DE3586987T2

DE3586987T2 - Methode zur foerderung einer disulfidverbindung in rekombinanten proteinen und formulationen, welche diese produkte enthalten.

Info

Publication number: DE3586987T2
Application number: DE8585308265T
Authority: DE
Inventors: Robert Forgan Halenbeck; Kirston Edward Koths
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1984-12-06
Filing date: 1985-11-13
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2005-11-14
Also published as: AU594930B2; ES549135A0; CA1248300A; GB8528017D0; GB2168055A; AU5005285A; DE3586987D1; US4572798A; IN163025B; JPH0696600B2; EP0185459B1; GB2168055B; ATE84540T1; ZA859001B; KR940003475B1; EP0185459A2; KR860005015A; EP0185459A3; JPS61140600A; ES8700271A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur katalytischen Erzeugung von Disulfidbindungen in vollständig reduzierten, clonierten, in Mikroben wie Escherichia coli erzeugten Genprodukten. Die Erfindung betrifft insbesondere ein solches Oxidationsverfahren, in dem die Umsetzung zur Förderung der in vitro Erzeugung von Disulfidbrücken, die den in der natürlich vorkommenden Proteinart vorhandenen entsprechen, kontrolliert wird.
Wenn native, in ihrem nativen Zustand eine oder mehrere Disulfidbrücken enthaltende Proteine als rekombinante Proteine in Mikroorganismen hergestellt werden, liegt das erzeugte Protein häufig in reduzierter Form ohne Disulfidbrücken vor. In einigen Fällen kann das Proteinprodukt nach der Reinigung Oligomere enthalten. Derartige Oligomere können als Folge einer unkontrollierten Oxidation oder Thiol- Disulfid-Austauschreaktionen auftreten. Wenn das native Protein Disulfidbindungen enthält, wird es häufig wünschenswert sein, die Ausbildung von entsprechenden Disulfidbindungen im rekombinanten Proteinprodukt chemisch zu fördern, während die Ausbildung von Oligomeren oder anderen modifizierten Protein-Nebenprodukten möglichst gering gehalten wird. Die unkontrollierte Proteinoxidation kann auch die Erzeugung von unerwünschten Isomeren zur Folge haben (falsche intramolekulare Brückenbildung). Derartige unerwünschte Umsetzungen können die Reinigung des Proteins von der Kultur erschweren, die Ausbeute des Proteins mit der gewünschten Struktur vermindern oder ein Protein mit unvollständiger Bioaktivität erzeugen. Die unkontrollierte Ausbildung von Disulfidbindungen während der Reinigung oder Formulierung ergibt bei bestimmten, zur therapeutischen Verwendung gedachten Proteinen ein inhomogenes Material, das mit Isomeren und/oder Oligomeren, die inaktiv sein und/oder eine erhöhte Immunogenität aufweisen können, verunreinigt ist.
Das am 23 Juli 1985 erteilte US-Patent 4,530,787 beschreibt ein Verfahren zur Oxidation solcher mikrobiell hergestellter Proteine in einer selektiven, kontrollierten Weise, unter Verwendung eines nicht-katalytisch oxidierenden Wirkstoffs, vorzugsweise o-Iodosylbenzoesäure, das vorzugsweise Cysteine unter Ausbildung der gewünschten Disulfidbrückenbildung in hohen Ausbeuten oxidiert. Dieses Verfahren erfordert mindestens stöchiometrische Mengen von Oxidationsmittel zu Protein, um mit Sicherheit einen vollständigen Ablauf der Oxidation zu erhalten.
Entsprechend ist ein Verfahren zur katalytischen Erzeugung von Disulfidbindungen in einem mikrobiell hergestellten Lab unter Verwendung einer Mischung von oxidiertem und reduziertem Glutathion in Harnstoff beschrieben worden. (Europäische Patentanmeldung Nr. 83 307841.3, veröffentlicht am 1. August 1984 unter der europäischen Publikationsnr. 114507, Hayenga et al.)
Perraudin et al. verglichen im J. Biol. Chem. 258 (1983), 11834-39, die oxidative Renaturierung von reduziertem Hühnereiweiß-Lysozym, die durch Cu²&spplus;-Ionen und Sauerstoff gefördert wurde, mit der durch einen Glutathion-Redoxpuffer geförderten und postulierten verschiedene Mechanismen für derartige Renaturierungen. Diese Arbeit wurde an einem löslichen Proteinprodukt durchgeführt, und sie behandelt nicht das Problem einer während der Oxidation möglichen Bildung von Oligomeren.
Es ist bekannt, daß Eisencyanide oder Cu²&spplus;-Ionen zur katalytischen Erzeugung von Disulfidbindungen in β-Lactoglobulin in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat fähig sind. Leslie, J. et al., Can. Jour. Biochem. 46 (1968), 625. Weitere Berichte erläutern die Verwendung von bestimmten, zweiwertigen Metallsalzen als Oxidationsmittel für Cysteine oder Sulfhydrylgruppen in bestimmten Fällen: (a) Kupferion: (für freies Cystein) Hanaki, A. et al., Bull Chem. Soc. Jpn. 56 (1983), 2065; (für Sulfhydrylgruppen in Lysozymen) Yutani, K. et al., J. Biochem. 64 (1968), 449; (für Sulfhydrylverbindungen wie Clutathion, Cystein, 2-Mercaptoethanol, Thioglycolsäure und reduzierte Fettsäure) Kobashi, K., Biochim. Biophys. Acta 158 (1968), 239; (b) Übergangsmetalle: (für Cystein und andere Mercaptane und Proteine mit freien Sulfhydrylgruppen) Friedman, Mendel, The Chemistry and Biochemistry of the Sulfhydryl Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, Kapitel 2 (1973), 25-50, und (c) möglicherweise das Calciumion: (für Sulfhydrylgruppen in Desoxyribonuklease) Price, P. et al., J. Biol. Chem. 244 (1969), 929.
Der Oxidationsmechanismus in diesen Umsetzungen ist unklar, es wird jedoch vermutet, daß er auf Umsetzungen unter Beteiligung von Peroxiden und freien Radikalen beruht. Es zeigt sich jedoch, daß die Fähigkeit zur Vorhersage, daß ein bestimmtes zweiwertiges Salz die richtige Oxidation eines bestimmten Proteins ohne umfangreiche Nebenreaktionen erfolgreich fördern wird, zur Zeit nicht möglich ist. Die vorliegende Erfindung zeigt die Fähigkeit von bestimmten Metall-enthaltenden Verbindungen zur hoch-selektiven und verwendbaren Förderung der Ausbildung von Disulfiden in verschiedenen Formen von rekombinantem Interleukin-2 und β- Interferon.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Oxidation eines vollständig reduzierten rekombinanten Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Interferon-beta, Interleukin-2 und Muteinen davon, wobei die Cysteine vorzugsweise unter Ausbildung von Disulfidbrücken, die denen im natürlich vorkommenden Protein vorhandenen entsprechen, oxidiert werden. Dieses Verfahren umfaßt die Umsetzung einer wäßrigen Lösung, die eine gelöste Form des rekombinanten Proteins und ein Lösungshilfsmittel enthält, bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,5 und 9 in Gegenwart von Luft mit mindestens einer wirksamen Menge eines ein Cu²&spplus;-Kation enthaltenden Oxidationspromotors.
Das erfindungsgemäße Verfahren vermindert die im Verlauf der Oxidation von bestimmten Proteinen auftretenden Schwierigkeiten auf ein Mindestmaß, einschließlich oxidativer Nebenreaktionen, der Unfähigkeit, die vollständige Bioaktivität wiederzuerlangen, und der unerwünschten Oligomer- oder Isomerbildung. Desweiteren besitzt das hier beschriebene, bevorzugte Verfahren unter Verwendung von Kupferchlorid als Oxidationspromotor die weiteren Vorteile der extremen Schnelligkeit und der Beteiligung eines Reagenz, das leicht im Endprodukt nachweisbar ist und aus dem Endprodukt leicht zu entfernen ist. Die hier beschriebene Umsetzung tritt sowohl bei katalytischen, als auch bei stöchiometrischen Konzentrationen (bezogen auf die freien Sulfhydrylgruppen) ein. Somit muß die Einhaltung des Molverhältnisses von Oxidationspromotor und Protein (um eine 100%ige Disulfidbildung zu erreichen) nicht so aufwendig sein wie bei anderen Oxidationsmitteln. Die Erzeugung von Disulfidbindungen in rekombinantem Interleukin-2 (rIL-2) oder β-Interferon (rIFN-β) in mg/ml Konzentrationen kann in einer Stunde bei CuCl&sub2;-Konzentrationen von weniger als 100 uM bis zur Vollständigkeit durchgeführt werden.
Fig. 1 stellt fünf Absorptionsmuster einer Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) eines Reaktionsgemisches dar, in dem ein rekombinantes IFN-β-Mutein mit einem gegen einen Serinrest in Position 17 ausgetauschten Cysteinrest (hier bezeichnet als IFN-βSer17) unter Verwendung von 8 uM CuCl&sub2; als Oxidationspromotor oxidiert worden ist. Fig. 1A stellt eine Kontrollumsetzung unter Beteiligung von reduziertem IFN-βSer17, das für 7 Minuten ohne CuCl&sub2; in einen Puffer gegeben worden ist, dar. Fig. 1B stellt eine 7-minütige Oxidation mit CuCl&sub2; dar; Fig. 1C stellt eine 14-minütige Oxidation dar; Fig. 1D stellt eine 28-minütige Oxidation dar und Fig. 1E stellt eine 75-minütige Oxidation dar. Fig. 1F stellt eine auf einer RP-HPLC- Analyse basierende graphische Darstellung des Prozentsatzes von oxidiertem IFN-βSer17 gegen die Zahl der Minuten der Oxidation dar.
Fig. 2 liefert einen Vergleich zwischen rekombinantem IFN-βSer17 nach einer 75-minütigen Oxidation in 8 uM CuCl&sub2; (Fig. 2A) und einer Aliquote desselben 15 Minuten bei 50ºC in 10 mM Dithiothreitol reduzierten Materials (Fig. 2B).
Fig. 3 stellt vier RP-HPLC-Absorptionsmuster eines Reaktionsgemisches dar, in dem rekombinantes IL-2-Mutein mit dem durch einen Serinrest in Position 125 ersetzten Cysteinrest und dem entfernten N-terminalen Alanin (hier bezeichnet als Des-Ala-IL-2Ser125) unter Verwendung von 50 uM CuCl&sub2;als Oxidationspromotor oxidiert worden ist. Fig. 3A stellt eine 2-minütige Oxidation dar, Fig. 3B stellt eine 10-minütige Oxidation dar, Fig. 3C stellt eine 50-minütige Oxidation dar und Fig. 3D stellt ein Chromatogramm des Reaktionsgemisches dar, nachdem das für 50 Minuten oxidierte Produkt unter Verwendung von 10 mM Dithiothreitol 15 Minuten bei 60ºC erneut reduziert worden ist.
Fig. 4 zeigt eine silbergefärbte, nicht reduzierende SDS-PAGE-Analyse des Des-Ala-IL-2Ser125-Proteins nach einer 40-minütigen Oxidation mit 50 uM CuCl&sub2; als Oxidationspromotor, um das Ausmaß der Bildung von intermolekularen Sulfhydrylgruppen (Oligomere) zu bestimmen.
Fig. 5 stellt graphische Darstellungen der prozentualen Oxidation von Des-Ala-IL-2Ser125 (durch Messung der Signalhöhe, weniger Hintergrund) gegen die Zeit in Minuten für drei verschiedene CuCl&sub2;-Konzentrationen bei 25ºC dar. Eine 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthaltende Kontrollumsetzung wurde ebenfalls durchgeführt.
Fig. 6 stellt eine graphische Darstellung der prozentualen Oxidation von Des-Ala-IL-2Ser125 (durch Messung der Signalhöhe, weniger Hintergrund) gegen den pH-Wert der Oxidationsreaktion unter Verwendung von 8 uM CuCl&sub2; dar. Die graphische Darstellung zeigt die Auswirkung der pH-Wert-Änderung auf die Umsetzungsgeschwindigkeit, die an dem Punkt der Umsetzung, an dem das IL-2 zu etwa 50% oxidiert ist, gemessen wird.
Fig. 7 stellt die Oxidation von Des-Ala-IL-2Ser125 unter Verwendung eines o-Phenanthrolin/Cu²&spplus;-Komplexes (Fig. 7B) im Vergleich mit der Oxidation unter Verwendung von CuCl&sub2; (Fig. 7A) dar.
Fig. 8 stellt eine graphische Darstellung der prozentualen Des-Ala-IL-2Ser125-Oxidation (das Verschwinden von freien Sulfhydrylgruppen, gemessen durch Umsetzung mit DTNB) als eine Funktion der in Minuten angegebenen Zeit bei 25ºC unter Verwendung von 50 uM CuCl&sub2;, 0,25 mg/ml teilweise gereinigtem IL-2, 50 mM Natriumphosphat und 0,1% SDS bei einem pH-Wert von 7,0.
Fig. 9 stellt eine SDS-Page-Analyse von sowohl einem reduzierenden als auch einem nicht reduzierenden Gel von durch HPLC gereinigtem, unter Verwendung von 50 uM CuCl&sub2; oxidiertem IL-2 dar.
Fig. 10 stellt ein RP-HPLC-Absorptionsmuster des durch 50 uM CuCl&sub2; geförderten Oxidationsproduktes von Des- Alanyl-IL-2 (das die drei im nativen IL-2 vorhandenen Cysteine enthält) dar.
Die rekombinanten, durch das erfindungsgemäße Verfahren oxidierten Proteine sind für die sie üblicherweise produzierenden Wirte nicht nativ. Sowohl IL-2 als auch β-IFN weisen Aminosäuresequenzen auf, die im wesentlichen mit nützlichen Proteinen identisch sind und die Cysteinreste enthalten, die im nützlichen Protein intramolekular unter Ausbildung einer einzigen Cysteineinheit (Disulfidbrücke) verbunden sind. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "im wesentlichen identisch", daß die Aminosäuresequenzen der rekombinanten und nützlichen Proteine entweder identisch sind oder sich durch eine oder mehrere Aminosäureveränderungen (z. B. Deletionen, Additionen oder Substitutionen), die keine nachteilige funktionelle Unähnlichkeit zwischen dem rekombinanten Protein und seinem nativen Gegenstück verursachen, unterscheiden. Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren oxidierten rekombinanten Proteine werden vollständig reduziert, d. h. sie weisen keine Disulfidbrückenbildung auf. Ein Protein wie Interleukin-2 wird üblicherweise vor dem Oxidationsverfahren reduziert, damit es bei der Oxidation als ein einheitliches Substrat vorliegt. Die Reduktion kann durch Behandlung des Proteins mit einem Reduktionsmittel wie Dithiothreitol oder 2-Mercaptoethanol über einen kurzen Zeitraum bei einer erhöhten Temperatur ausgeführt werden. Das Reduktionsmittel wird anschließend unmittelbar vor der Oxidationsreaktion entfernt.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren zu oxidierenden rekombinanten Proteine können unter Verwendung von bestehenden gentechnologischen Verfahren erzeugt werden. Diese Verfahren umfassen die Identifizierung und Charakterisierung des natives Protein codierenden Strukturgens, die Isolierung oder Synthese dieses Gens oder einer Mutante, die ein funktionell äquivalentes Mutein des nativen Proteins codiert, die Insertion des Gens in einen geeigneten Expressionsvektor in eine Position, die die Expression des Gens erlaubt, die Transformation von kompetenten, heterologen Wirten, vorzugsweise Mikroorganismen, durch den Vektor, die Identifizierung der richtigen Transformanten und die Züchtung der Transformanten in einem geeigneten Nährmedium. Das Protein wird üblicherweise durch Aufbrechen der Zellen, durch Behandlung der Zelltrümmer mit Lösungshilfsmitteln (in Abhängigkeit von den Lösungseigenschaften des Proteins) und zur Isolierung des Rohproteins mit einem oder mehreren Extraktionsmitteln und durch Reinigung des Rohproteins durch verschiedene präparative, chromatographische Verfahren aus der Kultur gewonnen. Wenn das Protein für eine Oligomerbildung während des Fermentations- oder Gewinnungsverfahrens anfällig ist, wird das Protein in einem geeigneten Stadium des Gewinnungsverfahrens mit einem Reduktionsmittel behandelt.
Nach der Gewinnung des rekombinanten Proteins in einer rohen, im wesentlichen reinen, oder reinen Form von dem Wirt, wird es reduziert und im Anschluß daran unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer kontrollierten Kinetik oxidiert. Eine kontrollierte Oxidation im Anschluß an das erfindungsgemäße Verfahren hat die Bildung von Disulfidbrücken im rekombinanten Protein zur Folge, die der Brückenbildung im nativen Gegenstück mit keiner oder minimaler Überoxidation und keiner oder minimaler Bildung von falschen Disulfiden oder unerwünschten Oligomeren entspricht. Eine derartige Oxidation ermöglicht die Herstellung des rekombinanten Proteins in hohen Ausbeuten in einer Konfiguration, die der Konfiguration des nativen Gegenstücks am ähnlichsten ist, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer funktionellen Gleichheit von rekombinantem Protein und nativem Protein gewährleistet ist.
Der hier verwendete Begriff "rekombinantes Protein" betrifft auch Muteine von IL-2 und β-IFN. Derartige Muteine enthalten zum Beispiel Proteine, in denen ein oder mehrere, an der Disulfidbrückenbildung nicht beteiligte Cysteine zur Entfernung von Stellen für die intermolekulare Vernetzung oder falsche intramolekulare Disulfidbrückenbildung durch andere Aminosäuren ersetzt worden sind. Weitere IL-2-Muteine, in denen andere Aminosäuren neben Cystein ersetzt worden sind, sind ebenfalls konstruiert worden und sind vollständig aktiv.
Ein Gen, das ein unerwünschtes und unwesentliches Cystein enthält, kann unter Verwendung eines synthetischen, zu der Genregion komplementären Oligonukleotidprimers, der jedoch einzelne oder mehrfache Basenänderungen im Cysteincodon enthält, selektiv modifiziert werden, was ein in dieser Position eine andere Aminosäure enthaltendes, mutantes Protein (Mutein) zur Folge hat. Wenn eine Deletion gewünscht ist, würde dem Oligonukleotidprimer das Codon für Cystein fehlen. Die Umwandlung von Cystein in neutrale Aminosäuren wie Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin und Methionin ist die bevorzugte Methode. Serin, Threonin oder Alanin sind wegen ihrer chemischen Ähnlichkeit zu Cystein ein bevorzugter Ersatz. Wenn das Cystein deletiert wird, ist das reife Mutein um eine Aminosäure kürzer als das native, ursprüngliche Protein.
Sowohl menschliches IL-2 als auch IFN-β enthalten drei Cysteinreste im reifen Protein. Das Vorhandensein von drei Cysteinen bedeutet, daß nach erneuter Oxidation diese Proteine eine von drei möglichen intramolekularen Disulfidbrücken bilden können, von denen nur eine der richtigen, im nativen Molekül gefundenen Brücke entspricht. Muteine von IFN-β und IL-2, in denen unwesentliche Cysteine gegen Serin ausgetauscht wurden, werden detailliert von Mark et al., PNAS USA 81 (1984), 5662-5666 bzw. Wang et al., Science 224 (1984), 1431-1433 diskutiert.
Der in diesem Verfahren verwendete Oxidationspromotor ist ein Wirkstoff, der vorzugsweise für die Förderung der Oxidation von Cysteinresten verantwortlich ist und der ein zweiwertiges Kupferkation enthält. Andere zweiwertige Kationen wie Fe²&spplus; sind als Oxidationspromotoren viel weniger wirksam. Es wurde festgestellt, daß durch das Cu²&spplus;-Kation ein reines, oxidiertes Protein mit wenigen Nebenprodukten entsteht. Der Begriff "vorzugsweise" zeigt an, daß der Oxidationspromotor (1) vorzugsweise Cysteine oxidiert, wobei eine Disulfidbindung mit keiner oder unbedeutender Oxidation auf höhere Stufen gebildet wird, (2) vorzugsweise Cysteine unter Ausbildung von Disulfidbrücken, die denen in der natürlich vorkommenden Proteinart vorhandenen entsprechen, oxidiert und (3) vorzugsweise Cysteinreste im Gegensatz zu anderen Resten oxidiert. Der hier beschriebene Oxidationspromotor ist zur Förderung der Oxidation eines zwei Cysteinreste enthaltenden IL-2-Muteins befähigt, wobei das gewünschte Produkt mit den unter Ausbildung von Disulfidbrücken, die den im natürlich vorkommenden Protein vorhandenen entsprechen, oxidierten Cysteine in einer mindestens 95%igen Ausbeute erhalten wird. Es ist auch zur Förderung der Oxidation eines drei Cysteinreste enthaltenden IL-2-Muteins befähigt, wobei das gewünschte Produkt in einer mindestens 80-85%igen Ausbeute erhalten wird. Beispiele von hier beschriebenen geeigneten Oxidationspromotoren schließen CuCl&sub2;und den (o-Phenanthrolin)&sub2;Cu+²-Komplex ein. Der Oxidationspromotor ist vorzugsweise CuCl&sub2;.
Die Menge des verwendeten Oxidationspromotors ist mindestens eine wirksame Menge für die Oxidation, d. h. eine Menge, die als Mindestmenge notwendig ist, um die Oxidationsreaktion innerhalb eines günstigen Zeitraums wirksam durchzuführen. Diese Menge und die optimale Menge für jede Umsetzung können spezifisch von solchen Faktoren, wie der Art des Proteins, der Art des Oxidationspromotors, der Reaktionstemperatur, dem pH-Wert der Umsetzung und der Art und Konzentration des Lösungshilfsmittels abhängen. Es wird auch angenommen, daß eine Veränderung der Konzentration des Oxidationspromotors und der Oxidationszeit die Art und die Mengen der erzeugten Nebenprodukte beeinflußt. Es wird für gewöhnlich für pharmazeutische Zwecke notwendig sein, im wesentlichen sämtliche Nebenprodukte ebenso wie nicht oxidiertes Ausgangsmaterial, das theoretisch unerwünschte Oligomere durch Thiol-Disulfid Umwandlungsreaktionen erzeugen könnte, zu entfernen. In den nachstehenden Beispielen ist eine wirksame Menge die Menge, die ungefähr zur Konzentration der freien Sulfhydrylgruppen im Protein, die für die Beteiligung an der Bildung der gewünschten Disulfidbindungen in Frage kommen, äquivalent ist. Diese Menge muß natürlich gemäß den Kriterien, die günstige Reaktionszeiten, Art und Mengen von Nebenprodukten, pH-Wert etc. einschließen, die aber nicht darauf beschränkt sind, für jedes Protein optimiert werden. Es ist wahrscheinlich, daß sich die unabhängigen Variablen in einer solchen Weise beeinflussen, daß es keine einmalige, optimale Einstellung der Bedingungen für sämtliche Proteine gibt.
Fig. 5, die die Wirkung der CuCl&sub2;-Konzentration auf die Geschwindigkeit der IL-2-Oxidation veranschaulicht, zeigt, daß sich die beobachtete Oxidationsgeschwindigkeit erhöht, wenn die CuCl&sub2;-Konzentration von 0,5 auf 50 uM erhöht wird. Es ist auch gezeigt worden, daß sich die Umsetzungsgeschwindigkeit um das Zweifache erhöht, wenn die Umsetzung bei 37ºC anstatt bei Raumtemperatur durchgeführt wird (vgl. Beispiel 3). Daher kann die Umsetzung kontrolliert werden, um das Potential für eine Überoxidation durch einfache Einstellung der Konzentration des Oxidationspromotors, der Reaktionszeit oder der Reaktionstemperatur möglichst gering zu halten. Die Menge des CuCl&sub2;wird in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis 400 uM sein, mehr bevorzugt von 5 bis 50 uM, wenn IL-2 das Protein ist.
Die Proteinkonzentration im Reaktionsgemisch wird üblicherweise zur Verminderung der Wahrscheinlichkeit der Oligomerbildung relativ niedrig gehalten. In Abhängigkeit vom Sulfhydrylgehalt und dem Molekulargewicht des zu oxidierenden Proteins beträgt die Proteinkonzentration üblicherweise weniger als etwa 5 mg/ml, vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 2 mg/ml und mehr bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 1 mg/ml.
Der pH-Wert des Reaktionsmediums wird üblicherweise bei einem Wert zwischen etwa 5,5 und 9 gehalten. Eine Verwendung von pH-Werten, die signifikant oberhalb des hier beschriebenen pH-Bereichs liegen, hat eine signifikante Verringerung der Oxidationsgeschwindigkeit unter Verwendung von CuCl&sub2; als Oxidationspromotor zur Folge. Der pH-Wert wird vorzugsweise zwischen etwa 6 und 8 und mehr bevorzugt bei etwa 7, wie in Fig. 6 angegeben, die die Wirkung des pH- Werts auf die Oxidationsgeschwindigkeit von IL-2 veranschaulicht, gehalten.
Das reduzierte, clonierte Protein, das weniger löslich als die oxidierte Form des Proteins ist, muß üblicherweise in Lösung bleiben, d. h. in einer solubilisierten Form, damit eine wirksame Oxidation eintreten kann. Deswegen wird das Reaktionsgemisch zur Verhinderung einer Proteinfällung aus der Lösung vorzugsweise auch mindestens eine wirksame Menge eines Lösungshilfsmittels enthalten. Der Begriff "Lösungshilfsmittel" betrifft, wie hier verwendet, ein ionisches oder nicht ionisches Protein-solubilisierendes Lösungsmittel, wie Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Harnstoff. Die Menge des Lösungshilfsmittels, das zu diesem Zweck verwendet werden kann, beträgt üblicherweise etwa 0,1 bis etwa 1 Gewichts-% pro Volumen (für Detergentien) oder etwa 5-9 M (für Harnstoff), hauptsächlich in Abhängigkeit von den Arten des verwendeten Oxidationspromotors und dem Protein.
Die Reaktionszeit der Oxidation wird zum Beispiel von der Konzentration der Reagenzien im Reaktionsgemisch, der Temperatur bei der Umsetzung und den Wirkstoffarten abhängen. Die Temperatur der Umsetzung wird üblicherweise zwischen etwa 20ºC und etwa 40ºC, günstigerweise bei Raumtemperatur liegen, um das Lösungshilfsmittel/Protein-Gemisch in Lösung zu halten. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur vergrößert die Reaktionsgeschwindigkeit. Zum Erreichen einer vollständigen Oxidation kann die Reaktionszeit oder die Temperatur, wie es für das bestimmte Verfahren geeignet ist, verändert werden. Die Oxidationsreaktion kann zum Beispiel durch Einfrieren der Lösung, durch Zusatz von Chelatbildnern wie EDTA zum Reaktionsgemisch oder durch Erniedrigung des pH auf einen Wert, bei dem die Umsetzung aufhört, beendet werden. Weitere Faktoren, wie die Konzentration des Lösungshilfsmittels, können ebenfalls die Umsetzungsgeschwindigkeit beeinflussen. Im Anschluß an die Umsetzung können durch selektive Ultrafiltration oder chromatographische Techniken der restliche Oxidationspromotor und unerwünschte Isomere oder Oligomere entfernt werden. Das oxidierte Protein kann gegebenenfalls unter Verwendung von Protein-Reinigungsverfahren, wie Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC), von Nebenprodukten und sämtlichen zurückbleibendem, reduziertem Protein weiter gereinigt werden. Das Ausmaß der Oxidation während der Umsetzung läßt sich auch leicht durch eine RP-HPLC- Analyse quantifizieren.
Rekombinantes Des-Ala-IL-2Cys125 enthält drei Cysteine und ist theoretisch für eine falsche Bildung von Disulfidbindung anfällig. Wenn dieses Protein durch das hier beschriebene Verfahren oxidiert wird, besteht das erhaltene Produkt aus einem Protein, das größtenteils die Disulfidbrücken seines nativen Gegenstücks (zwischen den Cysteinresten 58 und 105 [Wang et al., Science 224 (1984), 1431-1433; Robb et al., PNAS 81 (1984), 6486-6490]) aufweist. Das oxidierte Protein ist im wesentlichen frei von Oligomeren (weniger als etwa 1-2 Gewichts-%) und enthält weniger als etwa 15 Gewichts-% von biologisch inaktiven Isomeren, die eine vom nativen Gegenstück abweichende Ausbildung von Disulfidbrücken aufweisen. Im Gegensatz dazu können die über unkontrollierte Oxidationen hergestellten Präparationen signifikante Mengen an Oligomeren (5%-10%) und sogar größere Mengen unerwünschter Isomere enthalten. Nicht-katalysierte Luftoxidationen vollziehen sich langsamer über Tage hinweg und erreichen sehr langsam die Vollständigkeit.
Proteine, die zur Eliminierung der Möglichkeit einer Isomerbildung (z. B. IL-2, in dem Cystein in Position 125 gegen Serin ausgetauscht worden ist, oder IFN-β, in dem Cystein in Position 17 gegen Serin ausgetauscht worden ist) entworfen worden sind, enthalten selbstverständlich keine Isomere. Mindestens im Fall von IL-2 ist das oxidierte Protein stärker wasserlöslich, als die reduzierte Form und weist in biologischen Tests auch eine höhere spezifische Aktivität auf. Dementsprechend kann die Menge des Lösungshilfsmittels (z. B. SDS) in den Präparationen verringert werden, wobei ein gereinigtes, ausreichend wasserlösliches Produkt erzeugt wird, um eine Formulierung mit üblichen wäßrigen, parenteralen Vehikeln in einer Weise, die für die Verwendung in Menschen oder Tieren geeignet ist, zu erlauben. Dieses oxidierte rekombinante IL-2-Mutein enthält weiter nur die im von natürlichen Quellen isolierten IL-2 vorkommenden Disulfidbrücken. Dasselbe vorstehend zur Bildung von Disulfidbrücken verwendete Verfahren kann bei anderen Muteinen von IL-2 zur Erzeugung von homogenen, biologisch aktiven Stoffen angewendet werden.
Man nimmt an, daß die Proteinpräparationen weniger antigen und möglicherweise therapeutisch wirksamer sind, da die durch die kontrollierte Oxidation hergestellten Proteinpräparationen üblicherweise mehr gewünschtes Produkt und weniger Nebenprodukte als die durch eine nicht kontrollierte Oxidation produzierten enthalten.
Präparationen von therapeutischen Proteinen werden eine therapeutisch wirksame Menge des Proteins zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Die Präparation wird üblicherweise zur parenteralen Verabreichung in Vehikeln, wie destilliertem Wasser, menschlichem Serumalbumin und/oder Dextrose, in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung formuliert. Im allgemeinen stellt die Erfindung eine pharmazeutische oder veterinäre Formulierung bereit, umfassend ein oxidiertes rekombinantes Protein, das durch ein erfindungsgemäßes Verfahren hergestellt bzw. zur veterinären oder pharmazeutischen Verwendung formuliert worden ist.
Derartige Formulierungen können gemäß den Standardverfahren des Fachgebiets hergestellt werden und geeignete Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel umfassen und/oder in einer Einheitsdosierungsform vorliegen.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen weiter das erfindungsgemäße Verfahren. Diese Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung in keiner Weise begrenzen. In den Beispielen werden sämtliche Temperaturen in Grad Celsius angegeben.

Beispiel 1

Kontrollierte Oxidation von rekombinantem IFN-βSer17 Präparation von IFN-βSer17

IFN-βSer17 ist ein mikrobiell produziertes Mutein von IFN-β, in dem der Cysteinrest in Aminosäureposition 17 gegen einen Serinrest ausgetauscht ist. IFN-βSer17 weist zwei verbleibende Cysteinreste auf: einen in Position 31 und den anderen in Position 141. Im nativen IFN-β treten die Cysteine in den Positionen 31 und 141 in Wechselwirkung, wobei eine Disulfidbrücke gebildet wird. Der gentechnologisch behandelte, in diesem Beispiel zur Herstellung von IFN-βSer17 verwendete E. coli-Stamm wurde am 18. November 1983 unter der Hinterlegungsnummer 39517 bei American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA hinterlegt.
Der vorstehend erwähnte, gentechnologisch behandelte E. coli-Stamm wurde im nachfolgend beschriebenen Medium gezüchtet:
Bestandteil Ungefähre Anfangskonzentration
Na&sub3;-Citrat·2 H&sub2;O 3 mM
H&sub2;PO&sub4; 30 mM
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 74 mM
MgSO&sub4;·7 H&sub2;O 3 mM
MnSO&sub4;·H&sub2;O 46 uM
ZnSO&sub4;·7 H&sub2;O 46 uM
CuSO&sub4;·5 H&sub2;O 1-2 uM
L-Tryptophan 350 uM
FeSO&sub4;·7 H&sub2;O 74 uM
Thiamin·HCl 0,002% (Gew./Vol.)
Glucose 0,5% (Gew./Vol.)
Es wurden gegebenenfalls eine 25%ige Lösung von Dow Corning Antifoam B, eine 50%ige Glucoselösung und 5 N KOH zugesetzt.
Die Temperatur wurde bei 37 ± 1ºC, der pH-Wert mit NaOH bei 6,5 ± 0,1 und der gelöste Sauerstoff bei 30% (Gew./Gew.) der Luftsättigung gehalten. Die Messungen der optischen Dichte und der Restglucose wurden nach 14 Stunden und danach in Zeitabständen von ungefähr einer Stunde vorgenommen. Die Ernte erfolgte bei Erreichen eines Glucoseverbrauchs von 40 ± 6 g/l (OD bei 680 nm = 10-11).
Das geerntete Material wurde unter Druck durch Drehung durch einen mikroporösen Durchflußfilter ungefähr dreifach konzentriert. Die konzentrierten Zellen wurden, bis zur 4-5-fachen Konzentrierung des geernteten Materials gegen entionisiertes Wasser diafiltriert. Die Zellen wurden im Anschluß daran aufgebrochen, indem sie durch einen Manton-Gaulin-Homogenisator bei 4,1-5,5·10&sup4; kpa (0,6-0,8 psi) geleitet wurden. Nach dem ersten Durchleiten wurde Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Natriumphosphatpuffer zu einer Endkonzentration von 2% (Gew./Vol.) SDS und 0,08 M Natriumphosphat zugegeben und die Solubilisierung wurde für eine Stunde fortgesetzt. Festes Dithiothreitol (DTT) wurde anschließend zu einer Endkonzentration von 50 mM zugesetzt, und das Homogenat wurde 10 Minuten bei 90 ± 5ºC erhitzt. Die erhaltene Zellsuspension wurde in einem Mischapparat mit 2-Butanol bei einem 1:1 2-Butanol:Suspension-Volumenverhältnis extrahiert. Das Gemisch wurde im Anschluß daran zentrifugiert, und die 2-Butanol-reiche Phase wurde gesammelt.
Die 2-Butanol-reiche Phase wurde mit 2,5 Volumen von 0,1%igem (Gew./Vol.) SDS in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vermischt. Festes DTT wurde zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit Eisessig auf 6,2 ± 0,1 eingestellt, und dieses Gemisch wurde zentrifugiert. Die erhaltene Paste wurde gesammelt und in einem Gemisch von PBS und 10% (Gew./Vol.) SDS mit einem unter Verwendung von 1 N NaOH eingestellten pH-Wert von 8,5 ± 0,1 erneut suspendiert. Festes DTT wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugesetzt, und die Suspension wurde bei 90 ± 5ºC für 10 Minuten erhitzt. Die Suspension wurde im Anschluß daran auf etwa 25ºC abgekühlt, der pH-Wert mit Eisessig auf 5,5 ± 0,1 eingestellt und die Lösung filtriert.
Die Lösung wurde anschließend auf eine Sephacryl-S- 200-Vorsäule mit einem Puffer, bestehend aus 1% SDS, 50 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA, pH 5,5, aufgetragen. Die höchsten Interferonaktivitäten enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und durch Ultrafiltration konzentriert, wobei ein Molekulargewicht von 10 Kilodalton abgetrennt wurde.
Das Protein wurde zur Erzeugung von Disulfidbindungen unter Verwendung des Verfahrens von Shaked et al., supra, oxidiert. Eine 1 mM o-Iodosylbenzoesäurelösung wurde durch Mischen der Säure in Wasser, eine etwa 5 Minuten lange Ultraschallbehandlung des Gemisches und anschließendes Rühren und langsamen Zusatz von 2% NaOH, wobei ein pH-Endwert von 8,2 ± 0,2 (weitere Ultraschallbehandlung kann als eine Alternative zum Basenzusatz verwendet werden) erhalten wurde, vorbereitet.
Ein Puffermedium für die Umsetzung wurde durch Auflösung von Na&sub4;P&sub2;O&sub7;·10 H&sub2;O in Wasser zu einer Konzentration von 2 mM vorbereitet. Der pH-Wert dieser Lösung wurde durch Zusatz von 10% Essigsäure auf 9,0 eingestellt, und es wurden SDS zu 0,1%, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zu 1 mM und die o-Iodosylbenzoesäurelösung zu 15 uM der Lösung zugesetzt.
Das auf 9,0 eingestellte Puffermedium wurde in ein mit einem Magnetrührer und einer pH-Elektrode ausgestattetes Gefäß gegeben. Die IFN-βSer17-Präparation und die o- Iodosylbenzoesäurelösungen wurden unter Verwendung von peristaltischen Pumpen, die auf den Einlaß von äquivalenten Molverhältnissen von IFN und Oxidationsmittel geeicht waren, aus Vorratsgefäßen zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Der pH- Wert des Reaktionsgemisches wurde durch Zusatz von 0,25 M NaOH über eine peristaltische Pumpe bei 5 ml/Std., wie benötigt, bei 9,0 unter Kontrolle gehalten. Die IFN-β-Lösung (5 mg/ml in 50 mM Acetatpuffer, pH-Wert 5,5) wurde etwa 5 Stunden lang bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Std. (7,0 Micromol/Std.) zugesetzt; die o-Iodosylbenzoesäurelösung wurde über denselben Zeitraum mit 7 ml/Std. (7 Micromol/Std.) zugesetzt. Es wurde wurde im Anschluß daran weiter Säurelösung zugesetzt, um einen 10-15 micromolaren Endüberschuß zu erhalten. Es folgte nach der Umsetzung eine Umkehrphasen-HPLC und ein Test auf den Restthiol-Gehalt von IFN-βSer17 durch einen Ellman-Test. Nach 6,5 Stunden wurde die Umsetzung durch Zusatz von 10% Essigsäure zum Reaktionsgemisch zu einem pH-Wert von 5,5 beendet.
Das Produkt wurde im Anschluß daran unter Verwendung eines aus 0,1% SDS, 1 mM EDTA und 50 mM Natriumacetat bestehenden Puffers beim pH-Wert von 5,5 auf eine Sephacryl- 200-Säule aufgetragen. Das Einzelsignal aus dieser Säule wurde vereinigt und unter Verwendung eines aus 0,1% SDS, 1 mM EDTA und 50 mM Natriumacetat bestehenden Puffers beim pH- Wert von 5,5 auf eine Sephadex-G-75-Säule aufgetragen.

Oxidation von vollständig reduziertem IFN-βSer17

Das vereinigte Sephadex-G-75-Material, das unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Iodosylbenzoesäure- Oxidationsverfahrens oxidiert worden ist, wurde für die nachfolgenden Untersuchungen der Kupferoxidation verwendet, da es das einzige leicht erhältliche Interferonprodukt war. Das gereinigte IFN-βSer17 wurde im Anschluß an den Zusatz von Dithiothreitol zu 10 mM 15 Minuten bei 50ºC reduziert, um mit Sicherheit zu erreichen, daß keines der Moleküle Disulfidbindungen enthielt. Dies wurde durch RP-HPLC in einem 30-60%igen Acetonitrilgradienten (30-40% in 5 Min., 40-60% in 27 Min.) in 0,1% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure (unter Verwendung einer Vydac-C4-Säule), die die oxidierte von der reduzierten Form von Interferon (Retentionszeiten 26 bzw. 28 Min.) bestätigt. Das reduzierte β-Interferon wurde von der RP-HPLC-Fraktion des entsprechenden Signals durch Gefriertrocknung und erneute Suspension in 0,1%iger (Gew./Vol.) SDS-Lösung und 50 mM Phosphatpuffer beim pH-Wert von 7,0 mit 5 uM EDTA konzentriert. Das Reaktionsgemisch enthielt 0,13 mg/ml Interferon. Die Oxidation wurde durch Zusatz von CuCl&sub2; zu einer 8 micromolaren Endkonzentration unter Verwendung von luftgesättigten Lösungen bei 25ºC gestartet.
Es ist von anderen gezeigt worden, daß die Kinetiken der Disulfidbildung durch Überprüfung der Veränderungen in der Position bei der Elution von verschiedenen HPLC-Säulen gemessen werden kann (Wu et al., Anal. Biochem. 129 (1983), 345-348 und Verweis 8 darin). Ein in den vorliegenden Beispielen verwendeter Test auf Oxidation beruht auf einer Verschiebung in der Elutionsposition bei der RP-HPLC mit einer anschließenden Oxidation.
Fig. 1A veranschaulicht eine RP-HPLC einer Kontrollumsetzung, die das reduzierte β-Interferon ohne CuCl&sub2; im Medium der erneuten Suspension nach 7 Minuten enthält. Fig. 10 veranschaulicht ein RP-HPLC des Reaktionsgemisches, das CuCl&sub2; nach einer 7-minütigen Oxidation enthält, Figur 1C nach einer 14-minütigen Oxidation, Fig. 1D nach einer 28-minütigen Oxidation und Fig. 1E nach 75 Minuten. Fig. 1F veranschaulicht eine graphische Darstellung von prozentualer Oxidation gegen Minuten der Oxidation auf der Grundlage einer RP-HPLC-Analyse. Die Ergebnisse zeigen, daß das Interferon nach 75 Minuten zu mehr als 95% oxidiert ist. Dieses oxidierte Produkt wurde unter Verwendung des zytopathischen Wirkungstests, der von Steward, W. E. II, The Interferon System (New York: Springer-Verlag, 1981), 17 beschrieben wird, auf seine Aktivität gegen Viren getestet, und es wurde gefunden, daß es dieselbe spezifische Bioaktivität wie das native IFN-β, 1·10&sup8; Einheiten/mg, aufweist.
Die für 75 Minuten oxidierte Probe wurde im Anschluß daran 15 Minuten bei 50ºC in 10 mM DTT reduziert. Fig. 2A zeigt das RP-HPLC des oxidierten Materials und Fig. 2B zeigt das RP-HPLC des reduzierten Materials. Ein Vergleich der Chromatogramme zeigt an, daß die Verschiebung der Retentionszeit im RP-HPLC auf eine durch Reduktion mit DTT umkehrbare Oxidation zurückzuführen war.

Beispiel 2

Kontrollierte Oxidation von Des-Ala-IL-2Ser125

Herstellung von vollständig reduziertem Des-Ala-IL-2Ser125

Des-Ala-IL-2Ser125 ist ein IL-2, dessen Aminosäuresequenz sich von der des nativen menschlichen IL-2 wie folgt unterscheidet: (1) das Fehlen des ersten N-terminalen Alaninrestes und (2) ein Serin ist durch ein Cystein in Position 125 ersetzt. Der in diesem Beispiel verwendete, Des- Ala-IL-2Ser125 produzierende E. coli-Stamm wurde bei der ATCC am 6. März 1984 unter der Hinterlegungsnummer 39626 hinterlegt.
Der vorstehend erwähnte, gentechnologisch behandelte E. coli-Stamm wurde unter Verwendung des nachfolgend beschriebenen Nährmediums in einem Fermenter gezüchtet:
Zugesetzte Anfangsbestandteile Ungefähre Anfangskonzentration
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 72 mM
KH&sub2;PO&sub4; 21,6 mM
Na&sub3;-Citrat 1,5 mM
ZnSO&sub4;·7 H&sub2;O 60 uM
MnSO&sub4;·H&sub2;O 60 uM
CuSO&sub4;·5 H&sub2;O 2 uM

pH-Wert mit 2,5 N NaOH auf 6,50 eingestellt

Autoklavierung

Sterile Zusätze (nach dem Autoklavieren):

MgSO&sub4;·7 H&sub2;O 3 mM
FeSO&sub4; 100 uM
L-Tryptophan 70 mg/l
Thiamin·HCl 20 mg/l
Glucose 5 g/l
Tetracyclin 5 mg/1
Ethanol (gegebenenfalls) 2% (Gew./Vol.)
Casaminosäuren 2% (Gew./Vol.)
Es wurden gegebenenfalls eine 20%ige Lösung von Dow- Corning-Antifoam-B, eine 50%ige Glucoselösung und 5 N KOH zugesetzt.
Der pH-Wert des Fermenters wurde mit 5 N NaOH bei 6,8 gehalten. Die Restglucose wurde zwischen 5-10 g/l, gelöster Sauerstoff bei 40% (Gew./Gew.) und die Temperatur bei 37 ± 1ºC gehalten. Die Casaminosäuren (20%ige (Gew./Vol.) Stammlösung) wurden zugesetzt, als die OD&sub6;&sub8;&sub0; etwa 10-15 betrug. Drei Stunden nach Zusatz der mit Casaminosäuren konzentrierten Lösung wurde Ethanol (95% (Gew./Vol.)) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2% (Gew./Gew.) zu erreichen. Zwei Stunden nach der Ethanolzugabe wurde geerntet.
Etwa 20-40 g (Naßgewicht) von den E. coli-MM294-1- Zellen, die das eingeführte, clonierte IL-2 enthielten, wurden in 200 ml von 50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH-Wert von 8,1 bis 8,5) erneut suspendiert. Der hohe pH-Wert war in den nachfolgenden Schritten bei der selektiven Extraktion von E. coli-Proteinen hilfreich. Die Zellen wurden 10 Minuten bei 3000-4000·g zentrifugiert und bei 4ºC in 200 ml Tris/EDTA-Puffer erneut suspendiert.
Die Zellen wurden im Anschluß daran bei 4ºC 45 Minuten (oder bis die optische Dichte bei 600 um etwa 85% gefallen war) unter Verwendung einer großen Sonde, die mit 50%iger Auslastung mit einer Stromeinstellung von "9" des Models W-375 des Ultraschallgeräts von Heat Systems pulste, mit Ultraschall behandelt. Alternativ dazu können die Zellen durch dreimaliges Durchleiten durch einen Manton-Goulin-Homogenisator aufgebrochen werden. Das Homogenat wurde 10 Minuten lang (6000 Upm) unter Verwendung eines Beckman-JA20- Rotors bei 4ºC bei 4500·g zentrifugiert. Die Zelltrümmer wurden in 50 ml eines Tris/EDTA-Gemisches bei Raumtemperatur erneut suspendiert. Über einen Zeitraum von 5 Minuten wurde ein gleiches Volumen von 8 M Harnstoff (Schwartz/Mann ultra rein) in Tris/EDTA-Puffer unter schnellem Rühren zu der Suspension zugesetzt, um eine Harnstoffendkonzentration von 4 M zu erhalten. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur 15-30 Minuten langsam gerührt.
Das Gemisch wurde nach dem Rühren 15 Minuten bei 12000·g (12000 Upm bei Raumtemperatur im Beckman-JA20-Rotor) zentrifugiert, und der Niederschlag wurde entnommen. Der Niederschlag wurde im Anschluß daran bei 20ºC in 9 ml von 50 mM Natriumphosphat (beim pH-Wert von 6,8), 1 mM EDTA und 10 mM DTT erneut suspendiert. Der Niederschlag wurde anschließend durch Zusatz von 1 ml 20% (Gew./Vol.) SDS-Lösung solubilisiert und heftig geschüttelt. Die erneute Suspension wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten bei 12000·g zentrifugiert, und das unlösliche Material wurde verworfen.
Die verbleibende Lösung wurde 15 Minuten bei 40ºC erhitzt, um mit Sicherheit sämtliches IL-2 vollständig zu reduzieren. Die überstehende Flüssigkeit (40% reines IL-2 enthaltend) wurde auf eine mit 50 mM Natriumphosphat (pH- Wert 6,8), 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 1%iger (Gew./Vol.) SDS- Lösung beschickte, auf 2,6 cm·100 cm bemessene Sephacryl- 200-(S-200)-Säule aufgetragen. Aliquots von 3 ul jeder Fraktion wurden im Anschluß daran auf einem Minigel einer 15%igen (Gew./Vol.) SDS/PAGE unterworfen, und das Gel wurde mit Coomassieblau gefärbt. Die Fraktionen mit den geringsten Verunreinigungen (Verminderung des Einschlusses von Verunreinigungen auf ein Mindestmaß von etwa 35 K, 18 K und 12 K Dalton) wurden vereinigt und unter Verwendung eines Amicon- YM5-Ultrafilters zu 5-10 ml konzentriert. Die Präparation bestand aus etwa 80-90% reinem IL-2.
Die vereinigten S-200 Fraktionen wurden auf eine Sephadex-G-100-Säule mit einer Abmessung von 2,6 cm·100 cm aufgetragen, die, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung einer 0,1%igen (Gew./Vol.) SDS-Lösung eluiert wurde. Die Fraktionen wurden durch SDS/PAGE analysiert und die reinsten Fraktionen vereinigt. Die reinsten Fraktionen enthielten 95-98% reines IL-2 mit 0,2-0,5 ng Endotoxin pro 100000 Einheiten. Mehr als 30% des im ursprünglichen Lysat vorhandenen IL-2 wurden als reines IL-2 gewonnen.
Man fand, daß diese vereinigten G-100-Fraktionen ohne Zusätze mindestens sechs Wochen stabil blieben, wenn sie bei 4ºC unter Stickstoff gelagert wurden. Es bildete sich bei 4ºC ein SDS enthaltender Niederschlag, der bei 25ºC vor der Verwendung erneut gelöst oder ohne bedeutenden Verlust von IL-2-Einheiten entfernt werden konnte.

Kontrollierte Oxidation von Des-Ala-IL-2Ser125 unter Verwendung von CuCl&sub2;

Das wie vorstehend beschrieben erhaltene, gereinigte, vollständig reduzierte Produkt, wurde durch Diafiltration/Ultrafiltration gegen 50 mM Tris-HCl-Puffer beim pH- Wert von 8,0 auf 0,5 mg/ml IL-2 eingestellt. Diafiltration gegen Tris-Puffer bewirkte nicht nur die Einstellung des pH- Werts, sondern auch die Entfernung des gesamten verbliebenen EDTA oder DTT, das die Oxidationsreaktion hätte stören können. Die SDS-Konzentration nach dem Diafiltrations/Ultrafiltrationsschritt betrug 1,6% (Gew./Vol.) (wie gemessen im Acridinorange-Test für SDS, beschrieben in Anal. Biochem. 118 (1981), 138-141), und der pH-Wert lag bei etwa 8,0. Das Konzentrat wurde mit Sauerstoff versetzt, indem man Luft durch die Lösung perlen ließ, und die Oxidation wurde unter Verwendung von frisch hergestellten Lösungen durch Zusatz von CuCl&sub2;zu 0,5 uM, 5 uM oder 50 uM gestartet. Die Umsetzungen wurden bei 25ºC durchgeführt. Zur Bestimmung der Oxidationskinetiken wurden in unterschiedlichen Zeitintervallen Aliquots des Reaktionsgemisches entnommen, durch Zusatz von EDTA zu einer Konzentration von 10 mM gestoppt und schnell bei -70ºC eingefroren. Jedes Aliquot wurde zur Messung des Umsetzungsfortschritts unter Verwendung der Gradientenelution mit Acetonitril (30-60% in 45 Min.) in 0,1%iger Trifluoressigsäure durch RP-HPLC analysiert, da ein RP-HPLC die oxidierte von der reduzierten Form des IL-2 trennt (Retentionszeiten 41 bzw. 45 Min.).
Fig. 3 zeigt die RP-HPLC-Analyse der oxidativen Umsetzungen, in denen 50 mM CuCl&sub2; (vor und nach der erneuten Reduktion) verwendet wurden. Fig. 3A zeigt, daß nach einer Oxidationszeit von nur 2 Minuten die Probe ungefähr zu zwei Dritteln oxidiert war. Fig. 30 zeigt, daß nach einer Oxidationszeit von 10 Minuten die Probe im wesentlichen vollständig oxidiert war und weitere Signale (Nebenreaktionen anzeigend) nur als Spuren beobachtet wurden. Fig. 3C zeigt, daß eine Oxidationszeit von 50 Minuten die Menge der produzierten Nebenproduktbestandteile nicht vergrößert und daß deswegen keine Nebenreaktionen während der verlängerten Oxidation auftreten. Fig. 3D zeigt, daß das Oxidationsprodukt nach einer Oxidationszeit von 50 Minuten unter Verwendung von 10 mM Dithiothreitol 15 Minuten bei 60ºC erneut zum vollständig reduzierten IL-2 reduziert werden kann. Dies zeigt an, daß die Signale in den Fig. 3A, 3B und 3C oxidiertes Material, das reduzierbar war, darstellten.
Fig. 4 zeigt eine mit silber-gefärbte, nicht reduzierende SDS-PAGE-Analyse des Produktes nach einer Oxidationszeit von 40 Minuten unter Verwendung von 50 uM CuCl&sub2;. Trotz der verwendeten, empfindlichen Färbetechniken fand man, daß nur Spuren des oxidierten Produktes intramolekulare Sulhydrylgruppen, die Dimere erzeugen, gebildet hatten.
Die Untersuchungen von bei verschiedenen CuCl&sub2;- Konzentrationen durchgeführten Oxidationen werden in Fig. 5 graphisch zusammengefaßt. Diese Figur zeigt, daß die beobachtete Oxidationsgeschwindigkeit, wie sie durch die Signalhöhe im HPLC ohne Hintergrund gemessen wird, von der CuCl&sub2;- Konzentration abhängt, und deswegen kann die Umsetzung durch Einstellung dieses Parameters kontrolliert werden. Diese Umsetzungen mit 5 uM an verwendetem CuCl&sub2; enthielten IL-2 in einem 6-fachen molaren Überschuß, trotzdem wurde es in 60 Minuten vollständig oxidiert, was anzeigte, daß CuCl&sub2; katalytisch wirken konnte. Eine 10 mM EDTA enthaltende Kontrollumsetzung zeigte im wesentlichen keine Oxidation.
Eine ähnliche Oxidationsreihe wurde bei einer IL-2- Lösung in einer Konzentration von 0,2 mg/ml unter Verwendung von 8 uM CuCl&sub2; in einem Gemisch von 30 mM Tris und 30 mM Natriumphosphatpuffer, der auf die pH-Werte von 6, 6,5, 7,5, 8,0, 8,5 oder 9,5 eingestellt war und 0,1% (Gew./Vol.) SDS enthielt, durchgeführt. In sämtlichen Umsetzungen wurde der pH-Wert am Ende der Umsetzung bestätigt. Die Untersuchungen von 7-minütigen, bei verschiedenen pH-Werten durchgeführten Oxidationen werden in Fig. 6 graphisch zusammengefaßt. Diese Figur zeigt, daß es einen optimalen pH-Bereich für die Oxidation von IL-2 gibt: etwa von 6 bis 8, oberhalb davon läßt die Oxidationsgeschwindigkeit sehr stark nach.

Kontrollierte Oxidation von Des-Ala-IL-2Ser125 unter Verwendung des (o-Phenantrolin)&sub2;Cu²&spplus;-Komplexes

Das vorstehend beschriebene Oxidationsverfahren wurde unter Verwendung eines frisch hergestellten 8 uM (o-Phenanthrolin)&sub2;Cu²&spplus;-Komplexes anstelle von CuCl&sub2; wiederholt. Der vorstehend beschriebene, 0,1% SDS (Gew./Vol.) enthaltende Tris/Phosphatpuffer wurde beim pH-Wert von 7,0 verwendet. Fig. 7 liefert einen Vergleich des RP-HPLC des IL-2 nach einer 7-minütigen, mit 8 uM CuCl&sub2; vorgenommenen Oxidation (Fig. 7A) mit dem RP-HPLC des IL-2 nach einer 7-minütigen, mit 8 uM (o-Phenanthrolin)&sub2;Cu²&spplus; durchgeführten Oxidation (Fig. 70). Die Ergebnisse zeigen, daß das IL-2 durch den (o-Phenanthrolin)&sub2;Cu²&spplus;-Komplex beim pH-Wert von 7 schneller als nur durch CuCl&sub2; oxidiert werden kann.

Reinigung von oxidiertem Des-Ala-IL-2Ser125

Das von der Harnstoffextraktion von Beispiel 2 gewonnene, unlösliche Material wurde in 50 mM Natriumphosphatpuffer und 1 mM EDTA beim pH-Wert von 7,0 erneut suspendiert. Die Suspension wurde im Anschluß daran durch Zusatz von festem SDS zu einer Endkonzentration von 5% (Gew./Vol.) solubilisiert.
Die 5%ige SDS-Lösung wurde mit 0,1 M Na&sub2;HPO&sub4; beim pH- Wert von 8,0 auf 2% SDS verdünnt. Die Proteinkonzentration wurde bestimmt, der pH-Wert wurde auf 8,5 eingestellt und DTT wurde zu 50 mM und EDTA zu 2 mM zugesetzt. Das Gemisch wurde zur Reduktion von IL-2 unter Stickstoff auf 40ºC erhitzt. Das Gemisch wurde im Anschluß daran abgekühlt und der pH-Wert wurde auf 5,0 eingestellt.
Die Lösung wurde anschließend mit 1 mM DTT enthaltendem 2-Butanol in einem Verhältnis (Vol./Vol.) von 1:1 bei Raumtemperatur extrahiert. Die Verweilzeit betrug 2-2,5 Minuten. Die Extraktion wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/Min. in einem Flüssig-Flüssig-Phasentrenngerät durchgeführt. Der organische Extrakt wurde abgetrennt, und sein pH-Wert wurde mit NaOH auf 8,0 eingestellt. Der Extrakt wurde im Anschluß daran langsam zu 0,1% SDS in 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 2 mM DTT und einem pH-Wert von 6 zugegeben und 15- 20 Minuten gerührt. Der erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt, und die erhaltene Paste wurde in 5% SDS in PBS erneut suspendiert. Die Lösung wurde durch Zentrifugation aufgeklärt und wie vorstehend beschrieben reduziert. Im Anschluß an die Reduktion wurde die Lösung mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt. Die Lösung wurde durch Gelfiltration unter Verwendung einer auf 2,6 cm·100 cm bemessenen, mit 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 1% (Gew./Vol.) SDS beschickten S-200-Säule gereinigt.
Die Fraktionen der entsprechenden Signale von dieser Säule wurden vereinigt, und ein Teil dieses Materials (in 50 mM Natriumacetat (pH 5,5), 1% SDS, 1 mM DTT und 1 mM EDTA) wurde unter Verwendung einer Amicon-YM-5-Ultrafiltrationsmembran mit einer Ausbeute von 6,6 mg an Gesamtprotein auf 760 Microliter konzentriert. Dithiothreitol wurde zu einer Konzentration von 2,5 mM zugesetzt, und die Probe wurde 10 Minuten bei 60ºC erhitzt, um mit Sicherheit eine vollständige Reduktion zu erreichen. Das Reduktionsmittel wurde unter Verwendung einer G-25-Entsalzungssäule (19·0,9 cm), die in 0,1% SDS enthaltendem, 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert wurde, entfernt. Die Fraktion des entsprechenden Signals des Proteins wurde vereinigt, 5,5 mg ergebend, die im Säulenpuffer auf 0,25 mg/ml verdünnt wurden. Die Menge freier Sulfhydrylgruppen wurde sofort unter Verwendung von Ellman-Reagenz (5,5'-Dithiodi(2-nitrobenzoesäure), (DTNB)) im Sulfhydryltest (wie beschrieben von Habeeb, A.F.S.A., Methods of Enzymology 25 Teil B (1972), 457- 64, der Cystein als Standard verwendet) getestet.
Man ließ zur Belüftung der Probe für 15 Sekunden Luft durch die Probe perlen, und die Oxidation wurde durch Zusatz von CuCl&sub2; zu einer 50 micromolaren Konzentration bei 25ºC begonnen. Der Oxidationsfortschritt wurde durch Untersuchung der verbliebenen freien Sulhydrylgruppen im wesentlichen unter Verwendung des DTNB-Tests nach einer 5, 10 und 30 Minuten langen Inkubation bei Raumtemperatur gemessen.
Fig. 8, die die Oxidationskinetiken der Fraktionen des entsprechenden Signals des IL-2 von der S-200-Säule darstellt, zeigt, daß die Oxidation nach 30 Minuten im wesentlichen vollständig war. EDTA wurde nach 35 Minuten zu einer Konzentration von 10 mM zugesetzt, mit einer anschließenden Zugabe von 1/10-Volumen von 100% Acetonitril/5% Trifluoressigsäure. Oxidiertes IL-2 wurde im Anschluß daran durch präparative RP-HPLC auf einer 10 mm·25 cm bemessenen, 10 Micron-Vydac-C4-Säule, die in 10% Acetonitril/0,1% TFA äquilibriert wurde, vom verbleibenden E. coli-Protein und Endotoxin abgetrennt. IL-2 wurde bei 60% Acetonitril gewonnen, im Anschluß an eine Gradientenelution bei 2 ml/min. (10-30% Acetonitril in 5 Minuten, 30-60% Acetonitril in 45 Minuten). Die Fraktion des entsprechenden Signals von IL-2 wurde vereinigt, und es wurde durch die Absorption bei 280 nm festgestellt, daß sämtliches gewonnene Protein aus 3 mg bestand.
An diesem Punkt wurde das Protein, wie nachstehend beschrieben, formuliert: Zu einem Volumen von 7,7 ml vereinigter HPLC-Fraktionen wurde Mannit zu 1,7% zugesetzt, und SDS wurde zu 0,037% zugegeben. Die Probe wurde über Nacht gefriergetrocknet und in 2,9 ml von 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8) in WFI (Wasser zur Injektion) erneut suspendiert. Die Endkonzentrationen von SDS und Mannit waren 0,1% bzw. 5%.
Mit vier Microgramm des gefriergetrockneten, erneut suspendierten IL-2 wurde eine SDS-PAGE-Minigelanalyse unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen (5-minütiges Kochen in 2% SDS und 50 mM Tris-HCl, beim pH-Wert von 6,8, mit oder ohne 1% β-Mercaptoethanol) durchgeführt. Die in Fig. 9 wiedergegebene Analyse zeigt, daß das nicht reduzierte IL-2 etwas schneller als das reduzierte IL-2 wandert, wie dies in der Literatur für ein Disulfidbindungen enthaltendes Molekül erwartet wird. Scannermessungen mit einem Densitometer unter Verwendung des Shimadzu-CS-930-Scanners mit dem TCA-fixierten, Coomassie-gefärbten Gel zeigten, daß das Endprodukt eine mehr als 95%ige Reinheit und weniger als 2% Protein aufweist, das in für oligomeres IL-2 zu erwartenden Positionen wandert. Die verbleibenden IL-2-Oligomere können gegebenenfalls durch Molekularsieb-Chromatographie (S-200 Säulen, Durchführung wie vorstehend beschrieben) im Anschluß an den Oxidationsschritt wirksam beseitigt werden. Es stellte sich heraus, daß die RP-HPLC sowohl verbliebene Verunreinigungen von E. coli als auch Pyrogene entfernt. Mindestens 50% des vereinigten Ausgangsmaterials bei der S-200-Säule wurden im oxidierten Endprodukt wiedergewonnen.
Als zuletzt vorhandene spezifische Bioaktivität des gereinigten IL-2 wurden 4-6·10&sup6; Einheiten/mg gemessen (Einheiten beruhend auf Einheiten gemessen mit dem HT-2 Zell-Proliferationstest (Watson, J., J. E. M. 150 (1979), 1510-1519 und Gillis, S. et al., J. I. 120 (1979), 2027- 2032) und auf dem Proteingehalt, gemessen nach dem Verfahren von Lowry, O.H. et al., J. Biol. Chem. 193 (1951), 265-275), und der Endotoxingehalt betrug weniger als 0,3 Nanogramm/mg IL-2, wie dies durch den Limulus-Ambozyten-Lysattest (LAL) gemessen wurde. Die spezifische, biologische Aktivität des gereinigten, oxidierten Produktes ist im wesentlichen vom nativen IL-2 von induzierten, peripheren Blutlymphocyten oder vom nativen, von der induzierten Jurkat-Zellinie isolierten IL-2 ununterscheidbar. Daher gleicht die Bioaktivität von oxidiertem, rekombinantem IL-2 dem der nativen Gegenstücke, von denen bekannt ist, daß sie oxidiert sind. Sowohl reduzierte native als auch reduzierte rekombinante IL-2-Proteine weisen bedeutend geringere spezifische Bioaktivitäten auf. Da gezeigt wurde, daß das hier beschriebene oxidierte Produkt verglichen mit den Messungen bei nativem, von Jurkat oder peripheren Blutlymphocyten abstammendem IL-2 identische biologische Aktivitäten aufweist (unveröffentlichte Beobachtungen), kann das durch das vorliegende Verfahren hergestellte IL-2 bei der Förderung der Fähigkeit des menschlichen Immunsystems, virale pathogene Stoffe und Krebsarten zu bekämpfen, von Nutzen sein.
Das Endprodukt kann zur Lagerung gefriergetrocknet werden und/oder kann 60 Tage lang oder länger ohne signifikante Änderung seiner biologischen oder physikalischen Eigenschaften bei 4ºC in Lösung aufbewahrt werden.
Bei der Durchführung der oxidativen Umsetzung von Des-Ala-IL-2Ser125, wie vorstehend beschrieben, aber ohne Verwendung von SDS oder anderer Lösungshilfsmittel zur Lösung des vollständig reduzierten IL-2, erfolgte keine meßbare Oxidation. Bei der Durchführung der Oxidation von Des- Ala-IL-2Ser125 unter den vorstehend beschriebenen, bevorzugten Bedingungen, mit dem Unterschied der Verwendung von FeSO&sub4; als Oxidationspromotor, sind weniger als 10% des Produktes oxidiert worden, wodurch gezeigt wurde, daß Fe²&spplus; ein viel weniger wirksames Kation zur Förderung der Oxidation darstellt.
Bei der Durchführung der Oxidation eines reduzierten Moleküls, das drei Cysteine enthielt (d. h. Des-Alanyl, rekombinantes IL-2, das von einem am 4. August 1983 unter der Hinterlegungsnummer 39405 bei der American Type Culture Collection hinterlegten E. coli-Stamm produziert wird), unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Bedingungen, wiesen mindestens 85% des Produktes richtige Disulfidbindungen (zwischen Cys 58 und Cys 105) auf und zeigten eine mit dem nativen Protein identische Bioaktivität. Ungefähr 15% des Materials, die vermutlich Isomere von IL-2 mit falschen Disulfidbindungen darstellten, waren inaktiv. Fig. 10 zeigt eine RP-HPLC-Analyse des mit einem 30-60%igen Acetonitrilgradienten eluierten Endproduktes. Die Retentionszeiten betrugen für inaktive Isomere 29 Min. und für aktives IL-2 44 Min..

Beispiel 3

Kontrollierte Oxidation von Des-Ala-IL-2Ser125 bei 37ºC

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung einer Temperaturerhöhung auf die oxidative Umsetzung dieser Erfindung.
Die in Beispiel 2 in "Reinigung von oxidiertem Des- Ala-IL-2Ser125" beschriebenen Fraktionen des entsprechenden Signals der S-200-Säule wurden vereinigt, und das Material des entsprechenden Signals wurde unter Verwendung einer Amicon-YM-5-Ultrafiltrationsmembran auf 720 Microliter konzentriert. Dithiothreitol wurde bis zu einer Konzentration von 3,5 mM zugesetzt, und das IL-2 wurde im Anschluß daran 10 Minuten bei 60ºC erhitzt. Das Dithiothreitol wurde anschließend unter Verwendung einer in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0) äquilibrierten, 0,1% SDS enthaltenden G-25- Entsalzungssäule entfernt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung desselben Puffers auf 0,25 mg/ml eingestellt. IL-2 wurde im Anschluß daran in zwei 10 ml Portionen aufgeteilt und in einem zirkulierenden Wasserbad bei entweder 25ºC oder 37ºC äquilibriert. Die Oxidation wurde durch Zusatz von CuCl&sub2; zu 50 uM eingeleitet. Die Oxidationskinetiken wurden anschließend bestimmt durch 1.) Messung der Menge freier Sulfhydrylgruppen unter Verwendung des Tests mit Ellman-Reagens und durch 2.) Überprüfung der Menge von IL-2, das bei den für reduziertes und oxidiertes IL-2 erwarteten Retentionszeiten vorhanden war, im Anschluß an eine RP-HPLC.
Die Temperaturerhöhung bei der Oxidation von 25ºC auf 37ºC vergrößerte die Oxidationsgeschwindigkeit, wie in beiden Tests gemessen wurde, ungefähr um das zweifache. Sowohl die Temperatur als auch die Kupferkonzentration haben deswegen einen Einfluß auf die Oxidationsgeschwindigkeit. Sowohl die Oxidationen bei 25ºC als auch die bei 37ºC verliefen bis zur im wesentlichen 100%igen Vollständigkeit, wobei freie Sulhydrylgruppen auf ein Mindestmaß verringert wurden und die Möglichkeit von nachfolgender Oligomerbildung durch Thiol-Disulfid-Umwandlung in großem Umfang vermindert wurde. Eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse ließ erkennen, daß die oxidierten IL-2-Produkte anscheinend identisch waren, und ein Biotest zeigte, daß sie dieselbe spezifische Aktivität aufwiesen. Eine nicht reduzierende SDS-PAGE-Analyse zeigte bei beiden Temperaturen die Bildung von weniger als 1% Oligomere.
Zusammengefaßt stellt die vorliegende Erfindung ein kontrolliertes Oxidationsverfahren für vollständig reduziertes, Cystein enthaltendes, rekombinantes IL-2 und IFN-β unter Verwendung eines Cu²&spplus; enthaltenden Oxidationspromotors bereit, der die in vitro Bildung von Disulfidbrücken, die denen im nativen Protein gefundenen entsprechen, katalysiert. Das hier beschriebene Verfahren beseitigt oder vermindert die Nebenreaktionen während der Oxidation auf ein Mindestmaß und maximiert die Fähigkeit des oxidierten Produktes zur Wiedergewinnung der vollständigen Bioaktivität.

Claims

1. Verfahren zur Oxidation eines vollständig reduzierten rekombinanten Proteins, ausgewählt aus der Gruppe Interferon-beta, Interleukin-2 und deren Muteine, umfassend die Umsetzung einer wäßrigen Lösung, die eine gelöste Form des rekombinanten Proteins und ein Lösungshilfsmittel enthält, bei einem pH zwischen etwa 5,5 und 9 in Gegenwart von Luft mit mindestens einer wirksamen Menge eines Cu²&spplus;-Kation enthaltenden Oxidationspromotors, wobei Cysteine vorzugsweise unter Ausbildung von Disulfidbrücken, die denen im natürlich vorkommenden Protein vorhandenen entsprechen, oxidiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das rekombinante Protein ein Mutein des Proteins ist, bei dem mindestens einer der Cysteinreste, der zur Ausbildung einer Disulfidbindung zur Verfügung steht und für die biologische Aktivität des Proteins nicht essentiell ist, entfernt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in dem das Mutein das des- Ala-IL-2Ser125 oder IFN-βSer17 ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, in dem der pH zwischen etwa 6 und etwa 8 liegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, in dem der Oxidationspromotor CuCl&sub2; oder (o-Phenanthrolin)&sub2;-Cu²&spplus; ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, in dem die Konzentration des Proteins im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 2 mg/ml liegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, in dem die Konzentration des Oxidationspromotors der Konzentration an freien Sulfhydrylgruppen des Proteins, die unter Bildung von Cystinen oxidiert werden sollen, ungefähr äquivalent ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, in dem der Oxidationspromotor CuCl&sub2; ist und seine Konzentration im Bereich von etwa 1 bis 400 micromolar liegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, in dem das Protein in Natriumdodecylsulfat oder Harnstoff solubilisiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Protein ein IL-2 oder IFN-β-Mutein ist, der Oxidationspromotor CuCl&sub2; in einer Menge von etwa 5 bis 50 micromolar ist, der pH der Umsetzung etwa 7 ist, die Konzentration des IL-2 oder IFN-β-Muteins im Reaktionsgemisch im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1 mg/ml liegt und Natriumdodecylsulfat als Lösungshilfsmittel in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 1 Gewichts-% pro Volumen vorhanden ist.

11. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen oder veterinären Formulierung, umfassend die Herstellung eines oxidierten rekombinanten Proteins durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und die Formulierung des Proteins zur pharmazeutischen bzw. veterinären Verwendung, gegebenenfalls zusammen mit einem verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel und/oder in einer Einheitsdosierungsform.