JPH0272870A - 再構築腫瘍 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、３次元に再構築された腫瘍、上記腫瘍の製
造方法、この方法を行うための研究室用キットおよび臨
床研究または薬理試験のためのそれらの用途に関するも
のである。

［従来の技術］ 組織内の悪性分化細胞を処置するための医薬に、有効成
分として使用し得る分子の選択は、インビトロ実験が行
い得る研究モデルの利用可能性によって促進される。

組織外殖片のフラグメントを培養することは可能である
。１次培養の最初の方法（以後、従来方法と称する）は
、培地に浸漬したフラグメントを培養フラスコの平底に
付着させ、その後細胞の新生か観察されるまで、インキ
ュベートすることかう成る。別のコラーゲンの繊Ｋ（［
：　Ｗ細胞収縮で得た皮膚相当ラティスで外殖片を覆う
ことからなる最近報告された組織外殖片の一次培養法［
ルガシーエンジョルラおよびニスカント・コント・ラン
デュ・デ・セアンス・ト・ラカデミ・デ・ファシス、パ
リ（Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、　Ｓｃ、　Ｐａｒｉｓ）３０１
巻、■（１７）、７７９〜７８４頁（１９８５年）］−
一コンパクト・カバー・ラティス培養法−一は、極めて
Ｗｉ効であることが証明された。

１次（初代）培養か進むと、使用した技術にかかイつり
なく、数回の移動後単層として均質な細胞集団が得られ
る。それに乙かかわらず、こうして得られた各集団は、
特定タイプの分化細胞が、常に″４ａ維芽細胞を含んで
いる間質細胞と接触した組織の場合とは、全く穴なる編
成を有することが明らかである。

まず第１に、実験に供されるタイプの悪性分化細胞が繊
維芽細胞と共存している３次元モデルのみが、インビボ
で起る状況を模倣した実験条件下で組織傷害の処置につ
いて対象分子を試験することを可能にすると思われる。

このような３次元モデルを、カバーラティス法による悪
性黒色外殖片の培養で得られた細胞のインヒドロ悪性黒
色腫再構築により得ることが可能なことが、既に報告さ
れている［ルガソーおよびニスカント、コツト・レンデ
ュ・デ・セアンス・ド・ラカデミ・デ・ファシス・パリ
（Ｃ，ＩＣＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｐａｒｉｓ）ＩＩＩ
（３０５）５０７〜５１３（１９８７年）］。

これらの公知モデルでは、分化細胞は２種の質なる起源
の繊維芽細胞、すなわち一方は一次培養組織の外殖片間
質細胞由来で他方はラティス自体由来のらのを含んでい
た。

［発明の構成］ この発明により、驚（べきことに、腫瘍外殖片由来の特
定タイプの悪性分化細胞が単一タイプの繊維芽細胞と共
存するモデルを作り得ることが明らかになった。

第１の態様として、この発明は、腫瘍外殖片由来の特定
タイプの悪性分化細胞、単一タイプの繊維芽細胞および
コラーゲンからなる３次元再構築腫瘍に関するものであ
る。

分化細胞は任念の既知タイプに属することができろ。好
ましいのは、それらが骨髄または皮膚に見られる細胞タ
イプに属することであり、この場合特にメラニン形成細
胞であることである。これらは原発性癌または転移由来
のものであり得るが、転移の方が好ましい。この発明は
、特に、分化細胞がメラニン形成細胞または腫瘍性芽細
胞である３次元再構築腫瘍に関するものである。

繊維芽性外相細胞は種々の起源のものであり得る。脈管
性繊維芽細胞が特に適当である。脈管性腫瘍、特に血管
腫から調製した繊維芽細胞を用いるのが好ましい。

この発明によると、極めて多数の再構築腫瘍を特定のタ
イプの分化細胞から構築することができ、これらの細胞
は各腫瘍に特定タイプの繊維芽細胞を同伴している。こ
の発明の主要な利点は、再構築腫瘍により、分化細胞を
繊維芽細胞と比較し得る細胞相互関係の比較分析が可能
になるという事実である。この分析は、特に腫瘍成長の
抑制に有用である。

この発明の再構築腫瘍は、真核細胞の培養と維持に適し
た培養培地と接触して生存を続ける生物学的存在である
。適当な培地は、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地［モア
等、ジャーナル・オプ・アメリカン・メディカル・アソ
シエーション（Ｊ。

Ａｍ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　）　ｌ　９９　（８
）８７〜９２頁（１９６７年）コであり、適当な場合に
は、例えば１種以上のアミノ酸、うし胎児血清および１
種以上の抗生物質を添加する。

この発明の別の態様によると、この発明は、この発明の
再構築腫瘍の製造法を提供する。この方法は、一方では
特定タイプの悪性分化細胞の均質な集団を、他方では繊
維芽細胞の集団を、別々に作り、これら２つの集団をコ
ラーゲンの存在下にインキュベートすることを含む。

病理が研究されるべき細胞の均質集団が、これらの細胞
の系から得られ得る場合に、この発明による方法の実行
の簡単さが顕著であることは注目に値する。一般に、腫
瘍から出発する場合、それらの外殖片から分化細胞を製
造する。この外殖片のフラグメントを公知方法の１つに
よる一次培養にかける。トリプシンを用いて処理し単一
の分化細胞を分離してから、フラグメントから発生する
分化細胞を採取して培養する。その後、継続副次培養を
行って、最終的に濃密な細胞＠濁物を得る。

組織の外殖片の培従物から繊維芽細胞を製造する。小さ
なフラグメントに切断した外殖片を常套の一次培養法に
よって培養する。外殖片に含有されろ繊９イを芽細胞は
、３から６周間でフラスコに侵入ずろ。その後、一般に
１５回の移動を越えることなしに継続副次培養を行って
、最終的に濃密な細胞懸濁物を得る。

分化細胞については、あらかじめ樹立した系から出発す
ることが可能である。この系を培養してから副次培養す
ると、最終的に濃厚細胞懸濁物を得る。

分化細胞と繊維芽細胞の両方の場合に、凍結形態で、最
終細胞懸濁物、または全ての中間細胞懸濁物を保持する
ことはもちろん可能である。

分化細胞および繊維芽細胞の集団の製造のための好適な
培地は、特に１つまたはそれ以上のアミノ酸、子牛血清
および１つまたはそれ以上の抗生物質を適当に補足した
、ＲＰＭＩ培地である。

分化細胞および繊維芽細胞を懸濁物の形態で接触させる
。これらの混合物は、単位容爪当たり３／４の分化細胞
と１／４の繊維芽細胞、または逆に、Ｉ／４の分化細胞
と３／４の繊維芽細胞を含有し得る。あらゆる中間の組
合せが可能である。

避けろべき唯一の状況は、２つの細胞集団の内の１つの
比率が他の細胞集団の比率の３分の１以下になることで
ある。分化細胞と繊維芽細胞を等しい比率で接触させる
のが好ましい。導入すべき細胞の数は、第一にコラーゲ
ンの添加後、細胞混合物がインキュベートされる最終量
に、さらに第二に、導入されたコラーゲンの量に左右さ
れる。このそれ自身の最終量は、使用される平底容器の
寸法に左右されろ。最終量４．７ｍｌを例として、直径
６ｃｍのペトリ皿、Ｉｍｇ／ｍｌの含有量のコラーゲン
溶液１．５ｍｌを使用する場合、細胞の２つのカテゴリ
ーの予備形成混合物である、１ｍｌ当たり４ｘｌｏ”ｌ
の細胞を含有する混合物の０．５ｍ１ｆｆｔを加えるこ
と、または細胞の１つのカテゴリーの懸濁物を０．２５
ｍ１および細胞の他のカテゴリーの懸濁物を０．２５ｍ
１．それぞれ１ｍｌ当たり４×１０８側の細胞を含有す
る懸濁物を加えることによって総ｆｉ２ＸＩ０６個の細
胞を誘導するのが優れている。

使用したコラーゲンは、結合組織から得られる。

ラットの社は使用するのに容易な１つの源である二僅か
に酸性化したコラーゲン溶液を製造する。このコラーゲ
ンを抽出し、精製してから例えばＩｏｏ　０　（ｖ／　
ｖ）当たり１部の酢酸を含有する溶液に溶かず。使用し
たコラーゲンは、１ｍｌ当たり０．　１から５ｍｇのコ
ラーゲンを含有し得る。１ｍｌ当たり１ｍｇ含有するの
が好ましい。

ベトリ皿のような平底容器に移したコラーゲン溶液に同
時に以下のものを加えるのが好ましい。

２つの細胞懸濁物またはそれらの予備製造混合物、栄養
培地および水酸化ナトリウムのような中和剤。

哺乳類細胞の培養に適当な温度、さらに好ましくは３７
℃で、得られた混合物をインキュベートする。数日後、
コラーゲンを収縮させる細胞の作用下で、それらの寸法
が安定化する不規則な円形物が現れる。この円形物はこ
の発明による３次元の再構築腫瘍である。

この再構築腫瘍の寸法は、コラーゲンを収縮させる能力
のある使用細胞の数とコラーゲンの量に左右される。例
えばＩｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含有する溶液を１，５
ｎ＋１当たり０．５＋＋＋１の量で、直径６ｃｍのベト
リ皿に、０．２５ｍ１のＮａＯＨおよび０．４５ｍ１の
子牛血清を補充した２ｍｌのＲＰＭＩＩ６４０培地の存
在下で２Ｘ１０’９１細胞を使用する場合、３７℃でイ
ンキュベーションの４から８日後に再構築腫瘍を得、こ
の腫瘍の型は、直径５からｌ０ｃＩｌ、厚さ０．５から
２ｍｍであり、不規則な輪郭を有する円形物を暗示する
。

この方法で得られた再構築腫瘍は、−旦培養フラスコに
移し、フラスコの底に付着させ、続いて全体としてその
周辺から皿の内に向けて細胞を生成する能力によって特
に特徴づけられる。繊維芽細胞様の細胞が届を形成して
おり、さらに分化細胞が、この層の表面上のコロニーに
それ自身を組織化しているのを観察することか可能であ
る。両者とも、使用した最初の細胞に由来する。

この再構築腫瘍は、その組織の編成およびその粘着性を
保ち、初代培養において両方の初期カテゴリーの細胞を
産生ずる点で、優れた安定性を持つ生物学的存在である
。再構築腫瘍から発生した上記細胞が一緒に流れ、さら
に容器の底に完全な層を形成する場合にのみ、細胞発生
のこの現象が、停止する。それにもかかわらず、細胞発
生のこの現象は、再構築腫瘍を他の新しい容器に移すこ
とによって再出発させ得る。

驚くべきことに、かなり類似する特徴を有する第２の再
構築腫瘍が、初代培養法によって培養された腫瘍外殖片
のフラグメントから発生するか、または１つのセルライ
ンに属する分化細胞から得られｊ二再＋１が築腫瘍（初
代と称する）から得られ得る。

同様に、この再構築腫瘍（第２代と称する）から出発し
た場合、かなり類似した特徴を打する再構築腫瘍を得る
ことが可能である。要するにｎ代再構築細胞から出発し
、１代の再構築細胞の特徴とほとんど異ならない特徴を
持つ再構築腫瘍由来の（ｎ＋１）代を得ることが一般に
可能である。

実際には、初期再構築腫瘍から発生した細胞を収集する
こと、およびコラーゲン溶液に結合させることで十分で
ある。２・３日のインキュベーンヨ後、誘導再構築腫瘍
を得る。初代再構築腫瘍について示したように、（ｎ＋
１）代再構築腫瘍を新鮮培地に移し得る。

それにもかかわらず、（ｎ＋１）代再構築腫瘍がｎ代再
構築腫瘍の特徴に類似ずろ特徴を有するが、より高いｎ
であればあるほど、さらに（ｎ＋１）代腫瘍は、１つの
世代から次のけ代で、再構築腫瘍中の繊維芽細胞様の細
胞が少なくなる点、および比例的に分化細胞数が大きく
なり、繊維芽細胞様の細胞の減少のため、容器の底に付
着した、繊維芽様の細胞を基礎とするコロニーの再構築
を不可能になる点で、初期に得られた初代再構築腫瘍と
異なることが分かった。

上記観察は、特定の再構築腫瘍を１つの移植から次のも
のに移すときになされた。

しかしながら、この発明による１世代から次の世代に、
または１つの移植から次の移植への再構築腫瘍の展開は
、上記再構築腫瘍の使用に真の障害とはならない。実際
に、この発明の任意の再構築腫瘍から発生する分化細胞
由来の初代再構築腫瘍を得ることも可能である。上述し
た発明の方法により、コラーゲンの存在下で、−次培養
によって初代再構築腫瘍を得るのに初期に使用した世代
から製造した繊維芽細胞の懸濁物を用い、細胞を採取し
て、それらを混合することで十分である。

別の態様として、この発明は、この発明による製造法を
行うのに適当な実験室用キットに関するものである。

特にこのキットは、試験するべき腫瘍系に関連する実験
用具を目的とする。それは、−１８０６Ｃで、例えば液
体窒素中で貯蔵され、その効力を試験し、この発明の目
的のために使用すべき繊維芽細胞の凍結乾燥物を扱い得
る、実験室用装置および試薬から成る。この懸濁物は、
キットの不可欠な部分を形成する。

キットは、用具および５から１０ラチスの製造のために
十分な量の試薬から成る。すなわち、特に１ｍｌ当たり
１ｍｇで０．１Ｍの水酸化ナトリウムを含有するコラー
ゲン溶液を含有する。平底フラスコおよびコラーゲンの
存在下で分化細胞と繊維芽細胞を混合するのに有用なフ
ラスコも包含する。

別の態様として、この発明は、特に分化細胞に患ってい
る病理症状の予後を示す上で問題がある場合、およびこ
の病理状態での処置に適当な薬の有効成分として使用し
得る分子を選択する上で問題がある場合、臨床研究にお
ける薬剤として、および薬理学的用具としての上記再構
築腫瘍の用途に関するものである。

この発明によると、悪性分化細胞から出発して、これら
の細胞と一緒に、これらをその中に含んでいる間質の繊
維芽細胞かまたは異なる起源の繊維芽細胞の何れかと結
合させることによって、実験室で多数の再構築腫瘍を作
ることが実際に可能である。これらの再構築腫瘍は、イ
ンビトロで行なわれろ展開を通して、分析すれば初期の
観察によって方向づけされる臨床研究を可能にするよう
な種々の生物学的パラメータを測定することを可能にす
る３次元の実験室モデルを代表する。

この発明による再構築腫瘍において、悪性細胞は、イン
ビトロにおいてそれらの動きと類似する動きをする。こ
の動きは、特に繊維芽細胞の層から隆起するこれらの細
胞の節および３次元的フォーカス現象によって特徴づけ
られる。それらは薬理学上優れた存用性のあるモデルを
代表することが知り得る。

従って、分子をその抗癌作用について有利に試験し得る
。節または３次元的フォーカスの非形成または形成の動
力学の低下は、試験した分子の効力を測定するのを可能
にする。研究モデルとして腫瘍系を使用することが不可
能であった上記測定法が可能なことは、重要な利点を現
している。

実施例１ 本実施例は悪性黒色腫および由来の異なる繊維芽細胞か
ら発したメラニン形成細胞の細胞系統から３つの再構築
腫瘍生成方法およびこれらの３つの再構築悪性黒色腫（
ＭＭｃｏＲ１）から、悪性黒色腫の第２代（ＭＭｃｏＲ
２）およびつぎの悪性黒色腫の第３代の生成方法につい
て記載する。対照実験は、平行して繊維芽細胞を添加し
ない以外は同一条件下で行う。再構築悪性黒色腫の特徴
の比較を示す。

１、試薬および装置 ａ）コラーゲン タイプ１コラーゲンをラット尾から抽出し、公知方法（
プロシーディング・オン・ナンユナル・アカデミイ・オ
ン・サイエンス、ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ　Ａ）、第７６巻第８号第
１２７４頁、１９７９年に記載）により、ｔｏｏｏ部（
ｖ／ｖ）に対し酢酸１部を含む精製水１ｍＱ、当りコラ
ーゲンｔａｇを含む態様で製造する。

ｂ）完全培養培地 下記の成分を有するＲＰＭ１１６４０培地（ギブコ、Ｇ
ｉｂｃｏ）： ＊Ｌ−グルタミン１％ ＊子牛胎児血清１５％（ｖ／ｖ最終培地）＊ペニシリン
ｍｉ２当り１００単位の割合で＊ストレプトマイシンｍ
ρ当り１００μｇの割合で。

Ｃ）培養フラスコ 平面２５ｃｍ”を有するファルコン社製フラスコを使用
する。

２、方法 ヒト悪性黒色腫の首から胸部皮膚転移の組織外殖片のフ
ラグメントを、完全培養培地２ｍＱを注入した培養フラ
スコの平担面に接種する。フラスコを３７℃に加熱する
。破片から細胞の出現が観察される。

これらの細胞中に、２．３のメラニン形成細胞が、第−
週から、細胞の真中に紡錘形状でみられる。５−８日後
、培地の量を５ｍ１２に増やす。ついで培地を５日毎に
新しくする。

インキュベーションの第４週の終りに、紡錘形状細胞は
フラスコの上記平面を一連の層で覆う。

表面上に、メラニン形成細胞の多数の小島が出現する。

ついで培養培地をフラスコを傾斜して除去し、ハンクス
（ＨＡＮＫＳ）洗浄液（ブローシーディング・オン・ソ
サイエティ・フォア・エクスペリメンタル・バイオロジ
イ・アンド・メディシン（Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、
Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、）、１９４９年、７１゜１９６）を
添加し、ついで短時間接触後除去する。

フラスコに０．２５％（ｗ／ｖ））リプシン溶液０゜５
ｍＣを添加すると、３分後に完全培地５Ｊを添加するこ
とにより、接触を中断後紡錘形状細胞よりも弱く付着し
ているメラニン形成細胞だけを分離することができる。

細胞懸濁液をピペットを用いて集め、２３０ｇにて５分
間遠心分離する。着色されている残渣を、完全培地１ｏ
ＩＩＩＱ中に添加する。得られた懸濁液を２つのフラス
コ（Ｆ２）に、１フラスコ当り５ｍＱの割合で分割する
。フラスコを８日間３７℃にて、５％ＣＯ２の存在下イ
ンキュベートする。この第一回移送細胞をトリプシンで
処理し、集め、上記と同様に、２つのフラスコ（Ｆ３）
中で継代培養する。３７℃にて５％ＣＯ７存在下、８日
間インキュベーンヨン後、第２回移送から導かれた細胞
をトリプシンで処理する。４つのフラスコ（Ｆ３）から
製造された４細胞！ｌＡＥ液を一緒にし、２３０ｇにて
、５分間遠心分離する。わずかに着色された前の移送か
らの残渣を懸澗させ、第３回としてインキュベートする
。細胞をトリプシンで処理後、集め遠心分離する。残渣
は無色であり、細胞係数のために完全培地中に＠濁させ
る。これをｍＱ当り４・１０６細胞を含む９．濁液Ｍｌ
の調製に用いる。

ｂ）線維芽細胞の＠濁液の製造 ）細胞の由来 生検は各々次のようにして行った。

＊２４才白人波検者の正常皮膚（以下、線維芽細胞ａと
いう） ＊２８才黒人波検者の正常皮膚（以下、線維芽細胞すと
いう）。

＊２０才女性の顔面からの静脈毛細管の血管腫（以下、
線維芽細胞Ｃという） ）方法 生検から得られた３つの外殖片を各、上記の方法で処理
する。初代培地から３−５週内に、第１回および第２回
移送については７−１４日内に細胞融合物が得られる。

強く付着しているため、線維芽細胞の分離を行うために
、トリプシンを少くとも１０分間作用させる必要がある
ことに注意すべきである。

最後の各タイプの線維芽細胞が、ｍ（当り４・１０８細
胞含む＠濁液Ｆｒの形で得る。

コラーゲン添加および次の割合で各種構成要素および成
分を注入した培地を含む、直径６ｃｍのペトリ皿中に、
懸濁液Ｍ１およびＦｌを添加する。

コラーゲン溶液　　　　　　１．５ｍ（！完全培養培地
　　　　　　　２　　ｍ（ｌＯ，ＩＭ　ＮａＯＨ０，２
５０ｍｆ２ −仔牛脂児血清　　　　　　　０．４５０ｍ１２−懸田
液　Ｍｌ　　　　　　　　０．２５ｍｆｆ懸濁液　Ｆｌ
　　　　　　　　Ｏ，２５ｍ１２ついで、２・１０６細
胞をｌＲｇ／ｍσコラーゲン溶液１．５ｍ１２の存在下
、インキュベートする。

３７℃１こで２ｉ０日リトラクンヨン後、いわゆる第１
代悪性黒色腫の再構築であるラティスを形成する（黒色
腫ＭＭｃｏＲ１）。

Ｂ）第２代および第３伏兵再構築悪性色素細胞腫の調製 ３７℃にて８−１５日インキュベーション後、黒色腫Ｍ
ＭｃｏＲＩを移し、完全培養培地を含むフラスコに付着
させ、これわ３７°Ｃにてインキュベートする。

フラスコの底全体の固まりから移動により、色素細胞種
ＭＭｃｏＲｌは細胞母集団Ｐ２を生成する。

これはまた分化したメラニン形成細胞および線維芽細胞
状細胞からなる。懸濁液ｓ２はこの母集団Ｐ２から調製
する。０．２５％（ｖ／ｖ）トリプシン溶液０．５１を
添加する。５−１５分接触後、すべての細胞の分離およ
び個別化が観察される。懸濁液をピペットにより集め、
ｍ（ｌ当り４・１０８細胞を含むように調製する。

ついで悪性黒色腫（ＭＭｃｏＲ２）を懸濁液ｓ２を、０
、ＩＭＮａＯＨ０，２５ｍｌ！および仔牛脂児血清０゜
４５ｍρを添加した完全培養培地２ｍＱの存在下、懸濁
液Ｓ２を０．５０ｍｆ７およびコラーゲン溶液１．５ｍ
Ｑに添加する。

同様の方法で、悪性黒色腫（ＭＭｃｏＲ３）を母集団Ｐ
３から調製した懸濁液ｓ３から再横築する。

これは分化メラニン形成細胞および線維芽細胞状細胞を
含み、ＭＭｃｏＲ２から誘導されたものである。

Ｃ）再構築悪性黒色腫の移送 各再構築悪性黒色腫を、細胞がフラスコ中に増殖のため
にあふれ始めるまで培養する。ついで黒色腫は完全培養
培地を含む新しいフラスコ中に移し、再びインキュベー
トする。この操作を、細胞の成長度により４−８週毎に
反覆する。

Ｄ）悪性黒色腫第３代から悪性黒色腫第１代の再構築 ０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン溶液０　、５　ｍ（ｌ
をＢにて得られたＭＭＣｏＲ３を含むフラスコ中に注入
する。５分間接触後、主として黒色腫を含む細胞懸濁液
を除去し、ついで、ｍＱ当り４・１０６細胞に調製する
。ついでこの懸濁液０．２５ｍｆ７を、２ｃ記載の手順
により黒色腫第１代を得るために主として使用したＩ８
濁液Ｆｌ　　Ｏ，２５ｍ（！と混和する。

このようにして３種の新しい悪性色素細胞を得る。各々
はそれか誘導された第１代（ＭＭｃｏＲＩ　）の特長を
有している。

３、結果 ９種の再構築黒色腫が得られた：第１代（Ｍ　Ｍ　ｃ　
。

Ｒ１）３種、第２代（ＭＭｃｏＲ２）３種および第３代
（ＭＭｃｏＲ３）３種である。

下の表は各々の発生および関係を示す。

対照実験は平行して、メラニン形成細胞だけで行い、わ
ずかに収縮したメラニン形成細胞ラティス（Ｌ　Ｍ）の
３継代は線維芽細胞を生成しなかった。

以下各ＬＭＩ、ＬＭ２およびＬＭ３という。これは本発
明の実験期間中再構築腫瘍を出現させなかった。

各再構築黒色腫および各ラティスＬＭにつきつぎのよう
なこと：直径測定による収縮力、収容容器の底部への付
着能力および細胞着色を測定するために、培養培地を移
動して細胞を集めた後、遠心分離した残渣の色、を検査
した。細胞は顕微鏡下で調査した。

観察はつぎのようならのである。

第１代について。

ＭＩ −わずかな収縮：３ｃｍラティスが直径６ｃｍのゲルか
ら　得られた。

付着ゼロ：培養フラスコに移動させたラティスはわ　ず
かな動きで分離した。

細胞の出現：移送における系の増殖と同じ。

着色：非常に薄いベージュ ＭＭｃｏＲＩａおよびＭＭｃｏＲＩ　ｂ進化はこの２種
の黒色腫につき同じ。

収縮：０．８ｃｍ −付着二強い 細胞の出現：コロニーの出現、裸眼で腫瘍細胞および線
維芽細胞状細胞層が見える。

−着色；いずれの場合もゼロ ＭＭｃｏＲＩ　ｃ −収縮：１．３ｃｍ 付着：ＭＭｃｏＲＩａおよびＭＭｃｏＲｌｂのものより
大、母集団Ｐ２（２Ｂ参照）を集めるために、トリプシ
ン溶液を１５分間作用させる必要あり。

細胞の出現：線維芽細胞状細胞上に腫瘍細胞の小塊が３
方向にのびている。

着色：ゼロ 第２代について （前の観察と比較して） Ｍ２ 収縮および付着：同じ 着色：ゼロ 細胞の出現：系統と同様に行動する。

ＭＭｃｏｌ１２ａおよびＭＭｃｏＲ２ｂ収縮および付着
：わずかに減少 着色；変化なし 一細胞の出現；線維芽細胞状細胞の減少、これはラティ
ス周辺で強い。移送における腫瘍細胞系に著しく近似し
た行動 ＭＭｃｏＲ２ｃ 収縮、付着および着色：変化なし ３方向の小塊および線維芽細胞状細胞が未だ存在するが
、より早くなく現われる。

第３代について （前の観察と比較して） Ｍ３ 進化−細胞成長の遅延と同じ ＭＭｃｏＲ３ａおよびＭＭｃｏＲ３ｂ 収縮（２・２　ｃｍ）および付着：減少およびＡＣＭ３
に接近 細胞の出現：線維芽細胞状細胞の希薄化および腫瘍系型
の成長が見られる。

ＭＭｃｏＲ３ｃ −収縮：変化なし 付着：わずかに減少 細胞の出現：わずかに減少しつつ、裸眼で見えるコロニ
ーが小さくなりつつ、わずかに緩やかになる。

紡錘状細胞は持続、成長は小さくなる。

重要なのは、各悪性黒色腫第３代（Ｍ　ＭｃｏＲ３ａ。

ＭＭｃｏＲ３ｂおよびＭＭｃｏＲ３ｃ）から出発して、
それから誘導されたメラニン形成細胞を主として使用し
た懸濁液Ｆｌの線維芽細胞と再共在させることにより、
その能力が再構築悪性黒色腫第１代（すなわち、各ＭＭ
ｃｏＲＩａＳＭＭｃｏＲｌｂおよびＭＭｃｏＲｌｃ）の
らのである再構築悪性黒色腫が得られることが判明した
ことである。

実施例２ 本実施例は、パーキット・リンパ腫患者の骨髄から得ら
れた腫瘍芽細胞からの再構築腫瘍の調製について記載す
る。

１、方法 腫瘍芽細胞の懸濁液を患者の骨髄から調製する。

培養培地にて骨髄細胞をインキュベーンヨン後線維芽細
胞の層上に腫瘍芽細胞からなる３方向の小さな集魚が観
察される。これらの細胞をトリプシンで処理後集め、完
全培地に懸濁させる。

腫瘍芽細胞の懸濁液を血管腫芽細胞（実施例１の線維芽
細胞Ｃ）の懸濁液とコラーゲンの存在下、共インキュベ
ートする。

採用した方法および使用した試薬および装置は実施例１
記載のものと同様である。

２、結果 腫瘍が３７℃にて収縮後形成される。この腫瘍を培養後
、紡錘状細胞の層に強く固着した腫瘍芽細胞の集魚およ
び小塊の形成が、それから遠く離れた外縁に観察された
。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）腫瘍外殖体から由来する特定タイプの悪性分化細
   胞、単一タイプの繊維芽細胞およびコラーゲンから成る
   ３次元に再構築された腫瘍。
2. （２）悪性細胞が骨髄腫転移から由来するものである、
   請求項１記載の再構築腫瘍。
3. （３）悪性細胞が骨髄から由来するものである、請求項
   １記載の再構築腫瘍。
4. （４）繊維芽細胞が血管腫から由来するものである、請
   求項１から３の何れか１項記載の再構築腫瘍。
5. （５）一方で所定タイプの悪性分化細胞の均質固体群お
   よび他方で繊維芽細胞の固体群を別々に製造し、これら
   ２つの固体群をコラーゲンの存在下で培養することから
   成る、再構築腫瘍の製造方法。
6. （６）分化細胞類および繊維芽細胞類が２つの異なる外
   殖片から由来するものである、請求項５記載の製造方法
   。
7. （７）繊維芽細胞の懸濁物およびコラーゲン溶液から成
   る、請求項５または６記載の製造方法を行うための、実
   験室用キット。
8. （８）臨床研究または薬理試験のための、請求項１から
   ４の何れか１項記載の再構築腫瘍の用途。