JPS58192896A - インタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タン・臂り質の精製に長い関ペゾチド化学ＶＣおける１
つの問題でめった。これまで用られてきた技術の例は、
沈殿、ｒル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ｒル
ミ気泳動、親和性クロマトグラフィーお工び述べるＶＣ
は多過ぎる他の方法である。

米然ＶＣ産出する、極めて低濃度で生物学的試料中ｙｃ
存在する高分子量のタンノ９り＊１単離しようとする計
画ａ１前述の技術の検定（ａ＃１αｖ＞を利用する多工
程法であった。多数のこのような場合において、極めて
大量の粗製出発物質を蓄積および処理しなくてはならず
、これには精製後の工程において多数の生成物が失なわ
れるため高い経費と通常多くの労力を要する。

問題の１つの適当なケースはインター７エロ／（ｉｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎ）を単離および特徴づける多数の試みの
歴史である。アイザック（Ｉｍａａｃ畠）およびリンデ
ンマン（Ｌｉｎｄｓｎｍａｎｎ）による最初の発見以来
、２０年にわたって全世界の研究者達はインターフェロ
ンを白血球または線維芽細胞（ｆｌｂｒｏｂｌａｓｔ）
の形で、均質なぜブチｒとして、その特定の生物学的ま
たは化学的性質を特徴づけ且つ同定できるのに十分な量
で単離しようとしたが、不成功に経った。

アイザックおよびインデンマンのインターフェロンを用
いる元の研究に関する米国特許第５．６９９，２２２号
において、活性物質の精製は硫酸アンモニウムの沈殿お
よびそれに引き続く透析に限定されている。このような
方法は比較的非特定的であり、こうしてそれによって得
られる生成物はなお極めて粗製状態である。

インターフェロンを精製する多工程法は米国特許第５，
４１４，６５１号に開示されており、この多工程法は非
晶質アルミノ−シリケート上の選択的吸着、ヨウ素また
はチオシアネートの溶液を用いる溶離、さらＫＨＯ１水
溶液、次いでＮａＯＨを用いる望まないタンパク質の沈
殿、水混和性溶媒、たとえばメタノール、エタノールま
たはアセトンを用いるインターフェロンの塩基溶液から
の沈殿、オヨヒ最後に２−ジエチルアミノエチル−セル
ｐ−スのような陰イオン交換樹脂による再溶解したイン
ターフェロンのクロマトグラフィーを用いて、その比活
性がこの全プロセスにより４ｏｏｏ倍に高められたと示
されるインターフェロンを生成する。例示された特定の
インターフェロンはヒヨコとサルのインターフェロンで
あった。

ほかの精製法は米国特許第４９７翫５４４号に教示され
ており、ここでは細胞培養の培地から誘導された粗製の
人の線維芽細胞のインターフェロン溶液が区域密度勾配
の超遠心分離によって精製されている。この技術はセフ
ァデックス（８・ｐｈａｄ＊ｘ）Ｇ−１００を用いる普
通のカラムグロマトグラフイーで得られるより高い収率
および精製を与えることが示された。

インターフェロンの精７製および特性づけに関する最近
の科学文献は、次のように要約することかできる： ＫｎｉｇｈｔｐＥ−、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、ムｅａｄ、
８ｃ１．Ｕ８ム７３゜５２０−３（１９７６）； Ｔ’ｏｒｍ’ａＪ、Ｔ、　ａｔ　ａｌ、＊Ｊ、Ｂｌｏ１
．ｏｈ＠ｍ、２５１４８１０−６（１９７６）； Ｂｒｉｄｇｖｎ、Ｐｊ、ａｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｏｈ＠ｍ、２５２゜６５８５−７（１９７７）； Ｄ＊Ｍａ＠ｙ＠ｒ　−Ｇｕｉｇｔｈａｒｄ、Ｊ、ａｔ　
　ｍｌ、、Ｎａｔｕｒｅ２７１．６２２−５（１９７８
）ｊ Ｋａｗａｋｉｔａ、Ｍ、ａｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、０ｈｅｔｎ、２５５゜５９８−６０２（１９７８）； １１＠ｒｔｈｏｌｄ、Ｗ、ａｔ　　ａｌ、ｔＪ、Ｂｌｏ
ｌ、Ｏｈｅｍ、２５５゜５２０６−１１　（１９７８）
； Ｊａｎｋｏｖｍｋｉ、Ｗ、Ｊ、　　　ａｔ　　ｍｌ、、
Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　１　６　　＋１１２４−３０
（１９７５）； １９６−２００（１９７８）。

上記の文献のいくつかはマウスまたは人のインターフェ
ロンを均質に精製したと述べているが、タンパク質の均
質性の古典的証明が与えられておらず、あるいは記載さ
れている純粋といわれる化合物の性質は記載されていな
い。

タンパク質の精製に高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を使用することは一般に技術的に知られている
。これらの参考書は特定的にタンノクク質の精製におけ
るイオン交換および大きさ排除型のカラムを記載してい
る。たとえば、Ｒ＊ｇｎｉ＠ｒ。

Ｆ、Ｅ、　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、０ｈｒｏｎ＋ａｔｏｇ、
８ｅ１．１４　、５１６−２０（１９７６）およびＯｈ
ａｍｇ、８．−Ｈ，＠ｔ　ｍｌ、。

Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、４８．１８３９−４５（１９７６
）参照。

逆相（ｒｃｖ＠ｒ畠・ｐｈａｓ・）分配クロマトグラフ
ィーにおけるククロソルプ（Ｌｉｅｈｒｏｉｏｒｂ）Ｒ
Ｐ−１８（オクタデシル結合シリカ微粒子カラム）の使
用は、β−工ンｒルフィンのような一ブチｒを精製する
ために成功したものである〔たとえば、Ｒｕｂｉｎｍｔ
＠ｉｎ、Ｍ、　ａｔ　ｍｌ、Ｐｒａｅ、Ｎａｔｌ、ムｓ
ａｄ。

８ｃｉ、、Ｕ８ム７４．４９６９−７２（１９７７））
。

最後に、マウスの′Ｂｈｒｌｌｅｈ　腹水症のａｍｍｓ
胞からのインターフェロンの３檀（分子１１＝ｓｔｏｏ
ｏ。

は、０ａｂｒ＠ｒ、Ｂ、　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、　２５４５６８１−４（１９７９）Ｋ記載
されている。

本発明は、鰻も広い意味において、約１２，０００より
大きい分子量を有するタンパク質を製造的現襖で高い分
割および高い収率で精製する改良された方法に関する。

この方法は、該タンパク質を不純な状態で、シアノプロ
ピル、シクロヘキシル、フェニル、オクチル、オクタデ
シルまたはグリセリル基を結合した多孔質シリカのマト
リックスの緩衛液で平衡化したカラムに、高性能液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＯ）の条件下に通して該タン
パク質を該カラム上へ吸収させ、その後腹タンパク質を
増加する勾配または減少する勾配の水性の水混和性ｆｓ
ｌ＆ｌＫで溶離し、そして該タンノぐり質を該溶出液の
選定７ラクシヨン中Ｋ１１１６純度の状態で優ることか
らなる。

本発明の好ましい特定の実施態様において、この新規な
精製方法を用いて、インターフェロンを十分な量で均質
に精製してこの医薬的に価値ある物質の化学的特性づけ
を初めて可能となる。インターフェロンを化学的に特徴
づけるこの能力は、この物質の開発における有意な進歩
を表わす。なぜなら、この能力により、普通のペプチド
合成法により、或いはインタ−７エロンアミノ酸序列〈
相当するＤＮＡを合成し、そしてこのようなりＮＡを適
当な有機体、好ましくはバクテリア中に１ＤＮＡ−再結
合技術により導入することｋよって、インターフェロン
を合成できるからである。次いで、生ずる有機体はイン
ターフェロンを生成する能力を有し、これは発酵技術を
応用してＦ＆業的なレベルで従来まれな化合物の便利な
源を提供するように規模を大きくすることができる。

インターフェロンを均質の夕ン〆り質として製造する特
定の方法は、次の工程の組み合わせからなる： ム）不純な状態のインターフェロンの水溶液を、１ｌＩ
ＩＩＩＩ液で平衡化したオクチル結合シリカのマトリッ
クスノカラＡＫ１高性能液体りロマトグラフィー条件丁
に通して該インターフェロンを該カラム上へ吸収させ、
その後該インターフェロンｔ−ｉカラムから増加する勾
配の水性の緩衛した水混和性溶媒で溶離し、そして譲イ
ンターフェロンを該溶出液の選定７ラクシヨン中に高純
度の状態で得；Ｂ）工程ムにおいて得られる選ばれたイ
ンターフェロンの７ラクシヨンを、緩＊ｌｆで平衡化し
たグリセリル結合したシリカのマトリックスのカラムに
通して譲インター７エｐンを該カラム上へ吸収させ、そ
の後該インターフェロンを譲カラムから減少する勾配の
水性の緩衛した水混和性溶媒で溶媒し、そしてインター
フェロンを明確な主ピークとして゛該溶出液の選定７ラ
クシヨン中に高純度の状態で得； Ｃ）工程Ｂにおいて得られる該明確な主ピークの１つに
相当するインターフェロンの選定７ラクシヨンのｌｌｌ
浴溶液、ｅｉ衝液で平衡化したオクチル結合シリカのマ
トリックスのカラムに１属性ｗ＠欣体クロマトグラフィ
ー条件下に通して該インターフェロンを該カラム上へ吸
収させ、その後該イ／ターフエロンを該カラムから水性
の緩衛した水混和性溶媒で溶離し、そしてインター７エ
ロ／を一一の明確なピークとして該溶出液の選定７ラク
ーシヨン中に均質なタンＲり質の状態で辱、そして、必
要に応じ工、工程０の操作を反復して究極の均質性を達
成する。

本発明は、また、この改良された方法によって得られる
純粋且つ均質なインターフェロンの梱（ｓｐ＠ｃｉｅ畠
）Ｋ関する。

本宅明の実施において使用するオクチルまたはグリセリ
ル変性多孔質シリカの微粒子のカラム（粒度＝１０μ；
平均孔大きさ一１ｏｏｒ）は、アメリカ合衆国ニューヨ
ーク州エルムスフォードの１！Ｍラゴラトリーズ（ＩＮ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｏｆｈｌｍｓｆｏｒｄ、
Ｎ、Ｙ、　、Ｕ　８ム）−ら、ｆｊｉ３億Ｌｉｅｈｒｏ
ｍｏｒｂ）ＬＰ−８およびＬｉｅｈｒ、ｏｓｏｒｂジオ
ールとして人手できる商品である。同等のオクチル変性
多孔質カラム（Ｏｈｒｏｍ＠ｇａｂｏｎｄ　Ｏ−８とし
て識別される）は、アメリカ合衆国ニューシャーシー州
マールト／のＢ、８イ／ダストリーズ（Ｅ、Ｓ、Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉｅｓ。

Ｍａｒｌｔｏｎ＋Ｎ、Ｊ、　、Ｕ　８ム）から入手する
ことができる。

酌述のカラムを利用する便利な高圧液体クロマトグラフ
ィー糸は米国特許第４，１１４０４６号に記載されてい
る。

本発明の方法を実施する場合、不純な高分子皺のぜブチ
ドの、好ましくは問題のタン／６り實の性質と適合する
ｐＨにおける緩衝水溶液中の溶液をシリカのマトリック
スのカラムに通す。通常、この操作は加圧下に、好まし
くは約５０〜約５．０００ｐｓｉ（ｉ４〜３４０気圧）
の範囲において実施する。タンパク質をカラムに吸着さ
せ、次いで水と混和性の溶媒の勾配を用いて選択的方式
で＃！続して溶離する。この目的に適した水混和性の溶
媒の例は、アルカノール、たとえばｎ−プロノぐノール
、２−プロアＺノール、エタノール、メタノール、ｔ−
ブタノールまたは環式□三−テル、たとえばジオ午サン
である。溶離液の分別は、７ラクシヨ／・コレクターを
使用し、それ自体知られた方法により、各フラクション
中のタンパク質含轍を、＾感度で動作するぜプチドモニ
ターで同時に監視することによ−）て達成する。この目
的に１ｓ当な系はＢｏｈｌｅｎ　　ａｔ　　ａｌ、、Ａ
ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、６７、　４５８（１９７５）
に開示されている。また、ターゲットタンｄり質の存在
を適当な生物検定により監視することが好ましい。

両方のカラム（「正常１分配クロマトグラフィーのため
のカラムおよび逆相クロマトグラフィーのためのカラム
）を用いるかどうか、そうする場合どの順序を選ぶかに
ついての決定は、大部分精製すべきタンパク質の性質に
依存する。たとえば、人の白血球のインターフェロンの
特定の場合において、胡め不純なインターフェロンの溶
液をオクチル結合シリカマトリンクス力ラム（ｉＩ！相
クロマトグラフィー）に通し約７５のａｍ液のｐＨ，好
ましくは１Ｍの酢酸ナトリウム−酢酸系を用いて分割（
ｒ＠５ｏｌｖｅ）’　ｌ、、増加するｎ−プロパンール
譲度の勾配で溶離し、次いで集めた活性なフラクション
をα１Ｍの酢酸ナトリウム中のグリセリル結合シリカマ
トリックスカラムに通し、低下するｎ−プロパ／−ルの
勾配で溶離し、ｋｋ後に分離したインタ−７エロ／成分
をオクチル結合シリカマトリックスカラムに、約４０の
緩衛液のｐＨ，好ましくは１Ｍのピリジン−２Ｍのギ酸
系を用いて通し、そして増加するｎ−プロノぐノールの
勾配で溶離することによって、最良の結果が連成される
ことがわかった。このようにして、人の白血球のインタ
ーフェロンの３つの別々の形態（α、βおよびγ）の各
々は均質なタンノぐり質を表わす別々の鋭いピークに分
割することができる。第２のオクチル結合シリカマトリ
ックスクロマトグラフィ一工程に対する培地を用いて出
発する全体の精製は、６０．０００〜８Ｑ、０００倍で
あったが、グリセロール結合シリカマトリックスのクロ
マトグラフィ一工程を通した累積収率は５０〜５０％の
範囲であ−〕だ。

人の白血球のインターフェロンの輌！１汰の特定ショ／
を染め、ｎ−プロパツールをｎ−へ千す／で抽出して除
去し、そして微量のｎ−へ千サンを工程Ｃへ進む前に水
相から除去する。

本発明の方法の実施により得られる均質な人の白血球の
インターフェロンの檜の各々は、前述のＨＰＬＣカラム
上の鋭いピークと、２−メルカプトＸり／−にの存在下
のｒデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄ８０４）ぎりア
クリルアミｒゲル電気泳励上の単一の狭い帯とを示した
。このゲルを抽出すると、タンパクｉ１Ｎと一致する抗
ウィルス活性の中−〇税いピークが得られた。この純粋
なイン（−７エロ／の樟の比活性は、ＭＤＢＫの牛の細
胞で約２．６〜４．０’Ｘ　１０８の範囲であり、セし
てＡｇ１７５２の人の細胞系統（ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌ
　ｌｉｎ＠）で灼ｔ５〜４Ｘ１０”であ晶とがわかった
。分子線は表４に見られるように約１６．ＯＤＤ〜２１
，０００の範囲であった。アミノ酸分析の結果は表５に
要約されている。

フインターフェロン類は抗ウィルス活性、副筋活性、生
長阻止活性および腫瘍抑制活性を示した。

これらの活性は、人のインターフェロンが１％より少な
い比較的粗映の製剤を用いて１〜１０Ｘ１ｏ’単位／日
を用いる１床レベルにおいてさえ鴎られた。本発明の１
つの面である精製された均質なインターフェロン類は、
従来用いられた粗勢の製剤と同じ方法で投与量を調整し
て望むレベルのインターフェロン単位を与えるようＫし
て使用することができる。個々の稀はそのまま使用する
ことができ、或いはこのような柚の２柚以上の混合物を
使用することもできる。このような混合物は単離した柿
を望むように混合することによって得ることができ、或
いはインターフェロンの幾つかの柚が存在するが、非イ
ンターフェロンの活性なタンパク質が存在しないところ
で精製を停止し、組成物が均質なインター７エロンタン
パク質の混合物であるようにすることによって、得るこ
とができる。

前述の精製法は、人の白＋１ｎ球のインターフェロンの
場合によって例示したが、人の線維芽細胞および動物踪
からのインターフェロンならびに約１２．０００より大
きい分子量をもつ他のタンパク質を包含する他のインタ
ーフェロンを精製するために使用することもできる。こ
うして、たとえば、ブローオピオコルチン（ｐｒｏ−ｏ
ｐｉｏｃｏｒｔｉｎ）（分子置約３０，０００）は本発
明の操作を用いて均質に精兼された（　ｋｉｎ＋ｕｒａ
　ａｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ。

８ｅｉ、Ｕ８ム　７６．１７５６−９（１９７９）参照
上適切な特定の条件を遥んで精製すべき各異なるタイプ
の夕／ノぐり質のためにｔ＊な分割を得ることは当業者
にとって自明であろう。

インターフェロンの製造の誘導、インターフェロンの初
期素度およびゲル濾過を含むインター７エｐンの分別は
この分野でよく知られた方法を用いて達成することがで
きる。不純な状態のインターフェロンの水溶液を生成す
るこれらの＊ｒ’￥は本発明の一部分ではない。

本発明の方法および生成物の由を、次の実施例により明
らかにする。

実施例　１ 刀ゼイン（１ｏｓ９／ｄ）を含有する血清不含最小必須
培地中で、Ｅ常の提供者からの人間の血清（１０’ｉｄ
ｌ胞／ａ／　）を、ニューカッスル（Ｎ＠ｗｅａｓｔｌ
ｅ）病気ウィルス（１５血球凝集単位／−）で１６時間
培誉することによって、インターフェロンを製造した。

ｓ、　ｏ　ｏ　ｏ単位／−の平均のインターフェロンの
力価を寿た。用いた操作はＭｏｇ＠ｎｍ＠ｎ、に、ｉ。

ａｔ　ｍｌ、、Ｐｈａｒｍａｅｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔ
ｈ＠ｒａｐ＠ｕｔｉｅｓ　Ａ。

１９７７、５６９−３８１　；Ｗｈｅ＠１ｏｅｋ、１．
Ｆ、、Ｊ。

Ｂａｃｔ＠ｒｉｏ１．９２．１４１５−１４２１　（１
９６６）および０ａｎｔ＠ｌｌ、に、　＠ｔ　ｍｌ、、
Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

２２．６２５−６２８（１９７１）Ｋ報告されたものを
多少２１したものであった。インターフェロンの力価は
、細胞病理作用−阻止検定によって測定し、この検定は
１６時間以内で実施することができた。すべてのインタ
ーフェロンの力価は参照単位／−で表わし、これはナシ
ョナル・インスシチュート・オブ・ヘルス（ｔｈ＠Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ＠ｏｆ　Ｈ＠ａｌｔｈ
　（Ｕ８ム）〕により提供された人の白皿琢のインター
フェロンのための参課榔準に対して補正した。

Ｂ、　（ンタ〜７エロンの一度および初期の分肉特に示
さないかぎり、これらの操作は０〜４℃で実施した。培
養の終りｋおいて、細胞および残屑（ｄ＠ｂｒｉｓ）を
低速遠心分ＪＩ１１（１５分、５００ｘｙ）により除去
した。カゼインをＨＯＩでｐＨ４，０に酸性化すること
によって沈殿した。２時間後、この混合物を遠心分１１
１（１０分、１２，０００Ｘｉし、そして４レツトを廃
梁した。上層（１０１）を１５％（Ｗ／Ｖ）のトリクロ
ロ酢酸に調整した。

１時間後、沈殿を遠心分１４１１（１０分、１λ０００
×Ｉ）により集め、セして５０−のαｊ　Ｍ　（Ｄ　Ｎ
ａＨＯＯｇ中に再溶解した。トリトンＸ−１００（（Ｌ
５ｐ）を加え、次いで酢＠１（１５ｓａ（）をかきませ
ながら綿々加えた。この混合物を０℃で１時間、次いで
一２０℃で１６時間貯蔵した。次いでそれを解凍し、遠
心分ＩＩＩ（１０分、１７，０００Ｘ９）した。

ぜレットを廃棄し、上層を４％のトリクロロ酢酸に調整
したＪ１時間後、この混合物を遍心分離（１０分、１２
，０ＯＯＸ１１）した。沈殿物を集め、セして５−のα
５モルのＮａＨＯＯ３中に丹溶解した。

０、ゲル濾過 尿素（ｔ５１をインターフェロンの１１１４ｍ物に加え
、でしてこの溶液を４Ｍの尿素／α１Ｍの酢酸す）　Ｉ
Ｊウムの緩鞠液で前もって平衡化したセファデックス（
８＊ｐｈａｄ＠ｘ）　Ｇ　−１００の微細粒子のカラム
（２，６Ｘ　９０ａ＋ｃ）Ｋ通した。このカラムを４Ｍ
の尿素／α１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ７，５で、室温
においてα５　ｇＬｔ／分の流速で溶離した。

１２５−の７ラクシヨンを集めた。インターフェロンの
活性は７ラクシヨン１９−２３中に溶出された。

Ｄ、高性能液体クロマトグラフィー セファデックスＧ−１００の試験の７ラクシヨン１９−
２３を合わせ、直接ぎ／プを経てリクロソルプ（Ｌｉｃ
ｈｒｏｓｏｒｂ）ＲＰ　−８カラム（１０μ、４．６　
Ｘ　２５０　ｔｍ　）に通した。このカラムは［１０１
％（Ｖ／Ｖ）のチオジグリコールをせ有する１七ルの酢
酸ナトリウム緩慟液（ｐｎｚｓ）で前も−）て平衝化し
、次いでｎ−プロパツールの直線の勾配で同−磯絢液中
でα２５−７分のｔＩ＆運で溶離した〔１時間、０〜２
０％；３時間、２０〜４０％（Ｖ／Ｖ　）　）。［１７
５ｇｔ０７ラクシＷ；４集めた。

インターフェロンは７ラクシヨン２３〜４０　（２５〜
３０％（Ｖ／Ｖ）の劾−プロノぐノール）中４Ｃ溶出さ
れた。

インターフェロン活性のほとんどを含有する７ラクシヨ
ン２７〜３６を合わせ、ｎ−プロパツールを８０％（Ｖ
／Ｖ　）の櫃終＃１度まで加え、そしてこの溶液を、８
０％（Ｖ／Ｖ）のｎ−プロツマノールを含有するａｌＭ
の酢酸す）９ウムの溶液で削もって手簡化したりクロソ
ルプ・ジオールのカラム（１０μ、４．６　Ｘ　２５０
　ｍ　）　Ｋ　Ｎ　ンデを経て通した。へいでこのカラ
ムをα１Ｍの酢酸ナトリウム中で４時間の直線の勾配の
７２〜５０％（Ｖ／Ｖ　）のプロパツールでα２５−７
分の流速で溶離した。

α７５−の７ラクシヨンを集めた。インターフェロン活
性は３つの明確な主ピークとして溶出され、それらのピ
ークは製造ごとに定置的に変化した。

これらのピークは溶出の順序に従ってα、βおよびｒと
表示した。ｆｆ−７ラクンヨンは６８％のｎ−プロノぐ
ノールの濃度で、β−７ラクシヨンは６６５％のｎ−７
’ロノぐノールで、ｒ−フラクションは６５．５％のｎ
−プロパツールで溶出された。

インターフェロンの活性の合計の回収率は８０％より高
かった。

各ピークからなる７ラクシ日ンを別々に集め、継続する
工程を経て個々に精製した。ピークｒは子量で存在しそ
して他の成分からよく分割されるように忠ｔ）れたので
、それをさらＫＭ製するために適んだ、ジオールカラム
からのピークｒからなるフラクション５４−５６を集め
、セして１−プロパツールを寺体積のヘキサンで２回抽
出することによって除去した。微量のヘキサンを窒素流
のもとに除去した。ピリジンとギ酸をそれぞれ１Ｍと２
ＭＯ最終＃度に加え、そしてこの溶液を１Ｍのピリジン
および２Ｍのギ酸（ｐＨ４，０）で前もって平衡化した
りクロンルプａｐ−ｓカラム（１０μｍ　　；４．６Ｘ
２５０ＩａＩ）Ｋ加える。このカラムを１Ｍのピリジン
／ホルメート緩絢液中で直線の２０〜４０％の１−プロ
ノ（ノールの勾配で３時間以内で０．２−７分の流速で
溶離した。１１６−のフラクションを集めた。活性の主
ピークはタンパク貿のピークと一致した。このピークか
らなる７ラクシヨン４５および４６（５２％、Ｖ　／　
Ｖ、プロパツール）を合わせ、同様な条件で再クロマト
グラフ処理した。インターフェロンは７ツクシヨン５１
（５２％、Ｖ　／　Ｖ　、プロパツール）中に溶出され
たつこの７ラクシヨンの比活性は牛血清アルブミンに関
して４×１０一単位／■であると針−された。この物質
をさらに特性づけのために使用した。この高性能工程の
螢光プロフィル（ｔｌｕｏｒｅａｃｅｎｃ・ｐｒｏｆ　
ｉ　ｌ・）は看しく再現性があったので、全操作の通続
な指紋（ｆｉｎｇ＠ｒｐｒｉｎｔ）を与えた。

精製の結果を表１に要約する。第２ＲＰ−８カラムに対
する培地な市いて出発する全体の＠鯛は６０．０００〜
ｓ　ｏ、　ｏ　ｏ　ｏ倍であった。工程１からジオール
工程を通じた累積収皐は５０〜５０％の範囲であ−）だ
。この工程を越えると、インターフェロンの３つのピー
クの各々は別々に精製した。

Ｅ、ボリアクリルアミドゲルの峨気泳動インターフェロ
ンの試料（ｔ５ｘ１０ｉ単位）をＮａＤｏｄ８０４およ
び２−メルカプトエタノール中で培愛し、次いでスラブ
・ゲル（ｓｌｍｂ　ｇ＠υに加えた。噸気泳拗後、単一
の鋺い帯がクーマツシー・ブルー（Ｏｏｏｒｘｒ畠ｍｍ
１ｍ　ｂｌｓ＋・）を用いて出発すると得られた。見掛
けの分子量は橡準のタンパク質と比較して１７；５００
と推定された。次いでゲルを１鵡の薄片に切った。各薄
片を０．４−の０．５　ＭのＮａＨＯＯ３／　ｃＬ１％
のＮａＩ）ｏｄ８０４中で均質化し、そしてインターフ
ェロンの活性について評価した。

抗９イルス活性の単一ピークが得られ、これ線皐−のタ
ンパク質の帯と一致した。活性の他のビークは＠測され
なかった。

均憤な人の白血球のインター７エロ／（ビークγ）のア
ミノ酸分析を、フルオレスカミン（ｆ　ｌｕｏｒｅｍｃ
ａｍｉｎｅ）のアミノ酸分析器で、０５〜１μｙの生来
の（ｎａｔｉｖｅ）インターフェロンおよびＳ−カルボ
キシメチル化したインターフェロンの試料について実施
した。システィン／シスチ／の比を測定するため、生来
のインターフェロンをカルボキシメチル化し、次いで６
ＭのＨＣｌ中で退元条件（α１％のチオグリコール＃１
）のもとで加水分解した。これらの条件下で、システィ
ンはＳ−カルボキシメチル化システィンとして測定きれ
。

これに対しシスチンは遊離のシスティンとして測定され
る。アミノ酸の分析値を表２中に要約する。

アミノ酸含量に基づく比活性を表２に要約する。

アミノ酸含瀘に基づく比活性は２〜４Ｘ１０’単位／ｗ
Ｉ９であることがわかった。

表　　　２ ムｓｘ　　　　　　　　１５．２士１２Ｔ　ｈ　ｒ　’
　　　　　　　　７．５土０５８・ｒ辛　　　　　　　
＆０土０５ Ｇｌｘ　　　　　　　　２４０士α６ Ｐｒｏ　　　　　　　　１５士α５ ＧＩＦ　　　　　　　　　　　　　ＦＬ５１　　α５Ａ
１ｍ　　　　　　　　＆２士α２ ０７ｓ（合計）　　　　　五３十０．７１／２シスチン
＋　　　　１８土α２ システイン＋　　　　　１５士（１５ Ｖａｌ　　　　　　　　　７．ａ±［１２Ｍ・ｔ　　　
　　　　五９土α２ ＩＩ＠　　　　　　　　ＦＬ９±［１４Ｌ＠１１　　　
　　　　２１Ｂ土１３ Ｔｙｒ　　　　　　　　５．ｌ±０２ Ｐ　ｈ　＠　　　　　　　　９．１±０６Ｈｉｓ　　　
　　　　　　１ｓ土０４ Ｌｙａ　　　　　　　　１１６士０５ Ａｒｇ　　　　　　　　１５士０５ Ｔｒ　ｐ　＋　＋　　　　　　　ｎ　ｙ±［１１米　時
間０に補正した。

劃　生米のインターフェロンのカルボキシメチル化倣Ｉ
／ｃ＃ｌ定した。

４−＋　　６モルのＨｏｔ／４％のチ蒼グリコール酸中
の加水分解後に＃ｌ定した。

ｆ ロイコ７オレシス（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒ＊ｓｉｍ）によ
る白血病の患者（慢性の骨髄性の白血病、ＯＭＬ）の血
液から単離した人の白血球を、カゼイン含有曲清不含培
地中でニューカッスル病ウィルスで培誉することによっ
てインター７エ四ンを製造した＝５、０００〜４０．０
００牢位／−のインターフェロンの力価が普通の試験で
得られた。

精製操作は正常の血゛液（実施例１）からのインターフ
ェロンについて記載したものと同一であり、そしてトリ
トンＸ−１００の存在下の０．５Ｍ（Ｄ酢酸による沈殿
、４Ｍの尿素中のセファデックス【１−１００を用いる
ゲルｐ過、ｐＨ７，５におけるリクロソルプＢＰ−８を
用いるＨＰＬＯ、リクロソルプ・ジオールを柑いるＨＰ
ＬＱおよびｐ　Ｈ４，０におけるリクロソルプＢＰ−８
を用いるＨＰＬ（３を包含していた。

リクロソルブ・ジオールのカラムからのα−１β−およ
びｒ−ピークからなるフラクションを別々に集め、そし
て継続する工程で１幽々に精製した。

７ラクシヨン４５−４６（α−ピーク）を集め、ｎ−プ
ロノぐノールを等体積のｎ−ヘキサンで２回抽出するこ
とによって除去しだ。微量のヘキサンを窒素流のもとで
除去した。ピリジンとギ酸をそれぞれ１Ｍと２Ｍの最終
１１１Ｆｊ［加え、この溶液をＩＭのピリジン／２Ｍの
ギ酸（ｐＨ４，０）で前もって手鞠化したりクロソルプ
ＲＰ−８カラム（１０μ、４．６　Ｘ　２５０畦）Ｋ通
し、このカラムを１Ｍのピリジンホルメート緩絢液中で
直線の２０〜４０％（Ｖ　／　Ｖ　）　ｎ−１０パ／−
ルの勾配で３時間以内に（１２ｓｄ／分の流速で溶離し
た。０６−の７ラクシヨンを集めた１、インターフェロ
ンの活性を５１〜５５％（Ｖ　／　Ｖ　）　ａ−プロパ
ツールの範囲の広いピークとして溶離した。これらのフ
ラクションを合わせ、同一条件下に再クロマトグラフ処
理した。インター７エ四ンの活性は３１％および５２％
（Ｖ　／　Ｖ　）　ｎ−プロパツールにおい工２つの主
ピーク（α１およびα、）中に溶出された。

少１の成分は３４％（Ｖ　／　Ｖ　）　ｎ−プロパツ−
ルにより溶出された。

リクロソルプ・ジオールのカラムからの７ラクシヨン４
７〜５０（ビークβ）を集め、ビークαについて前述し
たように処理し、リクロソルプＲＰ−８でクロマトグラ
フ処理した。インター７エ四ンの活性は２つの主ピーク
＝３２％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパツールにおいてβ茸およ
び３４％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパツールにおいてβ１中に
溶出された。

この場合、再クロマトグラフ処理は不必要であった。い
くつかの製造において、３１％（Ｖ／Ｖ　）ｎ−プロパ
ツールで溶出されるβ１と表示する夏ピークが一醐され
た。

リクロソルブ・ジオールのカラムからの７ラクシヨン５
２−５４（ピークｒ）を崇め、そしてビークａについて
前述したように処理し、リクロソルプＲＰ−８でクロマ
トグラフ処理した。インターフェロン活性は５つの主ピ
ーク、すなわち二γ１（３１％ｎ−プロパツール、Ｖ／
Ｖ）、ｒ＊（３２％ｎ−プロノぐノール、ｖ／ｖ　）、
ｒｓｃ　５４％、ｎ−プロパノール、ｖ　／　ｖ　）　
、γ４（５５％れ−プロパノール、Ｖ　／　Ｖ　）およ
び７ｓ（３５，５％ｎ−プロパツール、Ｖ／Ｖ）中に溶
出された。この場合、再クロマトグラフ処理は不必装で
あった。

インターフェロンの個々の楠を生成するための＠製の結
果を表３に要約する。

掩α雪およびβ冨はリクロソルプ・ジオールのカラムの
溶出特性によってさらに区別される：αは６８％（Ｖ／
Ｖ）ｎ−プロノζノールで、−ｔ−Ｌテβ鵞は６６５％
（Ｖ　／　Ｖ　）　ｎ−プロノぐノールで、それぞれ溶
出される。

インターフェロンの種の試料（１５ｘ１（Ｉｓ単位）を
Ｎａ１）ｏｄ８０４および２−メルカプトエタノール中
で培誉し、次いでスラブ・ゲルに加えた。−気泳拗鐘、
ビークα１１α２、β３、β１、β２およびγ。

は単一の帯を与えたが、ビークβ１、β３およびγ。

は２つの帯を与えた。見掛けの分子量はすべて１４００
０〜１８，０００の範囲に入るが、ただしβ１は１６，
５００と２１，０００の帯を与え、そしてβ４は２ｔ０
００の帯を与えた（表４参照）。

精鯛した人の白血球のインター７エロ／のフラクション
の°ｆミノ酸分析は、フルオレスカミン（ｆ　ｌｕｏｒ
ｅｓｃａｍｉｎｅ）アミノ酸分析器を用い［１５〜１μ
夕のインターフェロンの試料について実施した。加水分
解を６ＮＯＨＯ１中で還元条件（０１％のチオグリコー
ル酸）下に行った。分析の結果を表５に要約する。

精製した人の白血球のインターフェロンのいろいろな樟
（３００ピコモル、６μｙ）を皇炭酸ナトリウムの水ｆ
ｇＰ＆（５０ｍＭ、ｐＨ８，５，５０μｌ）中に溶かし
た。トリプシン（２μｌのＭｏｌ、ｐＨ３、中の０１μ
ｇ）を加え、この混合物を５７℃で１４時間培資した。

酢酸（５μりを加え、この混合物をリクロソルプＲＰ−
８カラム（１０μ〕粒貫、４．６　Ｘ　２５０　＋＋ｎ
　）に通した。二のカラムをα５．−７分において１峙
間α１Ｍのギ酸１００３ＭのピリジンＮｉ絢液（ｐＩ（
５）中で０〜４０％（ｖ　／　ｖ　）　ｎ−プロパツー
ルの直線の勾配を用いて溶層した。ペプチドをフルオレ
スカミン監視系により検知した。結果は表６に記載され
ており、ソシテ％ｎ−プロノぐノールおよびピークの相
対大きさくＳ＝小、Ｍ＝中、Ｌ＝大）で表わされている
。

表　　　６ ａ、　　５Ｉ；、４Ｌ、４．２Ｍ、　　１ｔｓｍ、１２
．５Ｓ、１４５Ｍ。

−１６８，１８Ｍ、　２０８．２１８．２２．５Ｓ、　
２９Ｍα、　ＳＬ、　４Ｌ、　４．２Ｍ、　１１５Ｍ、
　１２．５Ｓ、　１４５Ｍ。

１６８、１８Ｍ、　２７８．２９Ｍ β、　　ＳＬ、　　４Ｌ、　　４．２Ｍ、　　１１５Ｍ
、　　１２．５８．　１４．５Ｍ。

１（５８，１７５８，１８Ｍ、　２９Ｍβ３３Ｌ、　４
Ｌ、　４．２Ｍ、　４．５８．　１０Ｍ、　　１２．５
８゜１４８、　１４．５Ｍ、　　１６Ｂ、　　１８Ｌ、
　　１９．５Ｍ、　　２７Ｍ。

２Ｍ ｒ、　　３Ｌ、　　４Ｌ、　　４．２Ｍ、　　４．５Ｂ
、　　５８．　　ＡＳＳ、　　１１５８゜１２．５８．
１４．５Ｍ、　１６Ｂ、　１７．５Ｍ、　１８Ｍ、２９
Ｍｙｌ　３Ｌ、　４Ｌ、　４．２Ｍ、　４５８．５８．
１１５８゜１２．５８．１４．５８．１６８．１８１．
２９Ｍ表　６（つづき） ｒｓ　　３Ｍ、４Ｍ、４．２Ｍ、１１５Ｍ、１２．５８
，１ｉ５８゜１４．５Ｍ、　１６８．１８Ｌ、　２０８
．５２Ｍγ、　　ＳＬ、　４Ｌ、　４．２Ｍ、　４．５
Ｍ、　７８．７．５８．１０８゜１　ｔ５Ｌ、　１２．
５８．１４８．１４．５Ｍ、　１６８゜１８Ｌ、２４．
５８，２５．５８，３２８精製した人の白血球のインタ
ーフェロンの柚を、アミノ糖を５０〜１００ビフモルの
レベルで同定。

できるアミノ糖分析に付した。すべての場合において、
グルコースアミンおよびガラクトース／マンノースアミ
ンは１残基／分子より小であった。

はとんどの場合において、アミノ軸に近接して浴出され
たある数の小さな４ブチｒはこの分析を妨害した。こう
して、アミノ糖に割当てられるピークであってさえ４プ
チドの性質の少なくとも一部をもつことがある。

最後に、逆側水分解（ｂａｃｋ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
）およびフルオレスカミンを用いるアミノ酸分析を含ム
エドマン（Ｅｄｍａｎ）法により１＋１モルの純粋なγ
２インターフェロンを序列する試みは、サイクル１およ
び２についてアミノ酸を与えなかった。１００ヒコモル
の純粋なｒ３の人の白血球のインターフェロンを口・ｆ
ンシンアミノＲブチダーゼおよびアミノペプチダーゼＭ
で３７℃で２０時間処理したが、生物学的活性は影響を
受けず、そしてアミノ酸は培地中に検出されなかった。

培地の上層（ｆｉ小必情培地中の白°血球およびニュー
カッスル病ウィルス）をアミノペプチダーゼで処理する
とき、インターフェロンの活性の損失は観測されなかっ
た。

このことはインターフェロン分子は精製的にさえブロッ
クされたＮＨ，末端を有することを示す。対焦として粗
製インター７エロ／ならびに純粋なインターフェロンお
よびインシュリンのβ−鎖をアミノペプチダーゼ証と一
緒に培養した。インシュリンはアミノ酸の放出によって
わかるように部分的に消化されたが、インターフェロン
の活性の損失は嵯副されなかった。

実施例　３ 実施ｔｙ１１１の操作と同様にして、集めた牛の白血球
を＊ｍＬ、誘導して牛のイアター７エロンを生成させ、
そして生じた牛のインターフェロ／を均質なタンノぐり
質の明確な種の形に均質に精製する。

実施例　４ 実施例１の操作と同様にして、集めた豚の自由１球を準
備し、誘導して豚のインター７エＵノを生成させ、そし
て生じた豚のインターフェロ／妃均質なタンノぐり質の
明確な種の形に均質に積装する。

実施例　５ 実施例１の操作と同様にして、集めた羊の白血球をＰ＄
偏し、誘導し１手のインターフェロンを生成させ、そし
て生じた洋のインターフェロンを均質なタンノぐり質の
明確な神の形に均質にＭ製する。

実施例　６ 実施例１の操作と同様にして、集めた鵬の白血球を＃−
偏し、誘導して鳥のインター７エロノを生成させ、そし
て生じた馬のインターフェロンを均質なタンパク實の明
確な柚の形に均ｆｉＭＫ輌鯛する。

実施例　７ ４３１例１の操作と同様にして、集めた犬の白血球を準
備し、誘導して犬のインターフェロンを生成させ、そし
て生じた犬のインターフェロンを均質なタンパク質の明
確な楠の形に均質ＫＭ製する。

実施例　８ 実施例１の操作と同様にして、集めたネコの白血球を準
備し、誘導してネコのインターフェロンを生成させ、そ
して生じたネコのインターフェロンを均質なタンパク質
の明確な麺の形に均質に精製する。

実施例　９ 実施例１の操作と同様にして、集めた霊長類の白血球を
準備し、誘導して霊長類のインターフェロンを生成させ
、そして生じたＩ長類のインター７エロ７を均質なタン
パク質の明確な檜の形に均質に精製する。

実施例　１０ （ａ）　　２　Ｘ　１０”単位／ｑの比活性をもつ均質
な人の白血球のインターフェロンの合計で３■を、５％
の正常な人の＠清アルブミンの２５−中に溶かした。こ
の溶液を細菌学的フィルターに通し、ト屯した溶液を無
菌的に１００個の小びんに分割し工人れた。各小びんは
、非経口投与Ｋｍした６Ｘ１０６皐位の純粋なインター
フェロンを含有した。

小びんは使用耐冷ｄ（−２０℃）することが好ましい。

（ｂＪ　　各々がほぼ自然に得られる比率で存在する、
ｔ５ｑの集めた均質なインターフェロンの檜α１、α寞
、β２、γ凰およびγ冨を含有し、この貯威した混合物
が約２Ｘ１０ａ単位／ｓ９の比活性を有し、そしてさら
に１０Ｏｑの人血清、アルブミンを含有する水爾欣をｍ
菌学的フィルターに通し、そしてトーした＃Ｉ液を無菌
的に１００個の小びんに分割して入れた。各小びんは約
５×１０６単位の純粋な集めたインターフェロンと１■
の人血清アルブミンを含有するであろう。非経口投与４
ＣＡしたインターフェロンを含有する小びんは使用Ｍｉ
ｌ〜蔵（−２０℃）することが好ましい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　均質なタンｄり質としてのインター７エロ／。 ２−　人のインターフェロンである特許請求の＃ｉ−第
   １項記載の均質なインター７エｐン。 五　白血球のインターフェロンである特許請求の範囲第
   ２項記載の均質な人のインターフェロン４（ａ）　　１
   ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩絢水溶液中□の３１％Ｏｎ
   −プロパツール（０〜４０％の勾配）の一度においてオ
   クチル結合シリカマトリックスＨＰＬＯ４，６Ｘ２５０
   ■のカラムから室温およびａ２−７分の流速で単一のピ
   ークとして溶離され； （ｂ）　　ロイシンアミノイプチダーゼおよびアミノイ
   プチグーゼとを用いる処理による非活性化に対して抵抗
   性であり； （ｃ）トリプシンで処理したときにベデチｒ・７ラグメ
   ントを与え、該７ラグメントは反応媒体をオクチル結合
   シリカマトリックスＨＰＬＯ４，，６Ｘ２５０ａカラム
   （１０μの粒度）に室温において（ＬＯＡＮのピリジン
   ／　ａ　１ｗ　ｔＤ　’ｆ　Ｊｋｌｌｌ　１１１Ｆ水溶
   液（ｐＨ３）を用いａ５ｓＪ／分のｔＩＩｔ速［テＯ〜
   ４０％ｆ）　ｎ　−７’ロｄノールの勾配で通過させた
   とき、５、　４．　４．２．　１１５．　１２．５，１
   ｊＬ５．　　ｌｄ。 １８．２０，２１，２１５および２９％Ｏｎ−プロア９
   ノールにおいてピークとして溶離される：均質なタンメ
   ク質で＆ｉＪ、 （ｄ）　　フロックされたアミノ末端；（＠）　　Ｍ　
   Ｄ　Ｂ　Ｋ　（牛）細胞）ニツイテ約２．６Ｘ１０”単
   位／ｑの比活性； ｌｆｌ　　Ａｇ　１７　Ｓ　２　（人系統（ｈｕｍａｎ
   　ｌｉｎ＠））細胞について約２−４ｘ１０ｓ単位／■
   の比活性；（ｇ）　　ｇリアクリルアミドゲルの電気泳
   動による約１へ５００士１０００の分子量； （ｈ）１残基／分子よりも小さいアミノ糖分；（１１ｍ
   性の生長阻止活性；および （ｊ）　　次のアミノ酸組成（±１５％、分子１１１ｔ
   ｈｏ。 に基づく）： Ａ１１　１５Ｌ８　　　ム１ｍ　　１１４　　　Ｐｈ＠
   ６９Ｔｈｒ　　７．７　　　Ｖａｌ　　２４　　　Ｈｌ
   ｓ　　１０８ｅｒ　　９．２　　　ＭＩｔ　　３７　　
   　Ｌｙｅ　　１α５Ｇｌｘ　　２ａ５　　　ＭＩｔ　　
   ２４　　　ムｒｇ　　＆２Ｐｒｏ　　６１　　　Ｌ＠ａ
   　　１ａ、ＯＯｙｓ　　１９Ｇｌｙ　　５．１　　　’
   Ｉ’ｙｒ　　４０を特徴とするα１と標示される人の白
   血球のインターフェロンの橋。 ５、（ａ）ＩＭのビリジンン２Ｍのギ酸ｌｌ−水溶液中
   の３２％のｎ−プロノぐノール（０〜４０％の勾配）の
   濃ｔｆにおいてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬ
   Ｏ４，６Ｘ２５０ｍのカラムから室温およびα２−７分
   の流通で単一のピークとして溶離され； （ｂ）　　ロイシンアミノ４ブチダーゼおよびアミノペ
   プチダーゼＶを用いる処理による非活性化に対して抵抗
   性であり； （ｃ（トリプシンを用いて処理したときＫぜブチｒ・フ
   ラグメントを与え、該７ラグメントは反応媒体をオクチ
   ル結合シリカマトリックスＨＰ　Ｌ　Ｏ４，６×２５０
   ■カラム（１０μの粒度）Ｋ室温において、１０３Ｍの
   ピリジン／α１Ｍのギ酸緩嬌水溶液（ｐＨ３）を用いＱ
   、５ｓｊ／分の流速にて０〜４０うのｎ−プロパツール
   の勾配で通過させたとき、３、　４．　４２．　１１５
   ．　１２．５．　１４５．　１６゜１８．２７および２
   ９％のｎ−プロノぐノールにおいてピークとして＃＠さ
   れ； （ｄ）　　α１Ｍの酢酸ナトリウムａｍ水溶液中の６８
   ％（Ｄｎ−プロノぐノール（７２５〜５０％〕勾配）の
   ｍｉにおいてグリセロール結合シリカマトリックスＨＰ
   ＬＯ４，６Ｘ２５０■のカラムから室温およびｏ、ｚｓ
   ｄ／分の流速で単一のピークとして溶離される； 均質なタンパク質であり、 （・）　ブロックされたアミノ末端； ｉｆ）　　Ｍ　Ｄ　Ｂ　Ｋ　（牛の細胞）Ｋついて約４
   ．０Ｘ１０＠単位／１ｌ１９の比活性； （ｇ）Ａｇ１７５２（人系統）細胞について約５×１０
   １単位／岬の比活性； （ｈ）　　ｔ”リアクリルアミドゲルの電気泳動による
   約１６．２００士へ０００の分子量； ０）１残基／分子よりも小さいアミノ糖分；（ｊｌ　　
   −性の生長阻止活性：および（ｋ）　　次のアミノ酸組
   成（±１５％、分子量１４２００に基づく）： Ａｓｘ　　１１７　　　　　ム１ｍ　　　ａＪ　　　　
   Ｐｈｓ　　　＆、０Ｔｈｒ　　　ａＳ　　　　　Ｖａｌ
   　　　６２　　　　Ｈｌｍ　　　２．８８＊ｒ　　１α
   ＯＭＩｔ　　　１８　　　　Ｌｙｅ　　　９０Ｇｌｘ　
   　２［Ｌ５　　　　　ＭＩｔ　　　７．０　　　　ムｒ
   ｇ　　　７．ＩＰｒｏ　　　４．９　　　　　Ｌ＠ａ　
   　　１＆ＯＯｙａ　　　４．０Ｇｌｙ　　　４．５　　
   　　　Ｔｙｒ　　　４４を特徴とする町と標示される人
   の白血球のインターフェロンの種。 ＆（ａ）　　１Ｍのピリジン／　２　Ｍのギ酸緩衛水溶
   液中の３２％のｎ−プロツマノーＡ／（０〜４０％の勾
   配）の濃度においてオクチル結合シリカマトリツｐｘＨ
   ＰＬＯ４，６ｘ２５０■のカラムから室温およびα２−
   ７分の流速で単一のピークとして溶離され； （ｂ）　　ロイシンアミノ４ブチダーゼおよびアミノペ
   プチダーゼＶを用いる処理による非活性化に対して抵抗
   性であり； （ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
   ラグメントを与え、該７ラグメントは反応媒体をオクチ
   ル結合シリカマトリックスＨＰ　Ｌ　０４．６×２５０
   鰭カラム（１０声の粒度）に室温において、ＩｌｌＬ０
   ３Ｍのピリジン／α１Ｍのギ酸緩衛水溶液（ｐＨ５）を
   用いａ５−７分の流速にて０〜４０％のｎ−プロパツー
   ルの勾配で通過させたとき、３、　４．　４．２．　１
   １５．　１２．５．　１４．５，１５゜１７．５．１８
   および２９％のｎ−プロパツールにおいてピークとして
   溶離され； （ｄ）０．１Ｍの酢酸す）　９ウム緩衛水溶液中の６６
   ５％のｎ−プロパツール（７２，５〜５０％の勾配）の
   濃度においてグリセロール結合シリカマトリックスＨＰ
   ＬＯ４，６Ｘ２５Ｑｗｘのカラムから室温およびＯ，２
   Ｓ−７分の流速で単一のピークとして溶離される； 均質なタンノでり質であり、 （ｅ）　　ブロックされたアミノ末端；（ｆ）ＭＤＩＩ
   Ｋ（牛の細胞）にツいての約ｔｏｘ１０纏単位／ｑの比
   活性： （ｇ）　　ムｇ１７３２（人系統）細胞についての約２
   ×１０ａ単位／ＩＩ＋９の比活性； （ｈ）　　ポリアクリルアミドゲルの４Ｅ気泳動による
   約１６．５００士嶌０ｏ０の分子量； （ｉ）１ｆｉ基／分子よりも小さいアミノ着分；（ｊ）
   　　腸性の生長阻止活性；および（ｋ）　　次の７七ノ
   ＃組成（±１５％、ｆｆｌ　１６．０００＃＜）：ムａ
   ｘ　　１１５　　　ムｌａ　　２９　　Ｐｈ＊　　１Ｌ
   ７Ｔｈｒ　　９．ＯＶａｌ　　４７　　■ｌ−五〇Ｂｅ
   ｔ　　　１［ＬＯＭｅｔ　　　　４４　　　　Ｌｙｅ　
   　　　８．５０１！　　２１９　　　Ｉｆ＠　　Ｚ４　
   　ムｒｇ　　ａｎＰｒｏ　　５．０　　　Ｌ＠ｗ　　１
   ８．９　０ｙｓ　　１８ＧＩＦ　　五〇　　　”ｌ’ｙ
   ｒ　　４．６を特徴とするβ３と標示される人の白血球
   のインターフェロンの橋。 Ｚ（ａ）ｔＭのピリジン／　２　ｈｉのギ酸緩衛水溶液
   中の３２％のｎ−プロ２ノール（０〜４０％の勾配）の
   ｆｌＨＩにおいてオクチル結合シリカマトリックスＨＰ
   ＬＯ４，６Ｘ２５０簡のカラムから室温およびａ２ｄ／
   分の流速で単一のピークとして溶離され； （ｂ）　　ロイシンアミ７Ｒブチダーゼおよびアミノぜ
   ブチダーゼＭを巾いる処理による非活性化に対して抵抗
   性であり： （ｃ）トリプシンを用いて処理したときＫ＜プチド・７
   ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
   ル結合シリカマトリックスＨＰＬＯＬ６Ｘ２５０ｉｏ＋
   カラム（１０μの粒度）Ｋ室温において、００３Ｍのピ
   リジン／１１１Ｍのギ酸緩衛水溶液（ｐＨ３）を用いａ
   ５−７分の流速にて０〜４０％ｆ）　ｎ　−７’ロバノ
   ールの勾配で通過させたとき、３．４，４．２，４５，
   １０，１２．５，１４，１４５゜１６．１８，１９５．
   ２７および３２％のｎ−プロノぐノールにおいてピーク
   として溶離される；均質なタンパク質であり、 （ｄ）　　フロックされたアミノ末端；（・）ＭＩ）１
   １Ｋ（牛の細胞）についての約４０×１０Ｉ単位／ｑの
   比活性； げ）Ａｇ１７５２（人系統）細胞についての約３ｘ１ｏ
   ａ単位／１１９の比活性； （ｇ１／リアクリルア之ドゲルの電気泳動による約２１
   ０００±ｔｏｏｏの分子量； （ｈ）１残基／分子よりも小さいアミノ穂分；０）陽性
   の生長阻止活性；および （ｊ）　　次のアミノ＃組成： ムｓｘ　　　１ａ２　　　　　ムｌａ　　　１１５　　
   　　　Ｐｈ＠　　　９．９Ｔｈｒ　　　９．９　　　Ｖ
   ａｌ　　　７５　　　Ｈｌｓ　　　＆８８ｓｒ　　１４
   ．５　　　Ｍｅｔ　　　４０　　　Ｌｙｅ　　　９．５
   Ｇｌｘ　　２ａ、５　　　ＩＩｓ　　　９５　　　Ａｒ
   ｇ　　１α８Ｐｒｏ　　　Ｓ、？　　　ＬａＩ３　２４
   ．４　　０ｙｓ　　　２．３を特徴とするβ、と標示さ
   れる人の白血球のインターフェロンの種。 ＆（ａ）ｔＵのピリジン７２Ｍのギ酸緩絢水溶液中の３
   １％のロープロア９ノール（０〜４０％の勾配）の＃度
   においてオクチル結合゛シリカマトリックスＨＰＬＯ４
   ，６Ｘ２５０■のカラムから室温および［１２−７分の
   流速で単一のピークとして溶蟻され； （ｂ）　　ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノイ
   プチダーゼｙを用いる処理による非活性化に対して抵抗
   性であり； （ｃ）トリプシンを用いて処理したときにぜプチド・フ
   ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
   ル結合シリカマトリックスＨＰＬＯ４，６Ｘ２５０■カ
   ラム（１０μの粒度）Ｋ室′ＩＡにおいて、α０３Ｍの
   ピリジン／Ｑ、ＩＭのギ峻＊両水溶液（ｐＨ３）を用い
   α５−７分の流速くて０〜４０％のｎ−プロア９ノール
   の勾配で通過させたと彦、５、　４．　４．２．　４．
   ５．　５．　６．５．　　Ｉ　Ｌ５．　１２．５゜１４
   ５．１６．１７．５．１８および２９％のｎ−プ四パノ
   ールにおいてピークとして溶離される；均質なタンノぐ
   り質であり、 （ｄ）　　ブロックされたアミノ末端；（・）　　ＭＤ
   ＢＫ（牛の細胞）についての約２．６×１０畠単位／■
   の比活性； （ｆ）　　ムｇ１７５２（人系統）細胞についての約２
   Ｘ１０’４１位／■の比活性： （−ぎりアクリルア之ドゲルの電気泳動による約１７、
   ７００±ｔｏｏｏの分子量； （ｈ）　　を残基／分子よりも小さいアミノ糖分；（１
   ）　　陽性の生長＠比活性；および（ｊ）　　次のアミ
   ノ酸輯成（±１５％、分子量１７，０００に基づく）： Ａｍｘ　　　１１１　　　　　ムｌａ　　　　ｌＬ７　
   　　　Ｐｋｅ　　　　　＆６Ｔｈｒ　　　　ａ４　　　
   　　Ｖａｌ　　　　７．５　　　　ＨＩｓ　　　　　１
   ７８ｅｒ　　１［１２Ｍ＠ｔ　　　４４　　　Ｌｙｓ　
   　　ＩＣＬＩＧｌｘ　　２五９　　　　ＩＩ＠　　Ｚ？
   　　　Ａｒｇ　　　　ａＯＰｒｏ　　　４．５　　　　
   Ｌ＠ｕ　　２α５　　０ｙｓ　　　　５５を特徴とする
   γ１と標示される人の白血球のインターフェロンの種。 ９（ａ）ＩＭのピリジン７２　Ｍのギ峻緩術水溶液中の
   ３２％のや一プロパツール、（０〜４０％）勾配）の濃
   度においてオクチル結合シリカマトリツ、クス４．６　
   Ｘ　２５０簡のカラムから室温およびａ２−７分の流速
   で単一のピークとして溶離され；（ｂ）　　ロイシンア
   ミノペプチダーゼおよびアミノイプチダーゼＭを用いる
   処理による非活性化に対して抵抗性であり； （Ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
   ラグメンＦを与え、該フラグメジＦは反応媒体をオクチ
   ル結合シリカマトリックスＨＰ　Ｌ　０４．６Ｘ２’５
   ０ｔｍカラム（１０μの粒度）Ｋ室温において、α０３
   Ｍのピリジン／　ａ　Ｉ　Ｍのギ峻緩四水溶液（ｐＨ３
   ）を用いａ５−７分の流速にて０〜４０％のｎ−プルパ
   ノールの勾配で通過させたとき、５、　４．　４．２．
   　４．５．　５．　１　ｔ　５．　１２．５．　１４．
   ５＊１（Ｓ、１８および２９％のｎ−プロアぐノールに
   おいてピークとして溶離される： 均質なタンパク質であり、 （ａ）　　ブリックされたアミノ末端；（・）ＭＤＩＩ
   Ｋ（牛の細胞）についての約４．０×１０”巣位／ｍ９
   の比活性； （ｆ）　　ムｇ１７ｓ２（人系統）細胞についての約２
   Ｘ１０’４１／ｗｑの比活性： （ｇ）／リアクリルア之ｒゲルの電気泳動による約１７
   ７００±１．ＯＤＤの分子量； （ｂ）ｌｆｉ基／分子よりも小さいアミノ塘分；（１陽
   性の生長阻止活性；および （ｊ）　　次のアミノ酸組成（±１５％、分子量１７，
   ７００に基づく）： ムａｘ　　　１１３　　　　　　ムｌａ　　　　＆Ｉ　
   　　　　　Ｐｋ＠　　　　１０Ｔｈｒ　　　９６　　　
   Ｖａｌ　　　２０　　　Ｈｌｓ　　　五５Ｂａｒ　　　
   ２８　　　Ｍ＠ｔ　　１９　　　Ｌｙｓ　　１α０Ｇｌ
   ｘ　　２！ａｎ°　　ＩＩ＠　　　＆０　　　ムｒｇ　
   　ａｓＰｒｏ　　４．８　　　ＬＩＭ　　２α１　　０
   １ｍ　　　２．９Ｇｌｙ　　５．０　　　Ｔｙｒ　　４
   ．８を特徴とするｒ３と標示される人の白血球のインタ
   ーフェレンの種。 １α　（ａ）ＩＭのピリジン７２Ｍのギ鍍緩彎水溶液中
   の３４％の１−プロパノール（０〜４０％の勾配）の濃
   度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬＯ４
   ，６Ｘ２５０■のカラムから室温およびｃＬ２ｄ１分の
   流速で一一のピークとして溶離される； （ｂ）　　ロイシンアミノイブチダーゼおよびアミノペ
   プチダーゼ輩を用いる処理による非活性化に対して抵抗
   性であり； （ｃ）トリプシンを用いて処理したときに４ブチｒ・７
   ラグメントを与え、ＩＥｆ７ラグメントは反応媒体をオ
   クチル結合シリカマトリックスＨＰＬＯ４ｄｘ２５０諺
   カラム（１０μの粒度）に室温において、ａ０３Ｍのピ
   リジン／（ＬＩＭのギ鹸緩絢水溶液（ｐＨ３）を用いａ
   ５−７分のｔＩＩＬ速にて０〜４０％のａ−プロ２ノー
   ルの勾配で通過させたとき、５、　４．　４２．　　Ｉ
   　Ｌ５．　１２．５．　１　＆５．　１４．５゜１４．
   １８．２０および３２％のｎ−プロノぐノールにおいて
   ピークとして溶離される； 均質なタンパク質であり、 （ｄ）　　ブロックされたアミノ末端：（・）ＭＤＢＫ
   （牛の細胞）Ｋついての約４５×１０”単位／ｗｅの比
   活性； （ｒ）　　ムｇ１７５２（人系統）細胞についての約１
   ５Ｘ１０１単位／ｑの比活性； （１）ぎりアクリルアミｒゲルの電気泳動による約１７
   、２００士１０００の分子量； （ｈ）１桟基／分子よ番）も小さいアミノ糖分；（１）
   陽性の生長阻止活性；および １）　　次のアミノ酸組成 ム−１１５，０ム１ｍ　　　　１３　　　　　Ｐｈ＠７
   ．２Ｔｈｒ　　ａＪ　　　Ｖａｌ　　　ａ５　　　Ｈｌ
   ｍ　　２．９Ｂ＠ｒ　　１α１Ｍ＠ｔ　　５６　　　Ｌ
   ｙｅ　　７．６Ｇｌｘ　　２２．８　　　ＩＩｓ’−４
   ８ムｒｇ　　１［ＬＩＰｒｏ　　４８　　　ＬＩＭ　　
   ２Ｉ１５　−　　Ｏｙｓ　　　＆ＩＧｌｙ　　１２　　
   　Ｔｙｒ　　五７ を特徴とするｒｓと標示される人の白血球のインター７
   エ゛ｐンの檜。 Ｉｔ（ａ）ＩＭのピリジン／　２　Ｍのギ酸緩絢水溶液
   中の３５％のａ−プロ２ノール（０〜４０％の勾配）の
   濃度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬＯ
   ４６Ｘ２５０ｍのカラムから室温およびα２−７分の流
   速で単一のピークとして溶離され； （ｂ）　　ロイ９２フ文ノイプチダーゼおよびアミノペ
   プチダーゼ輩を用いる処理による非活性化に対して抵抗
   性である； 均質なタンパク質であり、 （ｅ）　　ブロックされたア虐ノ末端；（ｄ）ＭＤＢＫ
   （牛の細胞）ｋついての約１５Ｘ１０口単位／ｗＩｇの
   比活性； （・）　ムｇ１７３２（人系統）細胞についての約ｔＯ
   Ｘ１０・単位／岬の比活性； （ｆ）／リアクリルアミドゲルの電気泳動による約２１
   ．０００士１０００の分子量； （ｇ）１８基／分子よりも小さいアミノ−分；（ｋ）　
   　−性の生長阻止活性；および（ｉ）　　次のアミノ酸
   組成（±１５％、分子量２１０００に基づく）： ム＠ｘ　　１７．９　　　ムｌａ　　１α４　　　Ｐｈ
   ＠９．１Ｔｈｒ　　　７．３　　　Ｖａｌ　　　７．９
   　　　Ｈｌｓ　　５８Ｂａｒ　　ＩＭ５　　　Ｍ＠ｔ　
   　４９　　　Ｌｙｓ　　１！２Ｇｌｘ　　２７．ＯＩＩ
   ＠　　９．７　　　Ａｒｇ　　＆５Ｐｒｏ　　　　６．
   Ｓ　　　　　Ｌ＠ｕ　　　２４．１　　　　　０ｙｓ　
   　　　４１Ｇｌｙ　　４．８　　　Ｔｙｒ　　５．０を
   特徴とするγ４と標示される人の白血球のインターフェ
   ロンの種。 １２（ａ）ＩＭのピリジン／　２　Ｍのギ酸緩−水溶液
   中の３５．５％のｎ−プロパツール（０〜４０％の勾配
   ）の濃度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰ
   ＬＯ４，ｄＸ２５０ｍのカラムから室温およびα２−７
   分の流通で単一のピークとして溶−され； （ｂ）　　ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノイ
   プチダーゼｙを用いる処理による非活性化に対して抵抗
   性であり： （ｃ）トリプミンを用いて処理したときにぜプチド・フ
   ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
   ル結合シリカマトリックスＨＰ　１０４．６×２５０−
   カラム（１０μの粒度）Ｋ室温において、［１０３Ｍの
   ピリジン／　（Ｌ　Ｉ　Ｍのギ酸緩檎水溶液（ｐｎ３）
   を用いｌ１ｌＬ５−７分の流速にて０〜４０％のｎ　”
   −７’　Ｅｌ　ハノールの勾配で通過させたとき、３、
   　４．　４．２．　４５．　７．　７．５．　１０．　
   １１５゜１２５、　１４．　１４．５．　１６．　　ｊ
   　８．　２４．５，２５．５および５２％の勤−プロパ
   ツールにおいてピークとして＊＊される； 均質なタンパク１１ｅアＩＪ、 （ｄ）　　フロックされたアミノ末端；（・）ＭＤＢＫ
   （牛の細胞）についての約α９×１０畠単位／岬の比活
   性； （ｆ）Ａｇ１７５２（人系統）細胞についての約２×１
   ０Ｓ単位／ｑの比活性； （ｓｒ）　　メリアクリルアミドゲルの電気線画による
   約１６．５００士１０００の分子量； （ｈ）ｌ基／分子よりも小さいアミノ糖分：０）　陽性
   の生長阻止活性；および １）　　次のアミノ＃１を組成 Ａａｘ　　１ｉ８　　　ムｌａ　　　ｔ３Ｐｈ＠６４Ｔ
   ｈｒ　　　７．６　　　Ｖａｌ　　　！ＬＩ　　　Ｈｌ
   ｍ　　　２．８８ｅｒ　　　９．０　　　Ｍ＠ｔ　　４
   ．７　　　Ｌｙｅ　　１２０Ｇｌｚ　　２［Ｌ８　　　
   ＩＩ＠１６　　　ムｒｇ　　ｔ。 Ｐｒｏ　　　４．２　　　Ｌ＠ｕ　　１９．６　　０ｙ
   ｍ　　２．５Ｇｌｙ　　４．ＯＴｙｒ　　　１６ を特徴とするｒｓと標示される人の白血球のインターフ
   ェロンの１ｎ０ １五　製薬学的に活性な化合物としての特許請求の範囲
   第１〜１２項のいずれかに記載の均質なインターフェロ
   ン。 １４　抗ウィルス剤としての特許請求の範囲第１〜１２
   項のいずれかに記載の均質なインターフェロン。 １５、制癌剤としての特許請求の範囲第１〜１２項のい
   ずれかに記載の均質なインターフェロン。 １６　生長阻止剤としての特許請求の範囲ＩＪ１〜１２
   項のいずれかに記載の均質なインター７エシンＱ １１　免疫抑制剤としての特許請求の範囲第１〜１２Ｔ
   ４４のいずれかに記載の均質なインター７エシンク １ａ　約１２．ｏｏｏより大きい分子量を有するタンパ
   ク實を不純な状態で、シアノプロピル、シクロヘキシル
   、フェニル、オクチル、オクタデシルまたはグリセリル
   基が結合した多孔質シリカのマトリックスの緩彎液で平
   衡化したカラムに、高性能液体クロマドグ２フィー（Ｈ
   ＰＬＣ）条ｑ　下ｖｃ遡して護タンノ臂り質′に該カラ
   ム上へ吸収させ、七の後該タ／バク質を増加する勾配ま
   たは減少する勾配の水性の水混和性溶媒で溶離し、そし
   て該タンパク質紫該浴出液の選定フラクション中１Ｃ＾
   純度の状態で得ることを特徴とする約１２．０００より
   大きい分子ｍを有するタンノ譬り質のｎ１鯛方法。 １９、　　約１２，０００より大きい分子ｔｔ−Ｗする
   タンパク質も不純な状態で、オクチルまたはグリセリル
   基が結合した多孔質シリカのマトリックスの緩衝液で平
   衡化したカラムｖｃ、ＨＰＬＣ条件下に通して該タンノ
   ４り質を該カラム上へ吸収させ、その後該タンノ譬り質
   會増加する勾配または減少する勾配の水性の水混合性溶
   媒で浴離し、そして該タンパク質會該溶出液の選定フラ
   クション中ＶＣ高純匿の状態で得る仁と會特徴とする特
   許請求の範囲第１８項記載の約１λ０ＧＧより大きい分
   子ｉｉｉ會有するタン・臂り質の精製方法。 ２、特許請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の均
   質なインターフェロンと非毒性の不活性な治療学的ＶＣ
   適合しうる固体または液体の担体を含有する製薬学的組
   成物。 ２、特許請求の範囲第１〜１２墳のいずれかに記載の均
   質なインターフェロンと非毒性の不活性な治療学的ＶＣ
   適合しうる固体萱たは液体の担体を含有する抗ウィルス
   剤。 ２、特許請求の範囲第１〜１２項のいずれかに６己載の
   均質なインターフェロンと非毒性の不活性な治療学的に
   適合しうる固体または液体の担体を含有する制癌剤。 ２、特許請求の範囲＠１−１２項のいずれかに１賊の均
   質なインターフェロンと非毒性の不活性な治療学８′ｇ
   ｗｃ適合しうる固体または液体の担体を含有する生育阻
   止剤。 ２、特許請求の範囲第１−１２項のいずれかＶＣ配躯の
   均質なインターフェロンと非毒性の不活性な治療学的Ｖ
   Ｃ適台しうる固体または液体の担体會含有する免疫抑制
   剤。 ２、特許請求の範囲第１−１２項のいすｒＬη・ＶＣ内
   己載の均質なインターフェロンの病気の抑制あ・よび予
   防にνける便用。 ２、特許請求の範囲第１−１２Ｊ１のいずれか１（記載
   の均質なインターフェロンのウィルスの感染の抑制およ
   び予防における使用。 ２、特許請求の範囲第１−１！項のいずれかＶＣ呂己載
   の均質なインターフェロンの腫瘍の生長の抑制νよび予
   防ｐｃおける使用。 ２＆　特許請求のａ間第１８又は１９項記載の方法また
   はそれらの自明の化学的に同等の方法ｖＣよって製造さ
   れた均質なインターフェロン。