ES2661404T3 - Métodos para la expresión de péptidos y proteínas - Google Patents

Abstract

Un método para la producción de un péptido (PeOI) o proteína de interés (PrOI) recombinares, en donde el método comprende: (a) introducir una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende al menos un PeOI o una PrOI, y al menos un alocrito de un sistema de secreción de tipo 1 (T1SS) o un fragmento del mismo, en una célula anfitriona, en donde la célula anfitriona no expresa un transportador heterólogo de casete de unión a ATP (ABC), una proteína de fusión de membrana heteróloga (MFP) y/o una proteína de membrana externa heteróloga (OMP) del T1SS, en donde dicho fragmento tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos; (b) cultivar la célula anfitriona en condiciones que permitan la expresión de la proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se expresa en forma de cuerpos de inclusión (IB); (c) aislar la proteína de fusión recombinante de dichas células anfitrionas; y (d) someter la proteína de fusión recombinante a condiciones que permiten que el PeOI o la PrOI se plieguen en una conformación tridimensional funcional.

Description

Métodos para la expresión de péptidos y proteínas

Campo de la invención

La presente invención se basa en el campo de la biología molecular, la expresión de péptidos y proteínas recombinantes y se refiere a métodos que comprenden secuencias de ácido nucleico de sustratos/alocritos de sistemas de secreción de Tipo 1 o fragmentos de los mismos para la producción eficaz de péptidos y proteínas recombinantes de interés. Los alocritos o fragmentos de los mismos mejoran la expresión de péptidos y proteínas de interés como cuerpos de inclusión (IB) y funcionan como Ietiquetas de IB.

Antecedentes de la invención

En los últimos años, la producción de proteínas/enzimas recombinantes para su uso en procedimientos industriales se ha vuelto cada vez más importante y se espera que pronto muchos procedimientos industriales involucren tecnologías recombinantes. Actualmente, se utilizan péptidos y proteínas bioactivos como agentes curativos en una variedad de enfermedades como diabetes (insulina), infecciones virales y leucemia (interferón), enfermedades del sistema inmunitario (interleuquinas) y deficiencias de glóbulos rojos (eritropoyetina) por nombrar unos pocos. Adicionalmente, se necesitan grandes cantidades de proteínas y péptidos para diversas aplicaciones industriales, incluidas, por ejemplo, industrias de pasta de papel y papel, textiles, industrias alimentarias, cuidado personal y cosméticos, refinado de azúcar, tratamiento de aguas residuales, producción de bebidas alcohólicas y como catalizadores para la generación de nuevos productos farmacéuticos.

Sin embargo, la expresión de péptidos y proteínas recombinantes es todavía limitada, ya que se requieren grandes esfuerzos para obtener los péptidos y proteínas deseadas con un plegamiento nativo, en altas cantidades y con elevada pureza.

Generalmente, la purificación del producto es costosa y especialmente la etapa final hasta 100% de pureza tiende a aumentar los costes exponencialmente porque las proteínas con características similares son difíciles de separar unas de otras (Hacking, A. J. (1986) Economics aspects of biotechnology, Cambridge University Press).

En muchos casos, es útil expresar una proteína o péptido en forma insoluble, particularmente cuando el péptido de interés (PeOI) o proteína de interés (PrOI) son bastante cortos, normalmente solubles y/o están sujetos a degradación proteolítica dentro de la célula anfitriona. La producción del péptido en forma insoluble facilita la recuperación simple y protege al péptido de la degradación proteolítica no deseable. Un medio para producir el péptido en forma insoluble consiste en producir recombinantemente el péptido como parte de un péptido/proteína de fusión insoluble incluyendo en el péptido de fusión al menos una etiqueta de solubilidad (es decir, una etiqueta de cuerpo de inclusión (IB)) que induce la formación de IB. Típicamente, la proteína de fusión está diseñada para incluir al menos un conector peptídico escindible de modo que el PeOI o la PrOI se puedan recuperar posteriormente de la proteína de fusión. La proteína de fusión se puede diseñar para que incluya una pluralidad de IB-etiquetas, conectores peptídicos escindibles, y regiones que codifican el PeOI o la PrOI.

Las proteínas de fusión que comprenden una etiqueta peptídica que facilita la expresión de proteínas insolubles son bien conocidas en la técnica. Típicamente, la parte de la etiqueta de la proteína quimérica o de fusión es grande, lo que aumenta la probabilidad de que la proteína de fusión sea insoluble. Los ejemplos de péptidos grandes típicamente utilizados incluyen, pero no se limitan a cloranfenicol acetiltransferasa (Dykes et al., (1988) Eur. J. Biochem., 174: 411), β-galactosidasa (Schellenberger et al., (1993) Int. J. Peptide Protein Res., 41:326; Shen et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 281:4627; y Kempe et al., (1985) Gene, 39: 239), glutatión-S-transferasa (Ray et al., (1993) Bio/Technology, 11:64 y Hancock et al., (documento WO94/04688)), el extremo N de L-ribuloquinasa (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.206.154 y Lai et al., (1993) Antimicrob. Agents & Chemo.), 37: 1614, proteína gp55 de bacteriófago T4 (Gramm et al., (1994) Bio/Technology, 12:1017), proteína cetosteroide isomerasa bacteriana (Kuliopulos et al., (1994) J Am. Chem. Soc. 116:4599 y en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.648.244), ubiquitina (Pilon et al., (1997) Biotechnol. Prog., 13: 374-79), proquimosina bovina (Haught et al., (1998) Biotechnol. Bioengineer. 57: 55-61), y proteína bactericida/incrementadora de la permeabilidad ("BPI"; Better,

M. D. y Gavit, P D., Patente de los Estados Unidos Núm. 6.242.219). La técnica está repleta de ejemplos específicos de esta tecnología, véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 6.037.145, que ilustra una etiqueta que protege la proteína quimérica expresada a partir de una proteasa específica; la Patente de los Estados Unidos Número 5.648.244, que ilustra la síntesis de una proteína de fusión que tiene una etiqueta y un conector escindible para la purificación fácil de la proteína deseada; y las Patentes de los Estados Unidos Números 5.215.896; 5,302,526; 5,330,902; y la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número 2005/221444, que describe etiquetas de fusión que contienen composiciones de aminoácidos específicamente diseñadas para aumentar la insolubilidad de la proteína o péptido quiméricos.

Sin embargo, los métodos conocidos en la técnica no proporcionan ninguna solución para volver a plegar el PeOI o la PrOI. Por lo tanto, todavía existe una necesidad en la técnica de métodos que permitan una producción mejorada de un PeOI y una PrOI recombinantes.

Los autores de la presente invención encontraron que los métodos que comprenden secuencias de ácido nucleico que comprenden fragmentos del gen de hemolisina A (HlyA) o lipasa A (LipA) superan la necesidad anterior en la técnica. Ambos genes son parte de un sistema de secreción de Tipo 1 (T1SS), que se produce principalmente en bacterias Gram negativas y exportan sus sustratos afines en una sola etapa desde el citosol al medio extracelular sin la formación de intermedios de sustrato periplásmico. Entre la familia de T1SS, la Hly T1SS descrita por Bakkes et al. que implica HlyA como sustrato de transporte es de particular interés, ya que lleva las denominadas repeticiones GG con la secuencia consenso GGxGxDxUx (x: cualquier residuo de aminoácido, U: residuo de aminoácido hidrófobo grande) (Ostolaza, H. et al., (1995) Eur J Biochem 228, 39-44). Estas repeticiones GG se unen a iones Ca2+ con alta afinidad. Este evento de unión se produce después de la secreción del alocrito T1SS al exterior, donde la concentración de Ca2+ es alta (hasta el intervalo mM) en comparación con la concentración de Ca2+ dentro de las células (nM elevado). La unión de Ca2+ a las repeticiones GG cataliza el plegamiento de los alocritos en la conformación activa nativa, y los iones Ca2+ actúan como un coadyuvante de plegamiento/chaperona (Jumpertz, T. et al., Microbiology 156, 2495-2505, doi:mic.0.038562-0[pii]). Otros componentes de HlyA T1SS de E. coli son la proteína de membrana interna HlyB, que es un transportador del casete de unión a ATP (ABC), la proteína de membrana externa (OMP) ToIC y la proteína de fusión de membrana (MFP) HlyD en la membrana interna.

El documento EP 2583975 A1 describe una molécula de ácido nucleico para la expresión recombinante y la secreción de un péptido o una proteína de interés. La molécula de ácido nucleico comprende una hemolisina A y/o una secuencia de nucleótidos derivada de hemolisina C y una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido o la proteína de interés. Bakkes et al. (Bakkes, P. et al., (2010), JBC, vol. 285, núm. 52, páginas 40573-40580) describen que proteínas de fusión de HlyA se expresan en cuerpos de inclusión y, en una realización diferente, que las proteínas de fusión pueden ser replegadas y desplegadas cambiando las concentraciones de urea.

Schwarz et al. (Schwarz, C. K. et al., (2012), Journal of Biotechnology, vol. 159, núm. 3, páginas 155-161) describen la expresión de la proteína IFABP G12V en cuerpos de inclusión.

Park et al. (Park, Y. et al., (2012), Microbial Cell Factories, vol. 11, página 60) describen la identificación de la región mínima en el reconocimiento del transportador ABC de lipasa.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un PeOI o una PrOI recombinantes, en donde el método comprende (a) introducir una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende al menos un PeOI o una PrOI y al menos un alocrito de un T1SS o un fragmento del mismo, en una célula anfitriona, en donde la célula anfitriona no expresa un transportador ABC heterólogo, un MFP heterólogo y/o un OMP heterólogo del T1SS, en donde dicho fragmento tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos; (b) cultivar la célula anfitriona en condiciones que permitan la expresión de la proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se expresa en forma de IB; (c) aislar la proteína de fusión recombinante de dichas células anfitrionas; y (d) someter la proteína de fusión recombinante a condiciones que permiten que el PeOI o la PrOI se plieguen en una conformación tridimensional funcional.

En diversas realizaciones, el alocrito de un T1SS se selecciona del grupo que consiste en HlyA, CyaA, EhxA, LktA, PlLktA, PasA, PvxA, MmxA, LtxA, ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, ApxIVA, ApxI, Apx11, AqxA, VcRtxA, VvRtxA, MbxA, citotoxina RTX, RtxL1, RtxL2, FrhA, LipA, TliA, PrtA, PrtSM, PrtG, PrtB, PrtC, AprA, AprX, ZapA, ZapE, Sap, HasA, colicina V, LapA, ORF, RzcA, RtxA , XF2407, XF2759, RzcA, RsaA, Crs, CsxA, CsxB, SlaA, SwmA, S111951, NodO, PlyA, PlyB, FrpA, FrpC y fragmentos de los mismos.

En realizaciones preferidas, el alocrito de un T1SS puede ser HlyA que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, un fragmento de la misma o un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o el fragmento de la misma.

En realizaciones más preferidas, el fragmento de HlyA consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 o un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

En diversas realizaciones, el medio de expresión comprende 20,0 mM o menos de Ca2+.

En realizaciones adicionales, la presente invención se refiere a un método en donde se inhibe la expresión del gen transportador ABC endógeno, el gen MFP endógeno y/o el gen OMP endógeno del T1SS o la actividad de los productos génicos correspondientes en la célula anfitriona o el transporte es ineficaz.

En otras diversas realizaciones, la célula anfitriona no expresa el transportador ABC endógeno, la MFP endógena y/o la OMP endógena del T1SS.

En otras realizaciones más, el péptido o proteína recombinantes se pueden exponer a un tampón de replegamiento, en donde el tampón de replegamiento comprende al menos 0,01 mM de Ca2+.

En diversas realizaciones de los métodos de la invención, (1) la célula anfitriona es una célula procariota; y/o (II) la expresión se realiza en medio de cultivo mínimo; y/o (III) el péptido o proteína de fusión recombinantes se purifican utilizando un método seleccionado entre cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño, y combinaciones de las mismas; y/o (IV) el método comprende la etapa adicional (e) de puesta en contacto de la proteína de fusión recombinante con una proteasa adecuada para la escisión de la proteína de fusión para producir el alocrito y el PeOI o la PrOI como moléculas separadas; y/o (V) el método comprende una etapa (e) como se define en (IV) seguida de la purificación del PeOI o la PrOI.

En otras realizaciones más, la presente invención también se puede referir a un método en donde al menos un PeOI

o una PrOI se seleccionan del grupo que consiste en Nisina, HCRF, IFABP, IFNA2, MBP, péptido 101, péptido 102, péptido 103, MAB-40 Mab-42, Fuzeon®, calcitonina de salmón, calcitonina humana, péptidos 1, péptido 238 como se expone en SEQ ID NO: 53, péptido 239 como se expone en SEQ ID NO: 54, péptido 240 como se expone en SEQ ID NO: 55, y péptido 241 como se expone en SEQ ID NO: 56.

Por otra parte, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos reguladora que modula la expresión de la proteína de fusión en realizaciones adicionales. Se entiende que todas las combinaciones de las realizaciones descritas anteriormente también están destinadas a estar dentro del alcance de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una presentación esquemática de algunas de las construcciones de plásmidos utilizadas.

La Figura 2 muestra un gel de SDS-PAGE (15%) de fracciones insolubles y solubles de productos lisados celulares de IFABP y MBP (y las mutaciones indicadas de los mismos) fusionadas al extremo N-terminal de HlyA1/HlyAc (FIG. 2A). Las muestras se cargaron sobre una SDS-PAGE y se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie (CBB). La FIG. 2B muestra muestras de producto lisado celular de E. coli que expresan proteínas de fusión de HlyA1 e indican PrOI o PeOI, en donde la PrOI o el PeOI se fusionan C-terminalmente con HlyA1, se analizan mediante SDS-PAGE y se visualizan mediante tinción con CBB. La FIG. 2C representa una SDS-PAGE (15%) de fracciones solubles e insolubles después de la rotura celular de las células que producen IFABP wt (codificada por el plásmido pQE-IFABP wt) o HlyA1-IFABP wt (codificada por pIAR_207). Se indica un producto de degradación soluble de HlyA1-IFABP wt. La FIG. 2D muestra la expresión de los péptidos 238, 239, 240 y 241 fusionados a HlyA1 y demuestra que la expresión de los péptidos 240 y 241 falla sin la proteína de fusión HlyA1.

La Figura 3 muestra experimentos de HlyA1 que se vuelven a plegar en presencia de EDTA o Ca2+ y se aplican a un IMAC y SEC. A: en presencia de Ca2+, HlyA1, que portaba una etiqueta His6 N-terminal, se cargó en el IMAC (calle izquierda) y las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente de imidazol. B: análisis SEC (columna Superdex 75 10/300, GE Healthcare) de HlyA1 eluido del IMAC. C & D: HlyA1 fue analizado por IMAC y SEC en presencia de EDTA.

La Figura 4 muestra experimentos de HlyA1-Nisina que está siendo replegada en presencia de Ca2+ o EDTA, concentrada y aplicada a un SEC. A: Fracción insoluble ("sedimento") y soluble ("sobrenadante") de HlyA1-Nisina después del replegamiento en presencia de Ca2+ y fracciones de elución del análisis SEC. B: Fracción insoluble ("sedimento") y soluble ("sobrenadante") de HlyA1-Nisina después del replegamiento en presencia de EDTA y fracciones de elución del análisis SEC. C: Cromatogramas SEC de A y B. D: Se incubó HlyA1-Nisina con Factor Xa (NEB), se tomaron muestras de la mezcla en varios momentos (0, 20, 40, 60, 90, 120 min de izquierda a derecha), se cargaron en un gel de SDS-PAGE y se tiñeron con CBB. E: Cromatogramas de HPLC de nisina de referencia (línea superior) y nisina que se produjo con la tecnología de la invención (línea inferior). F: Análisis de SDS-PAGE de fracciones de elución de HPLC. Calle izquierda: reacción del Factor Xa después de 90 minutos, otras calles: fracciones de elución de HPLC. Las flechas indican las posiciones de Nisina y HlyA1.

La Figura 5 muestra experimentos de replegamiento de LipA1-Nisina en presencia de Ca2+ y EDTA. La LipA1-Nisina se produjo en forma de IB en E. coli y los IB aislados se replegaron en presencia de Ca2+ o EDTA. En presencia de Ca2+, se produjo LipA1-Nisina pura y soluble en un estado homogéneo. Por el contrario, LipA1-Nisina se agregó en presencia de EDTA. A y B: Análisis por SDS-PAGE de fracciones de elución SEC y el cromatograma SEC correspondiente de LipA1-Nisina replegado con Ca2+. C y D: LipA1-Nisina se replegó en presencia de EDTA y se analizó como se describe en A y B.

La Figura 6 muestra análisis de expresión de péptidos codificados por pIAR_215, pIAR_220, pIAR_221, pIAR_222 y pIAR_223 y experimentos de replegamiento de péptidos expresados (codificados por pIAR_220, pIAR_222 y pIAR_223) en presencia de Ca2+ y EDTA. Las proteínas indicadas se produjeron como IB en E. coli y los IB aislados se replegaron en presencia de Ca2+ o EDTA. A: Análisis de SDS-PAGE de las muestras indicadas. B-G: Análisis SEC de proteínas indicadas replegadas.

La Figura 7 muestra la producción de HCRF. A: Los IB de HlyA1-HCRF, codificados por el plásmido pIAR_202, se replegaron en presencia de Ca2+ o EDTA. B: HlyA1-HCRF, replegado en presencia de Ca2+, se incubó con Factor Xa durante 10 min, 40 min y 120 min. Las flechas indican la posición de HlyA1-HCRF, HlyA1 y HCRF, respectivamente. HlyA1-HCRF, se replegó en tampón que contenía Ca2+ o EDTA, se aplicó al análisis SEC y las fracciones de elución se analizaron mediante SDS-PAGE. C: Cromatogramas de elución del análisis SEC mencionado anteriormente. D: Gel de SDS-PAGE teñido con CBB después del análisis SEC de HlyA1-HCRF replegado en presencia de Ca2+. E: Gel de SDS-PAGE teñido con CBB después del análisis SEC de HlyA1-HCRF replegado en presencia de EDTA. Las flechas indican la posición de HlyA1-HCRF. HlyA1-HCRF se replegó en presencia de Ca2+, se incubó con Factor Xa durante 2 horas y la mezcla de digestión se purificó por HPLC. F: Cromatograma de HPLC. G: Gel de SDS-PAGE teñido con CBB de fracciones de elución de HPLC. Las flechas indican la posición de HCRF.

La Figura 8 muestra los estudios de producción y funcionales de HlyA1-IFABP. Análisis SEC de HlyA1-IFABP replegado. A y C: Gel de SDS-PAGE de fracciones de elución del análisis SEC de HlyA1-IFABP replegado con Ca2+ y cromatograma de elución de SEC. B y D: Gel de SDS-PAGE de fracciones de elución del análisis SEC de HlyA1-IFABP replegado con EDTA y cromatograma de elución de SEC. E: HlyA1-IFABP purificado en presencia de Ca2+ o EDTA se incubó con Factor Xa y las muestras de proteína se analizaron mediante SDS-PAGE en puntos de tiempo indicados. La flecha indica la posición de IFABP. F y G: Estudios funcionales de HlyA1-IFABP utilizando experimentos de titulación con DAUDA. F: HlyA1-IFABP se replegó en presencia de Ca2+ y se purificó por SEC. DAUDA se tituló a HlyA1-IFABP, se registró la señal de fluorescencia a 500 nm y se trazó frente a la concentración de DAUDA. La calle de color negro representa la curva del ajuste teórico. G: Se repitieron los mismos experimentos que en F con HlyA1-IFABP purificado en presencia de EDTA.

La Figura 9 muestra la producción de HlyA1-IFNA2. A: Análisis de SDS-PAGE de HlyA1-IFNA2 replegado en presencia de arginina 0,5 M. El IFNA2-HlyA1 secretado sirvió como referencia para la proteína oxidada que contenía enlaces disulfuro (calle izquierda). En ausencia de DTT, HlyA1-IFNA2 migra en la misma altura de migración que la referencia. Por el contrario, HlyA1-IFNA2 en presencia de DTT migra más lentamente. Estos resultados indican la formación de enlaces disulfuro dentro de HlyA1-IFNA2 replegado. B y C: Análisis de SEC de HlyA1-IFNA2 después del replegamiento en presencia de Ca2+ y EDTA, respectivamente. B: Replegamiento en presencia de Ca2+. C: replegamiento en presencia de EDTA.

La Figura 10 muestra un experimento de unión de HlyA1-MBP replegado y resina de amilosa. HlyA1-MBP se expresó en E. coli (calle "producto lisado celular") y se prepararon IB de HlyA1-MBP (calle "HlyA1-MBP"), se desnaturalizaron y se replegaron en presencia de Ca2+. Algo de HlyA1-MBP precipitó durante el replegamiento (calle "precipitado") y el HlyA1-MBP soluble (calle "replegado") se cargó en resina de amilosa. El HlyA1-MBP unido a amilosa y sin proteína permaneció dentro del "flujo continuo". Después del lavado, HlyA1-MBP se hizo eluir con maltosa (calle "elución").

La Figura 11 muestra la producción de los péptidos 101, 102 y 103. A: Expresión de HlyA1 fusionado a los péptidos 101, 102 y 103. B-D: Esquema de purificación de HlyA1 fusionado al péptido 101, 102 y 103. Las células que expresan las correspondientes proteínas de fusión se rompieron y los productos lisados celulares (calle "productos lisados celulares") se centrifugaron. No se encontraron proteínas de fusión visibles en la fracción soluble (calle "fracción soluble") y las proteínas de fusión se agregaron como IB. Los IB se desnaturalizaron (calle "IB desnat.") y se replegaron en presencia de Ca2+. Las proteínas de fusión se replegaron eficazmente con Ca2+ ("péptido replegado 10X") y no precipitaron proteínas ("sedimento"). Las proteínas de fusión renaturalizadas se incubaron con Factor Xa y los péptidos 101, 102 y 103 se separaron de HlyA1 (calle "Factor Xa"). Se produjo un producto de escisión no específico en todos los casos (véase la calle "+Factor Xa").

La Figura 12 muestra experimentos de digestión del Factor Xa con el péptido 103 fusionado a HlyA1-R210D (codificado por el plásmido pIAR_112). Los IB replegados (calle "-") se incubaron con Factor Xa ("+") y las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE. No se produjo ningún producto de escisión no específico (en comparación con los resultados que se muestran en la Figura 11).

La Figura 13 muestra la producción de Fuzeon®. HlyA1-Fuzeon® se replegó en presencia de Ca2+ (A) o EDTA

(B) y se cargó en una columna Superdex 75 16/60. La flecha indica la posición de HlyA1-Fuzeon®. C: HlyA1-Fuzeon® se replegó en presencia de Ca2+ y se incubó con Factor Xa durante 10 min, 40 min y 120 min. Las flechas indican la posición de los productos de escisión HlyA1 y Fuzeon®.

La Figura 14 muestra experimentos de IB de HlyA1 M88A-Met-péptido 103 que se desnaturalizaron y se incubaron con CNBr durante los períodos indicados. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE. El producto de escisión HlyA1 M88A-Met es visible en el gel. No se obtuvieron productos de escisión no específicos. Dado que el péptido 103 no se tiñó con CBB (presumiblemente debido a su peso molecular relativamente pequeño), se purificó por HPLC y se secuenció de nuevo mediante espectrometría de masas. Utilizando semejante método, se identificó el péptido 103.

La Figura 15 muestra los análisis de expresión de HlyA1 M88A-Met-péptido 3 en cultivos discontinuos y

fermentación. Las células de E. coli que portaban el plásmido pIAR_115 se incubaron en cultivos discontinuos (calle izquierda), o mediante fermentación con glucosa (calle central) o glicerol (calle derecha) como alimento. Se obtuvieron altas densidades celulares (> 50) por fermentación con glucosa y glicerina como alimento. Sin embargo, la glucosa parece reprimir la expresión de la proteína de fusión en las condiciones utilizadas. En presencia de glicerol, en cambio, se lograron altas densidades celulares y altos niveles de expresión.

La Figura 16 muestra el análisis de secreción de diferentes péptidos fusionados a HlyA1. A: Análisis de secreción de los péptidos 101, 102 y 103 fusionados a HlyA1. Los PeOI se fusionaron C-terminalmente a HlyA1 (plásmidos pIAR_101, pIAR_102 y pIAR_103) y se coexpresaron con HlyB y HlyD (pK184-HlyBD). Las muestras de producto lisado celular y sobrenadante se analizaron mediante SDS-PAGE. B: Análisis de secreción de HlyA1-Mab40. Las células expresaron HlyA1-Mab40 y, si se indica por medio de a+, HlyB y HlyD (del plásmido pK184-HlyBD). Además, se investigó la influencia de IPTG y pantallas (aireación diferente) para la expresión y secreción. Después del crecimiento celular, el producto lisado celular y las muestras de sobrenadante se analizaron mediante SDS-PAGE. Los péptidos analizados fusionados C-terminalmente a HlyA1 fueron secretados de manera eficaz por el T1SS exclusivo.

Descripción detallada de la invención

Los términos utilizados en la presente memoria tienen, a menos que se indique explícitamente lo contrario, los siguientes significados.

"Al menos uno", según se utiliza en la presente memoria, se refiere a uno o más, en particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más.

"Aislado" o "aislando", según se utiliza de forma indistinta en la presente memoria en relación con una molécula, significa que dicha molécula se ha separado al menos parcialmente de otras moléculas que están asociadas de forma natural con dicha molécula. "Aislado" puede significar que la molécula se ha purificado para separarla de otras moléculas y componentes, tales como otras proteínas y ácidos nucleicos y desechos celulares que pueden originarse en una célula anfitriona.

"Ácido nucleico" según se utiliza en la presente memoria incluye todas las formas naturales de ácidos nucleicos, tales como ADN y ARN.

Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico son ADN. "Identidad de secuencia de ácido nucleico" según se utiliza en la presente memoria, significa que el residuo en una posición dada es idéntico al de una posición correspondiente de un ácido nucleico de referencia. La identidad de secuencia de ácido nucleico preferida de la presente invención es 80%, más preferida 90% o aún más preferida 95%.

El término "fragmento", según se utiliza en la presente memoria en conexión con una molécula de ácido nucleico, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se compara con su secuencia de ácido nucleico de referencia acortada en uno o más nucleótidos terminales 3' o 5'. El acortamiento se produce en el extremo 3', el extremo 5' o ambos, de modo que queda una cadena contigua de nucleótidos de la secuencia de referencia. El fragmento tiene preferiblemente una longitud de al menos 20, más preferiblemente al menos 50 nucleótidos.

El término "péptido" se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva para designar un polímero de residuos de aminoácido conectados entre sí mediante enlaces peptídicos. Un péptido de acuerdo con la presente invención tiene 2-100 residuos de aminoácido.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se utilizan indistintamente a lo largo de la memoria descriptiva para designar un polímero de residuos de aminoácido conectados entre sí mediante enlaces peptídicos. Una proteína o polipéptido de acuerdo con la presente invención tiene preferiblemente 100 o más residuos de aminoácido.

Los términos "proteína de interés", "PrOI" o "péptido de interés", "PeOI", según se utilizan en la presente memoria, se refieren a cualquier producto génico que se expresa mediante expresión recombinante. El término "un péptido o una proteína de interés" según se describe en la presente memoria abarca cualquier péptido o proteína de origen natural o no natural. En algunas realizaciones, el PeOI o la PrOI son un péptido o proteína no naturales/sintéticos. Sintético a este respecto significa que la secuencia del péptido o la proteína ha sido diseñada artificialmente. De este modo, una secuencia que codifica un PeOI o una PrOI puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica uno, dos o más péptidos o proteínas de origen natural. Estos péptidos o proteínas de origen natural se pueden haber modificado adicionalmente, p. ej., mediante mutagénesis de la secuencia codificante.

El término "fragmento N-terminal" se refiere a una secuencia de péptido o proteína que está truncada Cterminalmente en comparación con una secuencia de péptido o proteína de referencia, de manera que permanece el polímero de aminoácidos contiguo que comienza en el extremo N del péptido o la proteína. En algunas realizaciones, tales fragmentos pueden tener una longitud de al menos 10 aminoácidos.

El término "fragmento C-terminal" se refiere a una secuencia de péptido o proteína que está truncada Nterminalmente en comparación con una secuencia de péptido o proteína de referencia, de manera que permanece el polímero de aminoácidos contiguo que comienza en el extremo C del péptido o la proteína. En algunas realizaciones, tales fragmentos pueden tener una longitud de al menos 10 aminoácidos.

El término "proteína de fusión" según se utiliza en la presente memoria se refiere a péptidos y proteínas que están conectados N-o C-terminalmente entre sí. Tales proteínas de fusión pueden estar codificadas por secuencias de ácido nucleico que están fusionadas operablemente entre sí. En ciertas realizaciones, una proteína de fusión se refiere a al menos un PeOI o una PrOI fusionados C-terminalmente a una cadena polipeptídica de acuerdo con la invención, por ejemplo, una cadena polipeptídica que comprende HlyA o un fragmento de la misma o un homólogo de la misma.

Generalmente, el experto en la técnica entiende que para poner en práctica la presente invención, cualquier secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria puede o debe comprender un codón de inicio y/o parada adicional o que un codón de inicio y/o parada de cualquiera de las secuencias descritas en la presente memoria puede o debe ser eliminado dependiendo de la construcción de ácido nucleico utilizada. El experto en la técnica basará esta decisión, p. ej., en si una secuencia de ácido nucleico comprendida en la molécula de ácido nucleico de la presente invención debe traducirse y/o debe traducirse como una proteína de fusión.

El término "introducir" en relación con una molécula de ácido nucleico, según se utiliza en la presente memoria, se refiere a la absorción e incorporación de ADN exógeno en una célula anfitriona. Tal absorción de la molécula de ácido nucleico puede depender de la competencia natural de la célula anfitriona o de métodos de transfección tales como la electroporación o la transformación con cloruro de calcio, que son bien conocidos en la técnica.

El término "célula anfitriona" según se utiliza en la presente memoria se refiere a un organismo que alberga la molécula de ácido nucleico o un vector que codifica el PeOI o la PrOI recombinantes. En realizaciones preferidas, la célula anfitriona es una célula procariota. En realizaciones más preferidas, la célula anfitriona es E. coli que puede incluir, pero no se limita a, las cepas BL21, DH1, DH5α, DM1, HB101, JM101-110, K12, Rosetta (DE3) pLysS, SURE, TOP10, XL1-Blue, XL2-Blue y XL10-Blue.

Los términos "expresión" o "expresado", según se utilizan indistintamente en la presente memoria, se refieren a un proceso en el que la información de un gen se utiliza para la síntesis de un producto génico. En sistemas de expresión basados en células, la expresión comprende etapas de transcripción y traducción.

El término "expresión recombinante", según se utiliza en la presente memoria, se refiere a la transcripción y traducción de un gen exógeno en un organismo anfitrión. El ADN exógeno se refiere a cualquier ácido desoxirribonucleico que se origina fuera de dicho organismo. El término "heterólogo" según se utiliza en la presente memoria en relación con las proteínas se refiere a una proteína que se expresa a partir de un ADN exógeno. Esto también incluye proteínas que se expresan a partir de secuencias de ácido nucleico que son idénticas a las secuencias de ácido nucleico endógeno y que se duplicaron artificialmente.

El término "producción", según se utiliza en la presente memoria en relación con un péptido o proteína recombinantes, significa que un péptido o una proteína recombinantes se expresan en una célula anfitriona y posteriormente se aíslan de otras moléculas de la célula anfitriona.

"Cultivando", "cultivar" o "cultivo", según se utilizan en la presente memoria, se refieren al crecimiento de una célula anfitriona en un medio de cultivo especialmente preparado en condiciones supervisadas. Los términos "condiciones adecuadas para la expresión recombinante" o "condiciones que permiten la expresión" se refieren a condiciones que permiten la producción de la PrOI en células anfitrionas utilizando métodos conocidos en la técnica, en donde las células se cultivan en medios y condiciones de temperatura definidos. El medio puede ser un medio nutriente, mínimo, selectivo, diferencial o enriquecido. Preferiblemente, el medio es un medio de cultivo mínimo. El crecimiento y la temperatura de expresión de la célula anfitriona pueden oscilar entre 4ºC y 45ºC. Preferiblemente, el crecimiento y la temperatura de expresión oscilan entre 30ºC y 39ºC. El término "medio de expresión" según se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquiera de los medios anteriores cuando se utilizan para el cultivo de una célula anfitriona durante la expresión de una proteína.

El término "someter" según se utiliza en la presente memoria significa que diversos componentes, por ejemplo proteínas y un tampón, se ponen en contacto.

Los términos "cuerpo de inclusión" o "IB", según se utilizan de forma indistinta en la presente memoria, se refieren a productos agregados nucleares o citoplásmicos de sustancias, por ejemplo, proteínas. Los IB no están disueltos y tienen una membrana lipídica no unitaria. En el método de la presente invención, los IB consisten principalmente en la proteína de fusión que comprende al menos un PeOT o una PrOT y al menos un alocrito de un T1SS o un fragmento del mismo.

Los términos "sustrato" o "alocrito", según se utilizan de forma indistinta en la presente memoria, se refieren a un soluto que puede ser la carga de un T1SS. El sustrato o alocrito es una proteína que contiene motivos de secuencia de péptidos específicos, tales como las repeticiones GG y la señal de secreción, que permiten el transporte a través

del T1SS.

Los términos "sistema de secreción de tipo 1" o "T1SS " según se utilizan indistintamente en la presente memoria se refieren a un complejo de proteína que consiste en tres subunidades proteicas: una proteína transportadora ABC, una MFP y una OMP. Los transportadores ABC son proteínas transmembrana que utilizan la energía de la hidrólisis de adenosina trifosfato (ATP) para llevar a cabo ciertos procesos biológicos, incluida la translocación de diversos sustratos a través de las membranas. Las proteínas de la familia MFP funcionan como proteínas auxiliares o "adaptadores", que conectan un portador primario en la membrana citoplasmática de una bacteria Gram-negativa con una proteína del factor de membrana externo que cumple una función de porina o de canal en la membrana externa. Por lo tanto, el complejo proteico tripartito permite el transporte de varias moléculas, tales como iones, fármacos y proteínas, para pasar la membrana interna y externa de bacterias Gram negativas. Un subgrupo de sustratos de T1SS son las toxinas RTX (repeticiones en toxinas).

El término "conformación tridimensional funcional" según se utiliza en la presente memoria en relación con proteínas se refiere a la estructura de una proteína que permite que dicha proteína tenga una actividad específica tal como catálisis de un sustrato, localización específica de una proteína o interacción con otras proteínas que es al menos 5%, 10%, 20%, 40% o 50%, o más preferiblemente al menos 80%, o incluso más preferiblemente 100% de la actividad de la misma proteína en su conformación nativa. Una conformación tridimensional funcional generalmente requiere que la proteína sea soluble. La conformación nativa de una proteína es su forma adecuadamente plegada y/o ensamblada, que es operativa y funcional. El estado nativo de una biomolécula puede poseer los cuatro niveles de estructura biomolecular, estando formada la estructura secundaria a cuaternaria a partir de interacciones débiles a lo largo de la cadena principal unida covalentemente. Esto está en contraste con el estado desnaturalizado, en el cual estas interacciones débiles se interrumpen, llevando a la pérdida de estas formas de estructura y reteniendo solo la estructura primaria de la biomolécula.

El término "inhibir", según se utiliza en la presente memoria, se refiere a una reducción detectable y significativa de la actividad de la proteína o la actividad de expresión génica causada por una molécula efectora. Los métodos para detectar la actividad proteica o la expresión génica son conocidos en la técnica.

La presente invención se refiere a métodos que comprenden secuencias de ácido nucleico de sustratos/alocritos de sistemas de secreción de Tipo 1 o fragmentos de los mismos para la producción eficaz de péptidos y proteínas recombinantes de interés. Los alocritos o fragmentos de los mismos mejoran la expresión de péptidos y proteína de interés como cuerpos de inclusión (IB) y funcionan como etiquetas IB. De manera importante, los alocritos y fragmentos de los mismos permiten la renaturalización eficaz de los cuerpos de inclusión en una conformación tridimensional funcional. Por lo tanto, los alocritos o fragmentos de los mismos combinan las ventajas de las etiquetas IB y las etiquetas de solubilidad sin los inconvenientes correspondientes.

El sistema de secreción Hly es un sistema de secreción de proteínas, que se produce principalmente en bacterias Gram negativas. Este sistema de secreción pertenece a la familia de T1SS, que transportan sus sustratos de una manera dirigida por ATP en una sola etapa desde el citosol hasta el espacio extracelular sin una estación intermedia en el periplasma. El sistema de secreción Hly comprende HlyB, que representa un transportador ABC, la MFP HlyD y la OMP ToIC universal. La toxina hemolítica HlyA de 110 kDa es un sustrato de transporte del sistema de secreción Hly. A nivel genético, los componentes necesarios para la secreción específica de HlyA están organizados en una estructura de operón. La secuencia de ácido nucleico que codifica HlyC también forma parte de este operón, pero no es necesaria para la secreción de HlyA a través del sistema de secreción de Hly. HlyC cataliza la acilación de HlyA, lo que hace que HlyA sea hemolítica. HlyA es una proteína, que consiste en 1024 residuos de aminoácido y requiere para su exportación a través del sistema de secreción Hly su extremo C que comprende aproximadamente 40-60 aminoácidos denominados señal de secreción. Además, HlyA se caracteriza por un dominio que comprende varias repeticiones ricas en glicina (GG) (GGXGXDXUX, en donde X puede ser cualquier aminoácido, U es un aminoácido grande hidrófobo situado en el extremo N de la señal de secreción). Las repeticiones GG son la característica de las repeticiones en la familia de las toxinas (RTX). Las repeticiones GG se unen a Ca2+ que induce su plegamiento. Por lo tanto, en ausencia de Ca2+, el dominio que comprende las repeticiones de GG no está estructurado. La secuencia de aminoácidos de una proteína HlyA se expone en SEQ ID NO: 2, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en el SEQ ID NO: 1. Un fragmento de HlyA, que se expresó a niveles mejorados en comparación con HlyA de tipo salvaje y carece de la parte N-terminal de HlyA (Figura 1) se denominó HlyA1. La secuencia de aminoácidos de HlyA1 se expone en SEQ ID NO: 4 mientras que la secuencia de nucleótidos codificante se expone en SEQ ID NO: 3.

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de los autores de la presente invención de que un PeOI o una PrOI fusionados con al menos un alocrito de un T1SS o un fragmento del mismo conduce a la expresión de la proteína de fusión en forma de IB incluso si el PeOI o la PrOI solos no conjugados se expresan en una forma soluble. Adicionalmente, los autores de la presente invención descubrieron que el Ca2+ induce el plegamiento del IB desnaturalizado de las proteínas de fusión que consisten en el alocrito y el PeOI o la PrOI en una conformación tridimensional soluble y funcional. Por lo tanto, los alocritos o fragmentos de los mismos son etiquetas bifuncionales que combinan las ventajas de las etiquetas IB (alto rendimiento, alta pureza inicial, inmunidad contra degradación proteolítica) y las etiquetas de solubilidad (productos solubles, bioactivos) sin las desventajas correspondientes (etiquetas-cuerpos de inclusión: productos agregados no activos; etiquetas de solubilidad: rendimientos bastante

bajos, baja pureza, propensos a la degradación proteolítica).

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un PeOI o una PrOI recombinantes, en donde el método comprende: (a) introducir una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende al menos un PeOI o una PrOI, y al menos un alocrito de un T1SS o un fragmento del mismo, en una célula anfitriona, en donde dicho fragmento tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos; (b) cultivar la célula anfitriona en condiciones que permiten la expresión de la proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se expresa en forma de IB; (c) aislar la proteína de fusión recombinante de dichas células anfitrionas. Las realizaciones adicionales pueden comprender la etapa (d) de someter la proteína de fusión recombinante a condiciones que permiten que el PeOI o la PrOI se plieguen en una conformación tridimensional funcional. En varias otras realizaciones del primer aspecto, la célula anfitriona no expresa un transportador ABC heterólogo, una MFP heteróloga y/o una OMP heteróloga del T1SS.

En diversas realizaciones, este aspecto de la invención también incluye alocritos de un T1SS que se seleccionan del grupo que consiste en HlyA, CyaA, EhxA, LktA, PlLktA, PasA, PvxA, MmxA, LtxA, ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, ApxIVA, ApxI , ApxII, AqxA, VcRtxA, VvRtxA, MbxA, citotoxina RTX, RtxL1, RtxL2, FrhA, LipA, TliA, PrtA, PrtSM, PrtG, PrtB, PrtC, AprA, AprX, ZapA, ZapE, Sap, HasA, colicina V, LapA , ORF, RzcA, RtxA, XF2407, XF2759, RzcA, RsaA, Crs, CsxA, CsxB, SlaA, SwmA, S111951, NodO, PlyA, PlyB, FrpA, FrpC, tipo FrpC u otros alocritos de T1SS como describen Linhartova et al. (Linhartova, 1. et al., FEMS Microbiol Rev 34, 1076-1112, FMR231 [pii]10.1111/j.15746976.2010.00231.x) y fragmentos de los mismos. En diversas realizaciones preferidas, los alocritos se caracterizan por la presencia de al menos una repetición GG de la secuencia consenso GGxGxDxUx (en donde X puede ser cualquier aminoácido, U es un aminoácido grande hidrófobo). En realizaciones más preferidas, el alocrito de un T1SS es HlyA que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, un fragmento de la misma o un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o el fragmento de la misma. En otras diversas realizaciones, el fragmento de HlyA consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 o un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

En diversas realizaciones, este aspecto de la invención también incluye homólogos de las secuencias antes mencionadas de SEQ ID NO: 1-4. El término "homólogo" según se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que tiene una secuencia altamente similar o una alta identidad de secuencia (p. ej., 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o más) con otra secuencia de polinucleótidos o polipéptidos o parte de la misma. Con respecto a la molécula de ácido nucleico anterior, el término homólogo incluye de ese modo secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 70, preferiblemente 80, más preferiblemente 90, incluso más preferiblemente 95, 97,5 o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la primera secuencia de ácido nucleico definida más arriba. La identidad de secuencia puede ocurrir en un tramo continuo de nucleótidos

o puede ser discontinua.

En diversas realizaciones del primer aspecto de la invención, el alocrito de un T1SS se puede fusionar al extremo C del PeOI o la PrOI. En otras diversas realizaciones del primer aspecto, el alocrito se puede fusionar al extremo N del PeOI o la PrOI.

En una realización, el medio de expresión comprende 20,0 mM o menos de Ca2+. En una realización más preferida, la concentración de Ca2+ en el medio de expresión es 0,1 mM o menos.

En diversas realizaciones, se inhibe la expresión del gen transportador ABC endógeno, el gen MFP endógeno y/o el gen OMP endógeno del T1SS o la actividad de los productos génicos correspondientes en la célula anfitriona. En diversas realizaciones, la célula anfitriona no expresa el transportador ABC endógeno, la MFP endógena y/o la OMP endógena del T1SS. Los métodos para inhibir la expresión de genes tales como su deleción o inserción de secuencias de nucleótidos que destruyen la integridad de la secuencia promotora o el propio gen son conocidos en la técnica. Una actividad de expresión génica preferida después de la deleción o interrupción puede ser inferior a 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o 5% de la actividad medida en células no tratadas. En otras diversas realizaciones de la invención, el transportador ABC endógeno, la MFP endógena y/o la OMP endógena del sistema de secreción de tipo 1 son inhibidos por anticuerpos o inhibidores de molécula pequeña. En realizaciones preferidas de la invención, la actividad del transportador ABC es inhibida por ortovanadato o un inhibidor homólogo de ATP tal como 8-azido-ATP. Dichos miméticos de ATP son conocidos en la técnica. La actividad proteica preferida después del tratamiento con inhibidor puede ser inferior a 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o 5% de la actividad medida en células no tratadas. En otras realizaciones de la invención, el transporte es inhibido o bloqueado por el propio alocrito, por ejemplo, mediante expresión en exceso los alocritos o anclaje de péptidos y proteínas de fusión.

En otras realizaciones, el péptido o proteína recombinantes se exponen a un tampón de replegamiento, en donde el tampón de replegamiento comprende al menos 0,01, más preferentemente 0,01-40 mM de Ca2+.

En diversas realizaciones de los métodos de la invención, (I) la célula anfitriona es una célula procariota; y/o (II) la expresión se realiza en medio de cultivo mínimo; y/o (III) el péptido o proteína de fusión recombinantes se purifican utilizando un método seleccionado entre cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño, y combinaciones de las mismas; y/o (IV) el

método comprende la etapa adicional (e) de poner en contacto la proteína de fusión recombinante con una proteasa adecuada para la escisión de la proteína de fusión para producir el alocrito y el PeOI o la PrOI como moléculas separadas; y/o (V) el método comprende una etapa (e) como se define en (IV) seguida de la purificación del PeOI o la PrOI.

En otra realización más, la presente invención también se puede referirse a un método en donde al menos un PeOI

o una PrOI se seleccionan del grupo que consiste en Nisina, HCRF, IFABP, IFNA2, MBP, péptido 101, péptido 102, péptido 103, MAB-40 Mab-42, Fuzeon®, calcitonina de salmón, calcitonina humana, péptido inhibidor 1, péptido 238 como se expone en SEQ ID NO: 53, péptido 239 como se expone en SEQ ID NO: 54, péptido 240 como se expone en SEQ ID NO: 55, y péptido 241 como se expone en SEQ ID NO: 56.

La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos reguladora que modula la expresión de la proteína de fusión en diversas realizaciones. Una secuencia de ácido nucleico reguladora preferida se expone en SEQ ID NO: 39. El término "secuencia de nucleótidos reguladora" según se utiliza en la presente memoria se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que están ubicadas 5' con respecto a un gen y potencian la actividad de expresión de dicho gen.

El término "etiqueta de afinidad" según se utilizan en la presente memoria se refiere a entidades, que están acopladas a PeOI o PrOI y permiten el enriquecimiento del PeOI o la PrOI etiquetados utilizando un receptor de etiqueta de afinidad. El término "cromatografía de afinidad" según se utiliza en la presente memoria se refiere a la formación del complejo del péptido o proteína etiquetados y el receptor. En ciertas realizaciones, las etiquetas de afinidad se pueden seleccionar del grupo que consiste en Strep-tag® o Strep-tag® II, la etiqueta myc, la etiqueta FLAG, la etiqueta His, la etiqueta modificadora de tipo ubiquitina pequeña (SUMO), la etiqueta de péptido NorpD covalente pero disociable (CYD), la etiqueta de cadena pesada de proteína C (HPC), la etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP) o la etiqueta HA o proteínas tales como la proteína de unión a estreptavidina (SBP), la proteína de unión a maltosa (MBP) y la glutatión-S-transferasa.

El término "sitio de escisión de proteasa" se refiere a una secuencia de péptidos que se puede escindir por medio de una proteasa seleccionada, permitiendo de este modo la separación de secuencias de péptidos o proteínas que están interconectadas por un sitio de escisión de proteasa. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión de proteasa se selecciona del grupo que consiste en un sitio de escisión de Factor Xa, una proteasa de virus del grabado del tabaco (TEV), una enteroquinasa, una proteasa que expresa SUMO, una Proteasa de IgA, una proteinasa de Arg-C, endopeptidasas de Asp-N, endopeptidasa de Asp-N + Glu N-terminal, caspasa1, caspasa2, caspasa3, caspasa4, caspasa5, caspasa6, caspasa7, caspasa8, caspasa9, caspasalü, alta especificidad para quimotripsina, baja especificidad para quimotripsina, clostripaina (Clostridiopeptidasa B), glutamil endopeptidasa, granzimaB, pepsina, prolina-endopeptidasa, proteininasa K, peptidasa estafilocócica I, Trombina, Tripsina, y Termolisina.

El término escisión química se refiere a la escisión de enlaces peptídicos causada por un compuesto químico. Tales compuestos pueden incluir, pero no están limitados a, bromuro de cianógeno (CNBr) que escinde en el extremo C de residuos de metionina, BNPS-escatol, NCS o TFA que escinden en el extremo C de residuos de triptófano e iones Ni2+ que escinden en el extremo C del tetrapéptido S/TXHZ (X y Z pueden ser cualquier residuo de aminoácido, excepto X = prolina) (Kopera et al., (2012), Plos One 7(5)).

"Fusionado", según se utiliza en el contexto de esta invención, significa que los péptidos o proteínas resultantes están directamente conectados entre sí o unidos entre sí por uno o más aminoácidos, péptidos o proteínas, p.ej., uno o más sitios de escisión de proteasa y/o etiquetas de afinidad.

Si el PeOI o la PrOI comprenden dos o más péptidos o proteínas de origen natural, los dos o más péptidos o proteínas pueden estar separados por sitios de escisión de proteasa.

En general, se puede elegir cualquier péptido o proteína como PeOI o PrOI. En ciertas realizaciones, la PrOI es una proteína que no forma un homo-dímero u homo-multímero. La evitación de péptidos o proteínas que interactúan por sí mismos puede ser ventajosa si el péptido o la proteína recombinantes se van a secretar en el sobrenadante del cultivo celular, porque la formación de complejos de proteína más grandes puede alterar una exportación de proteína eficaz. Sin embargo, la PrOI también puede ser un péptido o proteína, que es una subunidad de un complejo de péptido o proteína más grande. Dichos péptido o proteína se pueden aislar después de la expresión y opcionalmente la secreción y ser adecuados para una reconstitución in vitro del complejo de múltiples péptidos o proteínas. En ciertas realizaciones, el PeOI o la PrOI son un péptido que tiene menos de 100 residuos de aminoácido. Si estos péptidos comprenden secuencias pre y/o pro en su estado nativo después de la traducción, la secuencia de ácido nucleico que codifica la PeOI se puede modificar genéticamente para que se limite a la secuencia que codifica el péptido maduro. Un péptido ilustrativo es la insulina, p. ej., insulina humana. La secreción de péptidos y proteínas expresados en exceso es especialmente ventajosa cuando el péptido o la proteína son dañinos para la célula anfitriona. Por esta razón, la presente invención es particularmente ventajosa para la expresión de lipasas y proteasas que se sabe que son tóxicas para la célula anfitriona y, por lo tanto, la expresión de estas proteínas por los sistemas y métodos de la invención representa una realización específica de la presente invención.

En diversas realizaciones, el PeOI o la PrOI son una enzima.

La International Union of Biochemistry and Molecular Biology ha desarrollado una nomenclatura para enzimas, los números EC; cada enzima se describe por una secuencia de cuatro números precedidos por "EC". El primer número clasifica ampliamente la enzima en función de su mecanismo.

La nomenclatura completa se puede consultar en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/.

Por consiguiente, un PeOI o una PrOI de acuerdo con la presente invención se puede elegir entre cualquiera de las clases EC1 (Oxidorreductasas), EC2 (Transferasas), EC3 (Hidrolasas), EC4 (Liasas), EC5 (Isomerasas), y EC6 (Ligasas), y las subclases de las mismas.

En ciertas realizaciones, el PeOI o la PrOI dependen del cofactor o albergan un grupo prostético. Para la expresión de tales péptidos o proteínas, en algunas realizaciones, el cofactor o grupo prostético correspondiente se puede añadir al medio de cultivo durante la expresión.

En ciertos casos, el PeOI o la PrOI son una deshidrogenasa o una oxidasa.

En caso de que el PeOI o la PrOI sean una deshidrogenasa, en algunas realizaciones, el PeOI o la PrOI se eligen del grupo que consiste en alcohol deshidrogenasas, glutamato deshidrogenasas, lactato deshidrogenasas, celobiosa deshidrogenasas, formiato deshidrogenasas y aldehído deshidrogenasas.

En caso de que el PeOI o la PrOI sean una oxidasa, en algunas realizaciones, el PeOI o la PrOI se eligen del grupo que consiste en oxidorreductasas del citocromo P450, en particular P450 BM3 y mutantes de las mismas, peroxidasas, monooxigenasas, hidrogenasas, monoaminooxidasas, aldehído oxidasas, xantina oxidasas, oxidasas de aminoácidos y oxidasas de NADH.

En realizaciones adicionales, el PeOI o la PrOI son una transaminasa o una quinasa.

En caso de que el PeOI o la PrOI sean una transaminasa, en algunas realizaciones, el PeOI o la PrOI se eligen del grupo que consiste en alanina aminotransferasas, aspartato aminotransferasas, glutamato-oxaloacético transaminasas, histidinol-fosfato transaminasas e histidinol-piruvato transaminasas.

En diversas realizaciones, si el PeOI o la PrOI son una quinasa, el PeOI o la PrOI se eligen del grupo que consiste en nucleósido difosfato quinasas, nucleósido monofosfato quinasas, piruvato quinasa y glucoquinasas.

En algunas realizaciones, si el PeOI o la PrOI son una hidrolasa, el PeOI o la PrOI se eligen del grupo que consiste en lipasas, amilasas, proteasas, celulasas, nitrilo hidrolasas, halogenasas, fosfolipasas y esterasas.

En ciertas realizaciones, si el PeOI o la PrOI son una liasa, el PeOI o la PrOI se eligen del grupo que consiste en aldolasas, p. ej., hidroxinitrilo liasas, enzimas dependientes de tiamina, p. ej., benzaldehído liasas y piruvato descarboxilasas.

En diversas realizaciones, si el PeOI o la PrOI son una isomerasa, el PeOI o la PrOI se eligen del grupo que consiste en isomerasas y mutasas.

En algunas realizaciones, si el PeOI o la PrOI son una ligasa, el PeOI o la PrOI pueden ser una ADN ligasa.

En ciertas realizaciones, el PeOI o la PrOI pueden ser un anticuerpo. Esto puede incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, cuyas inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de las mismas pueden incluir Fab, Fv y F(ab')2, Fab', y similares.

También se contemplan en la presente memoria PeOI y PrOI terapéuticamente activos, p. ej., una citoquina.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el PeOI o la PrOI se seleccionan del grupo que consiste en citoquinas, en particular interferones humanos o murinos, interleuquinas, factores estimuladores de colonias, factores de necrosis,

p. ej., factor de necrosis tumoral y factores de crecimiento.

En algunas realizaciones, si el PeOI o la PrOI son un interferón, el PeOI o la PrOI se pueden seleccionar del grupo que consiste en interferón alfa, p. ej., alfa-1, alfa-2, alfa-2a y alfa-2b, alfa-2, alfa-8, alfa-16, alfa 21, beta, p. ej., beta1, beta-1a y beta-1b o gamma.

En realizaciones adicionales, el PeOI o la PrOI son un péptido antimicrobiano, en particular un péptido seleccionado del grupo que consiste en bacteriocinas y lantibióticos, p. ej., nisina, catelicidinas, defensinas y saposinas.

En realizaciones adicionales, el PeOI o la PrOI son un péptido adherente con especificidades de superficie distintas, por ejemplo, para acero, aluminio y otros metales o especificidades hacia otras superficies como carbono, cerámica, minerales, plásticos, madera y otros materiales u otros materiales biológicos como células, o péptidos adherentes que funcionan en ambientes acuosos y en condiciones anaerobias.

En realizaciones adicionales, el PeOI o la PrOI tienen una longitud que varía de 2 a 100 aminoácidos, en donde dichos aminoácidos se seleccionan del grupo de los 20 aminoácidos proteinógenos. Más preferiblemente, dichos PeOI o PrOI se seleccionan del grupo de péptidos o proteínas que consisten en DYKDDDDKMASMTGGQQMGHHHHHH (SEQ ID NO: 45), MGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP (SEQ ID NO: 46), ENREVPPGFTALIKTLRKCKII (SEQ ID NO: 47), NLVSGLIEARKYLEWLHRKLKNCKV (SEQ ID NO: 48), HHHHHHIEGRAMSILKSPIDERSILK (SEQ ID NO: 49), HHHHHHIEGRPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPG (SEQ ID NO: 50), HHHHHHIEGRGAPGAPGSQGAPGLQ (SEQ ID NO: 51), GGGRGDMGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPRGDGGG (SEQ ID NO: 52).

También se describen en la presente memoria PeOI o PrOI, que son péptidos o proteínas terapéuticamente activos. En ciertas realizaciones, el PeOI o la PrOI son un péptido terapéuticamente activo. En algunas realizaciones, un péptido terapéuticamente activo se puede seleccionar del grupo que consiste en Fuzeon/T20, calcitonina humana, calcitonina de salmón, factor de liberación de corticotropina humana, Mab40, Mab42, péptidos asociados con la enfermedad de Alzheimer, exenatida, glatiramer/copaxona, teriparatida/forsteo, Romiplostim/Nplate, Pramlintide/Symlin, timalfasina/Zadaxin, enfuvirtida, hormonas de andrenocorticotropina (ACTH), péptido natriurético cerebral, Nesiritide/Natrecor, corticoliberina, sermorelina, somatorelina, secretina (humana y porcina), terlipresina, sinapultida, teduglutida, vx-001, péptido intestinal vasoactivo, Aviptadil, linaclotida y teduglutida.

En ciertas realizaciones, PeOI o PrOI es un sustrato de secreción de tipo I. Más de 1000 proteínas están anotadas o han sido descritas como sustratos de secreción de tipo I en la bibliografía. Muchos de ellos tienen características interesantes para el uso biotecnológico, en particular las hidrolasas como proteasas y lipasas. Las proteasas y lipasas adecuadas han sido descritas por Baumann et al. (1993) EMBO J 12, 3357-3364; y Meier et al. (2007) J. BIOL. CHEM.: 282(43), pág. 31477-31483.

Por supuesto, la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un PeOI o una PrOI se pueden someter a mutagénesis y, por lo tanto, conducir a un PeOI o una PrOI mutados a nivel de proteína.

El término "mutación", según se utiliza en la presente memoria, se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos de una secuencia de nucleótidos o proteína dadas e incluye sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones. En un ejemplo específico, la mutación es una mutación puntual, es decir, el remplazo de uno o más nucleótidos y/o aminoácidos en una secuencia dada. Se entiende que si el término "mutación" se utiliza en relación con una secuencia de proteína, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede comprender mutaciones o modificaciones múltiples, incluyendo mutaciones silenciosas que, por ejemplo, sirven para aumentar la eficacia de la expresión (optimización de codones) sin cambiar la secuencia de aminoácidos. En la presente invención, la mutación es preferiblemente la sustitución de uno o dos aminoácidos por otros aminoácidos. Alternativamente o además, la molécula de ácido nucleico puede comprender intercambios de nucleótidos que no alteran la secuencia de proteína codificada, denominadas mutaciones silenciosas. En algunas realizaciones, las mutaciones, p. ej., las mutaciones silenciosas aumentan la eficacia de expresión y/o la eficacia de secreción del péptido o proteína codificados por la molécula de ácido nucleico. De manera importante, las mutaciones se pueden inducir en toda la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Por lo tanto, las mutaciones pueden no estar limitadas a secuencias que codifican un péptido o proteína. En consecuencia, también se pueden someter a mutagénesis tramos de secuencias no codificantes. Este tipo de mutación también cae dentro del alcance del término mutación silenciosa. La mutagénesis de secuencias no codificantes puede ser ventajosa, p. ej., para lograr una mejora de la expresión y/o secreción de un péptido o proteína codificados por un tramo de secuencia diferente dentro de la molécula de ácido nucleico.

El término "mutagénesis" según se utiliza en la presente memoria significa que las condiciones experimentales se eligen de modo que el aminoácido que se produce naturalmente en una posición de secuencia dada de una secuencia de proteína se pueda sustituir por al menos un aminoácido que no está presente en esta posición específica en el secuencia polipeptídica natural respectiva. El término "mutagénesis" también incluye la modificación (adicional) de la longitud de segmentos de secuencia por deleción o inserción de uno o más aminoácidos. Por lo tanto, está dentro del alcance de la invención que, por ejemplo, un aminoácido en una posición de secuencia elegida se remplace por un tramo de tres mutaciones aleatorias, lo que conduce a una inserción de dos residuos de aminoácido en comparación con la longitud del segmento respectivo de la proteína de tipo salvaje. Semejante inserción o deleción se pueden introducir independientemente entre sí en cualquiera de los segmentos peptídicos que se pueden someter a mutagénesis en la invención.

El término "mutagénesis al azar" significa que no está presente ningún aminoácido individual (mutación) predeterminado en una determinada posición de secuencia, sino que uno de al menos dos aminoácidos diferentes se puede incorporar con una cierta probabilidad en una posición de secuencia predefinida durante la mutagénesis.

"Optimización de codones" significa que los codones que codifican un residuo de aminoácido se reemplazan por un codón diferente que codifica el mismo aminoácido, pero que se utiliza con más frecuencia por un organismo anfitrión dado para este aminoácido particular. Se entiende que tales secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido homólogo pueden tener una alta variabilidad de secuencia de modo que la identidad de secuencia entre las

moléculas de ácido nucleico que codifican los mismos polipéptidos u polipéptidos homólogos puede ser baja.

La secuencia codificante natural de una secuencia de proteína, es decir, el segmento génico respectivo de una enzima, se puede utilizar como un punto de partida para la mutagénesis de las posiciones de aminoácidos seleccionadas en la presente invención. Para la mutagénesis de las posiciones de aminoácidos enumeradas, el experto en la técnica tiene a su disposición los diversos métodos convencionales establecidos para la mutagénesis dirigida al sitio (Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Una técnica comúnmente utilizada es la introducción de mutaciones mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utilizando mezclas de oligonucleótidos sintéticos, que tienen una composición de bases degenerada en las posiciones de secuencia deseadas. Por ejemplo, el uso del codón NNK o NNS (en donde N = adenina, guanina, citosina o timina; K = guanina o timina; S = adenina o citosina) permite la incorporación de los 20 aminoácidos más el codón de parada ámbar durante la mutagénesis, mientras que el codón VVS limita el número de aminoácidos posiblemente incorporados a 12, ya que excluye la incorporación de los aminoácidos Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val en la posición seleccionada de la secuencia polipeptídica (V = adenina, guanina o citosina); el uso del codón NMS (en donde M = adenina o citosina), por ejemplo, restringe el número de aminoácidos posibles a 11 en una posición de secuencia seleccionada, ya que excluye la incorporación de los aminoácidos Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val en una posición de secuencia seleccionada. Otra posibilidad es el uso de codones NDT o NDC (en donde D = adenina, guanina o timina) ya que esto proporciona una razón 1:1 entre el número de codones y los aminoácidos codificados, reduce de ese modo el esfuerzo del escrutinio, y conduce a un conjunto equilibrado de 12 residuos de aminoácido polares, no polares, aromáticos, no aromáticos, hidrófilos e hidrófobos (Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Phe, Ser, Tyr, Val (Reetz M. T. et al., 2008, ChemBioChem, 21; 9(11): 1797-804)).

En determinadas realizaciones, el PeOI o la PrOI comprenden una deleción de al menos 10, 20, 30, 40, 50 o más aminoácidos N-y/o C-terminales con respecto a la secuencia del péptido o la proteína de tipo salvaje.

En diversas realizaciones, el PeOI o la PrOI se seleccionan del grupo que consiste en MBP, lipasa CalB, proteasa SprP, hidrolasa PlaB, hidrolasa PlaK, hidrolasa PlbF, lipasa TesA, Vif, interferón humano alfa-1, alfa-2, alfa-8, alfa16, alfa-21, interferón beta humano, interferón gamma humano, interferón alfa murino, interferón gamma murino, IFABP, Cas2, proteína Affibody ZA3, nisina, factor de liberación de corticotropina, péptido amiloide-beta, exenatida, Fuzeon/T20, calcitonina de salmón, Mab40, Mab42, lipasa LipA, SprP, la proteína Vif de VIH-1 y calcitonina humana.

El PeOI o la PrOI se pueden clonar en un vector. En ciertas realizaciones, el vector se selecciona del grupo que consiste en un vector pSU, un vector pET, un vector pBAD, un vector pK184, un vector pMONO, un vector pSELECT, un vector pSELECT-Tag, un vector pVITRO, un vector pVIVO, un vector pORF, un vector pBLAST, un vector pUNO, un vector pDUO, un vector pZERO, un vector pDeNy, un vector pDRIVE, un vector pDRIVE-SEAP, un vector de Fusión HaloTag®, un vector pTARGET™, un vector Flexi®, un vector pDEST, un vector pHIL, un vector pPIC, un vector pMET, un vector pPink, un vector pLP, un vector pTOPO, un vector pBud, un vector pCEP, un vector pCMV, un vector pDisplay, un vector pEF, un vector pFL, un vector pFRT, un vector pFastBac, un vector pGAPZ, un vector pIZ/V5, un vector pLenti6, un vector pMIB, un vector pOG, un vector pOpti, un vector pREP4, un vector pRSET, un vector pSCREEN, un vector pSecTag, un vector pTEF1, un vector pTracer, un vector pTrc, un vector pUB6, un vector pVAX1, un vector pYC2, un vector pYES2, un vector pZeo, un vector pcDNA, un vector pFLAG, un vector pTAC, un vector pT7, un vector Gateway, un vector pQE, un vector pLEXY, un vector pRNA, un vector pPK, un vector pUMVC, un vector pLIVE, un vector pCRUZ, un vector Duet y otros vectores o derivados de los mismos. En realizaciones preferidas, el vector es el vector pSU.

Los vectores de la presente invención se pueden seleccionar del grupo que consiste en vectores de número de copias alto, medio y bajo.

Los vectores descritos anteriormente se pueden utilizar para la transformación o transfección de una célula anfitriona para lograr la expresión de un péptido o proteína que están codificados por una molécula de ácido nucleico descrita anteriormente y comprendida en el ADN del vector.

La célula anfitriona se puede seleccionar específicamente como una célula anfitriona capaz de expresar el gen. Además o de otro modo, para producir un péptido o proteína, un fragmento del péptido o la proteína o una proteína de fusión del péptido o la proteína con otro polipéptido, el ácido nucleico que codifica el péptido o la proteína se puede modificar genéticamente para su expresión en un sistema adecuado. La transformación se puede realizar utilizando técnicas convencionales (Sambrook, J. et al. (2001), más arriba).

Los organismos anfitriones procariotas o eucariotas que comprenden semejante vector para la expresión recombinante de un PeOI o una PrOI como se describe en la presente memoria también forman parte de la presente invención. Las células anfitrionas adecuadas pueden ser células procariotas. En ciertas realizaciones, las células anfitrionas se seleccionan del grupo que consiste en bacterias gram positivas y gram negativas. En algunas realizaciones, la célula anfitriona es una bacteria gram negativa, tal como E. coli. En ciertas realizaciones, la célula anfitriona es E. coli, en particular E. coli BL21 (DE3) u otros derivados de E. coli K12 o E. coli B834 o E. coli DH5α o XL-1. En realizaciones adicionales, la célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste en células de

Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas, Serratia marcescens, Salmonella, Shigella (y otras enterobacteriáceas), Neisseria, Hemophilus, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Helicobacter, Acinetobacter, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, Legionella , bacterias del ácido acético, Bacillus, Bacilos, Corynebacterium, Clostridium, Listeria, Streptococcus, Staphylococcus y Archaea. Las células anfitrionas eucariotas adecuadas son, entre otras, células CHO, células de insecto, hongos, células de levadura, p. ej., Saccharomyces cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris.

Las células anfitrionas transformadas se cultivan en condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o una proteína de la invención. En ciertas realizaciones, las células se cultivan en condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un PeOI o una PrOI.

Para producir PeOI o PrOI recombinantes, se introduce un vector en un organismo anfitrión procariota o eucariota adecuado por medio de tecnología de ADN recombinante. Para este fin, la célula anfitriona se transforma primero con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención utilizando métodos convencionales establecidos (Sambrook, J. et al. (2001), más arriba). La célula anfitriona se cultiva a continuación en condiciones que permiten la expresión del ADN heterólogo y, por lo tanto, la síntesis del polipéptido correspondiente. Posteriormente, el polipéptido se recupera de la célula.

Para la expresión de los péptidos y proteínas de la presente invención, los expertos en la técnica conocen varios protocolos adecuados.

Generalmente, se puede emplear en este método cualquier medio de cultivo conocido adecuado para el crecimiento del anfitrión seleccionado. En diversas realizaciones, el medio es un medio rico o un medio mínimo. También se contempla en la presente memoria un método, en donde las etapas de crecimiento de las células y la expresión del péptido o proteína comprenden el uso de diferentes medios. Por ejemplo, la etapa de crecimiento se puede realizar utilizando un medio enriquecido, que se reemplaza por un medio mínimo en la etapa de expresión. En ciertos casos, el medio se selecciona del grupo que consiste en medio LB, medio TB, medio 2YT, medio sintético y medio mínimo.

En algunas realizaciones, el medio se puede suplementar con IPTG, arabinosa, triptófano y/o maltosa, y/o la temperatura del cultivo se puede cambiar y/o el cultivo se puede exponer a luz UV. En diversas realizaciones, las condiciones que permiten la secreción del péptido o la proteína recombinantes son las mismas que se utilizan para la expresión del péptido o proteína.

En ciertas realizaciones, la célula anfitriona es una célula procariota, tal como E. coli, en particular E. coli BL21 (DE3) y E. coli DH5α.

En algunas realizaciones, el cultivo completo de la célula anfitriona, p. ej., durante el crecimiento y la expresión, se lleva a cabo en un medio mínimo. El medio mínimo es ventajoso para la expresión del péptido o la proteína recombinantes, ya que el contenido de proteína, lípido, carbohidrato, pigmento e impureza en este medio se reduce y por lo tanto evita o reduce la necesidad de etapas de purificación intensivas.

Además, los autores de la presente invención descubrieron que una complementación del tampón de replegamiento con sales de metales alcalinotérreos es ventajosa para someter el PeOI o la PrOI recombinantes a plegamiento en una conformación tridimensional funcional. En algunas realizaciones, la concentración final en el tampón de replegamiento es al menos 0,01 mM. En ciertas realizaciones, el tampón de replegamiento se puede complementar con al menos una sal de metal alcalinotérreo seleccionada del grupo que consiste en una sal de magnesio, sal de calcio, sal de estroncio o sal de bario. En algunas realizaciones, el tampón de replegamiento comprende al menos 0,01 mM de una sal de calcio. La concentración total de sal de metal alcalinotérreo al menos 0,01 mM se puede lograr combinando varias sales de diferentes metales alcalinotérreos y/o el mismo metal alcalinotérreo. Si el metal alcalinotérreo se selecciona entre sal de magnesio, sal de calcio, sal de estroncio o sal de bario, la composición puede comprender al menos 0,01 mM de una única sal de calcio, estroncio o bario o combinaciones de varias sales de magnesio, calcio, estroncio o bario, lo que lleva a una concentración total de al menos 0,01 mM. En particular, se puede lograr una concentración de sal de calcio de al menos 0,01 mM combinando varias sales de calcio que conducen a una concentración total de al menos 0,01 mM. En ciertas realizaciones, las sales de calcio se seleccionan del grupo que consiste en CaCl2, CaCO3, Ca(OH)2, CaSO4.2H2O, Ca3(PO4)2, Ca(CH3COO)2·H2O, y Ca(C2H3O2)2. En realizaciones específicas, el tampón contiene al menos iones Ca2+ 0,01 mM. En diversas realizaciones, la concentración de Ca2+ en el tampón de replegamiento está en el intervalo de 20-100 mM. En una realización preferida, la concentración de Ca2+ es 20 mM.

En diversas realizaciones, el método también abarca la purificación del péptido o la proteína recombinantes, en donde el péptido o la proteína recombinantes se purifican utilizando un método seleccionado entre cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño y combinaciones de las mismas.

En varias realizaciones, el método puede comprender el tratamiento del péptido o la proteína recombinantes con una proteasa adecuada para la escisión de un sitio de escisión de proteasa dentro del péptido o la proteína recombinantes. En algunas realizaciones, el péptido o la proteína recombinantes se purifican antes de la escisión proteolítica utilizando uno o más métodos descritos anteriormente. También después de la escisión del péptido o la

proteína recombinantes, el método puede comprender una etapa de purificación adicional como se ha definido anteriormente. De este modo, en algunas realizaciones, el péptido o la proteína recombinantes se purifican, se someten a escisión proteolítica y el PeOI o la PrOI se purifican adicionalmente.

Mediante la introducción de un sitio de escisión de proteasa específica del sitio entre HlyA o fragmentos de HlyA y el PeOI (p. ej., el Factor Xa de proteasa) o mediante escisión química, el alocrito y el PeOI o la PrOI se pueden separar y la PrOI o el PeOI resultantes se producen sin ningún aminoácido adicional/artificial. La escisión química se puede llevar a cabo con bromuro de cianógeno, B-bromosuccinimida, N-clorosuccinimida, BNPS-escatol (3-bromo-3-metil2-(o-nitrofenilsulfenil)indolenina) o iones Ni2+. Tales métodos son bien conocidos en la técnica.

Después de la purificación y/o secreción del péptido o la proteína de la presente invención, en particular del PeOI o la PrOI, el péptido o la proteína se pueden fusionar a un radical que prolonga la semi-vida en suero del péptido o la proteína. Dichos radicales son bien conocidos en la técnica y los expertos en la técnica pueden recurrir a la práctica habitual para identificar radicales adecuados. Los radicales ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, una porción Fc de una inmunoglobulina, un dominio CH3 de una inmunoglobulina, un dominio CH4 de una inmunoglobulina, albúmina o un fragmento de albúmina, un péptido de unión a albúmina, una proteína de unión a albúmina, transferrina, una molécula de polialquilenglicol, hidroxietil almidón, ácido palmítico y otras moléculas de ácidos grasos. La fusión puede ser al extremo N o C, pero también puede ser a una cadena lateral de aminoácido que sea susceptible de tal modificación, incluyendo las cadenas laterales de cisteína, lisina, serina, treonina, ácido glutámico y ácido aspártico.

En otras diversas realizaciones, los residuos de cisteína en la secuencia polipeptídica del péptido o la proteína de la presente invención, p. ej., PeOI o PrOI, se pueden mutar a otros aminoácidos o suprimir, por ejemplo para evitar la formación de puentes disulfuro. En otras realizaciones, el péptido o la proteína de la invención pueden incluir uno o más aminoácidos que están mutados a residuos de cisteína con el fin de generar sitios de acoplamiento para modificaciones, por ejemplo para la conjugación con otros compuestos, tales como polietilenglicol (PEG), biotina, péptidos o proteínas, o para la formación de enlaces disulfuro no naturales. Por lo tanto, el método descrito anteriormente también puede comprender el acoplamiento de compuestos, tales como polietilenglicol (PEG), biotina, péptidos o proteínas, o para la formación de enlaces disulfuro no naturales.

Ejemplos

Materiales y métodos

Las proteínas se expresaron en Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen). Todos los oligonucleótidos se adquirieron de Eurofins MWG. Todas las enzimas se adquirieron de NEB, Clontech, Invitrogen o Fermentas.

1. Clonación HD In-Fusion

1.1 Linealización del Vector

El vector se linealizó mediante PCR utilizando oligonucleótidos que se reasocian en las posiciones deseadas. Por ejemplo, el plásmido pSU-HlyA1 se amplificó con los oligonucleótidos pSUrev_lin_for (5'-TAATATATTAATTTAAATGATAGCAATCTTACT-3 ') (SEQ ID NO: 40) y pSUrev_X_rev (5'-TGCTGATGTGGTCAGG3) (SEQ ID NO: 41). Si se desea, los oligonucleótidos codifican un sitio de escisión de proteasa, es decir, el oligonucleótido pSUrev_lin_Xa_rev (5'-ACGGCCATCAATTGCTGATGTGGTCAGG-3') (SEQ ID NO: 42) codifica un sitio de escisión del Factor Xa (secuencia primaria: IDGR). Los productos de PCR se trataron con DpnI para destruir el molde de PCR. Cuando se deseó, los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Hilden) o mediante Extracción con Gel (Qiagen, Hilden).

1.2. Amplificación de los insertos

Los genes de interés se amplificaron mediante PCR con oligonucleótidos que se reasocian con el gen de interés y que portan salientes en 5' que son complementarios al vector linealizado. Por ejemplo, el saliente del oligonucleótido directo (5'-GCAATTGATGGCCGT-3 ') (SEQ ID NO: 43), era complementario al oligonucleótido pSUrev_lin_Xa_rev, y el saliente del oligonucleótido inverso (5'-TAAATTAATATATTA-3) (SEQ ID NO: 44) era complementario al oligonucleótido pSUrev_lin_for. Cuando se deseó, los productos de PCR se purificaron con un kit de Purificación de PCR (Qiagen, Hilden) o mediante Extracción con Gel (Qiagen, Hilden).

1.3. Reacción HD In-Fusion

Esta reacción se realizó de acuerdo con el manual (ClonTech).

1.4. Transformación

Las células de E. coli adecuadas se transformaron con el producto In-Fusion, se dejaron crecer durante la noche en placas de agar que contenían el marcador de selección deseado, y se seleccionaron colonias individuales para la preparación de los plásmidos. Las secuencias de todos los plásmidos se verificaron por secuenciación.

2. Inserción o eliminación de nucleótidos por PCR y Ligadura Posterior

2.1. Fosforilación

Los oligonucleótidos se ordenaron con un 5'-fosfato o se fosforilaron en su extremo 5' con la polinucleótido quinasa de T4 (NEB) de acuerdo con el manual.

2.2.

Amplificación del plásmido

Para la deleción de nucleótidos, los plásmidos se amplificaron mediante PCR en los nucleótidos deseados con oligonucleótidos fosforilados. Para las inserciones, los plásmidos se amplificaron mediante PCR en los nucleótidos deseados con oligonucleótidos fosforilados en 5' que portaban los nucleótidos para insertarlos en su extremo 5'. Las reacciones de PCR se incubaron con DpnI a 37ºC para destruir el ADN molde, se extrajeron en gel y se ligaron 50 ng de plásmidos linealizados durante la noche a 4ºC con Ligasa (NEB) y el tampón de reacción recomendado. Las muestras de ligación se utilizaron para la transformación de E. coli, los plásmidos se aislaron y las secuencias se verificaron por secuenciación.

3.

Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis se realizó de acuerdo con el protocolo de Mutagénesis Dirigida al Sitio de (Agilent).

4.

Expresión en exceso de los genes de interés

E. coli se transformó con el plásmido deseado y se cultivó en medio 2YT a 37ºC y se sometió a movimiento oscilante. La expresión se indujo con IPTG 1 mM y las células se cultivaron durante 4 h. Típicamente, la DO600 de los cultivos osciló entre 5 y 8. Las células se recogieron por centrifugación y se almacenaron a -20ºC.

5. Preparación de IB

Las células se resuspendieron en tampón de resuspensión (Tris-HCl 10 mM, NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, pH 7,3) y se rompieron mediante tres pases a través de un disruptor celular (2,5 kbar, Constant Systems). Los PRODUCTOS lisados celulares se centrifugaron durante 20 minutos, 13.500 xg, 4ºC, el sedimento se lavó con tampón de resuspensión con un suplemento de Triton-X-100 al 0,5% y DTT 1 mM. Después de centrifugar durante 20 minutos,

13.500 xg, 4ºC, el sedimento se lavó con tampón de resuspensión. Después de la centrifugación, el sedimento que contenía los IB se solubilizó/desnaturalizó a 4ºC/temperatura ambiente en tampón de desnaturalización (Tris-HCl 10 mM, NaCl 120 mM, ETDA 0,1 mM, glicerol al 10%, hidrocloruro de guanidinio 6 M/urea 8 M pH 7,3). Los IB desnaturalizados se almacenaron a -20ºC.

6.

Escisión química con bromuro de cianógeno (CNBr)

Los IB desnaturalizados se complementaron con HCl 0,1 N y un exceso molar de 100 veces de CNBr (Sigma-Aldrich). La reacción se incubó a temperatura ambiente.

7.

Escisión química con 3-Bromo-3-metil-2-(2-nitrofeniltio)-3H-indol (BNPS-Escatol)

Los IB se solubilizaron en H2O al 50% y ácido acético al 50% y se incubaron con BNPS-escatol (disuelto en ácido acético) a temperatura ambiente u otras temperaturas. Se describen más detalles en Vestling et al. (1994) RCM 8, 786-790; y Rahali et al. (1999) Journal of protein chemistry 18, 1-12.

8.

Escisión química con N-clorosuccinimida (NCS)

Los IB se disolvieron en urea 8 M, pH 7,3 y se mezclaron con NCS (disuelta en ácido acético). Se describen más detalles en Shechter et al. (1976) Biochemistry 15, 5071-5075; y Lischwe et al. (1977) The Journal of biological chemistry 252, 4976-4980.

9.

Escisión química con ácido trifluoroacético (TFA)

Los IB se disolvieron en TFA. Se añadieron DMSO y HCl (37%) para iniciar la reacción de escisión. La mezcla de reacción se incubó a diferentes temperaturas. Se describen más detalles en Dimarchi et al. (1987) Process for selective peptide bond cleavage, documento EP0288272A3.

10.

Replegamiento de IB

Los IB desnaturalizado se diluyeron a 0,2 mg/ml en tampón de desnaturalización y se replegaron, ya sea mientras se sometían a diálisis frente a tampón de replegamiento (Tris-HCl 10 mM, NaCl 120 mM, pH 7,3) con un suplemento de CaCl2 20 mM o EDTA 0,2 mM ya sea o mediante la dilución de los IB desnaturalizados inmediatamente en tampón de resuspensión (con un suplemento de CaCl2 20 mM o EDTA 0,2 mM) a 0,2 mg/mL. Se pueden alterar los componentes del tampón de replegamiento y se podrían utilizar otros tampones (Hepes, CAPS, Bicina, Citrato, etc.), valores de pH comprendidos entre 0-14, concentraciones de sal y suplementos adicionales. La concentración de proteína para el replegamiento también se podría alterar, por ejemplo, variando de 0,01 a 20 mg/ml. Los IB

replegados se centrifugaron durante 20 minutos, 50.000 xg, 4ºC y el sobrenadante se utilizó para experimentos adicionales.

11.

Concentración de muestras de proteínas

Las proteínas se concentraron por ultrafiltración (Dispositivos de Filtración Amicon, Millipore) con los cortes de peso molecular deseados (MWCO).

12.

Cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC)

Las IMAC se realizaron con sistemas FPLC (Akta Systems, GE Healthcare). Las proteínas replegadas, que contenían una etiqueta His, se cargaron sobre una columna IMAC equilibrada en tampón IMAC A (Tris-HCl 10 mM, KCl 100 mM, glicerol al 10%, imidazol 10 mM, pH 7,3) con un suplemento de EDTA 0,1 mM o CaCl2 20 mM. Las proteínas se hicieron eluir con un gradiente lineal de imidazol de 10 a 500 mM.

13.

Digestión con Factor Xa

Se incubaron 50 μg de proteína con 1 μg de Factor Xa (NEB) a 4ºC, 20ºC o 25ºC y se tomaron muestras en diversos momentos.

14.

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Las proteínas se cargaron sobre una columna SEC (Superdex 75 16/60, Superdex 75 10/300, Superdex 200 16/60, Superdex 200 10/300, GE Healthcare) equilibrada en el tampón correspondiente.

15.

HPLC

La RP-HPLC analítica se realizó con una columna protegida terminalmente LiChrospher WP 300 RP-18 (Merck) a temperatura ambiente. Los IB replegados/desnaturalizados se inyectaron y se hicieron eluir mezclando el tampón acuoso A (acetonitrilo al 0%, ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v)) con el disolvente orgánico tampón B (acetonitrilo al 100%, ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v)). Las proteínas o péptidos se hicieron eluir con un gradiente de 0-100% de tampón B. Los cromatogramas muestran la absorbancia a 220 nm. El eluyente se fraccionó, se recogió y el disolvente se evaporó.

16.

Espectroscopia de fluorescencia con DAUDA

Se preparó ácido 11-(dansilamino)undecanoico (DAUDA, Cayman Chemical) como una solución de partida 1 mM en isopropanol al 50% y tampón al 50% (KH2PO4 20 mM, EDTA 0,25 mM, pH 7,3) y se diluyó adicionalmente a las concentraciones apropiadas con tampón. Se utilizó proteína 100 nM en tampón y una cubeta de vidrio de sílice de 1 ml. La señal de fluorescencia se registró a una longitud de onda de 500 nm después de la excitación a 350 nm utilizando Fluorolog®-3 (Horiba) (Kim y Frieden (1998) Protein Sci, 7, 1821-1828). El ancho de la rendija se ajustó a 4,3 nm tanto para la excitación como para la emisión, y la señal se integró durante 0,5 s. Las señales de fluorescencia de DAUDA en tampón en ausencia de proteína se restaron como fondo. Las señales de fluorescencia corregidas y normalizadas se trazaron frente a la concentración de DAUDA. Los datos se ajustaron utilizando el programa Prism 5.

17.

Análisis de unión a resina de amilosa

El HlyA1-MBP replegado se cargó sobre resina de amilosa por flujo de gravedad y después de un lavado exhaustivo, la proteína se hizo eluir con tampón de replegamiento que contenía maltosa 10 mM.

18.

Análisis de secreción

Las células de E. coli se transformaron con el plásmido pK184-HlyBD (que codifica el transportador ABC HlyB y la proteína de fusión de membrana HlyD para permitir el ensamblaje de la hemolisina A T1SS y el plásmido que codifica las proteínas de fusión. PK184 HlyB, D ha sido previamente descrito por Bakkes et al. al. (2010) JBC; 285(52): 40573-80. Las células se cultivaron en medio 2x YT con un suplemento de (30 µg/ml) y ampicilina (100 µg/ml) y CaCl2 5 mM durante la noche.Se inocularon 50 mM de medio de crecimiento con células de una DO600 inicial de 0,1. Las células se cultivaron a 37ºC y se indujo agitación y expresión con IPTG 1 mM a una DO600 de 0,40,6. Después de 2-6 h, los cultivos se centrifugaron (20 min, 50.000 xg, 4ºC) y las muestras de sobrenadante (16 μL) y las células (DOeq = 0,08) se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con Azul Brillante de Coomassie (CBB).

19.

Vector utilizado y secuencias de proteínas codificadas por los vectores utilizados

El siguiente ADN se clonó en la cadena principal del plásmido pSU.

Nombre Vector

PeOI / ProOI Proteína de tipo salvaje Núm. Acceso Versión núm. fecha Construcción Secuencia de vector que codifica SEQ ID NO: Secuencia de proteína / SEQ ID NO:

pIAR_101

Péptido 101 - HlyA1-péptido 1 5 6

pIAR_102

Péptido 102 - HlyA1-péptido 2 7 8

pIAR_103

Péptido 103 - HlyA1-péptido 3 9 10

pIAR_112

Péptido 103 - HlyaA1R210D-péptido 3 11 12

pIAR_115

Péptido 103 - HlyA1M88A-péptido 3 13 14

pIAR_201

Fuzeon® ACCESO 3H00_A VERSION 3H00_A GI:281307071, VRL 19-DIC-2009 HlyA1-Fuzeon® 15 16

pIAR_202

Factor de liberación de corticotropina humana ACCESO AAX18228 AXX18228.1 GI: 6978827, ROD 14-AG-2011 HlyA1-HCRF 17 18

pIAR_207

IFABP ACCESO NP_037200 VERSION NP_37200.1 GI:125973, BCT 03-MAY-2011 HlyA1-IFABP 19 20

pIAR_212

precursor péptido betaamiloide [homo sapiens], 40 aminoácidos ACCESO ABB26265 VERSION ABB26265.2 GI:8176534, 14-JUL-2000 HlyA1-Mab40 21 22

pIAR_213

MBP - HlyA1-MBP 23 24

pIAR_214

nisina ACCESO P13068 VERSION P13068.1 GI:125973, BCT 03-MAY-2011 HlyA1-nisina 25 26

pIAR_215

nisina " HlyA1-nisina (3 repeticiones GG) 27 28

pIAR_220

nisina " HlyA1-nisina 2 repeticiones GG) 29 30

pIAR_221

nisina " HlyA1-nisina (1 repetición GG) 31 32

pIAR_222

nisina " HlyA1-nisina (sin repetición GG) 33 34

pIAR_223

nisina " HlyA1-nisina (4 repeticiones GG sin porción C-terminal de HlyA1) 35 36

pIAR_227

Calcitonina salmón ACCESO BAA00281 VERSION BAA00281.1 GI:220946, SYN 21-MAY2003 HlyA1-Met-calcitonina de salmón 65

pIAR_228

Calcitonina humana ACCESO ACB14881 VERSION ACB14881.1 GI:170320110, SYN 24MAR-2008 HlyA1-Tyr-calcitonina humana 60

Nombre

PeOI / ProOI Proteína de tipo salvaje Construcción Secuencia de Secuencia de

Vector

Núm. Acceso Versión núm. fecha vector que codifica SEQ ID NO: proteína / SEQ ID NO:

pIAR_229

Precursor péptido betaamiloide [homo sapiens], 42 aminoácidos ACCESO AAB26265 VERSION AAB26265.2 GI:8176534, 14-JUL-2000 HlyA1-Tyr-Mab42 64

pIAR_237

Péptido inhibidor 1 Q06455 (MTG8_HUMANA) HlyA1-Met-péptido inhibidor 1 62

pIAR_238

secuencia artificial HlyA1-Try-péptido 238 53

pIAR_239

secuencia artificial HlyA1-Try-péptido 239 54

pIAR_240

secuencia artificial HlyA1-Try-péptido 240 55

pIAR_241

secuencia artificial HlyA1-Try-péptido 241 56

pIAR_242

secuencia artificial Péptido 240 55

pIAR_243

secuencia artificial Péptido 241 56

pIAR_302

nisina ACCESO P13068 LipA-nisina 37 38

VERSION P13068.1

GI.125973, BCT 03-MAY

2011

Ejemplo 1 Formación de IB de PeOI o PrOI que están fusionados N-terminalmente o C-terminalmente a HlyA o sus fragmentos

Todos los PrOI y PeOI indicados fusionados N-terminalmente a HlyA o fragmentos de HlyA (por ejemplo HlyA1, véase la FIG. 1 para un esquema de algunas construcciones) se agregaron en las células en forma de IB (Figura 2) Sorprendentemente, el IFABP no conjugado es normalmente soluble dentro de las células (véase la Figura 2C) Estos resultados indican que HlyA y los fragmentos de HlyA inducen la formación de IB y transfieren esta característica a los péptidos y proteínas fusionados.

Las PrOI o los PeOI fusionados C-terminalmente con HlyA o fragmentos de HlyA (por ejemplo HlyA1, véase la Figura 1 para una vista esquemática de las construcciones) se expresaron en E. coli (Figura 2B) y son insolubles dentro de las células (véase HlyA1-IFABP ilustrativo, Figura 2C). Por lo tanto, HlyA y los fragmentos de HlyA fuerzan la agregación en forma de IB de las PrOI y los PeOI fusionados a su extremo N y C.

Las proteínas de fusión de HlyA o sus fragmentos y los oligómeros peptídicos que consisten en dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más monómeros de un péptido o péptidos diferentes también se expresan como agregados insolubles dentro de las células. La figura 2D muestra la expresión del péptido 238 (SEQ ID NO: 53) como un monómero, trímero (péptido 240 [SEQ ID NO: 55]) y pentámero (péptido 241 [SEQ ID NO: 56]) fusionados a HlyA1. Sin la fusión a HlyA1, los péptidos triméricos y pentaméricos no fueron producidos por las células (véanse pET16b_240 y pET16b_241). Los péptidos oligoméricos no se expresan dentro de las células ni se degradan proteolíticamente.

Se obtuvieron datos de expresión similares para los siguientes péptidos fusionados con HlyA1: Mab40 (SEQ ID NO: 63), Mab42 (SEQ ID NO: 64), calcitonina de salmón (SEQ ID NO: 65), calcitonina humana (SEQ ID NO: 60), péptido inhibidor 1 (SEQ ID NO: 62) y otros.

Ejemplo 2 Purificación y replegamiento de HlyA y HlyA1

HlyA y HlyA1 se produjeron en E. coli en forma de IB. Los IB se replegaron en presencia de EDTA o CaCl2, respectivamente. Las eficacias de replegamiento fueron de aproximadamente 35% con EDTA y se obtuvieron HlyA o HlyA1 inestables y no homogéneos. Las Figuras 3A y B muestran resultados para el fragmento de HlyA HlyA1. Por el contrario, más de 90% de HlyA o HlyA1 se replegaron en presencia de Ca2+ y las proteínas fueron estables y homogéneas (Figuras 3C y D).

Ejemplo 3 Purificación y replegamiento de HlyA1-Nisina

A partir de 5 g de células que expresaban HlyA1-Nisina (codificada por el plásmido pIAR_214), se prepararon aproximadamente 140 mg de IB brutos de HlyA1-Nisina, se desnaturalizaron y replegaron. En presencia de EDTA, la mayoría de las proteínas eran insolubles y se agregaban y solo se producían cantidades bajas de HlyA1-Nisina no homogénea (Figuras 4A y C). El replegamiento con Ca2+, por el contrario, produjo una especie de proteína homogénea con alta pureza y altos rendimientos (Figuras 4B y C). La eficacia de replegamiento fue superior a 95% en presencia de Ca2+ e inferior a 25% en presencia de EDTA.

Después del replegamiento, la nisina se separó de HlyA1 mediante proteólisis específica del sitio con Factor Xa (Figura 4D). Después de 90 minutos, se purificaron 100 µl de la mezcla de reacción por medio de HPLC (Figura 4E). Las fracciones de elución se analizaron por medio de análisis SDS-PAGE (Figura 4F), transferencia Western y espectrometría de masas (datos no mostrados) y se identificó la molécula completa de Nisina.

Ejemplo 4 Purificación y replegamiento de LipA1-Nisina

La lipasa A (LipA) es otra proteína RTX secretada por un T1SS exclusivo. Se clonó una construcción comparable a HlyA1-Nisina en donde la Nisina se fusionó a un fragmento C-terminal de LipA. Este fragmento abarcó el dominio RTX y la señal de secreción de LipA (codificada en el plásmido pIAR_302). Posteriormente, se produjo LipA1-Nisina en E. coli y se examinó la formación de IB. Como se muestra en la Figura 5A, LipA1-Nisina forma IB. Por otra parte, el replegamiento de LipA1-Nisina desnaturalizada se analizó en presencia de Ca2+ y EDTA, respectivamente. Los análisis SEC de LipA1-Nisina replegada demuestran que la proteína de fusión se comporta de manera similar a HlyA1-Nisina y que Ca2+ induce el replegamiento de LipA1-Nisina a una proteína homogénea estable (Figura 5B). En presencia de EDTA, en contraste, la LipA1-Nisina se vuelve a plegar menos eficazmente y la mayoría de la LipA1-Nisina forma agregados (Figuras 5C y D). Por lo tanto, HlyA, LipA y probablemente otros miembros de la superfamilia de proteínas RTX se podrían utilizar para producir PrOI y PeOI en forma de IB y para replegar proteínas de fusión mediante la adición de Ca2+, otros iones metálicos o condiciones específicas de replegamiento.

Ejemplo 5 Análisis de diferentes fragmentos de HlyA y su integridad para inducir el replegamiento

Se truncó HlyA1-Nisina por etapas mediante repeticiones de GG desde el extremo N (Figura 1) para investigar la influencia de cada repetición de GG para la formación de IB y el replegamiento. Se investigaron las proteínas expresadas a partir de los plásmidos pIAR_215, pIAR_220, pIAR_221, pIAR_222. Para examinar la influencia de la porción C-terminal de HlyA1, se diseñó pIAR_223. pIAR_223 corresponde a la Nisina fusionada C-terminalmente a las 4 repeticiones de GG de HlyA1 que carece del extremo C de HlyA1 (que incluye la señal de secreción).

Solo la proteína expresada a partir del plásmido pIAR_222 se expresó en E. coli en cantidades que eran visibles en muestras de producto lisado celular (Figura 6A). Sin embargo, los IB de las células que expresan proteínas codificadas por pIAR_215, pIAR_220-223 se podían preparar, desnaturalizar y replegar con Ca2+ o EDTA. Las proteínas replegadas se concentraron y se analizaron por medio de SEC. Se analizó la escisión de proteínas concentradas con Factor Xa. Solo los plásmidos pIAR_220, pIAR_222 y pIAR_223 produjeron proteína recombinante en cantidades significativas. Por lo tanto, se toman en consideración estas proteínas para las siguientes interpretaciones.

Se produjeron IB de proteínas codificadas a partir del plásmido pIAR_220 (dos repeticiones de GG), pIAR_222 (sin repetición de GG) y pIAR_223 (solo cuatro repeticiones de GG, sin porción C-terminal de HlyA1). Por lo tanto, las repeticiones de GG y la porción C-terminal de HlyA1 que consiste en la señal de secreción son potentes para inducir la formación de IB.

La proteína codificada por pIAR_220 (dos repeticiones de GG) se replegó y se concentró más eficazmente en presencia de Ca2+ en comparación con EDTA (Figuras 6B y C), mientras que el replegamiento y la concentración tuvieron eficacias comparables para la proteína codificada por pIAR_222 (sin repetición de GG) tanto con Ca2+ como con EDTA. Por lo tanto, dos repeticiones de GG permiten aumentar la eficiencia de replegamiento en una forma dependiente de Ca2+. El análisis mediante SEC de proteínas codificadas por pIAR_220 y pIAR_222 apoyó estos resultados. La proteína codificada por pIAR_220 mostró una señal distinta y simétrica por medio de análisis SEC solamente en presencia de Ca2+ (Figura 6C), mientras que los cromatogramas del análisis por SEC con la proteína codificada por pIAR_222 son comparables en presencia de EDTA y Ca2+ (Figuras 6D y E) y la proteína codificada por pIAR_222 no se replegó, por lo tanto, en un estado soluble, homogéneo. Esto demuestra que las repeticiones de GG son esenciales para una renaturalización eficaz.

La proteína codificada por pIAR_223 (4 repeticiones de GG sin la porción C-terminal de HlyA1) eluye como una señal simétrica de la SEC solo en presencia de Ca2+. Por el contrario, en presencia de EDTA, la proteína recombinante expresada a partir de pIAR_223 no es homogénea (Figuras 6F y G).

Ejemplo 6 Purificación y replegamiento de HlyA1-HCRF

De aproximadamente 5 g de células, se purificaron aproximadamente 200 mg de IB brutos para HlyA1-HCRF (codificado por el plásmido pIAR_202) que se desnaturalizaron en hidrocloruro de guanidinio y posteriormente se replegaron (Figura 7A). El replegamiento de 40 mg de HlyA1-HCRF en presencia de EDTA produjo aproximadamente 8,4 mg de proteína soluble, sin embargo, la muestra de proteína era inestable y no homogénea (Figuras 7C y E). Por el contrario, el replegamiento en presencia de Ca2+ produjo 34 mg de proteína soluble y homogénea (correspondiente a una tasa de replegamiento de aproximadamente 85%) (Figuras 7C y D).

El HlyA1-HCRF replegado fue digerido con Factor Xa (Figura 7G) y la mezcla de reacción se purificó por medio de HPLC (Figura 7F). Con esta estrategia, HCRF se escindió y se separó de HlyA1.

Ejemplo 7 Producción de IFABP

El HlyA1-IFABP (codificado en el plásmido pIAR_207) se expresó y se prepararon 205 mg de IB desnaturalizados a partir de aproximadamente 6 g de células. HlyA1-IFABP se replegó (> 65%) en presencia de Ca2+ y EDTA en un estado estable y homogéneo (Figura 8A-D). A pesar de forzar la agregación de IFABP en IB, HlyA1 no altera el replegamiento de IFABP desnaturalizado in vitro. Con esta estrategia se produjo HlyA1-IFABP con un alto rendimiento, alta pureza y en una forma soluble. Basándose en el análisis SEC, el efecto positivo de Ca2+ fue insignificante para la renaturalización de HlyA1-IFABP, sin embargo, la actividad biológica de HlyA1-IFABP es mayor en presencia de Ca2+ (Figuras 8F y G). Por lo tanto, en algunas realizaciones, los alocritos de T1SS o fragmentos de los mismos funcionan como etiquetas de IB y no interfieren en la renaturalización eficaz de PeOI o PrOI fusionados. La presencia de iones Ca2+ aumenta la bioactividad del compañero de fusión, por ejemplo, aumentando su estabilidad y solubilidad al incrementar la estabilidad y/o la estabilidad de los alocritos o fragmentos de los mismos.

IFABP se escindió de HlyA1 con Factor Xa. Un microgramo de factor Xa digirió > 95% de 50 μg de HlyA1-IFABP en 3 horas a 20°C. (Figura 8E). La actividad biológica de HlyA1-IFABP se examinó con ácido 11-(((5-(dimetilamino)-1naftalenil)sulfonil)amino)undecanoico (DAUDA), un análogo de ácido graso fluorescente (Figuras 8F y G). Se determinó que la KD para HlyA1-IFABP replegado en Ca2+ y EDTA era de 140,8 nM ± 13,1 nM y 264,3 nM ± 13,2 nM, respectivamente. HlyA1-IFABP es un agente activo biológico que demuestra que la tecnología desarrollada permite la producción de proteína soluble, activa. La actividad es comparable con los valores de la bibliografía para IFABP (KD = 20,9 nM ± 0,6 nM).

Ejemplo 8 Producción de IFNA2

HlyA1-IFNA2 (codificado por el plásmido pIAR_210) se expresó a altos niveles en E. coli. Se purificaron 310 mg de IB desnaturalizados a partir de aproximadamente 5 g de células. El replegamiento de HlyA1-IFNA2 se realizó en presencia de Ca2+ o EDTA. Se replegó ± 3-4% de HlyA1-IFNA2 en presencia de ambos reactivos. Los análisis de SDS-PAGE con o sin un reactivo reductor (DTT) sugirieron un estado oxidado de HlyA1-IFNA2 después del replegamiento y, por lo tanto, la formación de enlaces disulfuro (datos no mostrados). La eficacia del replegamiento se incrementó a casi 100% mediante la adición de arginina 0,5 M. De nuevo, HlyA1 no interfiere en el replegamiento de IFNA2, e IFNA2 se produjo con un alto rendimiento con la invención presentada. El HlyA1-IFNA2 replegado se oxidó como se demostró mediante análisis de SDS-PAGE en presencia y ausencia de DTT (Figura 9A) y agente activo biológico (datos no mostrados).

El HlyA1-IFNA2 replegado en presencia de arginina y Ca2+ fue soluble y homogéneo (Figura 9B). Por el contrario, se observaron dos señales de elución para HlyA1-IFNA2 replegado con arginina y EDTA (Figura 9C). Por lo tanto, el replegamiento en presencia de Ca2+ aumentó la homogeneidad de HlyA1-IFNA2 en comparación con el replegamiento en presencia de EDTA.

Ejemplo 9 Producción de MBP

La MBP es bien conocida como etiqueta de solubilidad para la expresión soluble de PrOI fusionada dentro de E. coli (Nallamsetty, S. y Waugh, D.S.A. (2007) Nat Protoc, 2, 383-391). Sin embargo, HlyA1 obliga a la agregación de MBP en forma de IB y se prepararon IB de HlyA1-MBP (codificados por el plásmido pIAR_213) (Figura 10). HlyA1-MBP se replegó y se concentró en presencia de Ca2+. El análisis mediante SEC demostró la producción de HlyA1-MBP soluble (datos no mostrados). El HlyA1-MBP replegado de unió a amilosa inmovilizada demostrando la funcionalidad biológica de MBP replegada (Figura 10).

Ejemplo 10 Replegamiento de pIAR_101-103 y digestión con Factor Xa

Las proteínas de fusión de HlyA1 y los péptidos 101, 102 y 103 (codificados por los plásmidos pIAR_101, pIAR_102 y pIAR_103) se expresaron en E. coli en forma de IB (Figura 11A). De aproximadamente 4,5 g de células, se prepararon 72 mg, 92 mg y 108 mg de IB brutos.

Los IB se replegaron con Ca2+ casi hasta 100% y las proteínas se concentraron (compárense las calles "sedimento" y "péptido replegado 10X", Figura 11B-D). Las proteínas de fusión se incubaron con Factor Xa y el PeOI se pudo separar de HlyA1. Los péptidos se purificaron por medio de HPLC. El péptido 103 se identificó mediante espectrometría de masas (datos no mostrados).

Ejemplo 11 Purificación y replegamiento de HlyA1-Fuzeon®

De aproximadamente 4 g de células, se purificaron 130 mg de IB brutos de HlyA1-Fuzeon® (codificado por el plásmido pIAR_201), que se desnaturalizaron en hidrocloruro de guanidinio y posteriormente se replegaron. La eficacia de replegamiento fue ± 30% con Ca2+ y ± 11% con EDTA. El análisis mediante SEC demostró que HlyA1-Fuzeon® solo podría producirse en un estado soluble en presencia de Ca2+ (Figuras 12A y B). La Figura 12C muestra los resultados de la separación proteolítica de Fuzeon® de HlyA1-Fuzeon® con Factor Xa.

Ejemplo 12 Degeneración de un sitio de escisión no específico para el factor Xa en HlyA1

La espectrometría de masas identificó un sitio de escisión inespecífico para el Factor Xa en HlyA1 (secuencia primaria SYGR, aa 207-210). La mutación de HlyA1 de tipo salvaje a HlyA1-R210D en el plásmido pIAR_112 se construyó con el propósito de romper este sitio de escisión e incrementar la eficacia de escisión del Factor Xa en sitios de escisión pretendidos entre HlyA1 y el PeOI o la PrOI. La digestión con el factor Xa de HlyA1-R210D fusionado al péptido 103 indicó que no se formaron productos de HlyA1-R210D en el sitio (Figura 13).

Ejemplo 13 Escisión química de proteínas de fusión

La escisión química de enlaces peptídicos es bien conocida en la bibliografía. Se investigó la aplicabilidad de dicho enfoque para separar la PrOI o el PeOI de la etiqueta bifuncional. Se eligieron bromuro de cianógeno (CNBr), un reactivo químico que escinde los enlaces peptídicos C-terminales con respecto a residuos de metionina, y BNPSescatol, NCS y TFA, reactivos químicos que escinden los enlaces peptídicos C-terminales con respecto a residuos de triptófano. Los únicos residuos de metionina y triptófano dentro de HlyA1 se mutaron a alanina (M88A, W109A) y se colocó una metionina o un triptófano N-terminalmente con respecto al PeOI o la PrOI. Por ejemplo, se añadió una metionina N-terminal con respecto al péptido 103 (proteína HlyA1 M88A-Met-Péptido 3, codificada en el plásmido pIAR_115). Como se muestra mediante el análisis de SDS-PAGE en la Figura 14, los péptidos se escindieron satisfactoriamente de HlyA1. A: el Péptido 103 se separó de HlyA1 M88A-Met por medio de CNBr. La identidad del péptido 103 se confirmó por espectrometría de masas (datos no mostrados). B: Aproximadamente 50% de los péptidos codificados por pIAR_202 w, pIAR_238, pIAR_239, pIAR_240 y pIAR_241 se escindieron de HlyA1 por medio de NCS en 3 h. pIAR_240 y pIAR_241 son claramente visibles en el gel teñido con Coomassie (indicado por la flecha), mientras que los otros péptidos eran demasiado pequeños para teñirse. La especie visible a más de 50 kDa en la muestra de 0 h corresponde al dímero con puentes de cisteína de los péptidos.

Ejemplo 14 Proteínas de fusión de HlyA1 expresadas a través de la fermentación

Se utilizó E. coli que portaba el plásmido pIAR_115 para la fermentación. Cuando la glucosa se utilizó como alimento durante la fermentación, la expresión se reprimió. Esta represión podría ser el resultado de una represión del promotor lac que regula la expresión del plásmido pIAR_115 por la glucosa. Por lo tanto, se sometió a ensayo el glicerol como alimento durante la fermentación. Con esta estrategia, se produjeron más de 2,5 kg de células húmedas a partir de caldo de 10 L de caldo de fermentación. Los niveles de expresión de HlyA1 M88A-Met-péptido 3 fueron comparables o incluso aumentaron para los cultivos discontinuos (Figura 15). De los 440 g de células (masa celular húmeda), se prepararon 65 g de IB. Por lo tanto, la tecnología de la invención es redimensionable al alza y los títulos de IB aumentan al aumentar la masa celular y/o los niveles de expresión.

Las invenciones descritas ilustrativamente en la presente memoria se pueden poner en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, que no se describan específicamente en la presente memoria. Por lo tanto, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. se leerán de manera expansiva y sin limitación. Además, los términos y expresiones empleados en la presente memoria se han utilizado como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, pero se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, se debe entender que, aunque la presente invención se ha descrito específicamente mediante realizaciones preferidas y características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a la modificación y variación de las invenciones incorporadas en la presente memoria, y que tales modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de esta invención. La invención se ha descrito amplia y genéricamente en la presente memoria. Cada una de las especies más estrechas y agrupaciones subgenéricas que caen dentro de la descripción genérica también forma parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una salvedad o limitación negativa que elimina cualquier materia sujeto del género, independientemente de si el material escindido se menciona específicamente o no en la presente memoria. Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. Otras realizaciones de la invención serán evidentes a partir de las siguientes reivindicaciones.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universität Düsseldorf

<120> MÉTODOS PARA LA EXPRESIÓN DE PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS 5

<130> P56528

<160> 66 10 <170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 3075

<212> ADN 15 <213> Escherichia coli

<400> 1

<210> 2

<211> 1024

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

<210> 3

<211> 654

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> fragmento de HlyA

<400> 3

10

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15

<220>

<223> fragmento de HlyA

<210> 5

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 5 ggccgtggtg atagcccggg c 21

<210> 6 15 <211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Secuencia Artificial

25 <210> 7

<211> 66

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 7

10

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15

<220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 8

<210> 9

<211> 54

<212> ADN 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial

30 <400> 9 gcagcagcag ctgcagcagc agcaagcggt tatggtccgg aaaaccagta cggc 54

<210> 10

<211> 18 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 40

<400> 10

<210> 11 45 <211> 729

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 50 <223> Secuencia Artificial

<400> 11

<210> 12

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 12

<210> 13

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 13

<210> 14

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 14

<210> 15

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 15

<210> 16

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 16

<210> 17

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 17

<210> 18 15 <211> 260

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Secuencia Artificial

<400> 18

<210> 19

<211> 1065

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 19

<210> 20

<211> 354

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial

15 <400> 20

<210> 21

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 21

<210> 22

<211> 259

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 22

<210> 23

<211> 1782 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Constructo de expresión 10

<400> 23

<210> 24

<213> Artificial

<220>

<223> fusión MBP-HlyA1 10

<400> 24

5 <210> 25

<211> 828

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 25

5

<210> 26

<211> 275

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10

<220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 26

<210> 27

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 27

<210> 28

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 28

<210> 29

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 29

<210> 30

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 30

<210> 31

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 31

<210> 32

<211> 230

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 32

10 <210> 33

<211> 642

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 33

<210> 34 5 <211> 213

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Secuencia Artificial

<400> 34

<210> 35

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 35

<210> 36

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 36

10

<210> 37

<211> 909

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15

<220>

<223> Secuencia Artificial

<400> 37

<210> 38

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial 10

<400> 38

<210> 39

<213> Artificial

<220>

<223> 3' Fragmento de HlyC + gap 10

<400> 39

5

<210> 40 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

10

<220> <223> Secuencia Artificial <400> 40 taatatatta atttaaatga tagcaatctt act 33

15

<210> 41 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

20

<220> <223> Secuencia Artificial

<400> 41 tgctgatgtg gtcagg

16

25

<210> 42 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

30

<220> <223> Secuencia Artificial

35 40

<400> 42 acggccatca attgctgatg tggtcagg <210> 43 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia Artificial 28

45

<400> 43 gcaattgatg gccgt 15

50

<210> 44 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Secuencia Artificial

<400> 44 taaattaata tatta 15

5 <210> 45

<211> 25

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> péptido

<400> 45

15

<210> 46

<211> 36

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20

<220>

<223> péptido

<210> 47

<211> 22

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido

35 <400> 47

<210> 48

<211> 25 40 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido 45

<400> 48

<210> 49

<211> 26 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido 10

<400> 49

<210> 50 15 <211> 37

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> péptido

<400> 50

<210> 51

<211> 25

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido

35 <400> 51

<210> 52

<211> 48 40 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

péptido 45

<400> 52

<210> 53

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

péptido 238 10

<400> 53

<210> 54 15 <211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> péptido 239

<400> 54

25 <210> 55

<211> 48

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> péptido 240

<400> 55

35

<210> 56

<211> 80

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40

<220>

<223> péptido 241

<400> 56

<210> 57

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido 242 10

<400> 57

<210> 58 15 <211> 100

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> péptido 243

<400> 58 5 <210> 59

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 59

<210> 60

<213> Homo sapiens

<400> 60 <210> 62

20

<210> 61

<211> 37

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25

<220>

<223> Fuzeon

<400> 61

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido inhibidor 1 10

<400> 62

<210> 63 15 <211> 40

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Mab40

<400> 63

25 <210> 64

<211> 42

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Mab42

<400> 64

<210> 65

<211> 22

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia líder de nisina

<400> 65

10 <210> 66

<211> 33

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

15 <400> 66

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
2. 1 . Un método para la producción de un péptido (PeOI) o proteína de interés (PrOI) recombinares, en donde el método comprende:

   (a)

   introducir una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende al menos un PeOI o una PrOI, y al menos un alocrito de un sistema de secreción de tipo 1 (T1SS) o un fragmento del mismo, en una célula anfitriona, en donde la célula anfitriona no expresa un transportador heterólogo de casete de unión a ATP (ABC), una proteína de fusión de membrana heteróloga (MFP) y/o una proteína de membrana externa heteróloga (OMP) del T1SS, en donde dicho fragmento tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos;

   (b)

   cultivar la célula anfitriona en condiciones que permitan la expresión de la proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se expresa en forma de cuerpos de inclusión (IB);

   (c)

   aislar la proteína de fusión recombinante de dichas células anfitrionas; y

   (d)

   someter la proteína de fusión recombinante a condiciones que permiten que el PeOI o la PrOI se plieguen en una conformación tridimensional funcional.

3. 2.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el alocrito de un T1SS se selecciona del grupo que consiste en HlyA, CyaA, EhxA, LktA, PlLktA, PasA, PvxA, MmxA, LtxA, ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, ApxIVA, ApxI, ApxII, AqxA, VcRtxA, VvRtxA, MbxA, RTX citotoxina, RtxL1, RtxL2, FrhA, LipA, TliA, PrtA, PrtSM, PrtG, PrtB, PrtC, Abr A, AprX, ZapA, ZapE, Sap, HasA, colicina V, LapA, ORF, RzcA, RtxA, XF2407 , XF2759, RzcA, RsaA, Crs, CsxA, CsxB, SlaA, SwmA, S111951, NodO, PlyA, PlyB, FrpA, FrpC.

4. 3.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el alocrito de un T1SS es HlyA que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, un fragmento de la misma o un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o el fragmento de la misma.

5. 4.

   El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el fragmento de HlyA consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 o un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

6. 5.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el medio de expresión que comprende 20,0 mM o menos de Ca2+.

7. 6.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la expresión del gen transportador ABC endógeno, el gen MFP endógeno y/o el gen OMP endógeno de T1SS o la actividad de los productos de los genes correspondientes en la celula anfitriona es inhibida o el transporte es infeciaz.

8. 7.

   El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la célula anfitriona no expresa el transportador ABC endógeno, la MFP endógena y/o la OMP endógena del T1SS.

9. 8.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde en la etapa (d) el péptido o la proteína recombinantes se exponen a un tampón de replegamiento, en donde el tampón de replegamiento comprende al menos 0,01 mM de Ca2+.

10. 9.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde:

    (I)

    la célula anfitriona es una célula procariota; y/o

    (II)

    la expresión se realiza en un medio de cultivo minimo; y/o

    (III) el péptido o la proteína de fusión recombinantes se purifican utilizando un método seleccionado entre cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño y combinaciones de las mismas; y/o

    (IV)

    el método comprende la etapa adicional (e) de poner en contacto la proteína de fusión con una proteasa adecuada para la escisión de la proteína de fusión para producir el alocrito y el péptido o la PrOI en forma de moléculas separadas; y/o

    (V)

    el método comprende la etapa adicional (e) de escindir la proteína de fusión recombinante por tratamiento químico para producir el alocrito y el PeOI o la PrOI en forma de moléculas separadas; y/o

    (VI)

    el método comprende una etapa (e) como se define en (IV) o (V) seguido de la purificación del PeOI o la PrOI.

11. 10.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde al menos un PeOI o una PrOI se seleccionan del grupo que consiste en Nisina, HCRF, IFABP, IFNA2, MBP, péptido 101, péptido 102, péptido 103, MAB-40, Mab-42, Fuzeon®, Calcitonina de salmón, Calcitonina humana, péptido inhibidor 1, 238, como se expone en SEQ ID NO:53, péptido 239 como se expone en SEQ ID NO:54, péptido 240 como se expone en SEQ ID NO:55, y péptido 241 como se expone en SEQ ID NO:56 .

12. 11.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos reguladora que modula la expresión de la proteína de fusión.