CN1141384C - 人骨髓间质干细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物细胞技术领域，具体涉及一种人骨髓间质干细胞及其制备方法。本发明从无菌骨髓中分离纯化培养出人骨髓间质干细胞，在体外已稳定培养、传代超过30代，经体内、外实验结果证实该细胞无致瘤性，具有间质干细胞多向分化的功能，能形成毛细血管样网状结构，脂肪样细胞，软骨样细胞及软骨组织等人体组织器官的各种细胞，具有明显的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属生物细胞技术领域，具体涉及一种人骨髓间质干细胞及其制备方法。
背景技术：干细胞是人体内最原始的细胞，具有复制能力，尤其在早期胚胎发育过程中，可以分化成人体组织器官的各种细胞。已有研究表明干细胞不但存在于胚胎，而且也存在于人体内。这个重大发现，使人类对自制自体细胞、组织、器官，并用于治疗癌症，自身免疫疾病，神经退行性疾病等疑难疾病充满了希望。目前国际上干细胞研究有四大热点：胚胎干细胞建系及定向诱导成组织细胞的分子机制；成体干细胞横向分化的条件；各种组织的成体干细胞库的建立及临床试验以及细胞移植的免疫排斥问题。国际上已取得的研究结果有：成功建立胚胎干细胞体外培养系统，并发现人的血液干细胞可以横向分化成肝脏，神经等组织细胞。有学者Anita Muraglia等人报道，从人骨髓中克隆了间质干细胞在体外能分化成骨、软骨和脂肪细胞的形成，但随着细胞的增殖其生长速度渐缓，逐渐失去骨、软骨和脂肪细胞分化的形成，也有学者Dennis等人从成年的小鼠骨髓中分离出了具有分化能力的间质干细胞，通过转入基因使其“永生化”，证明该细胞能分化成骨、软骨和脂肪细胞。但到目前为止，国内外尚无能在体外长期培养的人间质干细胞(一般连续传代满30代即可为细胞株)，即使能在体外长期培养也是通过转基因后才得以实现。
发明内容
本发明的目的是提供能在体外长期培养的人骨髓间质干细胞及其制备方法。
本发明从外科手术取得的无菌肋骨中分离纯化培养了一株人骨髓间质干细胞，在体外已稳定培养、传代超过30代，经体内、外实验结果证实该细胞具有间质干细胞多向分化的功能。本发明方法的具体步骤如下：
1.用含肝素的生理盐水反复冲洗骨髓腔，收集细胞放置预先用明胶包埋的培养瓶中，用含15％胎牛血清、内皮细胞生长因子(简称ECGF)、肝素的高糖DMEM培养基，在5％二氧化碳37℃培养箱中培养48小时后，吸去悬浮细胞与培养液，补充新鲜培养液继续培养使其增殖，最初细胞呈梭形状生长，待细胞长满后，用胰酶消化，一瓶分传二瓶继续培养；
2.收集细胞用CD31抗体标记，然后用含有磁珠的二抗进行反应，通过磁性分离器得到阳性细胞，将阳性细胞继续培养，方法同前。细胞长满后给予传代，此时细胞形态呈非梭形状、类似于星状细胞，增殖速度明显加快，每星期传代二次，每次以一瓶分传三瓶；
3.检测间质干细胞特征：在体外稳定培养5个月传代超过30代后，用流式细胞仪测定第10、20、30代的细胞表面标记，结果显示CD9、CD31、CD34、CD45、CD49均为阴性，CD105，CD106分别为98％，99％阳性，呈现为间质干细胞的特征；
体外培养观察到细胞有明显的接触生长抑制，一般情况下，一瓶长满的细胞每周换一次培养液，可稳定生长一个多月不会出现老化和脱落。细胞与Matrigrl一起培养12小时可形成毛细血管样网状结构，用地塞米松和胰岛素诱导可出现脂肪样细胞，说明细胞内有脂肪滴形成。在动物体内实验中，以2.5×107细胞接种裸鼠皮下无肿块形成，证明细胞无致瘤性，细胞与Matrigrl一起培养后，经病理切片证实，在裸鼠皮下形成软骨样细胞及软骨组织。
上述方法中的培液为6-8毫升/每瓶，其中含肝素为5-10单位/100微升，含ECGF400-1000微克/100微升。
从上述体内外的实验结果证明本发明人骨髓间质干细胞具有间质干细胞多向分化的功能。由于间质干细胞具有多向分化的潜能，通过诱导可分化成人体组织器官的各种细胞，例成骨、软骨、脂肪、心肌、肝脏和造血细胞等，所以间质干细胞具有明显的临床应用价值，近年来干细胞研究已成为医学领域的一个热点，相信通过不断的探索、研究，其应用前景将更加显著。
附图说明
图1是人骨髓间质干细胞分化成的骨样组织
图2是人骨髓间质干细胞分化成的脂肪细胞
图3是人骨髓间质干细胞分化成的网状样毛细血管
图4是人骨髓间质干细胞分化成的毛细血管
图5是人骨髓间质干细胞分化成的软骨样组织
Claims (4)
1.一种人骨髓间质干细胞的制备方法，其特征是通过下述步骤，
1)取无菌肋骨，用含肝素的生理盐水冲洗骨髓腔，收集细胞入培养瓶，DMEM培养基5％二氧化碳37℃培养48小时后，去悬浮细胞与培养液，补充新鲜培养液继续培养，待细胞长满后，胰酶消化，分传二瓶继续培养；
2)收集细胞CD31抗体标记后，用含磁珠的二抗进行反应，得阳性细胞，继续培养，传代，每星期传代二次，每次以一瓶分传三瓶；
3)检测间质干细胞特征：体外稳定培养5个月传代超过30代后，测定第10、20、30代细胞表面标记，得具有间质干细胞特征的人骨髓间质干细胞，经培养、诱导细胞无致瘤性，能形成毛细血管样网状结构，脂肪样细胞，软骨样细胞及软骨组织。
2.按权利要求1的方法，其中DMEM培养基含15％胎牛血清，内皮细胞生长因子和肝素。
3.按权利要求1的方法，其中的培液为6-8毫升/每瓶，其中含肝素为5-10单位/100微升，含ECGF400-1000微克/100微升。
4、按权利要求1所述的人骨髓间质干细胞，其特征是所述干细胞在体外稳定培养、传代超过30代，具有间质干细胞多向分化的功能。
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