JPS6272625A - 安定な経口投与剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 この発明は生化学工学の分野に属する。さらに詳しくは
、この発明はヒトへの非経口的注射に適する生物学的に
活性な組換インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はイン
ターフェロン−β（Ｉ　ＦＮ−β）の医薬組成物に関す
る。 〔従来の技術〕 天然インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウィルス、２本鎖
ＲＮＡ、他のポリヌクレオチド、抗原、及びマイトジェ
ンにより誘導された後に種々の細胞により生産される種
−特異的蛋白質、しばしば糖蛋白質である。インターフ
ェロンは抗ウイルス機能、抗増殖機能、免疫調節機能及
び抗細胞機能のごとき多くの生物学的活性を示す。少な
くとも３種類の異るタイプのヒト−インターフェロンが
同定されており、そしてそれらの抗ウィルス活性、抗増
殖活性及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の活性化活性
の観点から特徴付けられている。これらは白血球、リン
パ球、線維芽綱胞及び免疫系により生産され、そしてα
、β及びＴインターフェロンとして分類される。これら
は、異る構造遺伝子によりコードされる異る蛋白質であ
ると報告されている。 しかしながら最近、若干のヒトインターフェロン遺伝子
が組換ＤＮＡ技法を用いてクローニングされ、そしてＥ
、コ’Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で発現された（Ｎａｇｏ
　ｌａ　、　Ｓ、等、Ｎａｔｕｒｅ、　２８４　：　３
１６（ｌ９８）　；Ｇｏｅｄｄｅｌ。 Ｄ、Ｖ、等、ｈ旦皿、　２ｉＬ：　４１Ｈ１９８０）　
；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、　ＩＥ等、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、
Ｒｅｓ、　、　　９　：　７３Ｈ１９８１）：及びＳ　
ｔｒｅｕ　］　ｉ　。 Ｗ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（Ｌ
ＩＳＡ）、７８：２８４８（ｌ９８１）。 天然ＩＬ−２は、抗原、マイトジェン及び７０抗原によ
り刺激された赤血球ロゼツト陽性子細胞により生産され
る抗原非特異的、遺伝的に限定されない可溶性因子であ
る。このものは、約１３，０００〜１７，０００ダルト
ンの範囲の報告された分子量を有する蛋白質であり　（
Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓ及びＪ、Ｗａｔｓｏｎ。 Ｊ、Ｅ　ｘ　、Ｍｅｄ、　（ｌ９８０）種９　　：　１
７０９）　、そしてｐＨ約６〜８．５の範囲に等電点を
有する。ヒトＩＬ−Ｌ２は多くのインビトロ及びインビ
ボ効果を有し、これにはヒト未桶血卑核球又はネズミ胸
腺細胞の増殖反応の増強、ヒト及び動物における細菌感
染、寄生虫感染、真菌感染、原生動物感染及びウィルス
感染に対する反応の増強、並びに連続性Ｔセルラインの
増殖の支持が含まれる。 ＩＦＮ及びＩＬ−２、並びにシスティン残基が除去され
ている（Ｉ　ＦＮの場合）か、又は他のアミノ酸により
置き換えられている（ＩＦＮ及びＩＬ−２の場合）それ
らのミューティンが遺伝子工学的技法により微生物的に
製造されている。微生物的に製造されたＩＬ−２はグリ
コジル化されておらず、そして微生物により還元状態で
生産される。精製されそして酸化された場合、これらの
微生物的に製造されたＩＬ−２は天然ヒトＩＬ−２に匹
敵する活性を示す。 Ｔ細胞から天然Ｉ　Ｌ−２を精製する方法がＷａｔｓｏ
ｎ、Ｊ、等、Ｌ」μｈ並０工（ｌ９７９）」５０：８４
９−８６１　：Ｇ１１ｌｉｓ、Ｓｏ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏ　　（ｌ９８０）　１２４：　１９５４−１９６
２；Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ、Ｄ、Ｙ、等、Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎ、Ｍｅｔｈ、　（ｌ９８０）３９：１８５−２０１；
Ｗｅｌｔｅ、Ｊ、等、Ｌ旦すュル世よ（ｌ９８２）　１
５６：４５４−４６４；並びにヨーロッパ特許出願ＮＱ
８３’１０３５８２．９（ｌ９８３年ＩＯ月２６日にＮ
１１Ｌ９２１６３として公開）及び１１ｋＬ８３４０３
５８２．９　（ｌ９８３年１１月１６日にｌＩ＆１９４
３１７として公開）により記載されている。一般に、こ
れらの方法は蛋白質を培養上清から硫酸アンモニウムに
より沈澱せしめ、次にクロマトグラフィーにより分画す
ることを含む。 細菌により生産されたＩＦＮを回収しそして精製する方
法が米国特許ＩＶｋ１４．４５０．１０３；隘４，３１
５，８５２；Ｔｈ４，３４３，７３５；及びＮ１１４，
３４３，７３６；並びにＤｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ。 等、　Ｎａｔｕｒｅ　（ｌ９８０）　２８７　　：　１
９３−１９７　、並びに５ｃａｎｄｅｌｌａ及びＫｏｒ
ｎｂｏｒｇ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　ｌｌ：４
４４７（ｌ９７１）に記載されている。一般に、これら
の方法によっては、ＩＦＮは臨床的及び療法的目的のた
めに十分に純粋な形でそして十分に大量に製造されず、
そして組換ＤＮＡ技法により生産された得られたＩＦＮ
調製物は残留毒性量の化学物質、例えばドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）　、並びに療法的適用の臨床的研究
のために許容されない抽出及び精製の段階で使用された
他の界面活性剤又は沈澱材を含む。 組換ＩＦＮ−β及びＩＬ−２の両者は７〜８の生理的ｐ
Ｈの溶液中に不溶である。従って、種々の方法及び添加
物がこれらの蛋白質を可溶化するために工夫されている
。 １１ａｎｉｓｃｈ等の米国特許Ｎ１４，４６３．９４０
は、インターフェロン及び正常血清アルブミンをｐＨ１
２，０にて５分間部合しそして次にｐＨを７．５にして
可溶性混合物を得ることによるインターフェロンの製剤
化方法を開示している。このような高いｐＨにインター
フェロンを暴露することはインターフェロンの性質に悪
影響を与えるであろう。さらに、製剤は幾らかのＳＤＳ
を含有する。 高ｐＨアルブミン製剤化に代る唯一の方法は、洗剤又は
チャオトロピック剤、例えば尿素又はグアニジン塩酸塩
を製剤に加えることによって蛋白質を可溶化することで
ある。ドデシル硫酸ナトリウムのごとき洗剤は、十分に
高い濃度で注射された場合血球溶解を生じさせるであろ
う。さらに、約１分子のＳＤＳがＩＬ−２の各分子に結
合するような比較的低レベルのＳＤＳは、もしＩＬ−２
製剤が非常に上投与量で投与される場合に肝臓の損傷を
惹起するであろう。尿素のごときチャオトロピック剤は
ＩＬ−２を可溶化するために機能するがしか、し３０％
以上の非常に高濃度で使用されなければならない。さら
に、尿素については高濃度での蛋白質の化学的修飾の問
題が存在する。 洗剤Ｎ−ラウリルサルコシネートを含む溶液の形の試薬
グレードのｒＬ−２が市販されている。 さらに、

【Ｌ−２配合物は試薬グレードのＩ　’Ｌ　−
２を含有する固体でもよく、そして他の洗剤である０、
５％のデオキシコレートを含む完全組織培養培地中に再
溶解されることが推奨されている。しかしながら、この
ような配合物はヒトへの非経口注射には適当でない。 口内及び膣内投与並びに直腸適用のための医薬吸収促進
剤として脂肪酸が使用されている。例えば、京／ｌメヒ
学工業の特開昭５７−８８１２６及び５７−８０３１４
を参照のこと。さらに、カナダ特許磁１１１３９６２号
、及び三共株式会社の特開昭５６−１０４８１２を参照
のこと。さらに、脂肪酸は、局所クリームでの使用（米
国特許１１ｈ４，３３１，６５３）、水中に溶質を溶解
せしめるための使用（米国特許阻３、６６７、９２９）
、及び注射薬のため（米国特許魚３．６５８．９７０；
ラウリン酸）について知られている。 Ｗａｎｇ等、　Ｊ、Ｐａｒｅ＋１ｅｒａ土Ｄｒｕ　　Ａ
ｓ５ｏｃ、　、３４＋４５２−４６２（ｌ９８０）は米
国において使用される非経口製品の賦形剤及びｐｏの総
説を提供している。この論文は、安然性及び無菌化の確
実性のために非経口製品の賦形剤を選択することは他の
投与形のようにささいなことではないことを示している
。賦形剤として使用されるべき物質が容認されるには長
期間の安全性試験と製造試行を必要とする。ざらに、安
定性及び溶解性のため、製品のｐＨは常に７．４の生理
的ｐＨに調整され得るわけではない。種々の薬剤のため
に使用される洗剤及び脂質のごとき可溶化剤のリストが
４５４頁に記載されており、そして正常血清アルブミン
のためのカプリル酸（オクタン酸）ナトリウムを包含す
る安定剤が４５８頁に記載されている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 蛋白質が該蛋白質を変性するような高アルカリ性にかけ
られず、蛋白質が可溶性であり、そして配合物がＳＤＳ
を含有しないか又は実質上含有しないような蛋白質配合
物が当業界で求められている。従って本発明はこのよう
な配合物及びその製造方法を提供しようとするものであ
る。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、動物又はヒトへの非経口的注射のために適当
な安定な医薬組成物であって、ドデシル硫酸ナトリウム
含有が蛋白質■当り４μｇ未満であるように精製された
組換インター口・イキンー２又はインターフェロン−β
蛋白質の療法的有効量を含んで成り、該蛋白質がラウリ
ン酸ナトリウムを含んで成る約７．０〜８．０のｐＨの
不活性キャリャ−媒体に溶解している組成物、及びその
凍結乾燥組成物に関する。このような組成物において、
ＩＬ−２は生理的ｐＨにおいて可溶性形であり、そして
このような可溶性組成物を得るためにｐＨを約１０．５
より高く上げる必要がない。さらに、ラウリン酸ナトリ
ウムは血中に自然に存在する。ラウリン酸ナトリウムに
類似する化合物であり、ヒト血清アルブミンのための既
知の安定剤であるオクタン酸ナトリウムは、生物学的に
活性な蛋白１ｉＩＬ−２のためには効果的な安定剤では
ない。 この組成物は改良された方法により製造され、この方法
は、 （ａ）蛋白質を生産するために形質転換された宿主生物
の破砕物から該蛋白質を抽出し；（ｂ）該抽出された蛋
白質を、ドデシル硫酸ナトリウムの含有量が蛋白質回当
り４μｇ未満であるように精製し； （ｃ）該精製された蛋白質を約９〜９．５のｐＨの媒体
と、ラウリン酸ナトリウムの存在下で混合し；そして、 （ｄ）該混合物のｐＨを約７．０〜８．０に調整する；
ことを含んで成る。 この発明の好ましい態様においては、安定剤は溶液の正
確なｐＨに依存して０．０３〜０．１重量％の濃度で存
在し、この方法において使用される安定剤はＳＤＳであ
り、配合物はさらにマンニトールを含有し、そのｐＨは
７．５〜ｉ、７であり、そしてこの配合物は段階（ｄ）
の後で凍結乾燥される。 〔具体的な説明〕 “組換（体）”なる語は遺伝子工学的技法を用いて得ら
れるＩＬ−２及びＩＦＬ−β蛋白質に関する。これらの
技法は典型的には、天然蛋白質をコードする構造遺伝子
を同定しそして特徴付け、この遺伝子又は天然蛋白質の
機能的に同等なミューティンをコードする変異体を単離
し又は合成し、この遺伝子を適当な発現ベクター中の該
遺伝子の発現を許容する位置に挿入し、該ベクターによ
りコンピテント宿主を形質転換し、正しい形質転換体を
同定し、そして該形質転換体を適当な増殖培地中で培養
することを含む。宿主生物が酵母又は哺乳類細胞である
ことができるが、しかし好ましくは微生物、さらに好ま
しくは細菌であり、最も好ましくはＥ、コリである。Ｉ
Ｌ−２及びＩＦＮ−βは典型的には、細胞を破砕し、細
胞破片を可溶化剤（蛋白質の溶解特性に依存する）及び
１種又は複数種の抽出剤で処理して粗蛋白質を単離し、
そしてこの粗蛋白質を種々のクロマトグラフ法によって
精製することにより、培地から回収される。 蛋白質が発酵過程又は回収工程においてオリゴマーを形
成しやすい場合には、蛋白質を回収工程の適当な段階で
還元剤により処理することができる。 ここで使用する場合、“β−ＨＩＦＮ”はヒトβ−イン
ターフェロン、あるいは組換ＤＮＡ技法によって製造さ
れるβ−インターフェロン様ポリペプチドであって、そ
のアミノ酸配列が天然β−インターフェロンと同一であ
るか、類似しているか、又は実質的に相同のものを意味
し、グリコジル化蛋白質及び非グリコジル化蛋白質の両
者を含む。 これらの組換蛋白質の例として、Ｎａｇｏｌａ、Ｓ、等
、Ｎａｔｕｒｅ、　２８４：３１６（ｌ９８０）；Ｇｏ
ｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ９等、Ｎａｔｕｒｅ、　２８７：
４１１（ｌ９８０）：Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、Ｅ等、Ｎｕ
ｃ。 Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、　、　　９　ニア３１（ｌ９８１）
；５ｔｒｅｕｌｉ、Ｍ、等、紅匹。 Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、７８：
２Ｂ４Ｂ（ｌ９８１）；ヨーロッパ特許出願公開隘２８
．０３３　（ｌ９８１年６月６日公開）；及びヨーロッ
パ特許出願患１０９，７４８　　（ｌ９８４年５月３０
日公開）に記載されているＩＦＮが挙げられる。 この明細書において使用する場合、“ＩＬ−２”なる語
は、天然インターロイキン−２である蛋白質、あるいは
ヒト−インターロイキン−２遺伝子、又は（ａ）天然ヒ
トインターロイキン−２のアミノ酸配列と少なくとも実
質的に同じアミノ酸配列及び（ｂ）天然ヒトインターロ
イキン−２と共通の生物学的活性を有する蛋白質をコー
ドするヒトインター、ロイキン−２遺伝子の変形体によ
り形質転換されている宿主により生産される蛋白質を意
味する。アミノ酸配列の実質的同一とは、配列が同一で
あるか、又は合成蛋白質と天然ヒトインターロイキン−
２との間の不都合な機能的差異を生じさせない１個又は
複数個のアミノ酸の変化（付加、置換）により異ること
を意味する。この様な組換蛋白質の例として、１９８３
年２月３日に出願されたヨーロッパ特許゛出願患８３１
０１０３５．０　（ｌ９８３年１０月１９日にＮＩＬ９
１５３９として公開）；１９８２年１２月２２日に出願
されたヨーロッパ特許出願ｍ８２３０７０３６．２（ｌ
９８３年９月１４日に磁８８１９５として公開）；１９
８３年１０月１３日に出願されたヨーロッパ特許出願Ｎ
１８３３０６２２１．９　（ｌ９８４年５月３０日にｌ
ｌｈ　１０９７４８として公開）；及びこの明細書の例
に記載されているＩＬ−２が挙げられる。 この発明において特に好ましいＩＬ−２及びβ−旧ＦＮ
は、生物学的活性のために必須でない１個又は複数個の
システィン残基が意図的に除去又は他のアミノ酸により
置換（β−旧１’Ｎの場合）されているか又は他のアミ
ノ酸により置換（ＩＬ−２の場合）されており、これに
よって分子間架橋の形成又は正しくない分子内ジスルフ
ィド結合の形成のための部位が除去されている生物学的
に活性なＩＬ−２及びβ−旧ＦＮである。さらに好まし
くは、この発明の蛋白質は、天然対応物のアミノ酸位置
１７のシスティン残基がセリン残基により置き換えられ
ているＩＦＮ−β−ミューティン（ＩＦＮ−βＳｅｒ＋
７と称する）、あるいは天然対応物のアミノ酸位置１２
５のシスティン残基がセリン残基により置き換えられて
いる（ＩＬ　−２ｓｅｔ、□。 と称する）か、又は天然対応物の最初のアラニン残基が
除去されているか、又は最初のアラニン残基が除去され
ており且つ位置１２５のシスティンがセリンにより置き
換えられている　（ｄｅｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒｔｚｓ−Ｉ
Ｌ−２と称する）ＩＬ−２ミユーテインである。 この発明の組成物は、媒体中に蛋白質を溶解するように
設計されておりそして非毒性であり且つ医薬として適合
性の特定のタイプの安定剤の有効量を含有し後でさらに
定義される媒体中に配合される。 媒体を記載する場合、“不活性”なる語は、配合物中で
該配合物中に含有されるＩＬ−２又はβ−ＨＩＦＮの生
物学的活性を妨害しない媒体に関する。 一般に、この発明の回収、精製及び配合（製剤化）工程
は、蛋白質を発現するように形質転換された宿主生物を
用いて発酵を行い、宿主微生物の細胞膜を破砕し、低濃
度のチャオトロピック剤を用いて破砕物から細菌蛋白質
を抽出し、可溶化剤を用いて蛋白質を回収し、２−ブタ
ノール又は２−メチル−２−ブタノールにより蛋白質を
抽出し、抽出された蛋白質をクロマトグラフ精製にかけ
、中和により蛋白質を沈澱せしめ、沈′澱物をチャオト
ロピンク剤中に再溶解し、ＳＤＳを除去し、蛋白質をｐ
Ｈ９〜９．５においてラウリン酸ナトリウムを含む媒体
中に配合し、この配合物のｐＨを７．０〜８．０の間（
ｐＨ７，０及び８．０を含む）に調整し、そしてこの配
合物を凍結乾燥することを含む。 微生物宿主により生産された組換ＩＬ−２を配合するた
めのこの発明の方法の好ましい具体例を次に記載する。 形質転換された微生物を適当な増殖培地中で典型的には
６８０　ｎ　ｍにおいて約３０以上、そして好ましくは
６８０ｎｍにおいて２０〜４０の光学濃度（ＯＤ）に増
殖せしめる。培養培地の組成は使用される特定の微生物
に依存する。この培地は、微生物の栄養的要求を満足せ
しめる化合物を含有する水性媒体である。増殖培地は典
型的には資化性の炭素及び窒素源、エネルギー源、マグ
ネシウム、カリウム及びナトリウムイオン、並びに場合
によってはアミノ酸並びにプリン及びとりミシン塩基を
含有するであろう。ＣＲｅｖｔｅｗ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃ
ａｌＪ風虫＋　Ｌａｎｇｅ　Ｍｉｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、第１４版、８０〜８５頁（ｌ９８０
）を参照のこと。）　　ｔｒｐプロモーターを含む発現
ベクターにおいては、培地中のトリプトファン濃度を注
意深く調節して、ＩＬ−２の発現が望まれる時点で制限
的になるようにする。Ｅ、コリのための増殖培地は当業
界においてよく知られている。 培養物から細胞を収得した後、必要であればこれらを濾
過、遠心、又は他の常用法により約２０〜１５０　ｗ／
ｍ１、好ましくは８０〜１００　ｍｇ／ｍｌ　（６８０
ｎｍにおいて、０Ｄ４０〜３００、好ましくは１６０〜
２００）に濃縮する。 濃縮の後、形質転換された微生物の細胞膜を破砕する。 破砕の主たる目的は次の抽出及び可溶化段階を促進する
ことである。常用の細胞破砕技法、例えば均質化（ｈｏ
ｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）音波処理（ｓｏｎ　ｉｃａ
　ｔ　１ｏｎ）又は加圧サイクル（ｐｒｅｓｓｕｒｅ　
ｃｙｃｌｉｎｇ）を、この発明の方法のこの段階におい
て使用することができる。好ましい方法は、音波処理、
又はＭａｎｔｏｎ−Ｇｕａｌｉｎホモジナイザーを用い
る均質化である。破砕段階の終点は光学濃度により決定
することができ、典型的には懸濁液の光学濃度は約６５
％〜８５％低下する。ともかく、破砕段階は実質的にす
べての細胞を破壊し、無傷の細胞が可溶可段階に実質上
移行しないようにすべきである。必要であれば、破砕に
先立って濃縮物の液相のｐＨを、次の段階においてｒＬ
−２蛋白質を不溶性の複合体として細胞破片中に残しな
からＥ、コリ蛋白質の除去を促進するレベルに調整する
。ｐ旧よ適当な緩衝液を添加することによってこのよう
に調整される。はとんどの場合、約８〜約８．５の間の
ｐＨが使用されよう。 破砕段階に続く回収工程中の段階は、ＩＬ−２を還元状
態に維持しながら、Ｅ、コリ蛋白質からＩＬ−２を良好
な収率で高い純度レベル（好ましくは約９５％以上、そ
してさらに好ましくは約９８％以上）に分離するように
主として計画される。同時に、これらの精製工程は、組
合わされて、最終生成物中のパイロジエン物質を患者へ
の非経口投与のために許容されると信じられるレベルに
低下せしめる。 細胞が破砕された後、破砕物の液相から粒状物を分離し
、そして抽出のための最適ｐＨに緩衝化された水性媒体
中に再懸濁する。場合によっては、この段階で粒状物を
緩衝液で洗浄することによりその中に存在するすべての
水溶性Ｅ、コリ蛋白質を除去することができる。ともか
く、抽出にかけられる細胞懸濁液の蛋白質濃度は通常約
５〜約６０ｍｇ／ｍＩｌ、好ましくは２０〜４０ｍ＋ｒ
／ｍ７！の範囲であろう。 粒状細胞材料からのＥ、コリ蛋白質の抽出は、破砕と同
時に、又は破砕に続いて行うことができる。破砕に続く
別個の段階として行うのが好ましい。抽出剤はチャオト
ロピック剤（すなわち、水素結合を解離させそして蛋白
質の三次構造に影響を与える穏和な蛋白質変性剤）の水
性溶液である。 抽出剤は、細胞破片と関連付けられている（これに含ま
れているか又はこれに結合している）ＩＬ・−２の少な
くとも実質的な部分を残しながら細胞破片から多量の巳
、コリ蛋白質を選択的に除去する。１Ｌ−２の疎水性、
及びそれが蛋白質の等電点近くのｐ）Ｉにおいて還元さ
れた不溶性の状態にあるという事実により選択性が促進
される。さらに、ＩＬ−２の実質的な部分がインビボに
おいて、Ｅ。 コリ中で高レベルで発現される他のクローン化蛋白質の
場合のように、有意な量の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ
　ｂｏｄｙ）として存在するであろう。抽出剤の例には
ラウリン酸ナトリウム、尿素、塩酸グアニジニウム（Ｓ
ＤＳが可溶化剤として使用される場合には塩酸グアニジ
ニウムを使用すべきでない）、及びチオシアン酸ナトリ
ウムが含まれる。 尿素が好ましい。抽出混合物中のチャオトロピンク剤の
濃度は使用される特定の剤及び抽出混合物中の細胞性材
料の量に依存するであろう。尿素の場合、２５℃におけ
る回分法においては約３．５Ｍ〜４．５Ｍ、好ましくは
約４Ｍの濃度（最終）が使用されよう。抽出が長期間に
わたって連続的に行われる場合、一層低い濃度を用いる
のが好ましいであろう。通常２０℃〜２５℃の範囲の温
度が抽出において使用され、便宜上室温が使用されよう
。溶液と粒状物との間の接触を増強し、そしてこれによ
って細胞破片から非ＩＬ−２蛋白質を抽出するために必
要な時間を短縮するために混合が典型的に用いられよう
。抽出工程の速度論的解析が５ＯＳ−ＰＡＧＥを用いて
上清について行われ、そして抽出は１５〜３０分間で実
質的に完了することが見出された。 抽出に続き、混合物を固相と液相に分離する。 次に、還元剤及び可溶化剤を含有する中性の水性緩衝液
に固相を接触せしめることにより、固相中のｒＬ−２を
選択的に可溶化する。疎水性のＩＬ−２を可溶化するた
めに適当な疎水性−親水性バランスを有する界面活性剤
（洗剤）を用いることができる。１０−１４個の炭素原
子を含有するアルカリ金属硫酸塩、及びアルカリ金属ア
ルキルサルコシネートが好ましい可溶化剤であり、ＳＤ
Ｓ及びサルコシルが特に好ましい。 可溶化において使用される可溶化剤の量は特定の可溶化
剤に依存するであろう。ＳＤＳ又はサルコシルを使用す
る場合、ＳＤＳ／サルコシルと固相蛋白質との好ましい
比率は約Ｏ，Ｓ：ｔ〜１．４：ｌである。可溶化媒体は
さらに、可溶化されたＩＬ−２がある有意な程度に酸化
されるのを回避するために十分な量の還元剤を含有する
。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び２−メルカプトエ
タノールのごとき蛋白質還元剤を使用することができる
。媒体中のり、ＴＴのごとき還元剤ρ濃度は通常糸５〜
２０ｍＭの範囲であろう。可溶化は典型的には２０℃〜
２５℃の範囲の温度で、固相と可溶化媒体との間の接触
を促進するために混合しながら行われる。一層高い温度
は不所望のＥ、コリ蛋白質を可溶化するであろう。サン
プルを１５分間装いた時又は溶液が透明に変った時に可
溶化が完了したと考える。可溶化が完了した後、不溶性
材料を分離する。 ＩＬ−２が可溶化された後、ＩＬ−２を水性溶液から還
元条件下で２−ブタノール又は２−メチル−２−ブタノ
ールにより抽出して、ｌｌ−２に非常に近い分子量を有
する幾らかの汚染物を包含する追加のＥ、コリ蛋白質を
除去する。水性溶液とブタノールとが実質的に不混和性
である条件（例えば、０．０５〜０．１５の範囲のイオ
ン強度）を用いる。有機抽出を行う場合、必要であれば
、水性溶液の蛋白質濃度を約６■／　ｍ　１未満、好ま
しくは約０．５〜４■／ｍｌｌに調整するのが好ましい
。 抽出を還元剤（例えばＤＴＴ）の存在下で行うことによ
り還元条件が維持される。ブタノールは通常、可溶化さ
れたＩＬ−２の水性溶液に約ｌ＝１〜約３：１、好まし
くは１：１　（抽出剤：水性溶液）の範囲の容量比で加
える。抽出は回分式又は連続式に行うことができる。温
度は通常２０℃〜１００℃の範囲であり、そしてｐＨは
通常約４〜９、好ましくは約５〜６の範囲である。溶液
とブタノールの接触時間は臨界的ではなく、そして数分
間のオーダーの比較的短い時間を使用することができる
。抽出が完了した後、水性相とブタノール相を分離し、
そしてＩ　Ｌ−２をブタノール相から分離する。ブタノ
ール相からＩＬ−２を分離するための好ましい方法は酸
沈澱である。これは、有機ましくは６．θ〜６．２に低
下せしめることによりＩＬ−２を沈澱せしめることによ
り行われる。 次の段階において、ＩＬ−２を抽出後に残留するすべて
のＥ、コリ汚染物からそして場合によっては可溶化剤か
ら分離する。ゲル濾過クロマトグラフィー、ＲＰ　−１
１ＰＬｃ、又はゲル濾過クロマトグラフィーとＲＰ　−
ＨＰＬＣとの組合わせが使用される。ゲル濾過クロマト
グラフィーは、パイロジエン成分、及びＩＬ−２より高
いか又は低い分子量を有する蛋白質汚染物を除去する２
つの段階において行うのが好ましい。（ＩＬ−２は約１
５．５にダルトンの分子量を有する。）これらの汚染物
からのＩＬ−２の分離を可能にするように溶液を分画す
ることができるゲルは市販されている。セファクリルＳ
−２００が高分子量成分を除去するために好ましいゲル
であり、そしてセファデックスＧ−２５，Ｇ−７５又は
Ｇ−１００が低分子量汚染物を除去するために好ましい
。ゲル濾過は典型的には、約０．１％〜１．０％の可溶
化剤及び約１〜１０ｒｎＭの還元剤を含有する緩衝化さ
れた溶液（ｐｆ１５．５〜７．０）中で行われる。カラ
ムの大きさは、所望の成分の適当な分離を可能にするも
のである。 ＲＰ　−＋１ＰＬｃはゲル濾過に代るものである。さら
に、ＲＰ　−ＨＰＬＣは、ＩＬ−２に近い分子量を有し
従ってゲル濾過によっては完全に除去され得ない分子を
溶液から除去することができる。さらに、細菌エンドト
キシンのごとき汚染物もＲＰ　−ＨＰＬＣにより効果的
に除去される。従って、ＲＰ　−ＨＰＬＣはゲル濾過後
の最終精製段階としても使用され得る。蛋白質の良好な
分離をもたらす支持体（不動相）をＲＰ　−１１ＰＬｃ
において使用することができる。Ｃ−４゜Ｃ−８、又は
Ｃ−１８の３００オングストロームのボアーサイズの支
持体が好ましい支持体の例である。ＩＬ−２を溶液に維
持するために約２．３以下、通常２．１〜２．３の酸性
ｐＨにおいて分離が行われる。 これに関して、可溶化（ゲル濾過）からの溶液のｐＨは
好ましくはこの範囲に調整されよう。溶液をＲＰ　−Ｈ
ＰＬＣカラムに負荷し、そして不動用に吸着せしめる。 酢酸又はトリフルオロ酢酸のごとき有機酸とプロパツー
ル又はアセトニトリルのごとき有機溶剤とから成るグラ
ジェント溶剤系を用いてカラムからＩＬ−２を溶出する
ことができる。酢酸−プロパツール、トリフルオロ酢酸
−プロパツール、及びトリフルオロ酢酸−アセトニトリ
ルが好ましい溶剤系である。ＩＬ−２は酢酸−プロパツ
ール基において約４０％のプロパツールで、トリフルオ
ロ酢酸−プロパツール基において約５０％のプロパツー
ルで、そしてトリフルオロ酢酸−アセトニトリル系にお
いて約６２％のアセトニトリルで溶出する。便利には、
溶離液の有機溶剤含量を、ＩＬ−２が溶出する溶剤濃度
より幾分低いレベルまで急速に上昇せしめ、次に約０．
１％〜１％／分の範囲でゆるやかなグラジェント変化を
行う。 最も好ましい溶剤系はトリフルオロ酢酸−アセトニ！・
リル、特に０．１％トリフルオロ酢酸−アセトニトリル
である。これは酢酸−プロパツール基よりも高分離の系
だからである。 ＩＬ−２をクロマトグラフィ一段階がら回収するとすぐ
に、塩基、例えばＮａ２ＨＰＯ４又はＮ　ａ　ＯＩｔで
中和することによりこれを沈澱せしめ、そして上記のよ
うにチャオトロピンク剤に再溶解し、そして０２５セフ
アデツクスカラムのごときゲル濾過脱塩カラムにかける
。チャオトロピンク剤は例えばラウリン酸ナトリウム、
グアニジン塩酸塩、尿素、又はチオシアン酸ナトリウム
であることができる。 ラウリン酸ナトリウム又は尿素が好ましい。一般に、再
溶解は、前のクロマトグラフィ一段階のために使用した
溶剤系に依存して中和塩基の存在下で行われる。 脱塩後、ＩＬ−２を集め、そしてＩＬ−２を溶解するた
めに有効量のラウリン酸ナトリウムと混合する。使用す
るラウリン酸ナトリウムの正確な量は主として配合物の
最終ｐＨ及びＩＬ−２の濃度に依存するであろう。一般
に、ｐＨ７，５における有効量は約０．Ｏ１〜０．ｌＷ
／Ｖ％、好ましくは０．０３〜０、ｌＷ／Ｖ％である。 約０．０１％未満ではラウリン・酸ナトリウムは可溶化
剤として有効でな（，０，１％より多い場合ＩＬ−２は
溶液から沈澱するであろう。より高いｐＨにおいては、
これらの最適濃度は異るであろう。 ＩＬ−２とラウリン酸ナトリウムとの水中での最初の混
合は約ｐＨ９〜９．５で行われるであろう。 成分を混合した後、ｐＨを７．０〜７．８　（ｐＨ７，
０及び７．８を含む）に下方調整し、そして成分を再び
混合する。７．０〜８．０の範囲のあるｐＨ値において
蛋白質は溶解せず、又はラウリン酸すＩ・リウムが沈澱
するかもしくは効果的でないであろうから、特定のｐＨ
が臨界的である。例えば、ｐＨを約７．４〜７．５より
低く調整した場合、ラウリン酸ナトリウムはラウリン酸
として沈澱するであろう。従って、約７．５〜７．７の
最終ｐｔ＋が好ましい。 ｐＨを上方に又は下方に調整するために使用される試薬
は臨界的でない。すなわち、任意の塩基、好ましくは無
機塩基、例えば二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａｇ肝０
４）、水酸化ナトリウム、又は水酸化アンモニウムを用
いてｐＨ値を９〜９．５に調整することができ、そして
任意の酸、例えばＩｌｌ！、マレイン酸、乳酸、酒石酸
又はクエン酸を用いてｐｉを下方に調整することができ
る。使用される量が混合物を効果的に稀釈してＩＬ−２
を沈澱せしめることがないように、酸は好ましくは濃厚
な形で使用される。 非経口的適用のため、ＩＬ−２は医薬として許容される
非経口的ビヒクルと共に単位投与注射溶液形に配合され
るであろう。このようなビヒクルは本来的に非毒性であ
り、そして非療法的である。 このようなビヒクルの例として水、塩溶液、リンゲル溶
液、デキストロース溶液及び水中５％ヒト血清アルブミ
ンが挙げられる。不揮発油及びオレイン酸エチルのごと
き非水性ビヒクルを使用することもできる。リボゾーム
をキャリヤーとして使用することができる。ビヒクルは
、少量の添加物、例えば増量剤、毒性改良剤例えばグリ
セリン、うクトース、マンニトール又はデキストロース
、油性ビヒクル、例えば安息香酸ベンジル、滑剤、懸濁
剤、キレート剤、安定剤、又は等張性及び化学的安定性
増強物質、例えば緩衝剤、例えば酒石酸、抗微生物防腐
剤、例えばフェノール、及び抗酸化剤、例えばアセトン
重亜硫酸ナトリウムを含むことができる。ＩＬ−２は典
型的にこれらのビヒクル中に約０．１■／ｍ１〜好まし
くは０．２〜５■／ｍｌの濃度で配合されるであろう。 ＩＬ−２配合物のための好ましい添加剤は、配合物に対
して２．５〜５．０重量％のマンニトールである。 配合物を７．０〜８．０のｐＨに調整した後、ｐＨが正
確に８．０にではなく８．０より低く調整された場合に
は配合物を好ましくは濾過して透明な溶液を得、凍結乾
燥し、そして最後に還元剤（’ＩＬ−２を還元状態に維
持するために、必要であれば）及びラウリン酸ナトリウ
ム（それを溶液状に維持するため）を含有する中性水性
緩衝液に再懸濁する。 ＩＬ−２はこの形で安定であり、そして使用される前に
さらに処理しそして配合するために貯蔵することかでき
る。 第１図はこの発明の個々の工程段階の詳細を例示してお
り、これには適当な醗酵培地での形質転換された微生物
の培養から、精製されたＩＬ−２を療法製剤に再溶解さ
れるように凍結乾燥する最終段階までも含む。このスキ
ームにおいて、その他の段階はＩＬ−２がゲル濾過によ
り分離された後のＩＬ−２の酸化、並びに酸化された生
成物のＲＰ−１１ＰＬＣによるか、又はゲル濾過及びそ
れに続くＲＰ−１１ＰＬｃによる精製を含む。これが、
ゲル濾過後に残留する汚染物及び不所望の酸化生成物の
効率的な除去をもたらす。好ましい酸化方法は、有用な
ＩＬ−２と実質的に同一なアミノ酸配列（この配列は、
有用なＩＬ−２中では分子内結合してシスチンを形成し
ているシスティンを含有する）を有する十分に還元され
た微生物的に生産された合成ＩＬ−２を制御された態様
で酸化してシスティンを選択的に酸化してシスチンを形
成するためのものである。この方法においては、十分に
還元された微生物的に生産された合成ＩＬ−２が、シス
ティンを選択的に酸化する酸化剤と、水性媒体中で８亥
システインのｐＫａより少なくとも０．５ｐＨユニット
低いｐＨにおいて反応する。この反応混合物中の合成蛋
白質の濃度は約５　Ｎ　／　ｍ　１未満であり、そして
酸化剤と蛋白質とのモル比は少なくとも化学量論的であ
り、但し反応の終りの期間中酸化剤が過剰に存在する。 １つの好ましい酸化剤は〇−ヨードソ安息香酸である。 酸化された生成物のＲＰ　−１１ＰＬＣ精製は上記の条
件下還元剤の非存在下及び上記のゲル濾過において使用
したのと同じが又はそれより低い濃度の洗剤の存在下で
行うことができる。 クロマトグラフィ一段階後のＩＬ−２の純度は約９５％
以上、そして通常約９８％以上である。 この高度に純粋な物質のエンドトキシン含量は１．００
０，０００国際単位（ＩＵ）のＩＬ−２”Ｍり約５０シ
未満、通常約０．０１ｔ１未満である。 酸化されたＩＬ−２のＩＩ　Ｐ　Ｌ　ＣプールをＮａＪ
ＰＯｎ　（Ｄ添加によって沈澱せしめる。次に、沈澱を
遠心により集め、そしてラウリン酸ナトリウム及びＮａ
２１１ＰＯ，に再溶解する。沈澱物の再溶解物をゲル濾
過カラム、例えばセファデックスＧ−２５カラムに負荷
し、そしてカラムからＩＬ−２を集める。 集められたＩＬ−２は可溶化剤及びラウリン酸ナトリウ
ムを実質上含有しない。次に、この集められたＩＬ−２
をラウリン酸ナトリウムとｐＨ９．１にて配合し、そし
て次にＩＭＩＩｃβを用いてｐＨを８．０に調整する。 次に配合物を凍結乾燥し、そして使用のために用意する
。この工程がＳＯ３を実質的に含有しないが、しかし溶
解形である配合物をもたらす。 第２図は、ｐＨ９．１のＩＬ−２及びラウリン酸ナトリ
ウムの配合物がＩＭＩＩＩ！によりｐＨ８，５未満に調
される具体例を例示する。この場合、調整された組成物
を濾過して過剰のラウリン酸ナトリウムを除去して透明
な溶液を得、そして次に凍結乾燥するのが好ましい。 この発明のＩＬ−２ＸＪ１成物は、ヒト末梢血単核細胞
又はネズミ胸腺細胞の増殖反応を増強するため、細菌感
染、寄生虫感染、真菌感染、原生動物感染及びウィルス
感染に対するヒト及び動物における免疫反応を増強する
ため、並びに連続性Ｔセルラインの増殖を支持するため
に使用することができる。 β−１１１ＦＮの配合のための好ましい態様においては
、個々の工程段階は次のように要約される。 形質転換された細菌宿主を適当な発酵培地中で増殖せし
め； 該発酵培地中の細菌をクロス−フロー濾過により濃縮し
； 細菌を機械的にホモジナイズして該細菌の細胞壁を破砕
し； 固体細胞性材料をホモジネートの他の部分から遠心によ
り分離し； 固体細胞性材料をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の
水溶液中に、蛋白質とＳＤＳの比率を約１：３として懸
濁することにより細胞性材料を可溶化し； β−旧ＦＮを２−ブタノールもしくは２−メチル−２−
ブタノール又はこれらの混合物により水性相から連続コ
カレント抽出により抽出し；２−ブタノール又は２−メ
チル−２−ブタノール相を約６０℃に約１０〜２０分間
加熱するか；又は２−ブタノール相を一夜エージングし
；混合物を遠心しそして沈澱した不純物を廃棄し；２−
ブタノール又は２−メチル−２−ブタノール相を水性緩
衝液と接触せしめ、そして混合物の９１１を約５．５に
調整することによりβ−１１１１’Ｎを沈澱せしめ； 沈澱したβ−１１１ＦＮを遠心により集め；β−旧ＦＮ
を蒸留水により、又はドデシル硫酸ナトリウムの水性溶
液により蛋白質とＳＤＳの比率を約ｌ：３として可溶化
し； 溶液のｐＨを約９．５に調整し、そして可溶化されたβ
−１１１ＦＮをジチオスレイトールにより還元し；還元
されたβ−旧ＦＮをクロマトグラフィーにより精製し； 精製されたβ−１１１ＦＮの溶出された両分を集め；β
−１１１ＦＮをゲルクロマトグラフィーによりさらに精
製し； 精製されたβ−）１１ＦＮを含有する溶出液を集め；こ
の溶出液にラウリン酸ナトリウムを加え；この溶出液の
ｐＨを約９〜９．５に調整し；配合物を混合し： この配合物の９１１をｐＨ７、ｏ〜８．０に下方調整し
；そして、所望によりβ−１１１ＦＮサンプルを凍結乾
燥する。 場合によっては１０ｍＭジチオスレイトールを最初の可
溶化段階において導入し、そして混合物を約９０°Ｃに
約１０分間加熱する。 β−１目ＦＮをコートする遺伝子により形質転換された
微生物を適当な増殖増地中で、典型的には６８０ｎｍに
おいて約１０以上、そして好ましくは６８０ｎｍにおい
て約５０〜ｌＯＯの光学濃度（ＯＤ）に増殖せしめる。 増殖培地の組成は使用される特定の微生物に依存するで
あろう。水性増殖培地は選択された微生物の栄養要求を
満たす化合物を含有する。増殖増進は典型的には資化性
の炭素及び窒素源、エネルギー源、マグネシウム、カリ
ウム及びナトリウムイオン、並びに場合によってはアミ
ノ酸並びにプリン及びピリミジン塩基を含有するであろ
う。〔ｈ社並皿り包虹並し肚虱並■卦■。 Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ、第１４版、８０−８５頁（ｌ９８０）を参照のこと
。〕Ｅ、コリのための増殖培地は当業界においてよく知
られている。この発明の方法において使用される特定の
可溶化剤に依存して、水中での可溶化剤の溶解性を低下
せしめる増殖培地中の物質の量を最少にするのが望まし
い。例えば、カリウムイオンはＳＤＳの溶解性に影響を
与えるので、この方法においてＳＤＳが安定剤として使
用される場合にはカリウムイオンを最少に維持すべきで
あり、又は濃縮段階の後にダイアフィルトレージョンに
より除去すべきである。 培養物が所望の細菌濃度に達した後、場合によっては、
加熱することにより、又は細胞が死滅した後に容易に除
去され得るクロロホルム又はトルエンのごとき細胞変性
剤を培地に加えることにより細胞を殺し又は不活性化す
る。この後場合によっては細胞を約２０−１５０■／ｍ
ｌｌ、好ましくは８０〜１００　ｍｇ　／　ｍ　ｊ！　
（６８０ｎ　ｍにおいて０Ｄ４０〜３００、好マシ＜は
１６０〜２００）に、クロスフロー濾過、遠心、又は他
の常用法により濃縮する。 濃縮段階の後、微生物の細胞膜を破砕して濃縮物中の粒
状物の可溶化を促進する。生物学的活性についてのβ−
ＩＩ　Ｉ　Ｆ　Ｎアッセイは、インターフェロンの多く
が細胞膜に関連付けられている（それに含有され、又は
それに結合している）ことを示す。 従って、細胞膜の破砕は可溶化剤と膜との接触を増強し
、そしてそれ故に膜に関連付けられているインターフェ
ロンが溶液に移行する速度を上昇せしめる。常用の膜破
砕技法、例えば均質化（ｈｏｍｏｇｅｎ　ｉｚａ　ｔ　
１ｏｎ）、音波処理（ｓｏｎ　ｉｃａ　ｔ　１ｏｎ）、
又は加圧サイクル（ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｃｙｃｌｉｎｇ
）を、この方法のこの段階において使用することができ
る。好ましい方法は、ビーズミル又は加圧ホモジナイザ
ーを使用する方法である。破砕の前又は後において、必
要であれば、濃縮物又は破砕物の液相のｐＨを、事情に
応じて、】薄物／破砕物中の可溶化剤及び粒状物の溶解
を促進するレベルに調整する。適当な緩衝液又はＮ　ａ
　ＯＩＩを添加することによりｐＨをこのように調整す
ることができる。はとんどの場合、約７〜約８の範囲の
ｐＨが好ましい。 細胞が破砕された後、粒状物を破砕物の液相から分離し
、そして可溶化のための最適ｐＨに緩衝化された水性媒
体に再Ｑｉすることができる。可溶化後の細胞懸濁液の
蛋白質濃度は約２〜約１５■／ｍｌ、好ましくは６〜８
■／ｍｌの範囲である。 β−旧ＦＮを含む粒状細胞材料の可溶化は、破砕と同時
に、又は破砕に続いて行うことができる。 破砕後の別個の段階として行うのが好ましい。可溶化は
好ましくは完全に・・・すなわち、破砕物中の実質的に
すべての粒状物（例えば蛋白質、脂質、核酸、リン脂質
）が水性媒体中に溶解するように行う。粒状物の実質的
に完全な溶解は、適当な溶解剤を水性懸濁液に添加する
ことにより達成される。β−ＨＩＦＮを可溶化するため
に適当な疎水性−親水性バランスを有しそしてβ−１１
１ＦＮと共に有機相に抽出され得る複合体を形成する界
面活性剤（洗浄）をこの発明において使用することがで
きる。強い天然の又は合成陰イオン界面活性剤、例えば
脂肪酸のアルカリ金属塩又はアノ°・カリ金属アルキル
サルフェートを使用することができる。このような薬剤
は一般に１０〜１４個の炭素原子を含有するであろう。 ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）及びラウリン酸
ナトリウムが特に好ましい可溶化剤である。この方法に
おいて使用することができる他の可溶化剤の例にはドデ
シルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、テ
トラデシル硫酸ナトリウム、トリデシルスルホン酸ナト
リウム、ミリスチン酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウ
ム、ナトリウムカブロイレート、ナトリウムドデシルＮ
−’サルコシネート、及びナトリウムテトラデシルＮ−
サルコシネートが含まれる。 可溶化において使用される可溶化剤の量は特定の剤及び
可溶化されるべき蛋白質の量に依存する。 はとんどの場合、可溶化剤と蛋白質の重量比は１：ｌ−
１０７１で十分である。ＳＤＳを使用する場合、約ｌ＝
１〜約５：１、好ましくは約３：ｌのＳＤＳと蛋白質の
比率が使用される。１５℃〜６０℃の範囲の温度が可溶
化において一般に使用される。溶液と粒状物との接触を
増強し、そしてそれ故に細胞性材料を溶解するのに要す
る時間を短縮するために攪拌が用いられる。溶液が実質
的に透明である場合に可溶化が完了したと考えられる。 ２８０ｎｍにおける約４．０〜８．０のＯＤが可溶化工
程の終点に特徴的である。 可溶化に続き、必要により溶液のイオン強点を溶液と有
機抽出剤が実質的に不混和性であるレベルに調整する。 イオン強度は約０．０５〜０．１５の範囲である。Ｎａ
Ｃ１等を包含する無機塩をこの目的のために溶液に加え
る。このようなイオン強度が抽出後の相分離を可能にす
る。この工程において使用される抽出剤はアルコール、
例えば２−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、
又はこれらの混合物である。混合物は好ましくは約５０
Ｗ％未満の２−メチル−２−ブタノールを含有する。 ２−ブタノールが好ましい抽出剤である。溶解物からヒ
トβ−ＩＦＮを抽出するこれらのアルコールの能力は特
異的である。抽出剤は通常β−１１１ＦＮの水性溶液と
約０．８：１〜約３＝１の範囲の容量比（抽出剤：水性
溶液）で混合する。抽出は常用の四分式又は連続液−液
抽出技法及び装置を用いて行うことができる。抽出は一
般に約２０℃〜１００℃で行い、約１分間〜１時間の範
囲の接触時間を用いる。最適接触時間は特定の可溶化剤
及び抽出剤の組合わせに依存する。ＳＤＳを使用する場
合、上記範囲内の短い時間を用いることができる。ラウ
リン酸ナトリウムを使用する場合、前記範囲内の長い時
間を使用しなければならない。抽出混合物のｐＨは約６
〜約９の範囲内にあり、ＳＤＳを使用する場合は約７．
５のｐＨが好ましく、そしてラウリン酸ナトリウムを使
用する場合には約８．５のｐＨが好ましい。 抽出の完了後、水性相及び抽出剤相を分離し、そしてβ
−旧ＦＮを抽出剤相から単離する。使用される特定の単
離法は使用する可溶化剤及び最終生成物の要求される純
度に依存する。種々の単離法、例えば沈澱、分子篩クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
及び電気泳動を用いることができる。ＳＤＳを使用する
場合、抽出剤溶液を水性緩衝液と約２＝１〜約５：１、
好ましくは約３＝１の容量比で混合し、そしてｐＨを典
型的には約５〜７の範囲に低下せしめることにより、β
−１１１ＦＮを他の蛋白質と共に抽出剤から沈澱せしめ
る。４〜８のｐＨ範囲におけるβ−１１１ＦＮの回収は
、ｐＨの上昇と共に蛋白質の回収の下降傾向を示し、約
８のｐＨにおいて６０％より多（の回収ロスが伴う。沈
澱段階のｐＨが５．５より高い場合、上清からの沈澱物
の分離、及びこの沈澱物からの残留抽出剤の蒸発が、約
９０％より高純度の生成物をもたらす。この生成物はさ
らに少量の（ｌ重量％未満ないし２重量％）の核酸及び
ＳＤＳ　（ＩＷ／Ｖ％未満）を含有する。当業界におい
て知られている方法（クロマトグラフィー法を包含する
がこれに限定されない）によりさらに精製した後、ＩＬ
−２について前記したように約９〜９．５のｐＨにおい
てラウリン酸ナトリウムを加え、そして前記のようにｐ
Ｈを約７．０〜８．０に調整する。ラウリン酸ナトリウ
ムの添加の後、場合によってはβ−ＨＩＦＮを適当な還
元剤により還元する。メルカプトエタノール、グルタチ
オン、システィン及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）が
一般に使用され、ＤＴＴが最も好ましい。 このようにして単離されたβ−旧ＦＭは凍結乾燥するこ
とができ、又は使用のため溶液として貯蔵することがで
きる。場合によっては、非毒性で非療法性で非免疫原性
の安定剤をβ−１１ｒＦＮに添加することができる。療
法的又は臨床的投与のため溶液中に使用することができ
る稀釈剤はヒト又は動物に投与するための医薬の製剤化
のために一般に使用される水性ビヒクルの中から選択さ
れる。言うま′でもなく、稀釈剤はβ−１１１ＦＮの生
物学的活性に影響を与えるべきではない。このような稀
釈剤の例には蒸留水、生理的塩水、リンゲル溶液、デキ
ストロース溶液及びバンク溶液が含まれる。凍結乾燥さ
れたβ−１１１１”Ｎを再溶解するために同じ稀釈剤を
用いることができる。 β−旧ＦＮ製剤は抗ウィルス、抗癌、免疫調節及び他の
療法的目的のために使用することができる。 療法剤としてインビボで使用される場合、蛋白質製剤は
療法的有効果（すなわち、患者の病的状態を除去するか
又は緩和するＮ）において患者に投与される。これらは
一般に非経腸的に、好ましくは静脈内に投与されるであ
ろう。投与量及び投与方法は治療されるべき病気の性質
及びその集団、特定の製剤の性質、例えばその蛋白質濃
度、患者、及び患者の病歴に依存するであろう。投与さ
れる製剤の量は典型的には約０．１〜約１０■／　ｋｇ
患者体重であろう。 次に、この発明を例によりさらに具体的に記載する。こ
れらの例は、この発明の範囲をなんら限定するものでは
ない。例において、特にことわらない限り、すべての部
及び％はｗ　／　ｖであり、そしてすべての温度は℃で
示す。 炎−上 ｄｅｓ−＾１ａ　Ｓｅｒ＋ｚｓｌＬ−２と称するミュー
ティンＩＬ−２をＥ、コリから回収した。このＩＬ−２
のアミノ酸配列は、位置１２５のシスティンがセリンに
変えられておりそして最初のＮ−末端アラニン残基が欠
けている点において天然分子のそれと異る。 この例において使用したｄｅｓ−Ａｌａ　Ｓｅｒ＋ｚｓ
ｌＬ−２生産性Ｅ　、コリの菌株は１９８４年３月６日
にアメリカンタイプ・カルチュア・コレクションに、受
託番号ＩＶｈ３９，６２６として寄託された。 この形質転換されたＥ、コリを次の増殖培地を用いて発
酵槽中で増殖せしめた。 （Ｎｌ１４）２ＳＯ４１５０ｍＭ ＫＬＰＯｔ　　　　　　　　　　２１．６　ｒｎ　ＭＮ
ａ３　サイトレート　　　　　　１．５ｍＭＺｎＳＯ４
・７１１２０　　　　　　　　３０　ｍ　ＭＭｎＳＯｎ
　　・１Ｉｚ０　　　　　　　　　３０　ｍ　ＭＣｕＳ
Ｏｎ　　＋　５Ｈ２０１ｒｎＭ ２、５　Ｎ　ＮａＯＨによりｐｔ＋を６．５０に調整し
、オートクレーブ殺菌した。 無菌添加物（オートクレーブ後） ＦＩｇＳＯａ　・７１１ｚ０　　　　　　　　３　ｍＭ
ＦｅＳＯａ　　　　　　　　　　　　１００　μＭＬ−
）リプトファン　　　　　１４呵／１チアミン−１１（
ｌ２０■／ｌ グルコース　　　　　　　　　５ｇ／／！テトラサイク
リン　　　　　　　５　ｍｇ　／　１エタノール（任意
的）　　　　　２％ カザミノ酸　　　　　　　　　２％ ダウコーニング・アンチフオームＢの２０％溶液、グル
コース５０％溶液、及び５ＮＫＯ１ｌを必要に応じて添
加した。 発酵槽のｐＨを５Ｎ　ＫＯＪＩにより６．８に維持した
。残留グルコースを５〜１０ｇ／βに、溶存酸素を４０
％に、そして温度を３７±１　”ｃに維持した。 カザミノ酸（２０％ストックン容液）を、ＯＤ　６ｅ。 が約ｌＯの時に加えた。０Ｄ６１１０が約２０に達した
後３時間で収得を行った。 収得した材料を中空繊維フィルター及び／又は遠心によ
り濃縮した。２０〜４０ｇ（湿重量）の濃縮物を２００
　ｍ　ｊ＋の５０　ｍＭＴｒｉｓ−１１ｃ＃　、　１　
ｍＭエチンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　（ｐＨ８，１
−８，５）（Ｔｒｉｓ／Ｅ［ＩＴＡ緩衝液）に再懸濁し
た。懸濁液を３０００〜４０００×ｇにて１０分間遠心
し、上清を除去し、そして固形物を２００　ｍ　／のＴ
ｒｉｓ　／　ＥＤＴＡ緩衝液に４℃にて再懸濁した。こ
の懸濁液をソニケーター（ハートシステムス、モデルＷ
　−３７５）に負荷し、大プローブを用いて、動力設定
値“９”として５０％負荷でパルスを与えながら４℃に
て４５分間音波処理した（終点−約８５％の０Ｄ６１１
（ｌの低下）。これに代る破砕法は懸液をＭａｎｔｏｎ
−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーに３回通す方法である。 ４５，０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心することにより破砕
物から細胞破片を分離した。 細胞破片を５０　ｍ　ＭＴｒｉｓ　−ＨＣ１，１ｍＭ　
ＥＤＴＡ（ｐＨ８，５）緩衝液中に室温にて約１：４．
５（ｗ／Ｖ）の比率で懸濁した。ジチオスレイトール（
Ｄ’　Ｔ　Ｔ　）を２５ｍＭの最終濃度に加えた。同し
Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中８Ｍ尿素を急速に攪拌しな
がら５分間にわたり懸濁液にゆっくり加えた（最終尿素
濃度４Ｍ）。室温にて３０分分間中かな攪拌を続けた後
、懸濁液を１２．０００Ｘ　ｇにて１５分間遠心して抽
出された細胞破片を回収した。（固相が形成されない場
合、上清を除去し、そして同容量のＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ
緩衝液を加え、そして混合物を遠心分離する。） 次に、抽出された細胞破片を９ｍｊ２の５０ｍＭリン酸
ナトリウム、１　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，０）に再
懸濁した。次に、懸濁液に固体ＳＤＳを５　ｗ　／　ｖ
％の最終濃度に添加することにより懸濁液を可溶化した
。 この５％ＳＤＳ溶液を０．　ＬＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐ
Ｈ８，０）により２％ＳＤＳに稀釈した。蛋白質濃度を
測定し、ｐＨを８．５に調整し、そしてＤＴＴを５０ｍ
ＭにそしてＥＤＴＡを２ｍＭになるように加えた。この
混合物をＮ２のもとで４０°Ｃに加熱してＩ　Ｌ−２を
還元した。次に混合物を冷却し、そしてｐＨを５．０に
調整した。 次に、溶液を１ｍＭＤＴＴを含有する２−ブタノールに
よりｌ　：　ｌ　　（Ｖ／Ｖ）の比率で室温にて抽出し
た。滞留時間は２〜２．５分間とした。２００ｍ１７分
の流速を用いて液−液相分離器中で抽出を行った。有機
抽出物を分離し、そしてそのｐＨをＮａ０ＩＩにより８
．０に調整した。次に、抽出物を１０ｍＭ　Ｎａｚｌｌ
ＰＯ，、２ｍＭ　ＤＴＴ　（ｐＨ６）中０．１％ＳＤＳ
に徐々に加え、そして１５〜２０分間攪拌した。得られ
た沈澱物を分離し、そして得られたペース１−をＰＢＳ
中５％ＳＤＳに再）調温した。 溶液を遠心により透明にし、そして次に透明になった溶
液２００　ｍ　Ｉｌを、１０ｍＭＤＴＴを用いて、２、
５　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡの存在下でｐＨ８，ｏ及び６０°
Ｃにて３０分間還元した。この懸濁液を３５Ｋにて２時
間遠心した。上清（３５ｍ＃）をＳ　−２００（Ｋ　−
５０、ファルマシア）カラム上に負荷し、そしてアセテ
−ト　（ｐＨ５，５）（５０ｍＭ）　、ＤＴＴ　（２ｍ
Ｍ）、ＥＤＴＡ　（ｌｍ　Ｍ）及び５ＤＳ（０，１％）
により１．５ｍ！！／分の速度で溶出した。Ｓ−２００
プール（２７０ｍｌ、　Ａｚｓｏ　＝　１．７７）はＨ
ＰＬＣで測定した場合約３３％純度であった二 Ｓ−２００プールの一部分（３５ｍｌ　）をトリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）によりｐＨ２，０に酸性化し、そして
次に２．５ｍｌ／分で、新たに調製した半分数周（ｌ，
３ｃｍ）　Ｃ−４Ｖｙｄａｃカラム上に負荷した。 これを、３５ｒｒｌずつの負荷で３回行った。この半分
取精製のために使用した溶剤はアセトニトリル（０，１
％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ）であり、そして使用したグラジェ
ントは１５分間にわたる０％から４５％の緩衝液Ｂ及び
それに続＜２００分間にわたる４５％から７５％の緩衝
液Ｂであった。ＩＬ−２プールはＡ２ｍ＋１　＝０．３
２６を有する７６ｍＪ（３試行）として流出し、これは
約２５１ＴＩ［ｒのＩＬ−２に相当し、そして約１５％
の収率であった。このＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ流出液を１６０
０　ｍ　ｊ！のＮａ、１（Ｐｏ４緩衝液（０，１Ｍ。 ９１１７、０　、０．１％５ＤＳ）中に稀釈し、そして
次に７６謙霞ＰＭ−１０メンフ゛ランを装着したアミコ
ンセルを用いて５０ｒｒｌに濃縮した。濃縮物を５０ｒ
ｒｌずつ３容量の５０　ｍＭ　ＮａｚｌｌＰＯ，（ｐＨ
７，０，１％ＳＯ５を含有）で洗浄した。最終容量は４
３ｍｌ１でありＡ２８゜＝０．６５であった。 酸化を行う前に、蛋白質溶液の合計チオール含量を２，
２′−ジチオジピリジンを用いて決定した。この決定は
、完全な酸化を達成するためにＩＬ−２溶液に添加しな
ければならないＯ〜ヨードソ安息香酸の最少理論量を計
算するために必要であった。０−ヨードソ安息香酸溶液
（ｌｍＭ、５０ｍＡりは、この化合物（ｌ３，４ｍｇ）
を約４５ｍＩ！の水に、混合物を数分間音波処理するこ
とにより溶解し、そして次に撹拌しそしてＮａ０１１　
（Ｉ　Ｎ　）を徐々に添加して酸を溶解することにより
調製した。アルカリ性溶液を加えて８．０〜８．５の最
終ｐＨを得た。酸化剤溶液の容量を５０ｍ１の最終容量
に調整した。完全な酸化のために必要な酸化剤の・合計
量を決定するためにスルヒドリル基の測定を行った。こ
れは、合計チオール濃度を２＋酸化剤の１５マイクロモ
ル過剰で除したものに相当する。 ０−ヨードソ安息香酸溶液を０．５ｍ７！／時の流速で
ｒＬ−２ン容液（５Ｑ　ｍ　ＭｍＭ　Ｎａ２ｔｌＰＱ４
、ｐＨ７又は７、５’）に加えることにより制御された
酸化を行った。酸化の程度を逆相１１　Ｐ　Ｌ　Ｃによ
りモニターした。 濃酢酸を用いて溶液のｐＨを５．５に低下せしめること
により酸化を停止した。酸化された生成分の１１ＰＬｃ
分析は、このものが約８０％の目的とする酸化されたＩ
Ｌ−２、約１３％の不所望の異性体（異性体を集め、Ｉ
　Ｌ−２活性についてアッセイし、そして不活性である
ことが見出された）、及び約６％の還元された（未酸化
の）ＩＬ−２を含んで成ることを示した。 ０、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ＃Ｅ酸ナトリウム、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ　（ｐＨ５，５）を用いるＧ−２５カラムクロ
マトグラフイーにより、ヨードソベンゾエート及びヨー
ドベンゾエートから酸化生成物を分離した。次に、下記
のようにしてＩ？Ｐ　−ＨＰＬＣにより溶液からＩ　Ｌ
−２を分離した。溶液を０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
　Ｆ　Ａ）中に１０倍に稀釈し、そして０、１％′Ｔ”
　Ｆ　Ａにより平衡化された内径４．６　＋ｕ　ｘ長さ
５ＣＩｌのＢｒｏｗｎｌｅｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ
−３００カラムに適用した。Ｉ　Ｌ−２を、０．１％の
ＴＦＡを含有する３０−６０％アセトニトリルのグラジ
ェントにより７容出した。得られる精製された組換ＩＬ
−２生成物は、還元ＳＯＳ　−ＰＡＧＥ分析により決定
した場合約９５％より多くのＩＬ−２を含有し、そして
エンドトキシン含量は約０．ｌｎｇ／ｑｌＬ−２であり
、そして３．３　Ｘｌ０ｓＵ／ｋｇの投与ｉ１　テ（７
）ＩＪ、Ｓ、Ｐ、　ラビットパイロジエンテストにより
決定した場合、パイロジエンを実質上含有していなかっ
た。 この点までの工程を第１図に示す。より大規模にＩＬ−
２を製造するためにこの方法の変法を用いることができ
る。すなわち、（ｌ）緩衝液のわずかな変更、（２）　
ＲＰ−ＨＰＬＣにおける酢酸−プロパノール溶剤系の使
用、及び（３）酸化後の稀釈／ダイアフィルトレージョ
ン段階、Ｓ−２００ゲル濾過段階、及び限外濾過段階を
含めること、ができよう。 第１図に示すＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃまでの工程は種々の精製
法により変更することができ、例えば、第２のＳ−２０
０カラムの通過の後、１％ＳＤＳ中ＩＬ−２溶液をｌ：
ｌＯで稀釈して０．１％ＳＤＳｔＭ度とし、そして次に
１０ｍＭリン酸緩衝液に対して７．５のｐＨ及び５ｐｐ
ｍＳＤＳにてダイアフィル１−レートすることができる
。次に、適当な使用のために必要であれば、この溶液を
濃縮することができる。 ０、１％トリフルオロ酢酸及び６０％アセトニトリル中
２５０■の酸化され精製されたＩＬ−２を含有する上記
の肝ＬＣプール全１００ｍ１を、該プールに６ｍＡの０
．５　Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯａを添加することにより沈澱せ
しめた。次に、沈澱物を５０００Ｘｇにて１５分間遠心
することにより集めた。次に、固体の遠心分離物を１２
０ｍｆの０．５％ラウリン酸ナトリウム、１０　ｍ　Ｍ
　ＮａｚｌｌＰＯ４に再溶解した。この溶液を、１０　
ｍＭ　ＮａｚｌｌＰＯ４（ｐＨ９，１）のカラム緩衝液
及び２０ｍｊ！／分の流速を用いてセファデックスＣ−
２５カラム５Ｘ８０ｃｍ上に負荷した。次にＩＬ−２を
カラムから１．５■／ｍｌのＩＬ−２を含有する１５０
ｍｎのプール中に集めた。このプール中のラウリン酸ナ
トリウムの濃度は０．０１％以下であり、そして＾ｎａ
１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　■［、１３８−１４１（
ｌ９８１）により記載されているＳＤＳのためのアクリ
ジンオレンジ測定により決定した場合のＳ　Ｄ　Ｓ　Ｑ
Ｑ度は０．４μｇ／■ＩＬ−２以下であった。 カラムから集めたＩＬ−２を水、ラウリン酸ナトリウム
、ＮａｚｌｌＰＯａ及びマンニトールと混合してｐＨ９
，１とし次の組成の最終生成物を得た。 夏　Ｌ　　　２　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．２５　１１１ｒ／ｍＡラウリン酸ナトリウム　　　
０．０７％Ｎａ、１ＩＰＯ４１０ｍ　Ｍ マンニトール　　　　　　　５％ 上記のアクリジンオレンジ測定により決定されたＳＯ３
の最終濃度は０．４μｇ／■ＩＬ−２以下又は０．１μ
ｇ／ｍ１以下であった。 ｐＨ９，１の配合物を、これにＩＭＨＣｊ＋を添加する
ことによりｐＨ７，５に調整した。次に、これを既知の
技法により凍結乾燥した。 凍結乾燥された配合物はＳＤＳを実質的に含有しないが
、しかしなおＩＬ−２は配合物中に可溶性であった。 尉−Ｉ この例はＩＬ−２の溶解性に対する最終ｐＨの効果を例
示する。例１の方法を行ったが、但しｐＨ９、ｌ゛の配
合物は次の最終濃度を有した。 Ｉ　　Ｌ　−２０，２５ｍｇ／　ｍｌｌラウリン酸ナト
リウム　　　０．０３％ＮａｚｌｌＰＯａ　　　　　　
　　　　１０　ｒｎ　Ｍマンニトール　　　　　　２．
５％ ＩＬ−２の最終濃度は０．６４１曜／ｍｌであった。 この配合物を２つの部分に分け、その一方をｌＮｌ１ｌ
！によってｐＨ７，５に調整して透明な（ＩＬ−２可溶
性）溶液を得、他方をｐＨ７，０に調整してわずかに曇
った溶液を得、幾らかのＩＬ−２が不溶性であることが
示された。配合物は、ｐＨ６，５に調整された場合曇り
、１分間後非常に曇り状態となった。水酸化ナトリウム
をこの配合物に加えてｐＨを７．５とした場合、この溶
液はほとんど完全に透明となった。 倒二づ− この例は、ＩＬ−２の溶解性に対するラウリン酸ナトリ
ウムの効果を例示する。例２の方法に従ったが、但し２
．５％ではなく５％のマンニトールを使用し、そしてｐ
Ｈ７，５に調製する前にラウリン酸ナトリウムを配合物
に添加しなかった。成分の量は次の通りであった。 ＩＬ−２プール　　　　　　　９．７５ｍ＃０、５　Ｍ
　ＮａｚｌｌＰ８４０．５　ｍ　ｌ１２５％マンニトー
ル　　　　　５．０ｍＡＩＩｚ０　　　　　　　　　　
　　１１　、０　ｍ　ｌこの配合物はｐＨ７．５に調整
した後曇り状態に変化し、ＩＬ−２がこの中に溶解しな
いことが示された。 次の濃度の成分を用いて０．０１％のラウリン酸ナトリ
ウムを含有する配合物を調整した。 ＩＬ−２プール　　　　　　　９．７５ｍ１Ｏ，５Ｍ　
ＮａｚｌｌＰＯａ　　　　　　　　　ｏ、　５　ｍ１２
５％マンニトール　　　　　２．５ｍ１１％ラウリン酸
ナトリウム　　０．２５　ｍ　ｌ！Ｈ２０１ＱｍＪ この配合物はｐＨ７，５に調整した後透明であり、ＩＬ
−２がこの混合物中に可溶性であることが示された。 次の濃度の成分を用いて０．１％のラウリン酸ナトリウ
ムを含有する配合物を調製した。 ＩＬ−２プール　　　　　　　９．７５ｍＡＯ，５Ｍ　
　Ｎａｚｌ冒ＰＯａ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｏ，５ｒｎＡシ２５％マンニトール　　　　　２．
５ｍ１１％ラウリン酸ナトリウム　　２．５ｍＪ１１ｚ
０　　　　　　　　　　　　　　１０　ｍｌこの配合物
はｐＨ７，５に調製した後透明であり、ＩＬ−２がこの
混合物中に可溶性であることが示された。 次の濃度の成分を用いて０．０６％のラウリン酸ナトリ
ウムを含有する配合物を調製した。 この例のＩ　Ｌ　−２９，７５ｍＩ ＮａｚｔｌＰＯ４ｏ、　５　ｍ　１ ２５％マンニトール　　　　　’１．５ｍ１１％ラウリ
ン酸ナトリウム　　１．５ｍｌ！１１２０　　　　　　
　　　　　　　　　３ｍＡ！この配合物のｐＨをＩＮＩ
ＩＣｊ２により７．５に調整した場合、溶液は透明なま
まであった。 次の濃度の成分を用いてラウリン酸ナトリウムではなく
１％のＳＤＳを含有するｐＨ７の対照配合物を調製した
。 ＩＬ−２プール　　　　　　　９．７５ｍＪ１０％ＳＤ
３　　　　　　　　２．５ｍｊ２Ｑ、５Ｍ　ＮａＪＰＯ
４ｐＨ７０，５ｍ１２５％マンニトール　　　　　２，
５ｍＪｌｈ０　　　　　　　　　　　　　９．７５ｍｊ
！この配合物は透明であることが見出された。 ０％、０．０１％、０゜０３％及び０．１％のラウリン
酸ナトリウム、並びに１％のＳＤＳを含む配合物につい
て紫外線スキャンを行った。これらのスキャンは、Ｏ，
１％ラウリン酸酸塩台物が１％ＳＤＳ配合物と同し安定
性を有することを示した。 次の濃度の成分を用いて０．１％のオクタン酸ナトリウ
ムを含有する対照配合物を調製した。 ＩＬ−２プール　　　　　　　　９．７５ｍ１Ｏ，５Ｍ
　ＮａｚｌｌＰＯ４ｏ、　５　ｍ１２２５％７７二ｌ−
−ル　　　　　　２．５ｍ１２１％オクタン酸ナトリウ
ム　　　０．２５　ｍ　１１１２０　　　　　　　　　
　　　　　１０　ｍｌこの配合物をｐＨ７，５に調整し
た場合、わずかに曇るようであった。オクタン酸ナトリ
ウムを０．２％のレベルに添加した場合、配合物はなお
曇っていた。従って、オクタン酸ナトリウム（ｃｍ脂肪
酸塩）はラウリン酸ナトリウム（ｃＩ！脂肪酸塩）のよ
うに安定剤として効果的ではなかった。 テトラデカン酸ナトリウム（ｃ３４脂肪酸ナトリウム）
を用いて上記の実験を反復した場合、この塩は溶液とし
て維持されないようであった。上記の実験をデカン酸ナ
トリウム（ｃ１０脂肪酸塩）を用いて反復した場合、配
合物は曇った。試験したこれらの脂肪酸の内ＣＩ！脂肪
酸塩のみが有効であった。 貫Ｂ 例１の方法においてＲＰ　−ＨＰＬＣ用の溶剤を６％酢
酸／水、及び６％酢酸／２−プロパツールとした。 グラジェント溶出の間、ＩＬ−２は約４０％の２−プロ
パツールにおいて溶出する。ＨＰＬＣプールを１容量の
０．８Ｎ水酸化ナトリウムで稀釈した。 ＩＬ−２が沈澱し、これを遠心により集めた。次に、沈
澱したＩＬ−２をラウリン酸ナトリウム及びＮａＪＰＯ
４中に再溶解し、そして例１に記載したようにして配合
した。 組換ＩＬ−２又はβ−旧ＦＮ蛋白質及びラウリン酸ナト
リウムを含有する製剤の有効果を該蛋白質による治療を
必要とする患者への非経口投与は有効であろう、なぜな
ら、この蛋白質は生理的ｐｕにおいて可溶性であり、そ
してこの蛋白質の強アルカリｐＨへの暴露が避けられる
からである。 この発明は、患者に非経口注射するのに適する医薬組成
物を提供し、この組成物はＭｉ換ＩＬ−２又はβ−旧Ｆ
Ｎ、及び有効量のラウリン酸ナトリウムを含有する。ラ
ウリン酸ナトリウムは蛋白質を安定化するために必要な
性質を有するのみならず、血液中で容易に代謝され得る
から、例えば、肝臓に蓄積することがないであろう。 ラウリン酸ナトリウム（ドデカン酸ナトリウム）を包含
する合計脂肪酸は血液中に２〜４■／　ｍ　１のレベル
で、又は全血液系中に約１２〜２０ｇの合計脂肪酸とし
て存在する。注射されたラウリン酸ナトリウムは血清ア
ルブミンと急速に結合しそして脂肪酸の代謝サイクルに
入り、ラウリン酸ナトリウムによる溶血又は腐骨分離（
ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）の問題は存在しないであ
ろう。 さらに、この発明の方法はＩＦＮ製剤中約５〜１０　ｐ
　ｇ　／ｍｌのＳＤＳ及びＩＬ−２製剤中約１５０μｇ
／ｍｌｌのＳＤＳの現在のレベルに対して、ＳＤＳの含
を量が０．４μｇ／ｍＩ！未満であるＩＬ−２又はＩＦ
Ｎ−β蛋白質の配合（製剤化）の方法を提供する。さら
に、この方法により得られる蛋白質は細胞膜破砕物中の
他の物質を実質上含有しない。この発明の方法は、ＳＤ
Ｓを含有しないか又はその含有量が痕跡である比較的高
純度の蛋白質の回収をもたらし、この蛋白質は医薬とし
て許容される製剤に再構成され得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、微生物的に生産されたＩＬ−２を処理し、そ
してｐＨ８，ｏにおいて配合するための好ましい方法の
流れ図である。 第２図は、第１図と同様の流れ図であるが、配合物が８
．０未満のｐＨに調整される。 ＦＩＧ、２ ０ゴ】エロコ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物又はヒトへの非経口的注射のために適当な安定
   な医薬組成物であって、ドデシル硫酸ナトリウムの含有
   量が蛋白質ｍｇ当り４μｇ未満であるように精製された
   組換インターロイキン−２又はインターフェロン−β蛋
   白質の療法的有効量を含んで成り、該蛋白質がラウリン
   酸ナトリウムを含んで成る約７．０〜８．０のｐＨの不
   活性キャリヤー媒体に溶解していることを特徴とする医
   薬組成物、又はその凍結乾燥医薬組成物。 ２、前記蛋白質がミューテインであり、該蛋白質がイン
   ターフェロンβである場合には生物学的活性に必須でな
   いシステイン残基が除去されているか又は他のアミノ酸
   により置き換えられており、あるいは該蛋白質がインタ
   ーロイキン−２である場合には生物学的活性に必須でな
   いシステイン残基が他のアミノ酸により置き換えられて
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の組
   成物。 ３、前記蛋白質がｄｅｓ−ａｌａ＿１ｓｅｒ＿１＿２＿
   ５ＩＬ−２、又はＳｅｒ＿１＿７ＩＦＮ−βであり、前
   記媒体が水性であり、そしてｐＨが７．５〜７．７であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に
   記載の組成物。 ４、０．４μｇ／ｍｌ未満のドデシル硫酸ナトリウムを
   有し、そしてさらにマンニトールを含有することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に
   記載の組成物。 ５、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記
   載の組成物の療法的有効量を動物又はヒトに非経口的に
   投与することを特徴とする動物又はヒトの治療方法。 ６、動物又はヒトに非経口投与するのに適当な不活性キ
   ャリヤー媒体に組換インターロイキン−２又はインター
   フェロン−β蛋白質を配合する方法であって、 （ａ）該蛋白質を生産するために形質転換された宿主生
   物の破砕物から該蛋白質を抽出し； （ｂ）該抽出された蛋白質を、ドデシル硫酸ナトリウム
   の含有量が蛋白質ｍｇ当り４μｇ未満であるように精製
   し； （ｃ）該精製された蛋白質を約９〜９．５のｐＨの前記
   媒体と、ラウリン酸ナトリウムの存在下で混合し；そし
   て、 （ｄ）該混合物のｐＨを約７．０〜８．０に調整する；
   ことを特徴とする方法。 ７、段階（ａ）の破砕物が微生物宿主の細胞膜の破砕物
   であり、前記抽出をドデシル硫酸ナトリウムを使用しな
   がら行い、そしてラウリン酸ナトリウムの濃度が溶液の
   ｐＨに依存して０．０１〜０．１ｗ／ｖ％であることを
   特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、動物又はヒトへの非経口的注射に適する組換インタ
   ーロイキン−２又はインターフェロン−β蛋白質の配合
   方法であって、 （ａ）該蛋白質を含有する形質転換された微生物の細胞
   膜を破砕し； （ｂ）該破砕物を、細胞性材料から不所望の蛋白質を選
   択的に抽出するチャオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐ
   ｉｃ　ａｇｅｎｔ）の水性溶液により抽出し； （ｃ）抽出混合物の固相中の蛋白質を、該蛋白質の水溶
   性複合体を形成する可溶化剤の水性溶液であって還元剤
   を含有するものにより可溶化し； （ｄ）生じた溶液から該蛋白質を還元剤の存在下で分離
   し； （ｅ）段階（ｄ）の生成物を酸化し； （ｆ）生じた酸化された生成物を逆相高速液体クロマト
   グラフィーにより精製し； （ｇ）段階（ｆ）からのプールを沈澱せしめ、そして沈
   澱物を集め； （ｈ）該沈澱物をチャオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏ
   ｐｉｃ　ａｇｅｎｔ）の存在下で再溶解し； （ｉ）沈澱物の再溶解物をゲル濾過カラムに通し、そし
   て該カラムから蛋白質を集め； （ｊ）段階（ｉ）からの蛋白質をラウリン酸ナトリウム
   を含んで成るｐＨ９〜９．５の不活性キャリヤー媒体と
   混合し； （ｋ）段階（ｊ）の混合物のｐＨを７．０〜８．０に調
   整して溶液を得；そして、 （ｌ）段階（ｋ）の溶液を凍結乾燥して最終配合物を得
   る； ことを特徴とする方法。 ９、段階（ｈ）において使用されるチャオトロピック剤
   をラウリン酸ナトリウム、尿素、グアニジン塩酸塩、及
   びチオシアン酸ナトリウムから成る群から選択し、そし
   て段階（ｆ）のクロマトグラフィーのために使用される
   溶剤系がトリフルオロ酢酸及びアセトニトリルであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０、ヒトに非経口投与するためのｄｅｓ−ａｌａ＿１
   ｓｅｒ＿１＿２＿５ＩＬ−２の配合方法であって、 （ａ）ＩＬ−２を含有する形質転換されたＥ．コリ（￥
   Ｅ．ｃｏｌｉ￥）の細胞膜を破砕し； （ｂ）該破砕物を塩基性ｐＨの尿素水溶液により抽出し
   ； （ｃ）抽出混合物の固相中のＩＬ−２を、還元剤を含有
   するドデシル硫酸ナトリウム水溶液により可溶可し； （ｄ）生じた溶液からＩＬ−２を還元剤の存在下で分離
   し； （ｅ）段階（ｄ）の生成物を酸化し； （ｆ）生じた酸化された生成物を、０．１％トリフルオ
   ロ酢酸とアセトニトリルとの混合物を用いる高速液体ク
   ロマトグラフィーにより精製し； （ｇ）段階（ｆ）からのプールをＮａ＿２ＨＰＯ＿４を
   用いて沈澱せしめ、そして沈澱物を集め； （ｈ）該沈澱物を、ラウリン酸ナトリウムを含有するＮ
   ａ＿２ＨＰＯ＿４、溶液中に再溶解し； （ｉ）沈澱物の再溶解物を脱塩カラムに通し、そして該
   カラムからＩＬ−２を集め； （ｊ）該ＩＬ−２を含む０．１ｗ／ｖ％のリウリン酸ナ
   トリウムＮａ＿２ＨＰＯ＿４溶液ｐＨ９．０〜９．５と
   混合し； （ｋ）段階（ｊ）からの混合物のｐＨを約７．０〜８．
   ０に調整し、ここでｐＨが８．０未満に調整されたなら
   混合物を濾過して過剰のラウリン酸ナトリウムを除去し
   ；そして （ｌ）段階（ｋ）からの混合物を凍結乾燥して最終配合
   物を得る； ことを特徴とする方法。