JPH03160989A - ヒト血漿性フィブロネクチン産生細胞株と生産法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 く産業上の利用分野〉 本発明は、細胞工学技術に基づくヒト血漿性フィブロネ
クチンの生産方法に関する。フィブロネクチンは、動物
細胞培養における無血清培地の成長因子としての添加剤
、さらに化粧品や癌診断治療などの医薬品原料としての
用途を有する。

〈従来の技術〉 フィブロネクチンは、細胞接着性因子としての作用を有
する生理活性タンパク質である。生体中におけるその所
在は、血漿や線維芽細胞膜」一、表皮の基底膜等に広く
分布し、生体防御お上び生体の維持Ｚこ重要な役割を担
っていることが知られている。

分子量は、血漿由来のヒトフィブロネクチンは還元時、
約２３万で、非還元時では２量体を形成し約４６万とさ
れている。また細胞由来のフィブロネクチンは多量体を
形成していることが報告されている。（日本組織培養学
会編．「細胞威長因子」朝倉書．店，１９８４） 生体（ｉｎ　ｖｉｖｏ）におけるフィブロネクチンの作
用は、細胞の接着、伸展作用だけでなく、細胞の走化性
、食作用、分化、細胞形態調節、細胞運動、細胞のガン
化、転移等の現象にも深く関与していることが報告され
ている。また、工業的な用途を含むｉｎ　ｖｉｔｒｏの
接着性動物細胞を用いた有用物質の生産、あるいはその
研究において、血清を使用しない無血清培養を行う場合
、培養液にフィブロネクチンのような細胞の接着、伸展
作用を有する因子が存在することが不可欠である。さら
にフィブロネクチンは治療分野で、外傷や組織内損傷に
対ずる修復剤としての応用（西田輝夫：臨床眼科，３ ４２，６１３．１９８８）　、抗癌剤への応用、化粧料
への応用などが進められている。

しかしながら、フィブロネクチンやフィブ［１ネクヂン
と同様な作用を有ずる接着因子は、いずれも動物個体ま
たはその血漿等に由来する因子で、これまで原料又はそ
の精製等の困難さにより、その製造に多くの問題点を有
している。特に、ヒト血漿由来フィブロネクチンはヒト
血漿を原料とする為に、安定した品質で大量に凋製し、
安価に供給することが著しく困難であり、更に血液山来
のウイルス等の混入等の安全性（バイオハザード）に関
して重大な問題が解決されていない。

〈発明が解決しようとしている問題点〉この発明の目的
は、工業的に安定したプロセスで血肢由来のウイルス等
の混入等していないヒト血漿性フィプロネクチンを安価
に大量凋製がてきる製造方法を提供することである。

〈問題点を解決するための手段〉 本願発明者らは、鋭意研究の結果、ウィルス等に汚染さ
れていないヒト肝芽腫由来細胞株であろ４ ＨＵＨ−６　ｃｌｏｎｅ５細胞をタンパク質性増殖因子
としてインシュリン単独を含有する無血清培地を用いて
培養した時に得られる培養上清中に、多量のヒト血漿由
来のフィブロネクチンが存在することを見出しその単離
を行ない、この発明を完成した。さらにまた、この発明
はヒト肝芽腫由来細胞株Ｈ　Ｕ　Ｈ６　ｃｌｏｎｅ５細
胞を無血清培地中で培養し、その培養上清中から威るヒ
ト血漿性フィブロネクチンの製造方法を供給する。

く発明の効果〉 この発明により、ヒト血漿性フィブロネクチンの細胞工
学的大量製造方法が供給される。本製造方法によって得
られるヒト血漿性フィブロネクチンは、ヒト肝芽腫由来
細胞■旧１−６　ｃｌｏｎｅ５細胞をタンパク質性増殖
因子としてインシュリン単独を含有する無血清培地を用
いた培養上清から得ることができるので、個々の動物個
体から得るのとは違い、工業的に大量にかつ安価に調製
することかできる。さらに血肢由来のウイルス等の混入
の危険も無い。従って、無血清培養法における細胞接着
５ 因子として非常に有効であり、さらに、組織損傷修復剤
など現在進められている医薬的応用あるいは化粧品への
応用などにも有用であると考えられる。

〈発明の詳細な説明〉 この発明によって生産されるフィプロネクヂンは以下の
性質を有する。

（ａ）ヒト肝芽腫由来細胞株ｔ｛ＵＮ−６　ｃｌｏｎｅ
５細胞のタンパク質性増殖因子としてインシュリン単独
を含有する無血清培地を用いた培養によって得られる培
養土清中に存在する。培養上清からの単離は、常法のゼ
ラヂンアフィニティクロマトグラフィー及び塩析等を組
合わせることにより行うことができる。

（ｂ）ＳＤｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
測定される分子量が、還元条件下で約２３０ＫＤであり
、ヒト血漿から精製されたフィブロネクチン標品と比較
してほぼ同一分子量である。

（ｃ）市販の抗フィブロネクチン抗血清と反応し、さら
に、抗ヒト血漿性フィブロネクチンモノクローナル抗体
とも反応する。

この発明のフィブロネクチンは、上述したように、その
由来、分子量、免疫学的反応性などからヒト血漿性フィ
ブロネクチンであると考えられる。

この発明のフィブロネクチンは以下のような一般的な方
法で単離することができるが単離方法はこれに限定され
るものではない。

まず、ヒト肝芽腫由来細胞株１１　Ｕ　Ｉｌ　−　６　
ｃ　ｌ　ｏ　ｎ　ｅ　５細胞をタンパク質性増殖として
インシュリン単独を含有する無血清培地を用いて培養す
る。ヒト肝芽腫由来細胞株ＩＩ　Ｕ　ｉｔ　−　６　ｃ
　ｌ　ｏ　ｎ　ｅ　５は、Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｂａｎｋ
（ＪＣＲＢ）に、細胞番号ＪＣＲＢＯ４０１として保存
されている周知の細胞株であり、ＪＣＲＢを通して供給
を受けられることができる。このヒト肝芽腫由来細胞株
ｔｌＵＨ−６　ｃｌｏｎｅ５細胞を無血清培地を用いて
継代培養する。無血清培地としては、タンパク質性増殖
因子としてインンユリン単独を含有するｅＲＤＰ培地（
日本農芸化学会誌５ｇ，　５７５５８３．　１９８４）
を用いることができる。培養は約３７°Ｃで、５％ＣＯ
２インキュベーター内で行うことが好ま７ しい。　次に培養上清を回収する。上清の回収は例えば
培養物を遠心分離することにより行うことができる。

次に回収した培養上清をゼラチンアフィニティークロマ
トグラフィーにかける。ゼラヂンアフィニティク口マト
グラフィーに用いる樹脂としてゼラチンセファロース４
Ｂ（ファルマソア社製）を挙げることができる。この樹
脂は予め低巖度（例えば２０ｍＭ程度）のトリス緩衝液
を用いて平衡化しておく。

ゼラチン　アフィニティー樹脂に吸着された両分は、上
記緩衝肢で洗浄後、尿素を含む緩衝液、例えば４Ｍ尿素
含有２０ｍＭ　トリス緩衝液を用いて溶出する。

上記操作により、この発明のフィブロネクチンを実質的
に単離することができる。上記操作に上り得られたフィ
ブロネクチンは、還元時のＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動において、メインバンドとして分子量約２
３０ＫＤの位置に現れる。このメインバンドの含量は泳
動時の全タンパク質量の９０％以上である。また他に現
れるバンドはウェ８ スタンプ口ツティング後の抗フィブロネクチン抗体を用
いた免疫染色によって、すべてフィブロネクチンと同定
され、不純物を実質的に含まないことがわかる。

さらに、」一記操作により得られたフィブロネクチン溶
液は、周知のタンパク質溶液の濃縮法によって濃縮する
ことができる。例えば、硫化アンモニウムを用いて塩析
することによって濃縮される。

〈実施例〉 ■．物質の凋製 ヒト肝芽由来細胞株ＨＵＨ−６　．ｃｌｏｎｅ５細胞（
ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）をタンパク質性成長因子
としてインシュリンを単独に含有するｅＲＤＦ培地を用
いて継代培養した。培養は３７℃で約１ケ月間行い、こ
の間に４代継代した。第１図にこの培養期間中の培地中
へのフィブロネクチンの生産量を経時的に示した。

培養生産物（コンディション　ドメディウム）を得るた
めの連続培養は約ＩＸ　１０’ｃｅｌｌｓ／ｃｍ”で細
胞を播種し、約２週間後より毎日、培地を交換し、得ら
れた培養生産物を回収した。

培養生産物を遠心分離して上清を回収し、ゼラチンアフ
ィニティクロマトグラフィーにか｛」た。

第２図にフィブロネクチンの吸着、溶出を示すアフィニ
タイクロマトグラムを図示した。ゼラチンアフィニティ
樹脂としては、ゼラチンセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア製）を用いた。樹脂は予めトリスー塩酸緩衝液（組或
：２０ｍＭ｝リスー塩酸緩衝肢ｐＨ７．４）で平衡化し
ておいた。ゼラヂンアフィニティ樹脂に吸着された両分
は、」二記トリスー塩酸緩衝液（組戊：４Ｍ尿素−２０
ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液．１）１１７．４）で溶出し
た。

■．物質の性質 （１）分子量 上記ゼラチンアフィニティクロマトグラフィー−１０ により得られた両分を常法に従い、還元条件下で３−１
６％グラジエント−ＳＤＳボリアクリルアミド電気泳動
にかけた。その結果分子量約２３０ＫＤの位置にメイン
バンドが現われた。またヒト血漿性フィブロネクチン標
品としてヒト血漿性フィブロネクチン（シグマ社製）と
比較したところ同一位置にメインバンドが現われた。こ
のことにより得られたフィブロネクチンは、ヒト血漿性
フィブロネクチンであった。

（２）免疫学的反応性 上記のように得られたフィブロネクチンは市販の抗フィ
ブロネクチンポリクローナル抗体および抗ヒト血漿性フ
ィブロネクチンモノクローナル抗体に対し、市販ヒｌ・
血漿性フィブロネクチンと同様な陽性反応を示した。

【図面の簡単な説明】

第ｌ図は、この発明のフィブロネクチンを含有する培養
物中における培養期間中の経口的なフィブロネクチン含
有量を示す図である。 第２図は、この発明のフィブロネクチンを単離する工程
におけるゼラチンアフィニティク［１７１・グラフィー
の縦軸にタンパク質濃度（０．Ｄ．・２８０ｎｍ）、横
軸に溶出時間をとった時の未吸着画分及び溶出画分を表
わす溶離曲線を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少数のタンパク質性増殖因子を含む、無血清培地で
   増殖可能で、培養液にヒト血漿性フィブロネクチンを分
   泌・生産するヒト肝芽腫細胞株、ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ
   ５。 ２、タンパク性増殖因子が、インシュリン単独であるｅ
   ＲＤＦ無血清培地中でフィブロネクチンを生産する特許
   請求範囲第１項記載の細胞株ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５。 ３、ＪＣＲＢに登録番号０４０１で登録されている特許
   請求範囲第１項記載の細胞株ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５。 ４、ヒト肝芽腫細胞株、ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５をイン
   シュリンのみをタンパク質性増殖因子として含む無血清
   培地で培養して、その培養液を精製することによるヒト
   血漿性フィブロネクチンの生産法。 ５、培養液からゼラチンアフィニティクロマトグラフィ
   ーを含む精製工程で、（ａ）ＳＤＳポリアクリルアシド
   ゲル電気泳動により測定される分子量が還元条件下で２
   ３０ＫＤであり、（ｂ）抗フィブロネクチン抗体と反応
   し、（ｃ）ヒト血漿性フィブロネクチンと同一の生化学
   的性状を有するフィブロネクチンを生産する特許請求範
   囲第４項記載の生産法。