JPS61140600A - 蛋白質の酸化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ニジエリシャ・コリ（Ｅａｃｈｅｒｉｅｈ
ｉａｃｏｉｌ）のごとき微生物において生産された十分
忙還元されたクローン化遺伝子生成物中のジスルフィド
結合の形成を触媒する方法に関する。さらに詳しくは、
この方法は天然蛋白質種中に存在するものに対応するジ
スルフィド橋のイン−ビトロ形成を促進するように反応
が制御される酸化方法に関する。

〔従来の技術〕

その天然状態忙おいて１又は複数のジスルフィド橋を含
有する天然蛋白質が組換蛋白質として微生物中で生産さ
れる場合、生産される蛋白質はしばしば還元形であって
ジスルフィド橋を欠く。若干の場合、蛋白質生成物は精
製の後オリシマーを含有する。このようなオリシマーは
制御されない酸化又はチオール−ジスルフィド交換反応
の結果であろう。天然蛋白質がジスルフィド結合を含有
　。

する場合、オリゴ９マー又は他の変形された蛋白質副産
物の形成を最少にしながら、組換蛋白質生成物中の対局
スるジスルフィド結合の形成を化学的に促進することが
しばしば好ましい。制御されない態様での蛋白質の酸化
はまた、不所望の異性体の形成（正しくない分子内架橋
形成）をもたらすであろう。このような不所望の反応は
培養物からの蛋白質の精製を複雑化し、所望の構造を有
する蛋白質の収量を減少せしめ、又は十分でない生物活
性を有する蛋白質を生成せしめるであろう。医療的使用
が意図される若干の蛋白質の場合、精製中又は製剤化中
における制御されないジスルフィド結合の形成は、不活
性なモして／又は増加した免疫原性を有する異性体及び
／又はオリゴ９マーにより汚染された不均一な物質をも
たらすであろう。

１９８５年７月２３日に許可された米国特許ム４．５３
０，７８７は、システィンを酸化して所望のジスルフィ
ド橋を高収率で優先的に生成せしめる非触媒的酸化剤、
好ましくはＯ−ヨートン安息香酸（ｏ−１ｏｄｅｓｏｂ
ｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ　）を用る選択的な制御され念
態様で、微生物的に生産された蛋白質を酸化する方法を
記載している。この方法は、酸化が完全に進行すること
全保証するため忙少なくとも理論量の酸化剤を必要とす
る。

同様に、尿素中酸化された及び還元され九グルタチオ／
の混合物を用いて、微生物的に生産されたレンネット中
のジスルフィド結合形成の触媒のための方法が記載され
ている。（ヨーロツノ９％許出願Ａ３３３０７８４１．
３．１９８４年８月１日ヨー　Ｃｆ　ｙ　／＃出願公開
Ａ　Ｉ　１４．５０７　、　Ｍａｙ＠ｎｇａｏ　）ドデ
シル硫酸ナトリウムの存在下で、フェリシアニド又は鋼
＋２イオンがβ−ラクトグロブリン中のジスルフィド結
合の形成を触媒することが知られている。Ｌｅｓｌｉ＠
、　Ｊ、等、　Ｃａｎ、　Ｊｏｕｒ。

Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、、　４６．６２５（１９６８）−他の
開示は、特定の場合のシスティン又はジスルヒドリル基
の酸化剤としての特定の２価金属塩の使用を教示してい
る：６）銅イオン＝（遊離システィンのため）Ｈａｎａ
ｋｉ、　Ａ、等、　Ｂｕｌｌ　Ｃｈｅｍ、　ｓｏｅ、　
Ｊｐｎ、＋　５Ｌ２０６５（１９８３）　：　（リゾチ
ーム中のスルヒドリルのため）　Ｙｕｔａｎｉ、　Ｋ、
等、　Ｊ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、＋　６４．４４９（１９６
８）　：　（スルヒドリル化合物１例えばグルタチオン
、システィン、２−メルカプトエタノールチオグリコー
ル酸及び還元されたリポ酸のため）Ｋｏｂａｓｈｌ　、
　Ｋ、　、　Ｂｌｏｅｈｉｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａ
ｅｔｎ、　１５Ｌ２３９（１９６８）：　（ｂ）遷移金
属＝（システィ／及び他のメルカプタン類並びに遊離ス
ルヒドリル基を有する蛋白質のため）　Ｆｒｉｅｄｍａ
ｎ、　Ｍｅｎｄｅｌ　ｅ　ＴｈｅＰｅｐｔｌｄｅｓ　ａ
ｎｄ　Ｆｒｅｔ＠ｉｎｓ、　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｐ＠
ｒｇａｍｏｎ　Ｐｒ＠ｍｓ　）　＋第２章２５〜５０頁
（１９７３）；並びに（ｃ）おそらくカルシウムイオン
：（デオキシリがヌクレアーゼ中のスルヒドリルのため
）Ｐｒｉｃ＠、　Ｐ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、、　２４４．９２９（１９６９）。

これらの反応における機構は明らかでないが、しかし過
酸化物又は遊離基が関与する反応に基礎を置くことが予
想されている。しかしながら、所与の２価塩が広範な副
反応を伴わないで特定の蛋白質の正しい酸化を好結果に
促進するであろうことを予想することは現時点では不可
能のようである。この発明は１組換インターロイキンー
２及びβ−インターフェロンの種々の形態においてジス
ルフィドの高度に選択的且つ有用な形成を促進する若干
の金属含有化合物の能力を証明する。

〔本発明の詳細な説明〕

この発明は、インターフェロン−β、インターロイキン
−２、及びこれらのムティンから成る群から選択された
十分に還元された組換蛋白質を酸化し、と九によってシ
スティンを、天然蛋白質中に存在するジスルフィド橋忙
相当するジスルフィド橋を優先的に形成するように酸化
する方法に関する。この方法は、可溶化され念形の組換
蛋白質を含有する水性溶液を、約５．５〜９の−におい
て、空気の存在下で、Ｃｕ＋２陽イオンを含有する少な
くとも有効量の酸化促進剤と供に反応せしめることを含
んで成る。

この発明の方法は、酸化的副反応、十分な生物活性の再
現不能、及び不所望のオリゴ９マー又は異性体形成を含
む特定の蛋白質の酸化中忙遭遇される困難を最小にする
。さら忙、酸化促進剤として塩化鋼を使用する。ここ忙
記載される好ましい方法は、非常忙急速であり、そして
最終生成中で容易に測定することができ且つそれから容
易に除去することができる試薬を用いるという追加の利
点を有する。ここに記載される反応は触媒的濃度におい
ても、化学量論的濃度（遊離スルフィドリルに関して）
においても活性である。従って、＃化促進剤と蛋白質と
のモル比をモニターする必要性（１００％のジスルフィ
ド形成を達成するため）は他の酸化剤を用いるのと比べ
て大きくない、、Ｉｎｇ／ｄ濃度における組換体インタ
ーロイキン−２（ｒＩＬ−２）又はβ−インターフェロ
ン（ｒｌＦＮ−β）中のジスルフィド結合の形成は、１
００μＭより低いＣｕ　Ｃ６２濃度において１時間以内
に完結し得る。

°この発明の方法により酸化される組換蛋白質はそれら
を製造するために使用される宿主に対して本来的ではな
い。ＩＬ−２及びβ−ＩＦＮＦｉいずれも有用蛋白質と
実質的に同一なアミノ酸配列を有し、そして有用蛋白質
中では分子内結合して１個のシスチン成分（ジスルフィ
ド橋＞を形成しているシスティン残基を含有する。これ
に関して、１実質的に同一″なる語は、組換有用蛋白質
のアミノ酸配列がその天然対応物のそれと同じであるか
、あるいは該組換蛋白質とその天然対応物との間の不都
合彦機能的非類似性を惹起しない１個又は複数個のアミ
ノ酸の変化（例えば、欠失、付加、又は置換）により異
ることを意味する。この発明の方法忙より酸化される組
換蛋白質は十分に還元される。すなわち、それらはジス
ルフィド橋を欠く。

インターロイキン−２のごとき蛋白質が酸化のために均
一な基質であるために、これは通常醸化過程に先立って
還元される。還元は、蛋白質を還元剤１例えばジチオス
レイトール又は２−メルカプトエタノールにより、上昇
した温度において短時間処理することにより達成され得
る。そしてこの還元剤が酸化の直前に除去される。

この発明の方法によって酸化されるべき組換蛋白質は確
立された遺伝子工学的技法を用いて生成せしめることが
できる。これらの技法は、天然蛋白質をコードする構造
遺伝子を同定しそして特徴付け、その遺伝子又は天然蛋
白質と機能的に同等なムティンをコードする変異体を単
離し又は合成し、該遺伝子を適切な発現ベクター中に該
遺伝子の発現を許容する位置に挿入し、該ベクターによ
りコンピテント異稲性宿主、好ましくは微生物を形質転
換し、正しい形質転換体を同定し、そして該形質転換体
を適当な増殖培地中で培養することを含む。この蛋白質
は典型的には、細胞を破砕し。

細胞片を可溶化剤（蛋白質の溶解特性に依存する）及び
１又は複数の抽出剤で処理して粗蛋白質を単離し、そし
てこの粗蛋白質を種々の調製的クロマトグラフ法により
精製することにより培養物から回収される。発酵又は回
収工程でこの蛋白質がオリゴマー形質に感受性であれば
、回収の適切な段階において還元剤により処理されるで
邊そう。

組換蛋白質が宿主から粗製の形で、実質的に純粋な形で
、又は純粋な形で回収された後、これは還元され、そし
て次にこの発明の方法を用いて制御された速度により酸
化される。この発明の方法忙従う制御された酸化が、過
剰酸化を伴わないで又は最少の過剰酸化を伴って、そし
て正しくないジスルフィド又は不所望のオリゴマーの生
成を伴わないで又は最少のそれらを伴って、天然対応物
中の架橋に一致する組換蛋白質中のジスルフィド橋の形
成を生じさせる。このような酸化が、天然対応物のコン
フィギユレーションに非常に類似するコンフィギユレー
ションでの組換蛋白質の高収量を可能にし、これによっ
て組換蛋白質が天然蛋白質と機能的に同等である可能性
を保証する。

ここで使用する”組換蛋白質”なる語はま念、ＩＬ−２
及びβ−ＩＦＮのムティンを意味する。このよりなムテ
ィンには、例えば、分子間架橋又は正しくない分子内ジ
スルフィド結合の形成のための部位を除去するためにジ
スルフィド橋に関与しない１又は複数のシスティンが他
のアミノ酸により置き換えられている蛋白質が含まれる
。システィン以外のアミノ酸が置き換えられている他の
ＩＬ−２ムテインもまた造成されておりそして十分に活
性である。

不所望のそして非必須のシスティンのコドンを含有する
遺伝子は、該遺伝子の該領域に相補的であるがしかし該
システィンコドン中に１又は多数の塩基変化を含有する
合成オリがヌクレオチドプライマーを用いて選択的に変
形し、今度はその部分に異るアミノ酸を含有する変異体
蛋白質（ムティン）をもたらすことができる。欠失が望
ましい場合、オリゴヌクレオチドはシスティンのコドン
を欠くであろう。システィンの中性アミノ酸、例えばグ
リシン、バリン、アラニン、ロイシン、インロイシン、
チロシン、フェニルアラニ／、ヒスチジン、トリプトフ
ァン、セリン、スレオニン又はメチオニンへの転換が好
ましい方法である。セリン、スレオニン又はアラニンは
化学的にシスティンに類似するため、これらが好ましい
置換物である。システィンが欠失する場合、天然アミノ
酸は天然蛋白質忙比べて１アミノ酸短い。

ヒ）　ＩＬ−２及びＩＦＮ−βはいずれも成熟蛋白質中
に３個のシスティン残基金含有する。３個のシスティン
の存在は、再酸化に際してこれらの蛋白質が３種類の可
能な分子内ジスルフィド橋のいずれかを形成することが
できることを意味し、この内の１種類のみが天然分子中
の正しい架橋に相当する。非必須システィンがセリン忙
変えられているＩＦＮ−β及びＩＬ−２のムティンは、
それぞれＭａｒｋ等、　（１９８４）、　ＰＮＡＳ　（
ＵＳＡ）、　８１．５６６２−５６６６、及びＷａ　ｎ
　ｇ等（１９８４）　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．
１４３１−１４３３に詳細に検討されている。

この発明の方法において使用される酸化促進剤は、シス
ティン残基の酸化を優先的に促進するため忙寄与しそし
て２価鋼陽イオンを含有する。

Ｆ＠＋２のごとき他の２価陽イオンは酸化促進剤として
非常に効果的でない。Ｃｕ　　は、最少の副産物を伴っ
て純粋な酸化された蛋白質を生成せしめることが見出さ
れる。１優先的”なる語は、酸化促進剤が（１）一層高
いレベルへの酸化を伴わないで又はそのような有意な酸
化を伴わないでシスティンを酸化して優先的にジスルフ
ィド結合を生成せしめ、（２）優先的に、システィンを
酸化して天然蛋白質中に存在するジスルフィド橋に相当
するジスルフィド橋を生成せしめ、そして（３）優先的
に、他の残基に対してシスティ／を酸化することを示す
。この発明の酸化促進剤は、天然蛋白質中に存在するジ
スルフィド橋に相当するジスルフィド橋を形成するよう
に酸化されたシスティンを有する目的生成物の９５チ以
上の収率を得るように、２個のシスティン残基金含有す
るＩＬ−２のムティンの酸化を促進することができる。

このものはまた、目的生成物の８０〜８５チの収率が得
られるよう忙、３個のシスティン残基を含有するＩＬ−
２のムティンの酸化を促進することができる。この発明
の適当な酸化促進剤の例にはＣｕ　ＣＬ２及び（ｏ−フ
ェナンスロリン）２Ｃｕ＋２錯体が含まれる。好ましく
は、酸化促進剤はＣｕ　ＣＬ　２である。

酸化促進剤の使用量は、酸化のために少なくとも有効な
量、すなわち最少において、便利な時間内に酸化反応を
効果的に行うために必要な量である。この竜、及び各反
応の九めの最適量は、例えば、蛋白質のタイプ、酸化促
進剤のタイプ、反応温度１反応の−、並び忙可溶化剤の
タイプ及び濃度に特異的に依存するであろう。酸化促進
剤の濃度及び酸化時間の変化もまた生成する副産物のタ
イプ及び量に影響を与えることが予想される。医療目的
のためには、実質的にすべての副産物、及びチオール−
ジスルフィド交換反応を介して不所望のオリゴマーを生
成することが理論上可能な未酸化出発物質を除去するこ
とが通常必要であろう。

後記の例において、有効量は、所望のジスルフィド結合
の形丞に関与することが予定されている蛋白質上の遊離
スルヒドリル基の濃度とおよそ当量の量である。言うま
でもなく、この量は１便利な反応時間、副産物のタイプ
及び量、声等を包含するがこれらに限定されない基準に
従って、各蛋白質について最適化されなければならない
。独立変数が相互に作用し、すべての蛋白質のために特
異的な一組の最適条件は存在しないようである。

ＩＬ−２の酸化速度忙対するＣ　ｕ　ＣＬ　２の濃度の
効果を例示する第５図は、観察される酸化速度が０．５
μＭから５０μＭへのＣｕ　Ｃ１２濃度の増加に従って
増加することを示す。反応が室温ではなく３７℃にて行
われる場合にも、反応速度が２倍に上昇することが示さ
れた（例３）。従って、単に酸化促進剤濃度、反応時間
、又は反応温度を調整することによって過剰酸化の可能
性を最少にするように反応を制御することができる。好
ましくは、Ｃｕ　Ｃ１２の量は蛋白質濃度に依存して１
〜４００μＭの範囲であり、一層好ましくは蛋白質がＩ
Ｌ−２である場合５〜５０μＭである。

オリゴマー〇形成の可能性を低下せしめるため、反応混
合物中の蛋白質濃度は一般に相対的に低く保持される。

酸化される蛋白質のスルヒドリル含量及び分子量に依存
して、蛋白質濃度は一般に５１ｎ９／−未満、好ましく
は約０．０５〜約２１１９／ｄ、そして一層好ましくは
約０．１〜約１■／ｄである。

反応媒体の−は一般忙、約５．５と９との間のし々ルに
保持される。ここに特定したー範囲より実質的に高い−
の使用は、酸化促進剤としてＣｕ　Ｃ２２を使用する酸
化の速度を有意に低下せしめる。声は好ましくは約６〜
８に保持され、そして一層好ましくは約７であり、この
ことはＩＬ−２の酸化速度に対する−の効果を例示する
第６図により示される。

効果的な酸化が生ずるためには、酸化された形態の蛋白
質より溶解性の低い還元されたクローン化蛋白質は溶液
Ｋ、すなわち可溶化された形に保持されなければならな
い。従って、反応混合物は好ましくはさらに、溶液から
蛋白質が沈澱するのを防止するために有効な量以上の可
溶化剤を含有するであろう。この明細書において使用す
る場合。

゛可溶化剤１なる語は１例えばドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ　）又は尿素のごとき、イオン性又は非イオン
性の蛋白質可溶化溶質を意味する。この目的のために使
用され得る可溶化剤の量は一般に、主として蛋白質及び
使用される酸化促進剤のタイプ忙依存して、約０．１〜
約１重量／容量係（洗剤の場合）、又は約５〜９Ｍ（尿
素の場合）である。

酸化反応時間は例えば、反応混合物中の試薬の濃度、反
応温度、及び試薬のタイプに依存するであろう。可溶化
剤／蛋白質混合物を溶液に維持するため、反応温度は通
常的２０℃と約４０℃の間、便利には室温であろう。反
応温度の上昇は反応速度を上昇せしめる。完全な酸化を
達成するため、反応時間又は温度は、特定の方法のため
に適切なように変えることができる。酸化反応は、例え
ば溶液を凍結し、反応混合物にＥＤＴＡのごときキレー
ト剤を添加し、又はｐＨｋ反応が停止する温度まで低下
せしめること忙より、効果的に停止させることができる
。他の因子、例えば可溶化剤の濃度も反応速度に影響を
与えることができる。反応の後、残留酸化促進剤及び不
所望の異性体又はオリゴマーを選択的限外ｐ適法又はク
ロマトグラフ法により除去することができる。必要であ
れば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）のごとき蛋白質精製法を用いて、副産物及び残留還
元蛋白質から酸化蛋白質を精製することができる。

組換ｄ＠５−ａｌａ　ＩＬ−２は３個のシスティンｙｓ
１２５ を含有し、そして正しくないジスルフィド結合の形成に
対して理論的に感受性である。この蛋白質がこの明細書
に記載した方法により酸化される場合、得られる生成物
はほとんどその対応物のジスルフィド（残基５８と１０
５のシスティン間［：Ｗａｎｇ等、　（１９８４）　５
ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．１４３１−１４３３；Ｒｏｂ
ｂ等、　（１９８４）　ＰＮＡＳ、　８１．６４８６−
６４９０　）　）のみを有する蛋白質から成る。酸化さ
れた蛋白質はオリゴマーを実質的に含有せず（約１〜２
重量％未満）、そして天然対応物のそれと異るジスルフ
ィド橋を有する生物学的に不活性な異性体約１５重量％
未満を含有する。これに対して、制御されない酸化を介
して作られ標品は有意量（５〜１０チ）のオリゴマー及
び一層多量の不所望の異性体を含有する。触媒されない
空気酸化は数日間にわたって徐々に進行し、そして完了
に達するのが非常九遅い。

言うまでもなく、異性体の生成の可能性を除去する念め
忙設計され九蛋白質（例えば、１２５位のシスティンが
セリンに変えられているＩＬ−２゜又は１７位のシステ
ィンがセリンに変えられているＩＦＮ−β）は異性体を
含有しない。少なくともＩＬ−２の場合には、酸化され
た蛋白質は還元されたそれよりも非常に水溶性であり、
そしてさらに生物学的測定において一層高い活性を有す
る。従って、調製物中の可溶化剤（例えばＳＤＳ　）の
量を減少せしめることができ、ヒト又は動物において使
用するのに適する態様の常用の水性非経腸ビヒクルと共
に製剤化することを許容するの釦十分に水溶性の精製さ
れた生成物が得られる。さらに。

この酸化された組換体ＩＬ−２ムティンは天然源から単
離されるＩＬ−２中忙存在するジスルフィド橋のみを含
有する。ジスルフィド結合を形成するために使用される
上記の方法と同じ方法が、均一な生物学的に活性な物質
を生成せしめるためにＩＬ−２の他のムティンにも適用
され得る。

制御された酸化により製造された蛋白質調製物は、典型
的忙は、制御されない酸化により製造された調製物より
も多くの目的生成物及び少ない副産物を含有するから、
これらは抗原性が少なくそしておそらく一層医療的に活
性であると予想される。

医療的蛋白質の調製物は医薬として許容される担体と共
に医療的に有効な量の蛋白質を含んで成る。この調製物
は一般に、非経腸的投与のために。

ビヒクル、例えば蒸留水、ヒト血清アルブミン。

及び／又は水中グルコース、あるいは生理的食塩水中に
制剤化される。

次の例によりこの発明をさらに説明する。これらの例は
、いかなる態様においてもこの発明を限定することを意
図するものではない。例中、すべての温度は℃である。

以下余白 ＩＦＮ−β　　　は、アミノ駿位置１７位のシスチー・
ｒ１フ イン残基がセリン残基忙より置き換えられているＩＦＮ
−βの微生物的に生産されたムティンである。

ＩＦＮ−β、□、７は２個の残留システィン残基含有し
、一方は３１位に存在し、他方は１４１位に存在する。

天然ＩＦＮ−β中では３１位及び１４１位のシスティン
が相互反応してジスルフィド橋を形成する。

ＩＦＮ−β、。４４．ｔ−製造するためＫこの例におい
て使用される遺伝子操作したＥ、コリ株は、アメリカン
・タイプ・カルチュアー・コレ２シ、ン（ＡＴＣＣ）。

１２３０１ノ臂−クラウン・ドライブ、ロックビル、メ
リーランド２０８５２　（米国）に１９８３年１１月１
８日に受託番号３９，５１７として寄託されている。

上記の遺伝子操作されたＥ、コＩＪ　を次の培地中で増
慣せしめた。

以下余白 Ｎａｓサイトレート・２Ｈ２０３ｒｎ）／ｌＨ２ＰＯ４
３０ｍＭ （ＮＨ４）２Ｓｏ４７４嘘 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０３ｍＭ ＭｎＳＯ４”Ｈ２Ｏ４６μＭ ＺｎＳＯ４’７Ｈ２０４６μＭ ＣｕＳＯ４”５Ｈ２０１−２μＭ Ｌ−）リデトファン　　　　　　　　３５０．μＭＦ＠
８０４−７Ｈ２０７４μＭ チアミン・ＨＣ’　　　　　　　　　　０．００２％（
ｗ／ｖ）グルコース　　　　　　　　　　　　　　０．
５％　　（Ｖマ）ダウコーニングアンチフオームＢの２
５％溶液グルコースの５０１溶液及び５Ｎ　ＫＯＨｔ−
必要に応じて加えた。

温度′ｆ：３７±１℃に、−をＮａＯＨにより６．５±
０、２　Ｋ、そして溶存酸素を空気飽和の３０　ｗ／ｖ
　％に維持した。光学濃度及び残留グルコースの測定を
、１４時間後及びその後０．５時間の間隔で行った。グ
ルコースの消費が４０±６１１／ｌ（６８０ｎｍＯＤ＝
１０〜１１）に達した時収得を行った。

収得した材料をミクロポーラスクロス−フローフィルタ
ーを通して加圧下で循環することにより約３倍に濃縮し
た。濃縮された細胞金、収得材料が４〜５倍に濃縮され
るまで脱イオン水圧対して透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅ
ｒ　）　した。次に、細胞を４．１〜５．５　Ｘ　１０
　　ｋｐｍ　（０，６〜０．８　ｐｓｉ　）においてマ
ントンーグアリンホモジナイデーを通すことによって破
砕した。最初の通過の後、ドデシル硫酸ナトリウム−リ
ン酸ナトリウム緩衝液を加えて２ｗ／ｖ＊　ＳＤＳ、　
０．０８　Ｍリン酸ナトリウムの最終濃度となるようＫ
し、そして１時間可溶化を行った。

次に、固体ジチオスレイトールを５０ｍＭの最終濃度と
なるように加え、そしてホモシネ−）ｔ−９０±５℃に
て１０分間加熱した。得られた細胞懸濁液を、２−ブタ
ノールにより、２−ブタノール：懸濁液１：１の容量比
において静置ミキサー中で抽出した。次に、この混合物
を遠心し、そして２−ブタノール−リッチ相を集めた。

この２−ブタノール−リッチ相を、リン酸緩衝化塩溶液
（ＰＢＳ　）中Ｑ、　１　ｖ／ｖ　＊　ＳＤＳの２．５
容量と混合した。固体Ｄ′ｒｒを最終濃度が０．１　酷
昧なるように加えた。氷酢酸忙より、混合物のｐＨｔ−
６，２±０．１に調整し、そしてこの混合物を遠心分離
した。

得られるペース）１−集め、そしてＰＢＳ及び１０ｗ／
ｖ　％　ＳＤＳの混合物中Ｉ’ｍ、　　Ｉ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈｆ用いてＰＩ（を８．５±０．５　Ｋ調整しながら再
懸濁した。固体ＤＴＴを最終濃度が１００ｍＭとなるよ
うに加え、そして懸濁液を９０±５℃に１０分間加熱し
た。次に、この懸濁液を約２５℃に冷却し、氷酢酸によ
り一を５．５±０．１に調整し、そして溶液ｔ−濾過し
た。

次に、この溶液金、１％８Ｄ８．５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＩ（５，５）から成る
緩衝液と共にセファクリルＳ−２００前カラムに適用し
た。

最も高いインターフェロン活性を含有する画分をプール
し、そしてｌＯキロダルトン分子量カットオフの限外濾
過により濃縮した。

５ｈａｋｅｄ等、前掲の方法を用いて蛋白質を酸化して
スルヒドリル結合を生成せしめた。１　ｍＭ　ｏ　−ヨ
ードソ安息香酸溶液を、この酸を水中で混合し、該混合
物を約５分間超音波処理しそして次に攪拌しそして２９
６　ＮａＯＨｔ−ゆっくり加えて最終ＰＨヲ８．２±０
．２にする（塩基を加える代りに追加の超音波処理を行
うこともできる）ととによって調製した、 Ｎａ４Ｐ２Ｏ７”１ＯＨ２０ｔ”水中に溶解して２ｍＭ
の濃度和することにより反応緩衝液媒体を調製した。１
０チ酢酸を加えるとと忙よりこの溶液のｐＨを９．０に
調製し、この溶液にＳＤＳを０．１％に、エチレンジア
ミン四酢酸（ＢＥＤＴＡ　）　ｔ　１　ｍＭに、そして
０−ヨートン安息香酸溶液を１５μＭＫなるように加え
た。

この緩衝液媒体を、マグネチックスターラー及び９．Ｏ
Ｋ段設定れたー電極を装着した反応容器に入れた。ＩＦ
Ｎ−、。ｒ１７調製物及び０−ヨートン安息香酸溶液を
、ＩＦＮと酸化剤を等モル比で導入するように調整され
た（リスタデンプを用いて保持容器から前記反応混合物
に加えた。必要に応じて０、２５　Ｎ　ＮａＯＨをペリ
スタポンプを通して５Ｉｎｌ／時の速度で添加すること
Ｋより反応混合物のｐ）（ｔ９．０に調整した。ＩＦＮ
−β溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液中５ｍ９／ＩＩＩ／、ｐ
Ｈ５，５）を’ｌ　ｒｎｌ　７時（７，０−Ｆイクロモ
ル／時）の流速で約５時間にわたって加え；０−ヨード
ソ安息香酸溶液を７　ｙｚｉ　７時（７マイクロモル／
時）で同じ時間忙わたりて加えた。この後、１０〜１５
マイクロモルの最終過剰に達するまで酸溶液の添加を続
けた。この反応に続き逆相ＨＰＬＣを行い、そしてＥｌ
１ｍａｎ測定法によりＩＦＮ−β、。４，７の残留チオ
ールを測定した。６．５時間後、反応混合物に１０％酢
酸を加えてｐ）１５．５　Ｋすることにより反応を停止
した。

次に、０．１　’Ａ　ＳＤＳ　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
、及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）から成る
緩衝液を用いて、生成物をセファクリル−２００カラム
に負荷した。このカラムからのモノマーピークをプール
し、そして０．１　％　８ＤＳ　、　１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ）１５．５）から
成る緩衝液を用いてセファデックスＧ−７５カラムに負
荷し念。

上記のヨードソ安息香酸法により酸化されたセファデッ
クスＧ−７５ｆ一層材料を用いて次の銅酸化法の検討を
行った。これが容易に入手できるインターフェロン生成
物だったからである。ジスルフィド結合を含有する分子
が存在しないことを保証するためジチオスレイトールを
１０ｍＭに添加した後５０℃にて１５分間、精製された
ＩＦＮ−β５ｅｒ１７を還元した。これは、０．１マ／
’ｖ％）リフルオロ酢酸中３０〜６０％アセトニトリル
グラジェ／ト（５分間に３０−４０チ、２７分間に４０
−６０’Ｉｒ　）　（Ｖｙｄａｅ　Ｃ４カラムを使用）
でのＲＰ−ＨＰＬＣにより確認し念。この方法により酸
化形インターフェロンから還元形のインターフェロンが
分離される（それぞれ保持時間２６分及び２８分）。還
元されたβ−インターフェロンｔ−ＲＰ−ＨＰＬＣピー
ク画分から、凍結乾燥、及び５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｆ含
有する０、１η４チＳＤＳ及び５０−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）中への再懸濁により濃縮した。反応混合物は
０．１３９／ａ／のインターフェロンを含有した。２５
℃にて、空気飽和溶液を用いながら、Ｃｕ　Ｃ４−２を
最終濃度８ｍＭＫ添加することＫより酸化を開始した。

ジスルフィド形成の速度が、種々のＨＰＬＣカラムから
の溶出位置の変化をモニターすることＫより測定され得
ることが他人により示されている（　Ｗｕ等、　Ａｎａ
ｌ、　ＢＩｏｅｈｅｍ、、　１２Ｌ　３４５−３４８（
１９８３）及びその参照８）。この例において使用され
る酸化についての１つの測定法は、酸化後のＲＰ−ＨＰ
ＬＣ上での溶出位置の変化に基く。

第１Ａ図はＣｕＣｌ２を含有しない再懸濁媒体中での７
分間後の還元されたβ−インターフェロンを含む対照反
応のＲＰ−ＨＰＬＣを示す。第１Ｂ図はＣｕＣ６２ｔ−
含有する反応混合物の７分間の酸化の後のＲＰ−ＨＰＬ
Ｃを示し、第１Ｃ図は１４分間の酸化の後、第１Ｄ図は
２８分間の酸化の後、そして第１Ｅ図は７５分間の酸化
の後のＲＰ−ＨＰＬＣを示す。

第１Ｆは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果に基く、酸化時間
（分）に対する酸化のチのプロットである。この結果は
、インターフェロンが７５分間で９５チ以上酸化される
こと金示す。この酸化された生成物を、Ｓｔｅｗａｒｄ
、　Ｗ、Ｅ、ＩＩｓ　Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ３
ｙｓｔｅｍ、にューヨーク、スズリンガーフェルラ一グ
、１９８１）１７頁に記載されている細胞変性効果測定
を用いて抗ウィルス活性について測定し。

そして天然β−ＩＦＮと同じ比生物活性Ｉ　Ｘ　１０８
ユニツト／りを有することが見出された。

７５分間酸化されたサンプルを次に１０ｍＭＤＴＴ中で
５０℃にて１５分間還元した。＠２Ａ図は酸化された物
質のＨＰＬＣを示しそして第２Ｂ図は還元され念物質の
ＲＰ−ＨＰＬＣを示す。クロマトグラムの比較は、ＲＰ
−ｅＬＣ保持時間の変化が「ｒ還元により可逆的な酸化
に基くことを示した。

ｄｅｎ−ａｉｍ　ＩＬ−２６ｅｒ１２５は、（１）最初
のＮ−末端アラニン残基の不存在及び（２）位置１２５
のシスティンに代るセリンにより天然ヒトＩＬ−２と異
るアミノ酸配列を有する。この例に使用されるｄｓｓ−
ａｌａＩＬ−２ｓｅｒ１２５生産Ｅ、コリけ１９８４年
３月６日に受託番号３９，６２６としてＡＴＣＣに寄託
されている。

上記の遺伝子操作されたＥ、コリヲ次の増殖培地を用い
て発酵槽中で増殖せしめた。

（ＮＨ４）２Ｓ０４７２ｒｎＭ ＫＨ２ＰＯ４２１，６ｒＩＩＭ Ｎｍｓサイトレート　　　　　　　　　１．５　　ｍＭ
ＺｎＳ０４−７Ｈ２０６０ａＭ ＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ６０μＭ ＣｕＳＯ４−５Ｈ２０２ｔｔＭ ２、５　Ｎ　ＮａＯＨによりｐＨｔ−６，５０に調整。

オートクレーブ殺菌。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０３ｒｎＮｉ ＦｅＳＯａ　　　　　　　　　Ｚｏｏ　ＩＩＭＬ−）リ
プトファン　　　　　　　７０へ７７チアミンーＨＣ１
２０■／ｌ グルコース　　　　　　　　　　　　　　５　１１／１
テトラサイクリン　　　　　　　　　　５鞠ル／ｊエタ
ノール（任意的）　　　　　　２チ　（ｖ／ｖ　）カブ
ミノ酸　　　　　　　　　　２　％　Ｃｗ／ｖ）ダウコ
ーニングアンチフオームＢ、グルコース５０俤溶液及び
５　Ｎ　ＫＯＨを必要により添加した。

発酵槽の−を５　Ｎ　ＫＯＨにより６．８に保持した。

残留グルコースを５〜１０１１／１１に、溶存酸素を４
０Ｖ／ｗ％に、そして温度を３７±１℃に保持した。０
Ｄ６８ｏが１０〜１５の時カザミノ酸（２０ｗ／ｖ　％
ストック溶液）を加えた。

カブミノ酸濃厚溶液を加えて３時間後、エタノール（９
５ｗ／ｗｅｓ）　を加えて最終濃ｆｌｉ　２　ｗ／ｗ　
％　Ｋした。エタノール添加の２時間後に収得した。

誘導されたクローン化ＩＬ−２ｔ−含有するＥ、コリＭ
Ｍ２９４−１細胞約２０〜４０Ｊ’（湿重量）を２００
ｔｐｔｌの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｇ、　１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　（ｐＨ８，１ｔｏ　８．．５）に再懸濁した。高い
ｐＨが次の段階におけるＥ、コリ蛋白質の選択的抽出を
助けた。細胞を３０００〜４０００×ｇＫて１０分間遠
心分離し、そして４ｔＫて２００ｒｌＬｌのＴｒｉｍ／
ＫＤＴＡ緩衝液中に再懸濁した。

次に、細胞を４ｔＫて４５分間（６００における光学濃
度が約８５チ低下するまで）、ヒートシステムスーモデ
ルＷ−３７５超音波処理機の出力設定″′９”で５０％
負荷のラージグローブノ！ルスを用いて超音波処理した
。他の方法として、細胞をマントンーコウリンホモジナ
イデーに３回通すことにより破壊した。ホモジネートを
、４℃にてイックマンＪＡ２０ローターを用いて４５０
０ＸＩにて１０分間（６０００ｒｐｍ　）遠心した。５
分間にわたり、同容積のＴｒｉｓ／ＫＤＴＡ緩衝液中８
Ｍ尿素（Ｓｃｈｗａｒｔｚ／Ｍａｎｎ超純）を、速く攪
拌しながら懸濁液に加え４Ｍの最終尿素濃度とした。生
じた混合物を室温にて１５〜３０分間ゆっくり攪拌した
。

攪拌後、混合物を１２，０ＯＯＸ、９にて１５分間（室
温にてペックマンＪＡ２０ローター中で１２．０００　
ｒｐｍ）遠心し、そしてベレットを得た。

次に、ペレットｆ：９ＩＩＬｌの５９ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐ）１６．８　）　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、
　１０　ｍＭ　ＤＴＴ中に２０℃にて再懸濁した。次に
、１＃Ｌ／の２０　ｗ／ｖ　ｔｓＳＤＳを添加しそして
激しく攪拌することによりベレットを可溶化した。再懸
濁物をｉｚ、ｏｏｏｘｙにて１０分間室温にて遠心し、
そして不溶性物質を廃棄した。

残りの溶液を４０℃忙て１５分間加熱することによりす
べてのＩＬ−２が十分に還元されることを確実にした。

上清液（４０％の純ＩＬ−２を含有する）ｆ：、５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐｉ（６，Ｆ）。

１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１　ｍＭ　ＤＴＴ、　１　ｗ／
ｖ　％　ＳＤＳ中で２．６個×１００倒セファクリルー
２００（Ｓ−２００）カラムに負荷した。次に、各画分
の３μｌのアリコートを１５　ｗ／ｖ　％　ＳＤＳ／Ｐ
ＡＧＥミニグルにかけ、そしてｒルをクマッシープルー
で染色した。最も少い汚染物を含有する画分（約３５ｋ
、１８ｋ及び１２にダルトンの汚染物の含量を最少にす
る）ｔ−プールし、そしてアミコｙ　ＹＭ５限外濾過器
を用いて５〜１０ＩＩＬＩＶｃ濃縮した。この調製物は
約８０〜９０係純度のルー２を含有する。

Ｓ−２００プールｋ　２．６ｃＴｎＸ　１００ｃｍセフ
ァデックスＧ−Ｚｏｏカラムに負荷し、これを上記のよ
うにして０．１　ｗ／ｖ％ＳＤＳを用いて溶出した。画
分ｔ−ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析し、そして最純画分
をプールした。これらの最純画分は９５〜９８チ純度の
ＩＬ−２を含有し、１００，０００ユニット当り０．２
〜０．５　ｎｌのエンドトキシンを含んでいた。粗細胞
溶解物中に存在するＩＬ−２の３０１以上が純ＩＬ−２
として回収され友。

窒素のもとて４℃にて貯蔵した場合、これらのプールさ
れたＧ−１００画分は添加物なしで少なくとも６週間安
定であった。ＳＤＳ含有沈澱が４℃で生成し、これは使
用に先立って２５℃にて再溶解することができ、又はＩ
Ｌ−２ユニツトの有意な喪失を伴わないで取り出すこと
ができた。

皮酸化 上記のようＫして得られた精製され十分に還元された生
成物ｔ、　５０　ｍＶ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ緩衝液（ｐＨ
８，０）Ｉｃ対する透析濾過／限外濾過により、０．５
ＩＩＩ９／ｍＪＩＬ−２に調整し念。Ｔｒｉｇ緩衝液に
対する透析−過はｐＨｆ：調整するため釦機能するのみ
ならず、酸化反応を妨害するかもしれない残留ＥＤＴＡ
又はＤＴＴヲ除去した。透析−過／限外濾過段階後のＳ
ＤＳ濃度は１．６　ｗ／ｖ　％　（Ａｎａｌ　、　Ｂｌ
ｏｃｈｅｍ、　。

Ｖｏｌ　１１８．１３８〜ｌ　４１頁、１９８１中に記
載されているＳＤＳについてのアクリジンオレンジ測定
により測定）であり、そして声は約８，０であった。溶
液に空気を泡立てることＫより濃厚物を酸素化し、そし
て新しく請判され次溶液を用いてＣｕ　ＣＬ　２を０．
５μＭ、５μＭ、又は５０　μＭに加えることにより酸
化を開始した。反応は２５℃にて行った。酸化の速度を
決定するため、反応混合物のアリコートを種々の時間間
隔において採取し、ＥＤＴＡを１０ｍＭ濃度忙加えそし
て一７０℃に急冷凍結することにより反応を停止した。

各アリコートを０．１チドリフルオロ酢酸中アセトニト
リルグラジエント溶出（４５分間に３０−６０％）を用
いてＲＰ−ＨＰＬＣにより分析して反応の程度を決定し
た。ＲＰ−ＨＰＬＣは酸化形のＩＬ−２を還元形のＩＬ
−２から分離する（それぞれ、保持時間４１分及び４５
分）からである。

ｆ８３図は、５０μＭ　ＣｕＣｌ２を用いる酸化反応の
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析（再還元の前後）を示す。第３Ａ図
は、酸化のわずか２分後にサンプルがおよそ３分の２酸
化され念ことを示す。ＩＥ３Ｂ図は、１０分間の酸化の
後サンプルは本質上完全に酸化され、そしてわずかに痕
跡の他のピーク（副反応の指標である）が観察されるこ
とを示す。第３Ｃ図は、５０分間の酸化が微量生成成分
の生成量を増加せしめないこと、及び従って延長された
酸化期間中に副反応が生じないことを示す。第３Ｄ図は
。

５０分間の酸化の後の酸化生成物が、１０ｍＭジチオス
レイトールを用いて６０℃にて１５分間で、十分に還元
された形に再還元され得ることを示す。

このことは、第３Ａ図、ＩＥａＢ図及び第３０図中のピ
ークが還元可能な酸化された物質を代表することを示す
。

第４図は、５０　／’Ｍ　ＣｕＣＺｚ　ｆ用いる４０分
間の酸化の生成物の銀染色非−還元性ＳＤＳ　−ＰＡＧ
Ｅ分析を示す。鋭敏な染色技法が使用されたにもかかわ
らず、痕跡の酸化生成物のみが分子間ジスルヒドリル基
を形成しダイマーが生じたことが見出された。

種々のＣｕＣｌ２濃度により行われた酸化の検討がＩ！
５図にグラフ的に要約されている。この図は、ＨＰＬＣ
ビークの高さくパックグラウンド無し）により測定され
た観察された雪化速度がＣｕＣｌ２濃度に依存し、そし
てそれ故にこの・母ラメーターを調整することにより反
応を制御することができることを示している。６倍モル
過剰のＩＬ−２Ｑ含有する５μＭ　ＣｕＣｌ２′ｆ！：
用いる反応もなお６０分間に完全に酸化され、ＣｕＣｌ
２が触媒的に機能し得ることが示された。１０　ｍＭ　
ＥＤＴＡ　１＆：含有する対照反応は酸化を実質上示さ
なかった。

０．１　ｗ／ｖ　％のＳＤＳを含有し、ｐＨ６，６，５
，７，５゜８．０，８．５又は９．５に調整された３　
０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ及び３０ｍＭす／酸ナトリウム緩衝
液混合物中８μＭＣｕＣｔ２ｔ−用いて、０．２ＩＩｌ
１７／ｄのルー２溶液に対する一連の同様の酸化を行っ
た。すべての反応において、反応の終りにおいて−を確
認した。これらの−値において７分間行われた酸化の検
討を第６図にグラフにより要約する。この図は、　ＩＬ
−２の酸化のための声範囲、すなわち約６〜８が存在し
、これより上では酸化速度が劇的に低下することを示し
ている。

Ｃｕ　Ｃｌ３ではなく新たに調製した８μＭ（ｏ−７エ
ナンスロリン）２Ｃｕ＋２錯体を用いて上記の酸化法を
反復した。０．１μ今俤のＳＤＳ　’１含有する上記の
Ｔｒｉｓ　／リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を使用し九。

第７図は、８　μＭ　ＣｕＣｔ２１１？：よる７分間の
酸化の後のＩＬ−２０ＲＰ−ＨＰＬＣ（第７Ａ図）と８
　ｐＨ（ｏ−フェナンスロリン）２Ｃｕ　　ｌＣよる分
間の酸化の後のＩＬ−２のＲＰ−ＨＰＬＣ（第７Ｂ図）
の比較を与える。

この結果は、ＩＬ−２がＣｕＣＡ２のみ忙よりてよりも
（０−フェナンスロリン）２Ｃ，＋２錯体によりｐＨ７
にて一層急速に酸化され得ることを示す。

酸化されたｄｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２ｓ＠ｒ１２５の精
製例２の尿素抽出から回収された不溶性物質を５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ
７，０）Ｋ再懸濁した。次に、この懸濁液を、固体ＳＤ
Ｓを５　ｗ／マチの最終濃度に添加することにより可溶
化した。

５　Ｓ　ＳＤＳ溶液を０．１　ＭＮａ２ＳＯ４（ｐ）１
８．０　）により２％ＳＤＳに稀釈した。蛋白質濃度を
決定し、Ｐ）（を８．５に調整し、そしてＤＴＴ　ｔ−
５０ｍＭにそしてＥＤＴＡを２ｍＭＫ加えた。この混合
物をＮ２のもとて４０℃に加熱してＩＬ−２’ｉ還元し
念。次忙この混合物を冷却しそして−を５．０に調整し
た。

次Ｋ、溶液を、ｌ　ｍＭ　ＤＴＴを含有する２−ブタノ
ールをｌ　：　１　ｖ／ｖ比で用いて室温にて抽出した
。

保持時間は２〜２．５分間であった。抽出は２００ｗＬ
ｌ／分の流速を用いて液−液相分離器中で行った。

有機相を分離し、そしてそのＰＨｔ−ＮａＯＨＩ／Ｃよ
り８．０に調整した。次に、抽出物’ｋ　Ｏ，Ｉ　Ｔｏ
　ＳＤＳ　、　ＩＱｍｌｖｌＮＩＬ２ＰＯ４，２ｒｎＭ
Ｌ　ＤＴＴ　（ｐＩ（６）　Ｋ：ゆっくり加え、そして
１５〜２０分間攪拌した。生じた沈澱を分離し、そして
生じたペーストｅ　ＰＢＳ中５　＊　ＳＤＳに再懸濁し
た。溶液を遠心分離によし清澄にし、そして上記のよう
にして還元した。還元の後、酢酸により溶液をｐｉ（５
，５に調整した。溶液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（
ｐｉ（６，，８）　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１　
ｍＭＤＴＴ　、　１　ｗ／ｖ　％　ＳＤＳ中”ｔ’２．
６ｃｍＸ　１００ｔｘＳ　−２００カラムを用いてダル
濾過により精製した。

このカラムからのピーク画分をプールし、そしてこの材
料［：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）。

１９Ｌ　ＳＤＳ　、　１　ｍＭ　ＤＴＴ及び１　ｍＭ　
ＥＤＴＡＩの１部分をアミ３７７Ｍ−５限外濾過膜を用
いて７６０μ／ニ１１縮し、６．６１Ｒｇの全蛋白質を
得た。ジチオスレイトールを２．５ｍＭの濃度に加え、
そして十分な還元を保証するため忙サンダルを６０℃に
て１０分間加熱した。０．１１　ＳＤＳを含有する５０
ｍＭリン酸す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ７，０）中で平
衡化されたＧ−２５脱塩カラム（１９Ｘ０．９ｃＷＩ）
’ｅ用いて還元剤を除去した。蛋白質ピークをプールし
て５．５＃１１７ｔ−ｉ、これヲカラム緩衝液中Ｋ　Ｏ
，２５ｍ９７Ｒ１に稀釈した。遊離スルヒドリル基の量
を、エルマン試薬（５、５’−ジチオ−ビス（２−ニト
ロ安息香酸）、（ＤＴＮＢ））スルヒドリル測定法（Ｈ
ａｂｅｅｂ。

Ａ、Ｆ、Ｓ、Ａ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｔ２５＋／４−）Ｂ、４５７−６
４頁、１９７２：標準としてシスティンを使用）を用い
て直接測定した。

サンプル忙空気を１５秒間泡立てることにより溶液を通
気し、そしてＣｕＣＬ２ｔ”　５０　ｍＭの濃度忙添加
することにより２５℃にて酸化を開始した。

室温でのインキュベーションの５．１０．及び３０分後
１’ｃ　ＤＴＮＢ測定法と実質上同様忙して残留遊離ス
ルヒドリル基を測定することにより酸化の糧度を測定し
た。

Ｓ−２００カラムからのピークＩｎ、−２画分の酸化速
度を示す第８図は、酸化が３０分まで忙実質的忙完了す
ることを示す。３５分後にＥＤＴＡ　ｔ−１０ｍＭの濃
度忙加え、次に１／１０容量の１００％アセトニトリル
１５ｓトリフルオロ酢酸を加えた。

次忙、酸化され之ＩＬ−２’ｉ残りのＥ、コリ蛋白質及
びエンドトキシンから、１０％アセトニトリル１０．１
％ＴＦＡ中で平衡化された１０１１１１Ｘ２５ａｎの１
００ミフロンＶｙｄａ　Ｃ４カラム上での調製用ＲＰ−
ＨＰＬＣにより分離した。２ｍｊ／分のグラジェント溶
出（５分間ｌＯ〜３０チアセトニトリル、４５分間３０
−６０％アセトニトリル）により６０チ。

アセトニトリルにおいてＩＬ−２ｔ−回収した。ＩＬ−
２のピークをプールし、２８０　ｎｍにおける吸収によ
り回収された全蛋白質が３ｍ９であると決定した。

この時点で蛋白質を次のようにして製剤化した。

７、７　ｍｌのプールされたＨＰＬＣ画分に、マンニト
ールを１．７１Ｋ、そしてＳＤＳを０．０３７俤になる
ように添加した。サンプルを一夜凍結乾燥し、そしてＷ
ｌ　（注射用水）中５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６
，８）　２．９ａ／に再懸濁した。ＳＤＳ及びマンニト
ールの最終濃度はそれぞれ０．１％及び５％であった。

４μｇの凍結乾燥されそして再懸濁されたＩＬ−２を、
還元条件又は非還元条件下（１チβ−メルカプトエタノ
ールを伴って又はこれを伴わないで、２％　ＳＤＳ　、
　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐ）１６．８中で
５分間煮沸）でＳＤＳ　−ＰＡＧＥミニｒル分析にかけ
た。ｆ８９図に示す分析は、ジスルフィド結合を含有す
る分子について文献から予想されるように、未還元ＩＬ
−２は還元ＩＬ−２よりもわずかに速く移動することを
示している。ＴＣＡ固定されクマッシー染色されたｒル
の島津Ｃ８−９３０スキャナーを用いるデンシトメータ
ースキャンは、最終生成物の純度が９５チ以上であり、
そしてオリゴＩＬ−２について予想される位置に移動す
る蛋白質の含量が２係未満であることを示した。必要で
あれば、ＩＬ−２酸化段階の後の分子篩クロマトグラフ
ィー（Ｓ−２００カラム、上記のようにして移動せしめ
る）により、残留ＩＬ−２オリゴマーを効果的に除去す
ることができる。ＲＰ　−ＨＰＬＣは、残留Ｅ、コリ汚
染物質及び発熱物質の両者を除去するようである。

プールされたＳ−２００出発材料の５０％以上が最終酸
化生成物９忙回収される。

精製されたＩＬ−２の最終比生物活性は４〜６×１０６
ユニツト／ｍｌ；／ＣＨＴ−２細胞増殖アツセイ（Ｗａ
ｔｓｏｎ、　Ｊ、、　１９７９．　ＪＥＭ、　１５０．
１５１０−１５１９゜及びＧ１１ｌｉｉ、　Ｓ、等、　
１９７９．　Ｊ、１．、１２０．２０２７−２０３２　
）により測定されたユニット、及びＬｏｗｒｙ。

０、Ｈｌ等、　１９５１．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、、　１９３　：　２６５−２７５の方法により測定さ
れた蛋白質含量に基くユニット〕であると測定され、そ
してエン−トキシン含量は、リムルスアメーバ細胞溶解
（ＬＡＬ　）アッセイにより測定しｆｃ場合０．３ｎＪ
’７〜ＩＬ−２未満であった。精與され酸化された生成
物の比生物活性は、誘導された末梢血リン／９球由来の
天然ＩＬ−２又は誘導されたジャーカット細胞系由来の
天然ＩＬ−２から本質上区別されない。すなわち、酸化
された組換ＩＬ−２の生物、活性は酸化されることが知
られている２種類の天然対応物のそれに類似する。還元
された天然ｒＬ−２蛋白質及び還元された組換ＩＬ−２
蛋白質の両者は有意に低い比生物活性を有する。この発
明の酸化された生成物は、天然ジャーカットＩＬ−２及
び末梢血リン／４球ＩＬ−２について測定されたそれら
と同一であることが示された（公表されていない観察）
から、との発明の方法により製造されるＩＬ−２は、ウ
ィルス性病原体及び癌と闘うヒト免疫系の能力の増強の
ために有用であろう。

最終生成物は凍結乾燥して貯蔵することができ、そして
／又は溶液の状態で４℃にて６０日までもしくはさらに
長期間、生物学的又は物理的性質の有意な変化を伴わな
いで貯蔵することができる。

上記の様にして、但し十分に還元されたＩＬ−２を溶液
状に保持するためのＳＯ８又は他の可溶化剤を使用しな
いで、ｄｅｌ−ａｌａ　ＩＬ−２Ｂｅｒ１２５の酸化反
応を行りた後測定し得る酸化は生じなかった。上記の好
ましい条件を用いて、但し酸化促進剤としてＦｅＳＯ４
ｔ”使用してｄｅｎ−ａｌａ　ＩＬ−２３ｓｒ１２５に
対する酸化を行っ念場合、生成物の１０％未満が酸化さ
れ、　Ｆｓ　　が酸化を促進するための非常に効果的で
な５陽イオンであることが示された。

３個のシスティンを含有する還元された分子（すなわち
、１９８３年１０月４日に受託番号３９．４０５として
ＡＴＣＣに寄託されたＥ、コリから生産されたアラニン
が除去された組換ｒＬ−２）に対して上記の条件を用い
て酸化を行った場合、８５チ以上の生成物が正しいジス
ルフィド結合（ｃｙ１１５８とａｙｓ　１０５の間）を
有し、そして天然蛋白質と同じ生物活性含水した。およ
そ１５チの物質が不活性であり、おそらく正しくないジ
スルフィド結合を含むＩＬ−２の異性体であろう。第１
０図は、３０−６０１ア七トニトリルグラジエントによ
り溶出された最終生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。

保持時間は、不活性異性体については２９分であり、そ
して活性なＩＬ−２については４４分である。

御された酸化 この例は、この発明の酸化反応に対する上昇した温度の
効果を例示する。

例２の酸化されたｄｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２Ｈｒ１２５
の精製の項に記載したＳ−２００カラムからのピーク画
分をプールし、そしてピーク物質をアミコンＹＭ−５限
外濾過膜を用いて７２０μｌに濃縮した。ジチオスレイ
トールを３．５ｍＦｖ！の濃度忙加え、そして次にＩＬ
−２’に６０℃にて１０分間加熱した。次に、０．１１
８ＤＳ　ｉ含有する５０励リン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）中で平衡化したＧ−２５脱塩カラムを用いて
ジチオスレイトールを除去した。

同じ緩衝液を用いて蛋白質濃度６０．ｚｓダ／”／に調
整した。次にＩＬ−２を１０Ｗｌｌずつ２つに分け、そ
して循環する水浴中で２５℃又は３７℃に平衡化した。

Ｃｕ　ＣＬ　２を５０μＭとなるように加えて酸化を開
始した。次に、酸化速度を、１）エルマン試薬アッセイ
を用いて遊離スルヒドリル基の量を測定することにより
、又は２）　ＲＰ−ＨＰＬＣｖｃおける還元された！Ｌ
−２及び酸化されたＩＬ−２について予想される保持時
間において存在するＩＬ−２の量をモニターすることに
より、決定した。

酸化の温度を２５℃から３７℃に上昇せしめることＫよ
り両側定法により測定された酸化の速度がおよそ２倍上
昇した。すなわち、銅濃度と同様に温度も酸化速度に影
響を与える。２５℃における酸化及び３７℃における酸
化はいずれも実質上１００％完結まで進行し、これによ
って遊離スルヒドリル基が最少となり、そしてチオ−ジ
スルフィド交換によるその後のオリゴマー形成の可能性
が大きく低下した。逆相ＨＰＬＣ分析は酸化されたＩＬ
−２生成物が同一であるらしいことを示し、そしてバイ
オアッセイはそれらが同じ比活性を有することを示した
。非還元ＳＯ８−ＰＡＧＥ分析は、いずれの温度におい
ても１１未満のオリゴマーが生成したことを示した。

要約すれば、天然蛋白質に存在中のジスルフィド橋に相
対するジスルフィド橋のイン−ビトロ形成を触媒するＣ
ｕ　　を含有する酸化促進剤を用いて、十分に還元され
たシスティン含有組換ＩＬ−２及びＩＦＮ−βを酸化す
る制御された方法を提供することが明らかである。この
発明の方法は酸化中の副反応を除去し又は最小にし、そ
して十分な生物活性を再現する酸化生成物の能力を最大
にする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、位置１７のシスティン残基がセリン残基によ
り置き換えられているＩＦＮ−βのムティン（この明細
書においてはＩＦＮ−β、。、１７と称する）を酸化促
進剤として８ＡＭ　ＣｕＣ２２’に用いて酸化した反応
混合物の５つの逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ
−ＨＰＬＣ）吸収プロフィールを示す。第１Ａ図は、　
ＣｕＣ／！ｚを含まない緩衝液中ＶＣ７分間置かれた還
元されたＩＦＮ−β５ｅｒ１７を用いる対照反応を示す
。第１Ｂ図は、ＣａＣｌ２による７分間の酸化を示し；
第１Ｃ図は１４分間の酸化を示し；第１Ｄ図は２８分間
の酸化を示し；そして第１Ｅ図は７５分間の酸化を示す
。ＩＥＩＦは、ＲＰ−ＨＰＬ、Ｃ分析を基礎とする。酸
化時間（分）Ｋ対する酸化されたＩＦＮ−β３゜ｒ１７
のチのプロットを示す。 第２図は、８ＡＭ　ＣｕＣＺｚ中で７５分間の酸化の後
の組換体ＩＦＮ−βａｅｒ１７　（第２Ａ図）と１０−
ジチオスレイトール中５０℃にて１５分分間光された同
じ材料のアリコート（第２Ｂ図）との比較を与える。 第３図は、位置１２５のシスティン残基がセリン残基に
より置き換えられておりそしてＮ−末端アラニンが除去
されているＩＬ−２の組換ムティン（この明細書におい
ては、ｄｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２ｓｅｒ１２ｓと称する
）ｔ−酸化促進剤として５０μＭ　ＣｕＣＺｚ　ｔ−用
いて酸化した反応混合物の４つのＲＰ−ＨＰＬＣ吸収プ
ロフィールを示す。第３Ａ図は２分間の酸化を示し；第
３Ｂ図は１０分間の酸化を示し；第３Ｃ図は５０分間の
酸化を示し；そして第３Ｄ図は５０分間の酸化生成物ｔ
？１０ｍＭジチオスレイトールを用いて６０℃にて１５
分間再還元した後の反応混合物のクロマトグラムを示す
。 第４図は酸化促進剤として５０μＭ　ＣｕＣｌ２を用い
て４０分間酸化した後のｄｅｓ−ａｉｍ　ＩＬ−２＠ｅ
ｒ１２５の、分子間スルヒドリル基（オリゴマー）の形
成の程度を決定するための、銀染色非−還元的５ＤＳ−
ＰＡＧＥ分／Ｉ２ｒを示す凹釦晴す雪１．Σあ気５ＩＥ
５図は、３種類の異るＣｕＣｔｚ濃度について２５℃に
おける１時間（分）忙対するｄｅｓ−ａｌａＩＬ−２ｇ
６ｒ１２ｓの酸化（ｑＡ　）　（ＨＰＬＣのピークの高
さにより測定、パックグラウンド無し）のプロット’ｆ
ｒ　示ｆ。１０ｒｒＭＩエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）を含有する対照反応も行った。 第６図は、８ＡＭ　ＣｕＣｌ２を用いる酸化反応の−に
対するｄｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２３＊ｒ１２５の酸化（
チ）（ＨＰＩ、Ｃのピークの高さにより測定、パックグ
ラウンド無し）のプロットを示す。プロットは、ＩＬ−
２が約５０９６酸化される反応点において測定された反
応率に対する−の変化の効果を示す。 第７図は、０−フェナンスロリン／　Ｃｕ＋２錯体を用
いるｄｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２Ｈｒ１２５の酸化（第７
Ｂ図）をＣｕＣｌ２をｍ５る酸化（第７Ａ図）と比較し
て示す。 第８図は、５０　ｍＭ　ＣｕＣｌ２．０．２５１ｎ９７
１１１部分精製ＩＬ−２、５０ｍＭリン酸ナトリウム、
０．１％ＳＤＳを用りるｐＨ７，０における、酸化され
たｄｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２ｓｅｒ１２５のＴｏ　（Ｄ
ＴＮＢとの反応により測定される遊離スルヒドリル基の
消失）の時間（分）の関数としてのグラフを示す。 第９図は、５０μＭ　ＣｕＣｌ２を用いて酸化されたＨ
ＰＬＣ精製ＩＬ−２の還元グル及び非還元ダルの両者の
５ＤＢ−ＰＡＧＥ分析を示す厖：ｌヤみαｉ漬も第１０
図は−５０ＡＭ　ＣｕＣｌｚ　ｌＣより促進されるｄｅ
ｓ−ａｌａｎｙｌ　ＩＬ−２（天然ＩＬ−２中忙存在す
る３個のシスティンを含有する）の酸化の生成物のＲＰ
−ＨＰＬＣ吸収プロフィールを示す。 以下余白 遣テ巳イツト− 倫・５、蓋 ！　　　、＄　　　　　審Ｌ−２ ＦＩｏ、　４ 時間（今） ｂ恢−５ 圧点　ｐＨ Ｆ−贋。 ／’７（Ｒ−乙θ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、インターフェロンβ、インターロイキン−２、及び
   これらのムテインから成る群から選択された十分に還元
   された組換蛋白質を酸化し、これによってシステインを
   酸化して天然蛋白質中に存在するジスルフィド橋に相当
   するジスルフィド橋を優先的に形成する方法であって、
   可溶化された形態の前記組換蛋白質を含有する水性溶液
   を５．５及び９の間のｐＨにおいて空気の存在下でＣｕ
   ＾＋＾２陽イオンを含有する少なくとも有効量の酸化促
   進剤と共に反応せしめることを特徴とする方法。 ２、前記組換蛋白質が、ジスルフィドを形成するために
   開放されておりそして該蛋白質の生物学的活性のために
   必須でない少なくとも１個のそのシステイン残基が除去
   されているか又は他のアミノ酸により置き換えられてい
   る前記蛋白質のムテインである特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、前記ムテインがｄｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２＿ｓ＿ｅ
   ＿ｒ＿１＿２＿５、又はＩＦＮ−β＿ｓ＿ｅ＿ｒ＿１＿
   ７である特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、前記ｐＨが約６と約８の間である特許請求の範囲第
   １項〜第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５、前記酸化促進剤がＣｕＣｌ＿２、又は（ｏ−フェナ
   ンスロリン）＿２Ｃｕ＾＋＾２である特許請求の範囲第
   １項〜第４項のいずれか１項記載の方法。 ６、前記蛋白質の濃度が約０．０５〜約２ｍｇ／ｍｌの
   範囲にある特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１
   項記載の方法。 ７、前記酸化促進剤の濃度が、酸化してシスチンを形成
   することが意図される蛋白質上の遊離スルヒドリル基の
   濃度とおよそ当量である特許請求の範囲第１項〜第６項
   のいずれか１項に記載の方法。 ８、前記酸化促進剤がＣｕＣｌ＿２でありそしてその濃
   度が約１〜４００μＭの範囲である特許請求の範囲第１
   項〜第７項のいずれか１項に記載の方法。 ９、前記蛋白質がドデシル硫酸ナトリウム又は尿素によ
   り可溶化される特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれ
   か１項に記載の方法。 １０、前記蛋白質がＩＬ−２又はＩＦＮ−βムテインで
   あり、前記酸化促進剤が約５〜５０μＭの量のＣｕＣｌ
   ＿２であり、反応のｐＨが約７であり、反応混合物中の
   ＩＬ−２又はＩＦＮ−２ムテインの濃度が約０．１〜約
   １ｍｇ／ｍｌの範囲であり、そしてドデシル硫酸ナトリ
   ウムが可溶化剤として約０．１〜１重量／容量％の範囲
   の濃度で存在する特許請求の範囲第１項記載の方法。