HU182500B - Process for producing homogenous interone - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya új eljárás homogén interferon előállítására oly modor , hogy 1. vizes interferon-oldatot oktil-csoport okkal módosított szilíciumdioxid-mátrix-alapú, acetátpufferrel (pH=7,5) pufferolt oszlopon gyors folyadékkromatografálásnak vetünk alá, és acetát-puffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — 0%-tól lineárisan emelkedő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk; 2. az előző lépésnél kapott interferon-tartalmú frakciókat gliceril-csopcrtokkal módosított sziliciumdioxid-mátrix-aiapú, acetát-pufferrel (pH=7,5) pufferolt oszlopon gyors folyadékkromatografálásnak vetjük alá, és acetát-puffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — lineárisan csökkenő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk; majd 3. az interferon-tartalmú frakciókat oktil-csoportokkal módosított sziliciumdioxid-mátrix-aiapú, piridin-hangyasav pufferrel (pH=4) pufferolt oszlopon gyors folyadékkromatografálásnak vetjük alá, és piridin-hangyasav puffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — lineárisan emelkedő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy nagyobb anyagmennyiség gazdaságos és egyszerű tisztítását biztosítja. 182500 -1-

Description

Találmányunk tárgya új és javított eljárás homogén interferon előállítására.

A fehérjék tisztítása régóta probléma a peptidkémiában. E célhoz alkalmazott megoldások körébe tartoznak kicsapásos eljárások, gélszőrés, iöncserén alapuló kromatográfia, gél-elektroforézis, affinitáson alapuló kromatográfia és sok egyéb módszer. A biológiai anyagokban szélsőségesen alacsony koncentrációban a természetben előforduló nagymolekulájú fehérjék elkülönítésére szolgáló eljárások a felsorolt módszerek sokaságát foglalják magukban. Tekintettel az egész folyamat során bekövetkező nagy veszteségekre, gyakran igen nagymennyiségű nyersanyaggal kell dolgozni. Ebből következik, hogy az ilyen fehérjék tisztítására irányuló eljárások rendkívül bonyolultak és költségesek. Jó példa erre az interferon elkülönítésével, azonosításával kapcsolatos sok különböző kísérlet. Az 1957-ben Isaacs és Lindemann által felfedezett — mind a leukocitákból származó, mind a fibroblasztokból származó — interferonnal kapcsolatban két évtizede világszerte folyó kutatások — amelyek célja a fajlagos biológiai és kémiai tulajdonságainak meghatározására elegendő menynyiségű, homogén peptidkénti elkülönítése volt — nem hoztak megfelelő eredményt.

A fenti szerzőknek az interferonnal kapcsolatos első munkáit magába foglaló 3 699 222 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint az aktív anyag tisztítása csupán ammóniumszulfáttal történő kicsapásból és ezt követő dialízisből áll. Az ilyen eljárás viszonylag nem specifikus volta miatt a kapott termék még nagy mértékben szennyezett.

Az interferon tisztítására többlépcsős eljárást a 3 414 651 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás ismertet. Az eljárás lépései az alábbiak: szelektív adszorpció amorf alumíniumszilikáton, jód- vagy tiocianát-oldattal végzett eluálás, nem kívánt fehérjék kicsapása vizes sósav- és vizes nátriumhidroxid-oldattal, az interferon kicsapása vízzel elegyedő oldószerrel, például metanollal, etanollal vagy acetonnal, végül az újból oldatba vitt interferont valamilyen ioncserélő gyantán, így 2-dietilaminoetil-cellulózon kromatografálják. Ezzel a tisztítási eljárással az interferon aktivitását a 6000-szeresére sikerült növelni. Fajspecifikus interferonokként az idézett szabadalmi leírás a csirke- és a majom-interferont nevezi meg.

Egy további tisztítási módszert a 3 975 344 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás ismertet. E szerint humán fibroblasztokból származó, nem tisztított interferon oldatát sűrűségi gradiensen alapuló ultracentrifugálással tisztítják. Ez a módszer — a leírás szerint — nagyobb hozamot és tisztaságot eredményez, mint a Sephadex G—100 alkalmazásával végzett oszlopkromatográfiás módszer.

Az alábbiakban megadott irodalmi helyek tárgya szintén az interferon tisztítása, megkísérelt azonoSltaSfl.

Knight, E.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 520— 3 (1976); Torma, E. T. és fsai: J. Bioi. Chem. 251 4810—4816 (1976); Bridgen, P. J. és tsai: J. Bioi.

Chem. 252, 6585—7 (1977); DeMaeyer-Guignard, J. és tsai: Natúré 271, 622—5 (1978); Kawakita, M. és tsai, J. Bioi. Chem. 253, 598—602 (1978); Berthold, W. és tsai; J. Bioi. Chem. 253, 5206—11 (1978); Jankowski, W. J. és tsai: J. Virology 16, 1124—30 (1975); Davey M. W. és tsai: J. Bioi. Chem. 251, 7620—5 (1976); Chadha, K. C. és tsai: Bíóchemistry 17, 196—200 (1978).

Noha számos publikációban a fent felsoroltak közül azt állítják, hogy egér- vagy humán-interferonokat a teljes homogenitásig sikerült tisztítani, ezt nem igazolják a fehérjék homogenitásának valamilyen klasszikus módszerrel történő kimutatásával, és az állítólag tiszta vegyületek tulajdonságait sem adják meg.

Szakmai körökben általánosan ismert a nagynyomású folyadék-kromatográfia (az alábbiakban az egyszerűség kedvéért: HPLC-módszer) alkalmazása a fehérjék tisztítására. Különösen az ioncserélő kromatográfiat és a kizárásos kromatográfiát írták le (lásd például: Regnier, F. E. és tsai: J. Chromatog. Sci. 14, 316—20 (1976) és Chang, S.—H. és tsai: Anal. Chem. 48, 1839—45 (1976)).

A fázíscserés kromatográfiában például oktadecilcsoportokkal módosított szilíciumdioxidből álló oszlopokat (Licbrosorb RP—-18) sikeresen alkalmaztak peptidek, így a β-endorfin tisztítására (lásd például: Rubinstein, M. és tsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4969—72 (1977)).

Végül az egerek Ebrlich-féle ascites-tumor-sejtjeiből származó három interferon-fajta (M=33 000, 26 000 és 20 000) részleges azonosítását írták le (Cabrer, B. és tsai, J. Bioi. Chem. 254, 3681—4 (1979) ).

Jelen tanulmány tárgya javított, nagyfelbontású, jó hozamú, preparatív mértékű eljárás mintegy 12 000 feletti mólsúlyú fehérjék tisztítására. Az eljárás szerint a szennyezett fehérje vizes oldatát HPLC-feltételek mellett puffer-oldattal egyensúlyba hozott, ciánpropil-, ciklohexil-, fenil-, oktil-, oktadecil- vagy gliceril-csoportokkal módosított, porózus SiO₂-mátrix bázisú oszlopon keresztül engedjük, ahol a fehérje először adszorbeálódik, majd a fehérjét egy vízzel elegyedő oldószerrel előállított, növekvő vagy csökkenő grádienssel eluáljuk úgy, hogy a fehérjét végül az eluátum bizonyos frakcióiban tisztább formában kapjuk. Az oszlopok, amelyeket egymás után és — a pH-érték, valamint a szerves oldószer tekintetében —- különböző feltételek mellett alkalmazunk, lehetőséget nyújtanak a természetes anyagban szélsőségesen alacsony koncentrációjú fehérjék tisztítására a homogenitásig.

A jelen találmány az interferon homogenitásig történő tisztítására vonatkozik, mégpedig olyan mennyiségekben, amelyek ezen orvostanilag értékes anyag első ízben történő kémiai azonosítását teszik lehetővé. Az interferon kémiai azonosításának lehetősége figyelemre méltó haladás e vegyülettel kapcsolatban, hiszen ez az előfeltétele a szintéziséhez, történjék ez akár hagyományos peptidszintézissel, akár gén-manipulálás útján alkalmas organizmusok, előnyösen baktériumok segítségével.

A találmány szerinti, homogén interferon elő3 állítására vonatkozó eljárást az jellemzi, hogy

1. vizes interferon-oldatot oktilcsoportokkal módosított szilíciumdioxid-mátrix-alapú, acetátpufferrel (pH=7,5) pufferolt oszlopon gyors folyadék-kromatografálásnak vetünk alá, és acetát-puffer és kis szénatomszámú alkohol — előnyösen n-propanol — 0%-tól lineárisan emelkedő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk;

2. az előző lépésnél kapott interferon-tartalmú frakciókat gliceril-csoportokkal módosított szilíciumdioxid-mátrix-alapú, acetát-pufferrel (pH=7,5) pufferolt oszlopon gyors folyadékkromatografálásnak vetjük alá, és acetát-puffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol -— lineárisan csökkenő alkanolkoncentráció grádiensű elegyével eluáljuk; majd

3. az interferon-tartalmú frakciókat oktil-csoportokkal módosított szilíciumdioxid-mátrix-alapú, piridin-hangyasav pufferrel (pH=4) pufferolt oszlopon gyors folyadék-kromatografálásnak vetjük alá, és piridin-hangyasav puffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — lineárisan emelkedő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk.

Oktil- vagy gliceril-csoportokkal módosított, porózus Si0₂-mátrix bázisú (a részecskék mérete: 10 μ, az átlagos pórusméret: 100 Á) HPLC-oszlopok a kereskedelemben kaphatók, például az EM Laboratories of Elmsford, N. Y., USA, által előállított Lichrosorb RP—8 és Lichrosorb-diol elnevezésű termékek. Oktil-csoportokkal módosított porózus Si0₂-oszlopokat az E. S. Industries, Marlton, N. Y., USA, Chromegabond C—8 elnevezéssel hoz forgalomba.

A fent megadott oszlopokhoz alkalmas HPLCrendszert a 4 116 046 sz. Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás ismertet.

A találmány szerinti eljárás foganatosításakor a szennyezett nagymolekulájú peptid oldatát előnyösen vizes puffer-oldat jelenlétében a szóban forgó fehérje szempontjából alkalmas pH-érték mellett az oszlopon átengedjük. Ezt általában nyomással, előnyösen 3,4 és 340 at közötti nyomással végezzük. Az oszlop anyagán adszorbeálódott fehérjét utána lépésenként, vízzel elegyedő oldószerből előállított gradienssel eluáljuk. Alkalmas oldószerek például az alkanolok, így n-propanol, 2-propanol, etanol, metanol, terc-butanol, továbbá ciklikus éterek, mint amilyen a dioxán. Az eluátumot önmagában ismert módon frakcionáljuk, amikoris az egyes frakciók aktív fehérje tartalmát nagyon érzékeny indikátorok segítségével határozzuk meg. Egy erre a célra alkalmas rendszert például Bohlen és társai, (Anal. Biochem. 67, 438 (1975) ír le. Tanácsos a cél-fehérje jelenlétét biológiai kimutatásra alkalmas módszerrel ellenőrizni.

A tisztítandó fehérje jellegétől függ, hogy a két oszlop-típus (a normál elosztásos kromatográfiához és a fáziscserés kromatográfiához alkalmas oszlopok) közül melyiket válasszuk, és milyen sorrendben alkalmazzuk az oszlopokat. Azt találtuk, hogy például humán leukocitákból származó interferon esetében a legjobb eredményeket akkor érjük el, ha a szennyezett interferon-oldatot először oktil4 csoportokkal módosított SiO₂-mátrix bázisú oszlopon (fáziscserés kromatográfia) átengedjük mintegy 7,5 pH-jú puffer-oldat, előnyösen 1 mólos nátriumacetát-ecetsav puffer alkalmazásával, majd növekvő n-propanol-gradienssel eluálunk, utána a gyűjtött aktív frakciókat 0,1 mólos nátriumacetátpuffer alkalmazásával gliceril-csoportokkal módosított SiO₂-mátrix bázisú oszlopon keresztül engedjük, és az aktív anyagot csökkenő n-propanolgradienssel eluáljuk, végül az elkülönített interferon-komponenseket mintegy 4,0 pH-jú pufferoldat (előnyösen 1 mól piridin és 2 mól hangyasav elegye) alkalmazásával oktil-csoportokkal módosított SiO₂-mátrix bázisú oszlopokra visszük és növekvő n-propanol-gradienssel eluáljuk. Ilyen módon a három elkülönített humán leukocita interferon (α, β γ) külön-külön bontható tovább, amikoris a kromatogramban élesen egymástól elkülönülő csúcsok jelennek meg; ezek a homogén fehérjék. Az egész tisztítási eljárással, az inkubáció során nyert folyadéktól a második oktil-módosított oszlopon végzett kromatográfiai lépésig, a tisztaság a 60 000—80 000-szeresére növekszik.

A humán leukocitákból származó interferon tisztítására alkalmas foganatosítási mód szerint a 2. lépésben kapott és a csúcskoncentrációkat tartalmazó frakciókat egyesítjük, az n-propanol eltávolítása céljából n-hexánnal extraháljuk és a 3. lépés foganatosítása előtt az n-hexán nyomaitól megtisztítjuk.

A humán leukocitákból a találmány szerinti eljárással előállított interferon-fajtákra jellemző a felsorolt HPCL-oszlopokon megjelenő éles csúcs; továbbá a poliakrilamid-gélen nátriumdodecilszulfáttal (NaDodSOj 2-merkaptoetanol jelenlétében végzett gél-elektroforézis során egyetlenegy keskeny sávot mutatnak. A gélt extrahálva egyetlenegy éles, vírus elleni aktivitású csúcsot kaptunk, amely azonos volt a fehérje sávval. A tiszta interferonfajták specifikus aktivitása MDBK-sejtek (szarvasmarha epitéliás vesesejtjei) esetén 2,6—4,0χ10⁸ egység/mg, az Ag 1732 sz. humán sejtsor esetében 1,5—4χ10⁸ egység/mg. A molekulasúly mintegy 16 000 és 21 000 között van (lásd:

4. táblázat). Az aminosav-elemzés eredményeit az

5. táblázatban adjuk meg.

Az interferonoknak vírus elleni, tumor elleni, növekedésgátló és immun-szuppresszív tulajdonságai vannak. Ezek az aktivitások klinikailag kimutathatók voltak még viszonylag szennyezett, 1%nál kevesebb interferont tartalmazó készítmények napi 1—10’ 10⁶ egység dózisban történő beadása esetén is. A találmány szerint tisztított, homogén interferon-készítmények az ismert interferon-készítményekhez hasonlóan alkalmazhatók, a dózis az elért tisztasági foknak megfelelően módosul. Az interferon-fajták önmagukban vagy egymással keverve adagolhatok, továbbá olyan készítmények formájában, amelyet a tisztítási eljárás megszakításával nyerünk, és amely több interferon-fajtát, de interferon-inaktív fehérjét már nem tartalmaz.

A találmány szerinti tisztítási eljárás — bár itt csak a humán leukocitákból származó interferonok példájával ismertetjük — alkalmas egyéb interferonok, például humán fibroblasztokból származó

-3Ί vagy állati eredetű interferonok, továbbá egyéb 12 000 feletti mólsúlyú fehérjék tisztítására is. így például a pro-opicatint (mólsúly mintegy 30 000) [vő.: Kimura és tsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1756—9 (1969)] a találmány szerinti eljárás alkalmazásával a homogenitásig tisztították. A találmány szerinti eljárás egyéb fehérjék tisztítására való adaptálásához szükséges intézkedések a szakember szakmai tudásához tartoznak.

Az interferon-termelés megindítását, az interferon első feldúsitását, frakcionálását, beleértve a gélszűrést is, önmagában ismert módszerek segítségével végezhetjük. Ezen eljárási lépések, amelyek szennyezett interferon vizes oldatát eredményezik, nem képezik a találmány tárgyát.

A találmányt eljárás és termék szempontjából az alábbi példákkal szemléltetjük.

1. példa

Normál véradók humán-leukocitáiból származó homogén interferon

A. Az interferon előállítása

Normál véradók (10⁷ sejt/ml) véréből vett leukocitákat 10 mg/ml kazeint tartalmazó szérummentes minimál-közegben a Newcastle-vírus (10 hemagglutinin-egység/ml) jelenlétében 16 órán keresztül inkubáljuk. A kapott átlagos interferontiter 5000 egység/ml. A használt módszerek kisebb módosításokkal az alábbi publikációkban leírtaknak felelnek meg: Mogensen, K. E. és társai, Pharmacology and Therapeutics A, 1977, 369—381; Wheelock, E. F., J. Bacteriol. 92, 1415—1421 (1966); Cantell, K. és társai, Appl. Microbiol. 22, 625—-628 (1971). Az interferon-titert a sejtkárosító effektuson alapuló, 16 óra alatt elvégezhető módszerrel határoztuk meg. Az összes interferon-titert egység/ml-ként adjuk meg, a kalibrálási alap a National Institute of Health (USA) humán leukocitainterferonra vonatkozó etalonja volt.

B. Az interferon feldúsítása és első frakcionálása

Amennyiben másképp nem adjuk meg a hőmérsékletet, 0 és 4 °C közötti hőfokon dolgozunk. Az inkubáció befejeztével a sejteket és sejttöredékeket centrifugálással (15 perc, 500 g) eltávolítjuk. A pH-értéket sósav-oldattal 4,0-re beállítva a kazeint kicsapjuk. 2 óra elteltével az elegyet centrifugáljuk (10 perc, 12 000 g), a csapadékot eldobjuk. A 10 liter folyadékhoz annyi triklórecetsavat adunk, hogy annak koncentrációja 1,5 vegyes-% (súly/térfogat) legyen. Egy óra elteltével a csapadékot centrifugálással (10 perc, 12 000 g) elkülönítjük, majd 50 ml 0,1 mólos nátriumhidrogénkarhonátoldatban feloldjuk. Az oldathoz 0,5 g Triton X—100 vegyszert és 1,5 ml ecetsavat adunk keverés közben, utána az elegyet 0 °C-on 1 órán át, majd —20 °C-on 16 órán át tároljuk. Felolvasztás után a folyadékot 10 percen át 17 000 g-vel centrifugáljuk, a csapadékot eldobjuk. A felül úszó rész triklórecetsav-tartalmát 4%-ra állítjuk be. Egy óra elteltével az elegyet centrifugáljuk (10 perc, 12 000 g), majd a csapadékot 5 ml 0,5 mólos nátriumhidrogén-karbonát-oldatban oldjuk.

C. Gélszűrés

A kapott töményített interferon-oldathoz 1,5 g karbamidot adunk, majd 4 mól karbamidot és 0,1 mól nátriumacetátot tartalmazó puffer-oldattal egyensúlyba hozott Sephadex G—100 oszlopra (2,6χ90 cm) visszük. Az oszlopot szobahőmérsékleten 0,5 ml/perc térfogatsebességgel a fenti 7,5 pH-jú puffer-oldattal eluáljuk. 12,5 ml-es frakciókat gyűjtünk. Interferon-aktivitást a 19—23. frakciók mutatnak.

D. Nagynyomású folyadékkal végzett kromatográfia (HPLC)

A Sephadex G—100 oszlopról eluált 19—23. frakciókat egyesítve szivattyú segítségével közvetlenül Liehrosorb RP—8 oszlopra (10 μ, 4,6χ250 mm) juttatjuk. Az oszlopot előzetesen 7,5 pH-jú, 0,01 tf% tiodiglikolt tartalmazó 1 mólos nátriumacetát-pufferrel egyensúlyba hoztuk. Az oszlopot n-propanolból és a fenti pufferból készített lineáris gradienssel (1 óra 0—20 tf% ; 3 óra 20—40 tf-%) 0,25 ml/perc térfogatsebesség mellett eluáljuk, 0,75 ml-es frakciókat gyűjtve. Az interferont a 25—30 tf% n-propanolt tartalmazó 23—40. frakciókban találjuk.

A legtöbb interferont tartalmazó 27—33. frakciókat egyesítjük, n-propanol-tartalmukat 80 tf%ra beállítjuk, utána az oldatot szivattyú segítségével közvetlenül Liehrosorb—Diol-oszlopra (10 μ; 4,6χ250 mm) juttatjuk, amelyet előzetesen 80 tf-% n-propanolt tartalmazó 0,1 mólos nátriumacetát-oldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot 4 órán keresztül 72—50 tf-% n-propanolt 0,1 mólos nátriumacetát-oldatban tartalmazó lineáris gradienssel 0,25 ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáljuk. 0,75 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az interferon-aktivitást három élesen elkülönülő koncentrációcsúcs alakjában eluáljuk. A csúcsokat eluálási sorrendjük szerint α-, β- és γ-csúcsnak nevezzük el. Az α-frakeiót 68%-os n-propanol, a ^-frakciót 66,5%-os n-propanol és a γ-frakciót 65,5%-os n-propanol tartalom mellett eluáljuk. Az interferon-aktivitás összhozama 80%-nál nagyobb.

Az egy-egy csúcshoz tartozó frakciókat egyesítjük és a következő lépésekben külön-kiilön tovább tisztítjuk. Tekintve, hogy a γ-csúcs kiemelkedően a legnagyobb, és a többi komponenstől a legjobban látszik elkülönülni, a további tisztításhoz a γ-komponenst választjuk. A diol-oszlopról származó 54—

56. frakciókat — amelyek a γ-csúcsot tartalmaznak — egyesítjük, és azonos mennyiségű hexánnal kétszer egymás után végzett extrakcióval az n-propanolt eltávolítjuk. A hexán nyomokat nitrogénáramban eltávolítjuk. Az oldathoz annyi piridint és hangyasavat adunk, hogy azok végső koncentrációja 1 mólos, illetve 2 mólos legyen. Az oldatot Liehrosorb RP—8 oszlopra (10 μ, 4,6χ250 mm) visszük, amelyet előzetesen 4,0 pH-jú, 1 mól piridint és 2 mól hangyasavat tartalmazó pufferrel egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot 3 óra alatt a fenti pufferből előállított és 20—40% n-propanolt tartalmazó lineáris gradienssel 0,2 ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáljuk, 0,6 ml-es frakciókat gyűjtve. Az aktivitás fő csúcsa megfelelt egy fehérjecsúcsnak. A 32 tf% propanol-tartalom mellett eluált 45. és 46. frakciót egyesítjük és azonos körülmények között újból kroinatografáljuk. Az interferont a 32 tf% propanol tartalom mellett eluált 31. frakcióban találjuk. E frakció fajlagos aktivi5

1. táblázat: Humán leukocita-interferon tisztítása

	Egység xlO-6	Protein, talált (mg)	Relatív fajlagos aktivitás (egység/mg)	Tisztasági fok	Hozam/lépés <%>
1. inkubációs közeg	50	10 000	5 XlO3	1	—
2. 4 pH-jú felülúszó rész	50	2 000	2,5 XlO1	5	100
3. triklórecetsavas (1,5%) csapadék	40	1 000	4X 101	8	80—100
4. Triton X-100-as felülúszó rész	40	250	1,6 XlO5	32	70—100
5. Triklórecetsavas (4%) csapadék	35	175	2 XlO5	40	80—90
6. Sephadex G—100	32	57	5,6xl05	112	70—90
7. Lichrosorb RP—8 (pH 7,5)	28	11	2,5 X 10®	500	80—100
8. Lichrosorb-Diol
a-esúes	11	1,1	IX 10’	5 000
/J-csúcs	2,5	nincs meghatározva		70—90
γ-csúcs	12,5	0,21	6X10’	12 000
9. Lichrosorb RP—8 (pH 4)	1,6	0,0064	3 XlO8	60 000	40—60
10. Lichrosorb RP—8 (pH 4)	8,2	0,021	4x10®	80 000	40—60

Az ebben a frakcióban kapott fehérje azonosításához etalonként marhaszérum-albumint használtunk. A

10. lépés homogén csúcsának aminosav elemzésével meghatározott abszolút fajlagos aktivitás: 2—4χ10^Β egység/mg(lásd szöveg). A 9. lépésben a 8. lépés γ-frekciójától indultunk ki. A 10. lépés kiindulási anyaga több preparátum 9. lépésének egyesített anyaga volt.

tása marhaszérum-albuminra vonatkoztatva 4 X10’ egység/ml. Ezt az anyagot használjuk fel a további azonosítási kísérletekhez. A HPLC fluoreszeencprofiljai igen jó reprodukálhatóságuknál fogva jellemzők az egész eljárásra.

A tisztítás eredményeit az 1. táblázatban foglaljuk össze. A teljes folyamat hatékonysága — az inkubáció során kapott oldattól a második RP—8 oszlopig — 6000—8000-szeres. Az első lépcső (a Diol-oszlopig) kumulatív hozama 30—50%. Utána a három interferon-fajta külön-külön került további tisztításra.

E. Poliakrilamid-gélen végzett elektroforézis

1,5 χ 10® egységet tartalmazó interferon-mintákat nátriumdodecil-szulfáttal és 2-merkapto-etanollal inkubálunk és géllemezre visszük. Az elektroforózis után Coomassie-kékkel festve egyetlenegy éles savót kapunk. A látszólagos (etalon fehérjékre vonatkoztatott) mólsúly 17 500. A gélt 1 mm-es csíkokra vágjuk, mindegyik csíkot 0,1% nátriumdodecil-szulfátot tartalmazó 0,4 ml 0,5 mólos nátriumhidrogénkarbonát-oldatban homogenizáljuk, és az interferon-aktivitást vizsgáljuk. Egyetlenegy vírus elleni aktivitású csúcsot találunk, amely az egyetlen fehérjecsúccsal egyezik.

2. táblázat

Humán leukocita-interferon aminosav összetétele

Aminosav	fragmensek
Asx	15,2 + 1,2
Thr+	7,5 + 0,5
Ser+	8,0 + 0,5
Glx	24,0+0,6
Pro	6,3 + 0,3
Gly	5,5 + 0,5
Alá	8,2 + 0,2
Cys (összesen)	3,3 + 0,7
1/2 cisztin++	1,8 + 0,2
cisztein+ +	1,5 + 0,5
Val	7,8+0,2
Met	3,9 + 0,2
Ile	8,9 + 0,4
Leu	21,8 + 1,3
Tyr	5,1+0,2
Phe	9,1+0,3
His	3,3 + 0,4
Lys	11,6+0,5
Arg	7,3+0,5
Trp+++	0,7+0,1

⁺ kiindulási időpontra visszaszámítva ^{+ +} természetes interferon karboximetilezése után mérve ^{+ + +} 6 mól HCl/4% tioglikolsav elegyében végzett hidrolízis után mérve.

Asx = Asn + Asp

Glx = Gin + Glu

F. Aminosavelemzés

A homogén leukocita γ-interferon aminosavelemzését fluorescaminos analizátorral, természetes és S-karboximetilezett interferont tartalmazó, 0,5—1 μg-nyi mintákon végezzük. A cisztein/cisztin arány meghatározására természetes interferont karbometilezünk, majd 6 mólos sósav-oldatban redukáló körülmények (0,1% tioglikolsav) között hidrolizáljuk. E feltételek mellett a ciszteint S-karboximetil-ciszteinként, a cisztint szabad cisztinként mérhetjük. Az aminosavelemzés eredményeit a 2. táblázatban adjuk meg. Az aminosav-tartalomra számított fajlagos aktivitás számítások szerint 2—4χ 10® egység/mg.

2. példa

Leukémiában szenvedő betegek leukocitáiból nyert leukocita-interferon

Krónikus myelógiás leukémiában szenvedő betegek véréből izolált leukocitákat kazeintartalmú szérummentes közegben a Newcastle-vírussal in-511 kubálunk, így leukoforézist előidézve. 5000—40 000 egység/ml értékű interferon-titereket kapunk.

A tisztítási eljárás az 1. példában leírtakkal egyezik éa az alábbi lépésekből áll: szelektív kicsapás 0,5 mól ecetsavval Triton X—100 jelenlétében, 5 Sephadex G—100 oszlopon 4 mól karbamid-oldattal végzett gélszűrés, három HPLC-lépés, mégpedig pH 7,5 mellett Lichrosorb RP—8, majd Lichrosorb—Diói, és pH 4 mellett Lichrosorb RP—8 oszlopokon. 10

A Lichrosorb—Diói-oszlopnál az α-, β-, illetve γ-csúcakoncentrációknak megfelelő frakciókat ösaazegyűjtjük, majd további lépésekben külön-kiilön tovább tisztítjuk.

Az α-csúcsnak megfelelő 43—46. frakciókból az 15 n-propanolt azonos mennyiségű hexánnal kétszer végzett extrakcióval eltávolítjuk. A hexán-nyomokat nitrogénáramban eltávolítjuk. Az oldathoz anynyi piridint és hangyasavat adunk, hogy azok végső koncentrációja 1 mól, illetve 2 mól legyen. Az 20 oldatot 4,0 pH-jú, 1 mól piridint és 2 mól hangyasavat tartalmazó pufferrel egyensúlyba hozott Lichrosorb RP—8 oszlopra (10 μ; 4,6x250 mm) visszük, majd 3 óra alatt 1 mól piridinformiátpufferból és n-propanolból előállított, 20 tf%-tól 25 40 tf%-ra lineárisan növekvő gradienssel eluáljuk 0,2 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 0,6 ml-es

3. táblázat: Humán leukocita-interferon tisztítása (2. példa)

Egység (talált) xlO^-6

1. Inkubációs közeg 800

2. 4 pH-jú felülúszó rész 800

3. Triklórecetsavas (1,5%) csapadék 780

4. Triton X—100-as felülúszó rész 760

5. Triklórecetsavas (4%) csapadék 810

6. Sephadex G—100 660

7. Lichrosorb RP—8 (pH 7,5) (2 tétel) 510

8. Liehrosorb-Diol σ-csúcs 149 /1-csúcs 148 γ-csúcs 139 összesen 436

9. Lichrosorb RP—8 (pH 4.0) a, (kétszer kromatografálva), 9 a₂ (kétszer kromatografálva)₃ 26

A 30

A 13 ϊι 15

γ. 3i γ, 26

γ. 3,5 összesen 158 ⁺⁺ fajlagos aktivitás MDBK-sejteken

Az a₂ és β₂ fajták a Lichrosorb—Diol-oszlopnál figyelt eluálási jellegzetességük alapján is különböznek egymástól: a₂ 68 tf%-os n-propanollal, β₂ 66,5 tf%-os n-propanollal eluálódik.

Az interferon-fajták 1,5 χ I0‘ egységet tartalmafrakciókat gyűjtve. Az interferon-aktivitás a 31— 35 tf% n-propanol mellett eluált frakciókban van. Ezeket a frakciókat egyesítjük és azonos leltételek mellett újból kromatografáljuk. Az interferon-aktivitást két koncentrációcsúcsban (a₄ és a₂) 31—32 tf% n-propanol mellett eluáljuk. Kis mennyiségű komponensek 34 tf% n-propanol mellett mutatkoznak.

A Lichrosorb—Diol-oszlop β-csúcskoncentrációjának megfelelő 47—50. frakciókat egyesítjük és az α-csúcs esetén leírtak szerint dolgozzuk fel. Az interferon-aktivitás két főcsúcsban jelenik meg: β, 32 tf% n-propanol és β₃ 34 tf% n-propanol-tartalom mellett. A kromatográfia megismétlése itt nem szükséges. Egyes preparátumokban 31 tf% n-propanol-tartaloni mellett β, frakció figyelhető meg.

A Lichrosorb—Diol-oszlop γ-csúcsának megfelelő 52—54. frakciókat egyesítjük és a fentiek szerint feldolgozzuk. Az interferon-aktivitás 5 főcsúcsban jelenik meg: γ₃ 31 tf% n-propanol, γ₂ 32 tf% n-propanol, γ₃ 34 tf% n-propanol, γ.₄ 35 tf% n-propanol és γ₅ 35,5 tf% n-propanol mellett. A kromatografálás megismétlése nem szükséges.

Az egyes interferon-fajták előállításával kapcsolatos tisztítás eredményeit a 3. táblázatban foglaljuk össze.

Tisztasági fok

Protein (talált) (mg)

Fajlagos aktivitás·* (egység/mg)

Hozam (%)

20 X 103	4 XlO1	1	100
4 XlO3	2X I05	5	100
2 XlO3	3,9 χ 106	9,8	97
510	1,5 X 106	37,5	95
350	2,3 X 106	57,5	100
130	5,1 XlO6	128	82
26	2X10’	500	64
5	3X 10’	750
3	5X10’	1 250
1,7	8X 10’	2 000	54
35X10~3	2,6 χ 108	6 500
65 XlO’3	4,0χ108	10 000
75X10'3	4,0 X 10s	10 000
32X10~3	4,0 χ 108	10 000
58 Xl0~3	2,6 X 108	6 500
77 XlO'3	4 X108	10 000
74X10'3	3,5 XlO8	8 750
10Xio-3	3,5 χ 108	8 750
50X10~3	0,9 X 108	2 250	20
zó mintáit	nátriumdodecil-szulfáttal	és 2-merkap-
to-etanollal	inkubálva	géllemezre	visszük. Az
elektroforézis után az a1;	«2, β2, Yj és γ4 csúcsok egy-

egy sávot adnak, míg a β₃, γ₃ és β„ csúcsok esetében 5 két-két sáv jelenik meg. A látszólagos mólsúlyok 7

-613

000 és 18 000 között vannak, a β₃ és a γ₄ kivételével, ugyanis β₃ egyik sávja 16 500-nál, másik sávja 21 000-nél van, és γ₄ 21 000-nél sávot mutat (lásd 4. táblázat).

A tisztított humán leukocita-interferon frakcióinak aminosav-elemzését fluorescaniinos aminosavanalizátorral végezzük 0,1—1 ^g-nyi mintákon. A redukáló hidrolízishez 6 mólos sósav-oldatot és 0,1% tioglikolsavat alkalmazunk. Az eredménye5 két az 5. táblázatban adjuk meg.

4. táblázat

	Molekulasúly ±1000	Fajlagos aktivitás MBBK-sejteken (szarvasmarha; egység/mg) ±25%	Fajlagos aktivitás Ag 1732 sejtsoron (humán sejtek, egys/mg) Í50%	Növekedésgátló aktivitás**
«1	16 500	2,6 X 108	2,6 XlO8	±
«2	16 200	4 XlO8	3 XlO8	+
β,	16 500	4 XlO8	2 XlO8	±
	21 000	4 X10’	3 XlO8	±
Ϊ!	17 700	2,6 XlO8	2 XlO8	±
Ϊ2 +	17 700	4 XlO8	1,5 XlO8	±
Ϊ3	17 200	3,5 XlO8	l,5xl08	±
Ϊ4	21 000	3,5 XlO8	4 XlO7	+
γ5+	16 000	0,9 XlO8	2 XlO8	±

⁺ Az NaDodS0₄-daI poliakrilamidon végzett gélelektroforézis 2 sávot mutat. A megadott érték a fősáv értéke. ⁺⁺ Steward et al. (Natúré 262, 300/1976) módszere szerint

5. táblázat: Humán leukocita-interferon aminosav elemzése

Fajta	βχ	«2		Pa +	Ti	Ϊ2	Ϊ3 +	Ϊ4 +	Ϊ5 +
Mólsúly	16 500	16 200	16 500	21 000	17 700	17 700	17 200	21 000	16 500
Fragmensek	142	139	142	181	153	153	148	180	142
Asx	13,8	11,7	11,5	18,2	13,1	13,3	15,0	17,9	13,8
Thr	7,7	8,3	9,0	9,9	8,4	9,6	8,6	7,3	7,6
Ser	9,2	10,0	10,0	14,5	10,2	7,8	10,1	13,5	9,0
Glx	20,3	20,5	21,9	28,5	23,9	25,0	22,8	27,0	20,8
Pro	6,1	4,9	5,0	5,9	4,5	4,8	4,8	6,5	4,2
Gly	5,1	4,5	5,0	3,6	5,7	5,0	3,2	4,8	4,0
Alá	8,4	8,3	7,9	11,5	8,7	8,1	9,3	10,4	9,3
Val	7,4	6,2	θ,7	7,5	7,3	7,0	5,5	7,9	5,1
Met	3,7	3,8	4,4	6,0	4,3	3,9	5,6	4,9	4,7
ILe	7,4	7,0	7,4	9,5	7,9	8,0	6,8	9,7	6,6
Leu	18,0	18,0	18,9	24,4	20,3	20,1	20,5	24,1	19,6
Tyr	4,0	4,0	4,6	5,0	4,8	4,8	3,7	5,0	3,6
Phe	6,9	8,0	8,7	9,9	8,6	9,0	7,2	9,1	6,4
His	3,0	2,8	3,0	3,8	3,7	3,3	2,9	3,8	2,8
Lys	10,5	9,0	8,5	9,3	10,1	10,0	7,6	12,3	12,0
Arg	6,2	7,1	8,0	10,8	8,0	8,5	10,1	8,5	9,0
Cys	3,9	4,0	1,8	2,3	3,3	2,9	3,1	4,1	2,3

⁺ a két sáv elegye

A standard deviáció fragmensenként ±1,5

Tripszin-bontás és a fragmensek kimutatása nagynyomású folyadékkromatográfiával

A tisztított humán leukocita interferonok 300— 300 pmól-ját 8 pH-jú nátriumhidrogénkarbonátoldatban (50 mmól, 50 μΐ) oldjuk. Az oldathoz 0,1 μg tripszin 2 μΐ 3 pH-jú sósavval készített oldatát adjuk, és az elegyet 37 °C-on 14 órán át inkubáljuk. 5 μ] ecetsav hozzáadása után az elegyet Lichrosorb RP—8 oszlopra (részecskeméret 10 μ; 4,6x250 mm) visszüli. Az oszlopot egy órán ke8 resztül n-propanolból és 0,1 mól hangyasav/0,03 mól piridin puffer-oldatból (pH = 3) készített, 0 tf%-tól 40 tf%-ra lineráisan növekvő gradienssel 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. A fragmenseket fluorescaminnal mutatjuk ki. Az eredményeket a 6. táblázatban adjuk meg. A csúcskoncentrációk helyét a gradiens n-propanol tartalmával, a fragmensek méretét az S, M, L betűkkel jelöljük meg, ahol S kicsi, M középső méretű és L nagy fragmenst jelent.

A tisztított humán interferon fajtákat olyan

-713

6. táblázat A humán leukocita-interferonok triptikus peptidjei

Fajta	Az, eluáló közeg n-propanol tartalma, %-ban
	3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M, 20S, 21S, 22,5S, 29M
	3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M, 27S, 29M
p	3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,58, 14,5M, 16S, 17,5S, 18M, 29M
	3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M, 16S, 18L, 19,5M, 27M, 32M
yi	3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5M, 18M, 29M
V*	3L, 4L, 4,2M, 4,SS, 6S, 11,5S, 12,5S, 14,5S, 16S, 18L, 29M
V*	3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M, 16S, 18L, 20S, 32M
Y.	3L, 4L, 4,2M, 4,5M, 7S, 7,5S, 10S, 11,5L, 12,6S, 14S, 14,5M, 16S, 18L, 24,58, 25,5S, 32S

aminocukor elemzésnek vetettük alá, amely 50— 100 pmól aminocukor kimutatására alkalmas. Mindegyik esetben molekulaként egynél kevesebb glukózamin, galaktózamin, illetve mannózamín fragmenst találtunk. Az aminocukrok közelében eluálható számos kis peptid azonban zavarja az elemzést, így nincs kizárva, hogy az aminocukrok hoz hozzárendelt koncentráció-csúcsok részben vagy egészében peptideknek tulajdoníthatók.

Végül a tiszta Y₂-interferon lebonthatóságát vizsgáltuk 1 nmól mintán kézzel végzett Edman-lebontás, ismételt hidrolízis és fluorescaminos aminosavelemzés útján. Az első két ciklusban aminosavat nem találtunk, 100 pmól tiszta humán leukocita interferont (γ₂) 20 órán át 37 °C-on leukinaminopeptidással és M jelű aminopeptidázzal kezeltünk. A kezelés a biológiai aktivitást nem befolyásolta, az inkubációs közegben aminosavak nem voltak találhatók. Az indukciós közeg (leukocitás és Newcastle-vírus minimál közegben) felül úszó részét M-aminopeptidázzal kezelve az interferonaktivitás csökkenését nem észleltük. Ez arra utal, hogy az interferon-molekula a tisztítási eljárás előtt már tartalmazott a láncvégeken védett aminocsoportot hordozó aminosavat. Ellenőrzésképpen nyers interferont, tisztított interferont, illetve az inzulin β-láncát M-aminopeptidázzal inkubáltuk. Míg az inzulin részben bontható volt (kimutatható aminosavak), addig az interferon-aktivitásban nem mutatkozott veszteség. 1 nmól = 10^-’ mól; 1 pmól = 10“ “ mól.

3. példa

Az 1. példában leírt módon szarvasmarha-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk.

4. példa

Az 1. példában leírt módon sertés-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk.

5. példa

Az 1. példában leírt módon juh-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk.

6. példa

Az 1. példában leírt módon ló-Ieukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk.

7. példa

Az 1. példában leírt módon kutya-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk.

8. példa

Az 1. példában leírt módon macska-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk.

9. példa

Az 1. példában leírt módon majom-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk.

10. példa (a) 2χ10⁸ egység/mg fajlagos aktivitású, homogén humán leukocita-interferon 3 mg-ját 25 ml 5%-os normál humán szérumalbuminban oldjuk. Az oldatot bakteriológiai szűrőn keresztül szűrjük, majd 100 db csíramentes ampullába töltjük. Mindegyik ampulla 6 X10® egység tiszta interferont tartalmaz. A parentális alkalmazásig az ampullákat előnyösen hidegben (—20 °C-on) tároljuk.

(b) 1,5 mg kb. 2χ10⁸ egység/ml fajlagos aktivitású homogén humán leukocitá-interferon α_1; <x₂, b₂, Yi és γ₂ fajtáit (mintegy természetes előfordulásuk arányában) tartalmazó vizes oldat és 100 mg normál humán szérum-albumin elegyét bakteriológiai szűrőn át szűrjük, majd csíramentes körülmények között 100 db ampullába töltjük. Mindegyik ampulla kb. 3χ10^β egység tiszta leukocitainterferont és 1 mg szérumalbumint tartalmaz. A parenterálisan alkalmazható interferont tartalmazó ampullákat célszerűen hidegben (—20 °C) tároljuk.

Claims (5)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás homogén interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy

   1. vizes interferon-oldatot oktilcsoportokkal módosított szilíciumoxid-mátrix-alapú, acetát-pufferrel (pH = 7,5) pufferolt oszlopon gyors folyadékkromatografálásának vetünk alá, és acetátpuffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — 0%-tól lineárisan emelkedő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk;
2. 2. az előző lépésnél kapott interferon-tartalmú frakciókat gliceril-csoportokkal módosított szilíciumoxid-mátrix-alapú, acetát-pufíerrel (pH = = 7,5) pufferolt oszlopon gyors folyadékkroma9

   -817 tograf álásnak vetjük alá, és acetát-puffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol lineárisan csökkenő — előnyösen 72,5 térfogat/ térfogat%-tól — alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk; majd
3. 3. az interferon-tartalmú frakciókat oktil-csoportokkal módosított sziliciumdioxid-mitrix-alapú, piridin-hangyasav pufferrel (pH == 4) pufferolt oszlopon gyors folyadékkromatografálásnak vetjük alá, és piridin-hangyasav puffer és kis szén- 10 atomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — lineárisan emelkedő — előnyösen 20 térfogat/térfogat %-tói — alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk.

   2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 15 módja, azzal jellemezve, hogy az

   1. lépésnél O-tól 40 térfogat/tórfogat%-ig emelkedő, a

   3. lépésnél 20-tól 40 térfogat/térfogat%-ig emelkedő és a

   2. lépésnél 72,5-től 50 térfogat/térfogat%-ig csökkenő n-propanol grádiensű elegyet alkalma5 zunk.

   3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kifejezett fő-csúcsokhoz (peak) hozzárendelt frakciókat öszszegyűjtjük, az n-propanolt n-hexános extrakcióval eltávolítjuk és a 3. lépés előtt a vizes oldatból az n-hexán nyomait eltávolítjuk.
4. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kiindulási anyagként humán interferont alkalmazunk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként leukocita-interferont alkalmazunk.