CN100402649C - 在基因重组多肽的生产中抑制副产物生成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了，在培养转化细胞而制造含有丝氨酸残基的多肽的方法中，通过在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种，以抑制代替丝氨酸残基而掺入O-乙酰丝氨酸残基的副产物多肽生成的方法，以及培养转化细胞而制造含有丝氨酸残基的多肽的方法，该方法的特征是，通过在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种进行培养，以抑制代替丝氨酸残基而掺入O-乙酰丝氨酸残基的副产物多肽生成。

Description

在基因重组多肽的生产中抑制副产物生成的方法
技术领域
本发明是关于在采用基因重组技术生产多肽的过程中抑制副产物生成的方法，以及以抑制副产物生成为特征的基因重组多肽的制造方法。
背景技术
在生理活性多肽的生产中，广泛使用基因重组技术。本来，遗传密码的翻译通常被极忠实地进行，但在目的多肽基因的翻译时，不仅生成该目的多肽，而且往往会生成混入与密码表中指定的氨基酸不同的氨基酸或者氨基酸衍生物的多肽。例如，关于核糖体的mRNA翻译的不正确度，在根据〔35S〕Cys掺入高度纯化的不含半胱氨酸的大肠杆菌蛋白质-鞭毛蛋白中的比例进行推断的场合，该氨基酸掺入的概率是每密码子大约10-4。如果存在抗生素链霉素，与密码表指定的氨基酸不同的氨基酸进入的概率就会显著地增大，据认为，这是由于该翻译将Arg密码子(CGU和CGC)弄错成Cys密码子(UGU和UGC)所致(ヴオ-ト生化学(下)，第2版，东京化学同人，p869-870，1998)。
另外，Tsai等人曾报告，在人的IL-2大肠杆菌内的表达中，原本在甲硫氨酸应该进入的位置，以高频度插入正亮氨酸(Tsai，L.B.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.156，p733-739，1988)。同样的报告，在牛垂体生成激素的表达(Bogosian，G.et al.，J.Biol.Chem.，Vol.264，p531-539，1989)中也发现。在这两种情况中，通过大肠杆菌的亮氨酸合成路径活化在细胞内合成正亮氨酸，正亮氨酸代替甲硫氨酸附加在甲硫氨酸tRNA上，结果进入了已表达的蛋白质中。
进而，除了正亮氨酸的错误掺入以外，Apostol等人指出，在利用大肠杆菌的重组血红蛋白的生产中，在本来亮氨酸应该掺入的位置掺入了正缬氨酸(Apostol l.et al.，J.Biol.Chem.，Vol.272，p28980-28988，1997)。对于此场合来说，也推断为大肠杆菌的亮氨酸合成路径的活化导致了正缬氨酸的生成，然后其代替亮氨酸掺入。
在上述事例中，已经知道在代替甲硫氨酸掺入正亮氨酸之目的多肽的事例中，通过增加发酵培养基中的甲硫氨酸和/或亮氨酸的浓度，或者减少正亮氨酸的量，或者两者同时进行，可以抑制正亮氨酸掺入在培养基中已增殖的转化微生物中被表达的异源多肽的方法(日本国特许第2879063号、美国专利第5599690号)。
另一方面，本发明人研究了利用以大肠杆菌作为宿主细胞的基因重组的人心房钠尿肽(以下也记载为hANP，氨基酸序列如SEQ ID No：1中所示：Kangawa，K.et.al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.118，p131-139，1984)的高效率的生产方法，结果成功地构筑由融合蛋白质生产hANP的高效率生产方法(日本国特许第1963624号)。在该生产方法中，融合蛋白质由大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端的97个氨基酸构成的保护肽、含有赖氨酸残基的3氨基酸残基的连接序列(Gln-Phe-Lys)和hANP构成，该融合蛋白质基因被编码在来自pBR322的表达载体上。利用来自大肠杆菌的乳糖启动子控制融合蛋白质基因的复制，已表达的融合蛋白质在大肠杆菌内作为包涵体蓄积。所得到的融合蛋白质通过改性剂变成可溶性的后，用特异地识别并切断赖氨酸残基的蛋白酶API(无色杆菌蛋白酶I〔Masaki，T.et al.，Biochim.Biophys.Acta，Vol.660，p51-55，1981〕)处理，释放hANP，再利用色谱法提纯，得到纯产物hANP。
本发明人在研究该hANP生产过程中，发现了物理化学性质与hANP类似、利用色谱操作不容易分离的杂质物。该杂质在利用分析型反相高压液相色谱(RP-HPLC)的分析中，作为在hANP洗脱位置的稍后方洗脱的物质被检测出，相对用酶反应切出的hANP以约5％的比例存在(下文中将该杂质物副产物多肽记载为R1)。另外，该R1在使用生产规模中使用的制备型高压液相色谱(HPLC)的场合，不易与hANP发生分离，其洗脱峰与hANP的洗脱峰的尾部分重叠，因此具有不容易分离的性质。
hANP也作为急性心力衰竭的治疗用药使用，像这样作为药品使用的hANP，必须是高纯度的。目前采用的生产方法，也可以确保作为药品的充分纯度，但在精制过程中要去除副生的多肽R1，因而收率减少，生产成本增大。因此，找到抑制该不纯物产生的方法，对于生产高纯度的hANP是一个重要的课题。
在基因重组多肽的制造中，由于在精制过程中要去除作为杂质的副产物，因而收率减少，生产成本出现问题，找出抑制该杂质产生的方法，对于生产高纯度的基因重组多肽是十分重要的。因此，本发明的目的在于，提供在基因重组多肽的生产中抑制副产物生成的方法及以抑制副产物生成为特征的基因重组多肽的制造方法。
发明的公开
本发明提供了，在经培养转化细胞而制造含有丝氨酸残基的多肽的方法中，通过在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种，从而抑制代替丝氨酸残基而掺入O-乙酰丝氨酸残基的副产物多肽生成的方法。
此外，本发明还提供了含有丝氨酸残基的多肽的制造方法，该方法是培养转化细胞而制造含有丝氨酸残基的多肽的制造方法，其特征在于，在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种，从而抑制代替丝氨酸残基而掺入O-乙酰丝氨酸残基的副产物多肽生成。
附图的简单说明
图1表示表达载体pGHα97SII的示意图。
图2表示酶反应结束后，用反相HPLC分析从融合蛋白质切割出的hANP的结果。
图3表示有关R1的结构分析的质谱分析的结果。
实施发明的最佳方式
(1)不纯物R1的鉴定
为了对在hANP的生产过程中生成的上述杂质进行分析，本发明人使用分析用C18反相高压液相色谱，分取R1峰，利用质谱分析分析其结构，以及进行氨基酸序列分析。结果确认，R1是与hANP相比分子量仅大42的物质。另外，分析R1的氨基酸序列显示，其氨基酸序列与hANP是相同的，据此判断，R1并不是hANP中的某种氨基酸被别的氨基酸取代而产生，而是含有受到经修饰的氨基酸的hANP衍生物。
进而，在如果存在数个修饰部位的场合，认为出现通过它们的组合产生的多种衍生物，但实际上用分析用HPLC仅得到单峰，由此认为修饰部位仅存在一处。关于修饰基的结构，是在生物合成的过程中产生的修饰反应，而且分子量是42，因此认为被乙酰化。
关于乙酰化的部位，根据hANP的氨基酸序列，认为可能是对丝氨酸残基、精氨酸残基和酪氨酸残基的修饰。因此，首先对在hANP的C-末端存在1处的酪氨酸残基进行C-末端氨基酸分析，结果证实，R1的C-末端氨基酸是酪氨酸，否定了在酪氨酸残基中的修饰可能性。进而，就精氨酸残基来说，R1可正常地被特异地识别精氨酸的蛋白酶(胰蛋白酶)的切断，因而认为这种可能性较小。因此判断在丝氨酸残基中产生乙酰化。这是因为，发现作为丝氨酸的乙酰化体的O-乙酰丝氨酸残基在细胞内合成，在多肽的翻译时，存在代替丝氨酸残基而掺入的可能性。另外，根据融合蛋白质中游离出hANP的时刻能够检测出R1，推测R1是在翻译为多肽时产生。因此判断，在R1中产生的修饰是融合蛋白质的表达时产生的，而不是在精制过程中产生。
(2)不纯物R1的生成抑制
本发明人研究了在培养过程中减少R1的生成。在以大肠杆菌作为宿主细胞生产重组多肽的场合，目前还没有关于使分子量仅增大42的修饰的报告，因此关于抑制R1生成的方法完全不清楚。因此，本发明人尝试从蛋白质构成成分的氨基酸入手，通过向培养基中添加氨基酸来抑制该氨基酸的生物合成，通过抑制O-乙酰丝氨酸等生物合成中间体的生成，抑制R1的产生。
按下面所述进行了试验研究。即，添加18种氨基酸(L-丙氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸)中的任一种，培养hANP生产菌，然后比较hANP和R1的生成量。
L-缬氨酸的添加会妨碍菌的增殖，因而没有用它来进行试验研究。另外，由于酪氨酸的溶解度较低，对于大量培养时是不合适的，因此也没有研究L-酪氨酸的添加，。
研究的结果表明，这18种氨基酸之中，甘氨酸、组氨酸或者甲硫氨酸的添加，将R1的生成抑制50％以上，这些氨基酸的添加对于R1生成的抑制效果较大。即，通过向培养基中添加这些氨基酸，可以抑制R1的生成，另外，还有增加每个菌体的包涵体产量的效果，在大量生产高纯度hANP时是十分有用的方法。另外，上述氨基酸的添加量，只要是在培养终了时，使添加的氨基酸(甘氨酸、组氨酸和/或甲硫氨酸)的宿主细胞中的生物合成受到抑制的量即可，例如在培养中监测培养基中的氨基酸含量，适宜地添加，以使任一氨基酸含量不缺乏。另外，根据菌体的氨基酸组成(Frederick C.H.et al.，Chemical Composition ofEscherichia coli in Escherichia coli and Salmonella，second edition，ASMpress，p.13-16中记载)、得到的菌体浓度、被表达的蛋白质的氨基酸组成及其表达量，计算出需要添加的氨基酸量，从最初就向培养基中添加即使在培养终了时刻氨基酸也充分残存的量也是可能的。
在本发明的实施例中，对于甘氨酸、组氨酸或者甲硫氨酸来说，进行了单独添加各个氨基酸的情况的研究，但通过组合这些氨基酸，期待能够充分进一步抑制R1的生成。
另外，虽然本发明人是在hANP生产的例子中进行的上述研究，但在使用基因重组技术的生产多肽中，形成+42的分子量的杂质，即使在生产hANP以外的肽或者蛋白质(尤其是含有丝氨酸的蛋白质)的场合，也经常会发生，因此本方法能够广泛适用于利用基因重组生产的肽或者蛋白质。另外，根据肽或者蛋白质的结构，不仅有1个丝氨酸残基，而且有时具有多个丝氨酸残基的情况，在多个丝氨酸残基的1处以上生成1种以上的掺入O-乙酰丝氨酸残基的副产物时，本发明也能够抑制这些副产物的生成。
在本发明中，作为能够适应的肽的例子，可举出A型钠尿肽、B型钠尿肽、缓激肽、大胃泌素、降钙素、降钙素基因相关肽、促肾上腺皮质素释放因子、Cortistatin、C型钠尿肽、防卫素1、Elafin、α-内啡肽、β-内啡肽、γ-内啡肽、内皮肽-1、内皮肽-2、大内皮肽-1、大内皮肽-2、大内皮肽-3、脑啡肽、Galanin、大胃泌素、肠抑胃肽、Ghrelin、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、生长激素释放因子、Histatin 5、胰岛素、接合肽、促黄体素释放激素、促黑素细胞激素、Midkine、神经激肽A、神经肽Y、神经降压肽、催产素、原肾上腺脊髓素N末端20肽、甲状旁腺素、甲状旁腺素相关肽、肽组氨酸-甲硫氨酸-27、垂体腺苷酸环化酶激活多肽38、血小板因子-4、肽T、肠促胰液素、血清胸腺因子、促生长素抑制素、尿皮质素、血管活性肠肽及其衍生物。作为蛋白质的例子，可举出生长激素及其衍生物。
本发明优选对含有丝氨酸残基的、分子量约1000～20000的多肽实施。另外，含有丝氨酸残基的多肽，最好是心房性钠尿肽，最好是人心房性钠尿肽。
能够在本发明中使用的宿主细胞，只要是能够在基因重组多肽的制造方法中使用的宿主细胞即可，没有特别的限制。例如可以是原核细胞或者真核细胞中的任一种，作为原核细胞可举出细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)，作为真核细胞可举出酵母(酿酒酵母属等)、动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞等)。作为宿主细胞优先选用包括细菌、酵母等的微生物，尤其好是大肠杆菌。
即，本发明是关于以下的方面。
a)在经培养转化细胞而制造基因重组多肽的方法中，通过在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种，抑制副产物多肽生成的方法；
b)基因重组多肽的制造方法，该方法是培养转化细胞而制造基因重组多肽的方法，其特征在于，在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种，进行培养，来抑制副产物多肽的生成；
c)上述a)或者b)中记载的方法，其中，副产物多肽是分子量相对于基因重组多肽为+42的受到修饰的衍生物；
d)上述a)至c)中记载的方法，其中，副产物多肽是乙酰化的衍生物；
e)上述a)至d)中记载的方法，其中，基因重组多肽是分子内具有丝氨酸的多肽；
f)上述a)至e)中记载的方法，其中，基因重组多肽的分子量是约1000～20000；
g)上述f)中记载的方法，其中，基因重组多肽是心房性钠尿肽；
h)上述g)中记载的方法，其中，心房性钠尿肽是人心房性钠尿肽；
i)上述a)至h)中记载的方法，其中，在培养转化细胞而制造基因重组多肽的方法中，宿主细胞是原核细胞或者真核细胞；
j)上述i)中记载的方法，其中，宿主细胞是微生物；
k)上述j)中记载的方法，其中，微生物是大肠杆菌。
产业上的应用可能性
本发明是关于在培养转化细胞而制造基因重组多肽的方法中，通过在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种，抑制副产物多肽生成的方法，以及以抑制副产物生成为特征的基因重组多肽的制造方法。特别是具有抑制代替丝氨酸残基而掺入O-乙酰丝氨酸残基的副产物多肽生成的效果，按照本发明，可以以比以往低的生产成本提供高纯度的基因重组多肽。
实施例
以下，通过实施例详细地说明本发明。本专业的技术人员可以对本发明进行各种变更、修饰，因此，本发明不受实施例的限制，本发明也包括这些变更和修饰。
实施例1：表达载体的制备
将由大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端部分的97氨基酸组成的保护肽(SEQID No：2)、含有赖氨酸残基的3种氨基酸残基的连接序列(Gln-Phe-Lys)及hANP(SEQ ID No：1)构成的融合蛋白质之编码基因，克隆在缺失BalI-PvulI区域的pBR322(Nature.1980；283：216-8)的EcoRI、DraI部位，制成表达载体pGHα97SII(图1：融合蛋白质基因序列省略)。表达载体的构建方法采用常规方法。
实施例2：R1的鉴定
(1)培养及包涵体回收
用发酵罐，使用表1所示的NU培养基培养导入上述的表达质粒的大肠杆菌W3110菌株(W3110/pGHα97SII)。
表1 NU培养基的组成(每1L培养基)
酵母提取物          4g
磷酸二氢钾          4g
磷酸氢二钾          4g
磷酸氢二钠          2.8g
氯化铵              0.2g
硫酸铵              1.2g
MgSO4·7H2O         2g
FeSO4·7H2O         40mg
CaCl2·2H2O         40mg
MnSO4·nH2O         10mg
AlCl2·6H2O         10mg
CoCl2·6H2O         4mg
ZnSO4·7H2O         2mg
Na2MoO4·2H2O       2mg
CuCl2·2H2O         1mg
H3BO4               0.5mg
盐酸四环素          2mg
                                      
在葡萄糖浓度4.5％、33℃、pH7.0、溶解氧浓度30％的条件下进行培养，分别通过滴入氨水、提高搅拌转速来控制pH和溶解氧浓度。葡萄糖消耗后，将培养温度控制在37℃，通过逐渐添加甘油作为碳源，促进hANP融合蛋白质的表达，进行约30小时的培养。在培养后的菌体中看到包涵体的形成，已表达的融合蛋白质相当于总菌体蛋白质的30％以上。
培养后，使用Mantnn-Gaulin匀浆器(15M-8AT)，在500kg/cm2的条件下对培养液进行匀浆化处理，利用离心分离机回收沉淀级分(包涵体)。接着，添加等量的30mM Tris·HCl(pH9.3)缓冲液，进行悬浮后，再次进行离心分离，回收沉淀。将该洗净操作再反复一次，将最终得到的沉淀悬浮在适量的30mMTris·HCl(pH9.3)缓冲液中。
(2)R1的检测
接着，将得到的包涵体悬浮/溶解在含有5M尿素的30mM Tris·HCl(pH9.3)缓冲液中。使用量为在包涵体悬浮于水中时OD660值为220的量。向该包涵体溶液中，以3.5单位/L比例添加API(和光纯药)，在30℃下进行1.5小时切割反应。图2是使用反相HPLC分析酶反应终了后切出的hANP的图。在柱温度40℃、流速1ml/min，使用A液：三氟乙酸溶液(1→1000)和B液：乙腈/三氟乙酸溶液(0.95→1000)混合液(1∶1)，采用使B液的初始浓度为43％、分析开始后每次一定量地增加B液、在16分钟达到52％的梯度法进行分析。作为对hANP的相对洗脱时间为1.1的杂质检测出R1。
(3)R1的精制
接着，为了R1的结构分析，进行R1的精制。在酶处理终了后的反应液中添加乙酸，使pH成为5.0，使保护肽沉淀后，通过离心分离去除沉淀。接着，在用含有2.5M尿素的50mM乙酸铵液(pH5.0)平衡化的CM-Toyopearl柱(TOSOH)中添加上清液，吸附R1和hANP后，利用氯化钠的盐浓度梯度使其洗脱，分取含有hANP和R1的级分。
向得到的级分中加入相当于20％(体积/体积)量的乙酸，向十八烷基(C18)作为配位基的反相系柱(soken ODS)上样，使hANP吸附在柱中后，利用乙腈浓度梯度使ANP溶出，分取含有hANP和R1的级分。
将这样得到的级分加在分析用反相HPLC柱(YMC-Pack ODS-A-302：4.6mm×150mm)上，分取R1的峰，得到高纯度的R1。
(4)R1的结构分析
通过采用爱德曼法测定N末端的氨基酸序列以及采用质谱(电子喷雾离子化法)测定分子量，进行R1的结构分析。结果发现，N末端的序列与hANP的序列一致。另一方面，质谱分析的结果表明，分子量是3122，与hANP的分子量3080相比，是仅大42的分子(图3)。当考察这些分析结果时，推测R1是受到某种修饰的hANP。关于该修饰基，根据+42的分子量和细胞内产生的修饰反应，推测是乙酰基。根据hANP的氨基酸序列推测，可能是对丝氨酸残基、精氨酸和酪氨酸残基的修饰，尤其是对丝氨酸残基的修饰可能性较大。业已知道，丝氨酸的乙酰体的O-乙酰丝氨酸在细胞内合成(Kredich，N.M.：Biosynthesis of cysteinin Escherichia coli and Salmonell，second edition ASM press，p514-527)，因此认为，在翻译为多肽时，O-乙酰丝氨酸代替丝氨酸掺入。
实施例3：氨基酸的添加和R1的生成抑制
(1)培养
在100ml的LBD培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％葡萄糖、0.1mol磷酸钾缓冲液〔pH7.0〕)中接种W3110/pGHα97SII的冷冻保存菌，在37℃进行约7小时振荡培养。在得到的培养液中添加甘油，使最终浓度成为10％后，向20个胶塞粉针瓶中各分注1mL，进行冷冻保存，在以后的实验中使用。
将该冷冻保存菌接种在200mL的表1的NU培养基(但变更为，pH7.2、作为碳源使用葡萄糖(4g/L)，酵母提取物变成0.1g/L)中，在33℃进行一夜振荡培养。利用离心分离进行集菌，用生理食盐水(0.9％NaCl)洗净一次，适量添加生理食盐水(0.9％NaCl)进行悬浮，使之成为最初的菌体浓度的7倍至8倍。
接着，将2mL该菌体悬浮液添加在以3g/L浓度含有L-丙氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸中任一种的100mL的NU培养基(但，pH6.9-7.0、酵母提取物0.1g/L、作为碳源使用甘油(10g/L))中，在37℃培养一夜。
(2)包涵体回收及R1的生成抑制
通过离心分离(7000转/分、20分钟)从各烧瓶的培养液中回收菌体后，悬浮于5ml的去离子水中，利用超声波细胞破碎机进行破碎处理。接着，通过离心分离(12000转/分、5分钟)将包涵体回收在沉淀级分中，用5ml的30mMTris·HCl(pH9.3)缓冲液进行悬浮，再进行离心分离(12000转/分、5分钟)，进行包涵体的洗净和浓缩。
接着，将得到的包涵体悬浮/溶解于含有5M尿素的30mM Tris·HCl(pH9.3)缓冲液中。使用的量在包涵体悬浮于1mL的水中时OD660值成为22的量。添加0.004单位/mL反应液的API蛋白酶(和光纯药)，通过在30℃、约150分钟的反应以使hANP从融合蛋白质游离。反应后，进行离心分离(12000转/分、5分钟)。向得到的300μL的上清液中添加13.5～15.5μL的5％乙酸，用450μL的精制水进行稀释。通过离心分离(12000转/分、5分钟)去除在该操作中产生的沉淀，用HPLC(柱：YMC-Pack ODS-A302)分析。根据相对hANP的峰面积的面积比计算出R1浓度。
表2是将R1对hANP的生成量进行相对比较。
表2  R1对hANP的生成量的比较
  添加氨基酸   R1对hANP的相对比率(％)   每单位菌体的包涵体生产量(相对比)
  不添加   8.97   1.00
  L赖氨酸   6.42   1.88
  L-苏氨酸   5.48   1.95
  L-甲硫氨酸   4.15   1.84
  L-丙氨酸   5.00   1.30
  L色氨酸   10.08   0.76
  L-丝氨酸   5.24   1.24
  L-甘氨酸   4.26   1.25
  L-组氨酸   3.71   1.39
  L-异亮氨酸   5.90   1.22
  L-谷氨酸   5.57   1.68
  L-谷氨酰胺   6.10   1.16
  L-精氨酸   5.02   1.92
  L-天冬氨酸   6.83   1.87
  L-天冬酰胺   6.35   1.86
  L-脯氨酸   9.01   1.62
其结果表明，在已进行研究的氨基酸内，添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸对R1的生成抑制效果大，与对照组(不添加氨基酸的情况)相比，R1的生成量减少50％以上。另外还表明，这些氨基酸的添加，具有使每个菌体的包涵体生产量增加的效果。在有R1生成抑制效果的组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中，如果考虑包涵体的生产量，添加甲硫氨酸时，R1相对hANP的生成量最低，对R1的生成抑制是有特别有效的。
另外，L-亮氨酸、L-苯基丙氨酸和L-半胱氨酸使融合蛋白质表达降低，因此不能回收包涵体，这些氨基酸的添加对hANP生产是无效的。
【序列表】
<110>サントリ-株式会社
<120>在基因重组多肽的生产中抑制副产物生成的方法
<130>YCT-601
<160>2
<210>1
<111>28
<212>PRT
<213>人
<223>hANP
<400>1
Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly
1             5                   10                   15
Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
20                         25
<210>2
<211>97
<212>PRT
<213>大肠埃希氏菌
<213>β-半乳糖苷酶N末端
<400>2
Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp
1              5                   10                   15
Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro
20                  25                  30
Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser
35                  40                  45
Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro
50                  55                  60
Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro Glu
65                  70                  75                   80
Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp
85                  90                   95
Ala

Claims (3)

1.在通过培养转化的大肠杆菌而制造含有丝氨酸残基的心房性钠尿肽的方法中降低副产物多肽生成的方法，其特征在于，通过在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种，以降低代替丝氨酸残基而掺入O-乙酰丝氨酸残基的副产物多肽生成。
2.通过培养转化的大肠杆菌生产含有丝氨酸残基的心房性钠尿肽的方法，其特征在于，通过在培养基中添加组氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一种，降低代替丝氨酸残基而掺入O-乙酰丝氨酸残基的副产物多肽的生成。
3.权利要求1或2的方法，其中，心房性钠尿肽是人心房性钠尿肽。
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