JPS61119189A - プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 - Google Patents
プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法Info
- Publication number
- JPS61119189A JPS61119189A JP59241457A JP24145784A JPS61119189A JP S61119189 A JPS61119189 A JP S61119189A JP 59241457 A JP59241457 A JP 59241457A JP 24145784 A JP24145784 A JP 24145784A JP S61119189 A JPS61119189 A JP S61119189A
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- Japan
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- precursor
- cells
- plasminogen activator
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーター前駆体（以
下、前駆体という）の産生増強方法に関する。更に詳し
くは、本発明は、前駆体の産生細胞を培養して前駆体を
生産するに際して、培地に中性アミノ酸及び有機酸もし
くはその塩を含むことを特徴とする＠駆体の産生増強方
法に関する。
下、前駆体という）の産生増強方法に関する。更に詳し
くは、本発明は、前駆体の産生細胞を培養して前駆体を
生産するに際して、培地に中性アミノ酸及び有機酸もし
くはその塩を含むことを特徴とする＠駆体の産生増強方
法に関する。
（従来の技術〕
本発明の前駆体に、先に本発明者が見出したものであり
、その詳細は特願昭５８−１７０３５４号に記載されて
いる。すなわち、本前駆体はそのままでは不活性である
が、プラスミン処理することにより酵素活性を発現する
、いわゆるチモゲンの一種である。この前駆体はヒト腎
Ｓ胞の無血ｌｒＩ培地中にて生成できることが最近判明
した０本前駆体はアミノ酸４１１個のｌＩ吠積構造有し
ており、分子量５万、フィブリンに特異的な親和性を示
し、従来のウロキナーゼとは全く冥なる性質ををする。
、その詳細は特願昭５８−１７０３５４号に記載されて
いる。すなわち、本前駆体はそのままでは不活性である
が、プラスミン処理することにより酵素活性を発現する
、いわゆるチモゲンの一種である。この前駆体はヒト腎
Ｓ胞の無血ｌｒＩ培地中にて生成できることが最近判明
した０本前駆体はアミノ酸４１１個のｌＩ吠積構造有し
ており、分子量５万、フィブリンに特異的な親和性を示
し、従来のウロキナーゼとは全く冥なる性質ををする。
また、合成基質法では活性が認められず、平板法で活性
を示す、その産生条件については、特願昭５８−１７０
３５４号で詳細に述べられているが、・必ずしも、その
産生効率が充分であるとは言えない。
を示す、その産生条件については、特願昭５８−１７０
３５４号で詳細に述べられているが、・必ずしも、その
産生効率が充分であるとは言えない。
従って、本発明の目的は前駆体の産生増強方法を堤供す
ることである。
ることである。
そこで本発明者らは、上記目的を解決するために、＠駆
体の産生増強について鋭意検討した結果、前駆体産生性
細胞培養培地中に、中性アミノ酸並びにを機酸またはそ
の塩を含ませることにより、前駆体の産生を向上できる
ことを見いだし、本発明を完成した。
体の産生増強について鋭意検討した結果、前駆体産生性
細胞培養培地中に、中性アミノ酸並びにを機酸またはそ
の塩を含ませることにより、前駆体の産生を向上できる
ことを見いだし、本発明を完成した。
部ち、本発明はプラスミノーゲンアクチベークー前駆体
の産生細胞を培養して、プラスミノーゲンアクチベータ
ー前駆体を生産するに際して、培地に中性アミノ酸並び
に有機酸またはその塩を含むことを特徴とするプラスミ
ノーゲンアクチベーター前駆体の産生増強方法に関する
。
の産生細胞を培養して、プラスミノーゲンアクチベータ
ー前駆体を生産するに際して、培地に中性アミノ酸並び
に有機酸またはその塩を含むことを特徴とするプラスミ
ノーゲンアクチベーター前駆体の産生増強方法に関する
。
（１）＠駆体産生細胞の調製
前駆体産生細胞の原料としては、ヒト腎細胞が好適に用
いられる。たとえば、ヒト腎細胞より得たｐｒｉｍａｒ
ｙ ｃｕｌｔｕｒｅまたはｄｉｐｉｏｉｄ ｃｅｌｌｇ
を継代培養して得られる前駆体を産生ずる細胞が用いら
れる。この種細胞を２０万〜３０万ｃｅｌｌｓ ／＋ｓ
ｌ植え込み、培地（たとえば、Ｗａｙｓｏｕｔｈ培地あ
るいは０ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＥ
Ｍ培地に熱不活化牛胎児ｌｆ［Ｉ？ｆ’ｔ２〜５ ｗ
／ ｖ％を添加したもの）を用いて２〜３日間培養を続
けた後、必要ならば培地を新しく交換して継代培養し、
細胞数を１００万〜２００万ｃｅｌｌｓ ／ｍｌに＆ｌ
ｌ整する。
いられる。たとえば、ヒト腎細胞より得たｐｒｉｍａｒ
ｙ ｃｕｌｔｕｒｅまたはｄｉｐｉｏｉｄ ｃｅｌｌｇ
を継代培養して得られる前駆体を産生ずる細胞が用いら
れる。この種細胞を２０万〜３０万ｃｅｌｌｓ ／＋ｓ
ｌ植え込み、培地（たとえば、Ｗａｙｓｏｕｔｈ培地あ
るいは０ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＥ
Ｍ培地に熱不活化牛胎児ｌｆ［Ｉ？ｆ’ｔ２〜５ ｗ
／ ｖ％を添加したもの）を用いて２〜３日間培養を続
けた後、必要ならば培地を新しく交換して継代培養し、
細胞数を１００万〜２００万ｃｅｌｌｓ ／ｍｌに＆ｌ
ｌ整する。
（２） 培養条件
基本培地としては、たとえばＷａｙ＋ｍｏｕ Ｌｈ培地
あるいはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ＭＥＭ培地に０．０５〜０．２Ｗ／Ｖ％ヒト血清アル
ブミンを添加した無血清培地が用いられる。
あるいはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ＭＥＭ培地に０．０５〜０．２Ｗ／Ｖ％ヒト血清アル
ブミンを添加した無血清培地が用いられる。
これに本発明の特徴である、中性アミノ酸並びに有機酸
またはその塩が添加される。中性アミノ酸としてはグリ
シン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルア
ラニン等の脂肪族アミノ酸などが例示されるが、好適に
はグリシンが用いられる。ｉｆＩ加量としては０．１〜
３ ｗ ／ ｖ％が例示される。添加量が、００１％以
下では産生能が十分上がらず、また、３％以上では、毒
性が上がって産生能向上にはマイナスとなるためである
。また、中性アミノ酸とを機酸又はその塩の割合として
は、１：１０〜ｔｏｏｔ （重量比）程度が望ましい
・ １、。
またはその塩が添加される。中性アミノ酸としてはグリ
シン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルア
ラニン等の脂肪族アミノ酸などが例示されるが、好適に
はグリシンが用いられる。ｉｆＩ加量としては０．１〜
３ ｗ ／ ｖ％が例示される。添加量が、００１％以
下では産生能が十分上がらず、また、３％以上では、毒
性が上がって産生能向上にはマイナスとなるためである
。また、中性アミノ酸とを機酸又はその塩の割合として
は、１：１０〜ｔｏｏｔ （重量比）程度が望ましい
・ １、。
有機酸としては炭素数３〜１８のものであれば特に限定
されｌい０通常は、カルボン酸、特に飽和または不飽和
脂肪族カルボン酸（就中、モノカルボン酸またはジカル
ボンｆＩりが好適に使用される。当該をａｓｎは置換基
として、たとえば水酸基等を有していてもよい、かかる
有機酸としては、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、クエ
ン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミ
チン酸、リルン酸、ミリスチン酸などが例示される。
されｌい０通常は、カルボン酸、特に飽和または不飽和
脂肪族カルボン酸（就中、モノカルボン酸またはジカル
ボンｆＩりが好適に使用される。当該をａｓｎは置換基
として、たとえば水酸基等を有していてもよい、かかる
有機酸としては、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、クエ
ン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミ
チン酸、リルン酸、ミリスチン酸などが例示される。
特に好適には、コハク酸などの脂肪族ジカルボン酸が使
用される。上記有機酸の塩としては、生理的に受は入れ
られる塩、たとえばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カ
リウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩な
ど）などを用いることができる。これらの有機酸もしく
はその塩の添加量としてはＯ，１〜３ ｗ ／ ｖ％が
例示される。
用される。上記有機酸の塩としては、生理的に受は入れ
られる塩、たとえばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カ
リウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩な
ど）などを用いることができる。これらの有機酸もしく
はその塩の添加量としてはＯ，１〜３ ｗ ／ ｖ％が
例示される。
また他に添加物として公知であるラクトアルブミン氷解
物、トランスフェリン、インツュリン等のホルモンなど
を添加してよい。
物、トランスフェリン、インツュリン等のホルモンなど
を添加してよい。
培養は、例えば前駆体産生細胞５０万〜２００万ｃａｌ
ｌｓ ／ｍｌを一定に維持しながら、上記培地中で行っ
て、前駆体を産生させ、２〜３日毎に項五培地を新しく
交換する。そしてこの交換した培地中に存在する前駆体
を回収する。
ｌｓ ／ｍｌを一定に維持しながら、上記培地中で行っ
て、前駆体を産生させ、２〜３日毎に項五培地を新しく
交換する。そしてこの交換した培地中に存在する前駆体
を回収する。
培地からの前駆体の回収は公知の手段を用いて行えばよ
く、例えば当該培地を遠心分離、減圧濃縮、塩析分画、
ゲル濾過、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーを、便宜組み合わせること
によって行われる。
く、例えば当該培地を遠心分離、減圧濃縮、塩析分画、
ゲル濾過、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーを、便宜組み合わせること
によって行われる。
本発明の方法により、本前駆体の産生は従来の方法に比
べて活性比で約１．３〜３倍程度増強することができる
。
べて活性比で約１．３〜３倍程度増強することができる
。
実験例１
本発明による前駆体産生増強効果を見るために、前駆体
の産生量の比較実験を行った。第１表に示したようにグ
リシン及びコハク酸の添加９は０〜５、ＯＷ／Ｖ％の範
囲で設定した。それ以外の条件は実施例１に準じて各群
とも同様に行った。産生量の指標として活性を測定した
。
の産生量の比較実験を行った。第１表に示したようにグ
リシン及びコハク酸の添加９は０〜５、ＯＷ／Ｖ％の範
囲で設定した。それ以外の条件は実施例１に準じて各群
とも同様に行った。産生量の指標として活性を測定した
。
活性量の測定は、ｐ−ＭＣ八へにより以下のように行っ
た。即ち、検体０．１１とプラスミン／８液（０，２ｃ
ｕ／＋ｍｌ、ゼラチンＢｉｌ液［ｐＨ８，６］で調製し
たもの）０．１ｍｌを混合後、３７℃でＩＯ分間インキ
エベーションし、ｐ−ＭＣＡｆ４液（０，１＠ＭＧｌｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣ＾）ｌ＋＋１を加え、さらに３
７℃で２０分間インキエベーシッンし、１８ｖ／ν％酢
酸を加えて反応を止めた後、Ｅχ（励起波長）３７００
ｍ、 Ｅｓ （螢光波長＋ ４６０ｎ−にて螢光強度を
測定した。その結果は、第１表に示す通りである。
た。即ち、検体０．１１とプラスミン／８液（０，２ｃ
ｕ／＋ｍｌ、ゼラチンＢｉｌ液［ｐＨ８，６］で調製し
たもの）０．１ｍｌを混合後、３７℃でＩＯ分間インキ
エベーションし、ｐ−ＭＣＡｆ４液（０，１＠ＭＧｌｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣ＾）ｌ＋＋１を加え、さらに３
７℃で２０分間インキエベーシッンし、１８ｖ／ν％酢
酸を加えて反応を止めた後、Ｅχ（励起波長）３７００
ｍ、 Ｅｓ （螢光波長＋ ４６０ｎ−にて螢光強度を
測定した。その結果は、第１表に示す通りである。
なお単位はＵ／ｓｌを用いた。Ｕはウロキナーゼ国際単
位であり、ＩＵ／＋ｗｌは検体１＋＋＋１につきプラス
ミン処理によって発現する線維＃：溶解活性がｌＵに相
当することを意味する。
位であり、ＩＵ／＋ｗｌは検体１＋＋＋１につきプラス
ミン処理によって発現する線維＃：溶解活性がｌＵに相
当することを意味する。
実験例２
実験例１と同様にして第２表に記載の添加物について、
併用効果を検討し、その結果を第２表に示した。
併用効果を検討し、その結果を第２表に示した。
実施例Ｉ
Ｗ ヒト腎Ｗ＆細胞より得
たｐｒｉｍａｒｙ−ｃｕｌｔｕｒｅを培養し、本発明前
駆体を産生ずる細胞だけを分離後再Ｉ８養し、その２０
ＸＩＱ４ ｃ、■ｓ ／ ＋ｗ Ｉの濃度で熱不活化
ウノ胎児血清５ ｗ ／ ｖ％金含有ａｙｓｏｕＬｈ培
地に埋え込み、３日間培養後、細胞数が１００×１０４
ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時点で、さらに、０．１ｗ
／ ｖ％ヒト血清アルブミン、０．５Ｗ／Ｖ％グリシン
、０．５Ｗ／Ｖ％コハク酸ナトリウム含有−ａｙ−蒙ｏ
ｕｔｈ培地（無血清培地）に上記前駆体産生細胞１００
Ｘ Ｉ Ｑ ４ｃｅｌｌｓ／ｍｌを植え直し、この濃
度を維持しつつ３日間培養した。培養液を遠心分離し、
沈殿には新しい培地を添加して＃！Ｉ養を続けた。
たｐｒｉｍａｒｙ−ｃｕｌｔｕｒｅを培養し、本発明前
駆体を産生ずる細胞だけを分離後再Ｉ８養し、その２０
ＸＩＱ４ ｃ、■ｓ ／ ＋ｗ Ｉの濃度で熱不活化
ウノ胎児血清５ ｗ ／ ｖ％金含有ａｙｓｏｕＬｈ培
地に埋え込み、３日間培養後、細胞数が１００×１０４
ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時点で、さらに、０．１ｗ
／ ｖ％ヒト血清アルブミン、０．５Ｗ／Ｖ％グリシン
、０．５Ｗ／Ｖ％コハク酸ナトリウム含有−ａｙ−蒙ｏ
ｕｔｈ培地（無血清培地）に上記前駆体産生細胞１００
Ｘ Ｉ Ｑ ４ｃｅｌｌｓ／ｍｌを植え直し、この濃
度を維持しつつ３日間培養した。培養液を遠心分離し、
沈殿には新しい培地を添加して＃！Ｉ養を続けた。
上清中には前駆体（活性は１ｍｌ当たり３００Ｕに相当
）が含まれていた。
）が含まれていた。
本発明により得られた前駆体は、特開昭５８−１７０３
５４で開示した［繊維素溶解酵素前駆体」と全く同一の
性質を有していた。
５４で開示した［繊維素溶解酵素前駆体」と全く同一の
性質を有していた。
実施例２
実施例１により得られた前駆体を含む培養土１ｌＩＦを
ｐＨＦｌ、５に調整した後、ＣＭ −５ｅｐｈａｄｅＸ
Ｃ−５０に接触した。０．１６Ｍリン＃Ｉ緩１ｈ液（
ｐＨ５，５）で吸着していた前駆体を溶出させた。
Ａ一方、前駆体で
予め免疫しておいたマウスＢＡＬ Ｂ ／ ｃの胛ｍｓ
ｉ＋胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコー
ルにより融合させたハイブリドーマのうち、前駆体に対
する抗体産生の高いクローンを選択した。この融合細胞
の培養液から、前駆体モノクローナル抗体を回収した。
ｐＨＦｌ、５に調整した後、ＣＭ −５ｅｐｈａｄｅＸ
Ｃ−５０に接触した。０．１６Ｍリン＃Ｉ緩１ｈ液（
ｐＨ５，５）で吸着していた前駆体を溶出させた。
Ａ一方、前駆体で
予め免疫しておいたマウスＢＡＬ Ｂ ／ ｃの胛ｍｓ
ｉ＋胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコー
ルにより融合させたハイブリドーマのうち、前駆体に対
する抗体産生の高いクローンを選択した。この融合細胞
の培養液から、前駆体モノクローナル抗体を回収した。
このモノクローナル抗体をＣＮＢ ｒ活性化３ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ４ Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に固定した
。
ｒｏｓｅ ４ Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に固定した
。
このモノクローナル抗体カラムを０．４Ｍ Ｎａ１ｌ！
含有０．１Ｍリン＃１緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
、これに前記の前駆体を含有する溶出液を接触した。
含有０．１Ｍリン＃１緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
、これに前記の前駆体を含有する溶出液を接触した。
０．４Ｍ ＮａＣ１含有０．１Ｍリン酸緩ｔＨ液（ｐＨ
７，ｏ）でカラムを洗浄した後、吸着していた当該前駆
体を０．５ＭＮａＣｊ含有０．２ｎグリシン−ＨＣｊ水
溶液（ρＩ（２，５）で溶出させた。溶出液を除菌濾過
した後、凍結乾燥し比活性が少なくともｇｏ、ｏｏｏυ
／曜の高度精製前駆体を得た。
７，ｏ）でカラムを洗浄した後、吸着していた当該前駆
体を０．５ＭＮａＣｊ含有０．２ｎグリシン−ＨＣｊ水
溶液（ρＩ（２，５）で溶出させた。溶出液を除菌濾過
した後、凍結乾燥し比活性が少なくともｇｏ、ｏｏｏυ
／曜の高度精製前駆体を得た。
なお、この精製品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法より分子量５万の１本の帯を示した。
気泳動法より分子量５万の１本の帯を示した。
Claims (1)
- プラスミノーゲンアクチベーター前駆体の産生細胞を培
養して、プラスミノーゲンアクチベーター前駆体を生産
するに際して、培地に中性アミノ酸並びに有機酸または
その塩を含むことを特徴とするプラスミノーゲンアクチ
ベーター前駆体の産生増強方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59241457A JPS61119189A (ja) | 1984-11-15 | 1984-11-15 | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59241457A JPS61119189A (ja) | 1984-11-15 | 1984-11-15 | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61119189A true JPS61119189A (ja) | 1986-06-06 |
| JPH0558709B2 JPH0558709B2 (ja) | 1993-08-27 |
Family
ID=17074595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59241457A Granted JPS61119189A (ja) | 1984-11-15 | 1984-11-15 | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61119189A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6384490A (ja) * | 1986-09-29 | 1988-04-15 | Green Cross Corp:The | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
| WO2001085945A1 (fr) * | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Suntory Limited | Procede permettant d'inhiber la formation de produits secondaires dans la production d'un polypeptide genetiquement modifie |
-
1984
- 1984-11-15 JP JP59241457A patent/JPS61119189A/ja active Granted
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA=1977 * |
| J.AM.MED.ASSOC=1976 * |
| JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1982 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6384490A (ja) * | 1986-09-29 | 1988-04-15 | Green Cross Corp:The | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
| WO2001085945A1 (fr) * | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Suntory Limited | Procede permettant d'inhiber la formation de produits secondaires dans la production d'un polypeptide genetiquement modifie |
| US7547529B1 (en) | 2000-05-10 | 2009-06-16 | Asubio Pharma Co., Ltd. | Methods for reducing the formation of by-products in the production of recombinant polypeptides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0558709B2 (ja) | 1993-08-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |