A302). La concentración
de R1 se calculó a partir de la proporción del área pico con
respecto a la de hANP.
La Tabla 2 muestra los niveles de producción de
R1 con respecto a hANP.
Los resultados mostraron que la adición de
histidina, metionina o glicina a los aminoácidos ensayados redujo
significativamente la producción de R1 como es evidente a partir de
la disminución del nivel de producción de R1 en el 50% o más en
comparación con el control (ningún aminoácido añadido). También se
demostró que la adición de estos aminoácidos aumentó el nivel de
cuerpos de inclusión producidos por célula. Entre la histidina,
metionina y glicina que tienen todas el efecto de reducir la
producción de R1, se observó que la metionina es la más eficaz para
reducir la producción de R1 debido al menor nivel de producción de
R1 con respecto a hANP acoplado a un alto nivel de producción de
cuerpos de inclusión.
Sin embargo, la L-leucina,
L-fenilalanina y L-cisteína
disminuyeron la expresión de la proteína de fusión fallando en la
recuperación de los cuerpos de inclusión, demostrando que la adición
de estos aminoácidos no es eficaz para la producción de hANP.
<110> SUNTORY LIMITED
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS PARA REDUCIR LA FORMACIÓN DE
SUBPRODUCTOS EN LA PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS RECOMBINANTES
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<130> YCT-601
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<160> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
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<223> hANP
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N terminal de
\beta-galactosidasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (5)
1. Un método para reducir la formación de un
polipéptido de subproducción que contiene un resto de
O-acetilserina en lugar de un resto de serina
añadiendo al menos una de histidina, metionina o glicina al medio en
un método para producir un polipéptido que contiene un resto de
serina cultivando Escherichia coli transformada.
2. Un método para producir un polipéptido que
contiene un resto de serina y para reducir la formación de un
polipéptido de subproducción que contiene un resto de
O-acetilserina en lugar de un resto de serina
caracterizado por la adición de al menos una de histidina,
metionina o glicina al medio, en un cultivo de E. coli
transformada.
3. El método como se define en la reivindicación
1 ó 2, en el que el peso molecular del polipéptido que contiene un
resto de serina es de aproximadamente 1000 a 20.000.
4. El método como se define en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido que contiene
un resto de serina es un péptido natriurético auricular.
5. El método como se define en la reivindicación
4, en el que el péptido natriurético auricular es péptido
natriurético auricular humano.
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